一種針對(duì)腫瘤治療的dna超晶格納米載藥分子的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種針對(duì)腫瘤治療的DNA超晶格納米載藥分子的制備方法。所述超晶格結(jié)構(gòu)的納米載藥分子是由DNA四面體折紙結(jié)構(gòu)通過(guò)巰基與納米金結(jié)合成四面體-納米金復(fù)合物，并由另一條單鏈連接這些復(fù)合物從而形成一種超晶格結(jié)構(gòu)。本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤是當(dāng)前危害人類健康，威脅人類生命安全的重要疾病之一。近年來(lái)，世界范圍內(nèi)死于腫瘤的人數(shù)一直呈上升趨勢(shì)。因此，研究治療腫瘤的藥物載體也成了當(dāng)今世界迫切需要的解決問(wèn)題。金納米粒子由于其良好的生物相容性、粒徑容易掌控和表面容易修飾等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是一種很有潛力的納米藥物載體。目前，對(duì)金納米粒子的合成工藝已經(jīng)十分成熟，不僅可以實(shí)現(xiàn)其在1-100納米范圍內(nèi)大小和形狀的可控，還可以通過(guò)表面修飾對(duì)其表面的物理、化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行控制。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中，金納米粒子已成為最活躍的材料之一并在腫瘤的熱療、造影以及載藥方面有了新的突破。然而，令人們擔(dān)憂的是，由于其生物的不可降解性，在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易團(tuán)聚，形成有害代謝產(chǎn)物并被運(yùn)輸?shù)礁闻K等重要器官，從而引發(fā)其他的疾病。
[0003]DNA由于其精準(zhǔn)的堿基配對(duì)結(jié)構(gòu)以及良好的生物相容性一直以來(lái)受到了人們的廣泛關(guān)注。DNA折紙結(jié)構(gòu)更是進(jìn)一步推動(dòng)了 DNA的研究并大大拓寬了其應(yīng)用領(lǐng)域。尤其在生物醫(yī)藥方面，DNA折紙結(jié)構(gòu)在腫瘤的治療、分子檢測(cè)方面已有突出貢獻(xiàn)。受益于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，本發(fā)明通過(guò)DNA四面體折紙結(jié)構(gòu)來(lái)控制金納米粒子，使其在微觀上形成一種超晶格結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)將使其在循環(huán)過(guò)程中不易團(tuán)聚從而通過(guò)腎臟排出體外。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種針對(duì)腫瘤治療的DNA超晶格納米載藥分子的制備方法。該方法將四條特定的DNA單鏈自組裝成帶有一段1-motif鏈并持有三個(gè)巰基的DNA四面體，再通過(guò)巰基與金納米粒子結(jié)合，最后引入與1-motif鏈特異性互補(bǔ)的二倍長(zhǎng)的單鏈將四面體相互連接起來(lái)形成一個(gè)超晶格結(jié)構(gòu)。本發(fā)明在腫瘤研究治療領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。
[0005]—種針對(duì)腫瘤治療的DNA超晶格納米載藥分子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)DNA四面體(TDN)結(jié)構(gòu)的制備:
將四條單鏈(50μΜ)分別取 2yL加入到 42yL Tris-MgCl2 (Tris 10mM, MgCl2 50mM,pH8)溶液中并置于PCR儀內(nèi)，將溫度迅速升到95°C穩(wěn)定10分鐘再冷卻至4°C穩(wěn)定30分鐘便可得到高產(chǎn)率的DNA四面體(2uM)；
(2)粒徑為4nm的納米金粒子的制備:
取10ml濃度為2.5*10 4M的檸檬酸鈉溶液放入50 ml圓底燒瓶中，加入28ul高氯酸(30mg/ml )，最后在攪拌下加入0.3ml新配制的硼氫化鈉(0.1M)溶液，即得到粒徑為4nm的納米金溶液；
(3)DNA四面體(TDN)與金納米粒子的結(jié)合:
取將400ul金納米粒子離心用30K超濾管濾去多余的溶劑，取沉淀用lOOul PBS(10mMpH7.4)溶解，然后加入2ul TDN(2uM)，靜置過(guò)夜；
(4)DNA超晶格結(jié)構(gòu)的合成:
取1 μ L 1-motif的互補(bǔ)鏈加入上述溶液中，混勻并在PCR中60度反應(yīng)10分鐘并迅速降至37度保持2小時(shí)。
[0006]通過(guò)改變DNA四面體與金納米粒子的摩爾比，改變超晶格結(jié)構(gòu)的大小程度。
最終退火溫度選擇迅速降溫，或選擇逐步緩慢降溫。
[0007]本發(fā)明中用到的DNA鏈序列如序列表所示，帶有1-motif的單鏈用TDN-1表示、帶有巰基的單鏈分別用SH-TDN-2、SH-TDN-3、SH-TDN-4表示。
[0008]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
本發(fā)明以帶有1-motif的DNA四面體為連接體，倉(cāng)ll造性地合成了 DNA、納米金超晶格結(jié)構(gòu)，其原料性質(zhì)穩(wěn)定，生物安全性好。
[0009]本發(fā)明中合成的DNA四面體由于精準(zhǔn)的堿基配對(duì)原則，其大小和形狀精確可控，三維構(gòu)型有利于超晶格結(jié)構(gòu)的形成。
[0010]本發(fā)明使用DNA和納米金粒子為原材料，生物相容性好。
【附圖說(shuō)明】
[0011 ] 圖1為TDN-AU復(fù)合物粒度圖。
[0012]圖2為TDN-Au復(fù)合物紫外吸收?qǐng)D(吸收波的紅移表示溶液中的顆粒粒徑變大)。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。以下的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不限制本發(fā)明的范圍。
[0014]實(shí)施例1:
將四條單鏈(50 yM)1-motif-TDN-l, SH-TDN-2, SH-TDN-3, SH-TDN-4 分別取 2 μ L 加入至lj42yL Tris-MgCl2 (Tris lOmM, MgCl2 50mM, pH8)溶液中并置于 PCR 儀內(nèi)，將溫度迅速升到95°C穩(wěn)定10分鐘再冷卻至4°C穩(wěn)定30分鐘便可得到高產(chǎn)率的DNA四面體(2uM)。
[0015]取10ml濃度為2.5*10 4M的檸檬酸鈉溶液放入50 ml圓底燒瓶中，加入28ul高氯酸(30mg/ml)，最后在攪拌下加入0.3ml新配制的硼氫化鈉(0.1M)溶液，即得到粒徑為4nm的納米金溶液。
[0016]將lOOul金納米粒子離心用30K超濾管濾去多余的溶劑，取沉淀用lOOulPBS.Mg2+ (PBS lOmM, MgCl2 5Mm, pH 7.4)溶解，然后加入 2ul TDN(200nM)，靜置過(guò)夜。
[0017]取1 μ 1 1-motif的互補(bǔ)鏈加入上述溶液中，混勻并在PCR中60度反應(yīng)10分鐘并迅速降至37度保持2小時(shí)。
[0018]實(shí)施例2:
將四條單鏈(50 μΜ) 1-motif-TDN-1, SH-TDN-2, SH-TDN-3, SH-TDN-4_Cy3 分別取2yL加入到 42yL Tris-MgCl2 (Tris lOmM, MgCl2 50mM, pH8)溶液中并置于 PCR 儀內(nèi)，將溫度迅速升到95°C穩(wěn)定10分鐘再冷卻至4°C穩(wěn)定30分鐘便可得到高產(chǎn)率帶熒光的DNA四面體(2uM)。
[0019]取10ml濃度為2.5*10 4M的檸檬酸鈉溶液放入50 ml圓底燒瓶中，加入28ul高氯酸(30mg/ml)，最后在攪拌下加入0.3ml新配制的硼氫化鈉(0.1M)溶液，即得到粒徑為4nm的納米金溶液。
[0020]將200ul金納米粒子離心用30K超濾管濾去多余的溶劑，取沉淀用lOOulPBS.Mg2+ (PBS lOmM, MgCl2 5Mm, pH 7.4)溶解，然后加入 2ul TDN(200nM)，靜置過(guò)夜。
[0021]取1 μ 1 1-motif的互補(bǔ)鏈加入上述溶液中，混勻并在PCR中60度反應(yīng)10分鐘并迅速降至37度保持2小時(shí)。
[0022]實(shí)施例3:
將四條單鏈(50 yM)1-motif-TDN-l, SH-TDN-2, SH-TDN-3, SH-TDN-4 分別取 2 μ L 加入至lj42yL Tris-MgCl2 (Tris lOmM, MgCl2 50mM, pH8)溶液中并置于 PCR 儀內(nèi)，將溫度迅速升到95°C穩(wěn)定10分鐘再冷卻至4°C穩(wěn)定30分鐘便可得到高產(chǎn)率的DNA四面體(2uM)。
[0023]取10ml濃度為2.5*10 4M的檸檬酸鈉溶液放入50 ml圓底燒瓶中，加入28ul高氯酸(30mg/ml)，最后在攪拌下加入0.3ml新配制的硼氫化鈉(0.1M)溶液，即得到粒徑為4nm的納米金溶液。
[0024]將200ul金納米粒子離心用30K超濾管濾去多余的溶劑，取沉淀用lOOulPBS.Mg2+ (PBS lOmM, MgCl2 5Mm, pH 7.4)溶解，然后加入 2ul TDN(200nM)，靜置過(guò)夜。
[0025]取1 μ 1 1-motif的互補(bǔ)鏈加入上述溶液中，混勻并在PCR中60度反應(yīng)10分鐘并以0.1°C /lOmin的速率降至37度保持2小時(shí)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種針對(duì)腫瘤治療的DNA超晶格納米載藥分子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)DNA四面體(TDN)結(jié)構(gòu)的制備: 將四條單鏈(50μΜ)分別取 2yL加入到 42yL Tris-MgCl2 (Tris 10mM, MgCl2 50mM,pH8)溶液中并置于PCR儀內(nèi)，將溫度迅速升到95°C穩(wěn)定10分鐘再冷卻至4°C穩(wěn)定30分鐘便可得到高產(chǎn)率的DNA四面體(2uM)； (2)粒徑為4nm的納米金粒子的制備: 取10ml濃度為2.5*10 4M的檸檬酸鈉溶液放入50 ml圓底燒瓶中，加入28ul高氯酸(30mg/ml )，最后在攪拌下加入0.3ml新配制的硼氫化鈉(0.1M)溶液，即得到粒徑為4nm的納米金溶液； (3)DNA四面體(TDN)與金納米粒子的結(jié)合: 取將400ul金納米粒子離心用30K超濾管濾去多余的溶劑，取沉淀用lOOul PBS(10mMpH7.4)溶解，然后加入2ul TDN(2uM)，靜置過(guò)夜； (4)DNA超晶格結(jié)構(gòu)的合成: 取1 μ L 1-motif的互補(bǔ)鏈加入上述溶液中，混勻并在PCR中60度反應(yīng)10分鐘并迅速降至37度保持2小時(shí)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種針對(duì)腫瘤治療的DNA超晶格納米載藥分子的制備方法，其特征在于，通過(guò)改變DNA四面體與金納米粒子的摩爾比，改變超晶格結(jié)構(gòu)的大小程度。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種針對(duì)腫瘤治療的DNA超晶格納米載藥分子的制備方法，其特征在于，最終退火溫度選擇迅速降溫，或選擇逐步緩慢降溫。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種針對(duì)腫瘤治療的新型DNA網(wǎng)狀納米載藥分子的構(gòu)建方法，通過(guò)DNA四面體與納米金的復(fù)合形成一種納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包括DNA四面體（TDN）結(jié)構(gòu)的制備、粒徑為4nm的納米金粒子的制備、DNA四面體（TDN）與金納米粒子的結(jié)合。本發(fā)明中的DNA四面體大小和開關(guān)精確可控且性質(zhì)極其穩(wěn)定。本發(fā)明創(chuàng)造性地使用DNA與金納米粒子將DNA四面體連接起來(lái)，形成了一個(gè)大型的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。本發(fā)明主要以DNA為原料，對(duì)人體無(wú)害。因而本發(fā)明將有望在腫瘤的研究與治療領(lǐng)域有極大的應(yīng)用。
【IPC分類】A61K47/02, A61P35/00, A61K47/26
【公開號(hào)】CN105381464
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510802843
【發(fā)明人】何丹農(nóng), 王萍, 劉婷, 夏智偉
【申請(qǐng)人】上海納米技術(shù)及應(yīng)用國(guó)家工程研究中心有限公司
【公開日】2016年3月9日
【申請(qǐng)日】2015年11月19日