用于綴合疫苗的經(jīng)過修飾的多糖的制作方法
【專利說明】用于綴合疫苗的經(jīng)過修飾的多糖 本申請是申請?zhí)枮?00880025103. 6的分案申請。 1.發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及制備免疫原性糖綴合物（特別是用于在受試者中誘導(dǎo)治療性免疫應(yīng)答的 藥物組合物中使用的免疫原性糖綴合物）的方法。本發(fā)明的免疫原性糖綴合物包含一種或 多種低聚糖或多糖，該低聚糖或多糖通過活性醛基綴合于一種或多種載體蛋白質(zhì)。因此， 本發(fā)明提供了制備以下物質(zhì)的方法：（i)不飽和的微生物的N-?；苌锏途厶腔蚨嗵?； (ii)不飽和的N-?；苌锏男路f的綴合物；以及（iii)糖綴合物組合物，其包含用作一 種或多種蛋白質(zhì)的共價(jià)連接體的微生物的不飽和N-酰基衍生物的片段的綴合物分子。本 發(fā)明另外包括所述免疫原性糖綴合物藥物組合物用于預(yù)防或治療感染性疾病的用途。 2.發(fā)明背景 在全世界，由革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌引起的微生物感染引起嚴(yán)重的發(fā)病 率，所述革蘭氏陽性菌例如鏈球菌（Streptococcus)、葡萄球菌（Staphylococcus)、腸 球菌（Enterococcus)、芽抱桿菌（Baci Ilus)、棒狀桿菌（Corynebacterium)、李斯特菌 (Listeria)、丹毒絲菌（Erysipelothrix)和梭狀芽孢桿菌（Clostridium)，所述革蘭氏陰 性菌例如嗜血桿菌（Haemophilus)、志賀氏菌（Shigella)、霍亂弧菌（Vibrio cholerae)、 奈瑟氏球菌（Neisseria)和某些類型的大腸桿菌（Escherichia coli)。例如，鏈球菌是革 蘭氏陽性菌的一個(gè)大的和變化的屬，該屬基于鏈球菌的細(xì)胞壁多糖的抗原性和結(jié)構(gòu)而被分 成幾群（Lancefield，R. C. 1933，A serological differentiation of human and other groups of hemolytic streptococci. J. Exp. Med. 57 :571-595 ；Lancefield, R. C. 1938, A micro-precipitin technique for classifying hemolytic streptococci and improved methods for producing antigen. Proc. Soc. Exp. Biol, and Med. 38 :473-478 ;其各自被全 文并入本文作為參考）。 例如，B群鏈球菌基于莢膜多糖被分類為若干不同的類型，例如Ia、Ib、II、III、IV、V、 VI、VII和VIII型，它們負(fù)責(zé)產(chǎn)生大部分的致病性。與使用許多其它人細(xì)菌性病原體的發(fā) 現(xiàn)相似，在用于疫苗時(shí)，B群鏈球菌的莢膜多糖可以提供有效的針對這些細(xì)菌感染的保護(hù) (參見，Wessels 等人，1"0.1 mmunogenicity in animals of a polysaccharide-protein conjugate vaccine against type III group B Streptococcus. J. Clin.Invest.86 ： 1428-1433 ;Wessels 等人 1993，Stimulation of protective antibodies against type Ia and Ib group B streptococci by a type Ia polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. Infect. Immun. 61 :4760-4766 ;其各自被全文并入本文作為參考）。 革蘭氏陰性菌也是發(fā)病率和死亡率的重要原因。在針對b型流感嗜血桿菌 (Haemophilus influenzae)細(xì)菌（Hib)的多糖-蛋白質(zhì)疫苗的新近開發(fā)和使用之前，Hib 細(xì)菌感染導(dǎo)致嬰兒精神發(fā)育遲緩的許多病例。 嬰兒和幼年兒童典型地具有差的對多糖抗原的免疫原性應(yīng)答。這些應(yīng)答的特征是不依 賴T細(xì)胞，并且因此不涉及例如記憶、同種型轉(zhuǎn)換或親和力成熟的重要屬性，所述重要屬性 是賦予針對隨后感染的長期免疫學(xué)防護(hù)所必需的。為了解決在嬰兒和幼年兒童對多糖的有 效免疫原性應(yīng)答的缺乏，本領(lǐng)域中已經(jīng)努力開發(fā)用于通過將多糖細(xì)菌抗原共價(jià)偶聯(lián)于載體 蛋白以形成綴合物分子而將不依賴T細(xì)胞的應(yīng)答轉(zhuǎn)換為T細(xì)胞依賴性應(yīng)答的方法。參見， Jennings等人美國專利第4, 356, 170號，其全文并入本文作為參考。 佐劑是加強(qiáng)對抗原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)，因此已經(jīng)在許多疫苗和疫苗候選物中有所應(yīng) 用。佐劑的免疫刺激作用不是抗原特異性的，因?yàn)樗鼈兗訌?qiáng)針對許多不同類型抗原的免疫 應(yīng)答。目前被FDA批準(zhǔn)人用的唯一的佐劑是鋁鹽，但是用于動物接種和在較新的疫苗候選 物中使用的許多佐劑在來源上是微生物的（White，R.G.，1976, The adjuvant effect of microbial products on the immune response. Ann. Rev. Microbiol. 30 :579-595,被全文 并入本文作為參考）。這種佐劑包括弗氏佐劑、小棒狀桿菌、胞壁酰二肽、破傷風(fēng)類毒素等。 多糖對載體蛋白的綴合可以有效地使多糖更具免疫原性。本領(lǐng)域中已知的載體蛋白 質(zhì)包括破傷風(fēng)毒素/類毒素、CRM197、得自革蘭氏陰性菌的外膜蛋白質(zhì)（例如，高分子量蛋白 質(zhì)）、得自不可分類的流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae)的P6和P4、得自粘膜炎莫 拉氏菌（Moraxella catarrhalis)的⑶和USPA、白喉毒素/類毒素、去毒的綠膿假單胞菌 毒素 （Pseudomonas aeruginosa toxin)A、霍亂菌毒素/類毒素、百日咳毒素/類毒素、產(chǎn)氣 莢膜梭菌（Clostridium perfringens)外毒素/類毒素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心 抗原、輪狀病毒VP 7蛋白質(zhì)或呼吸道合胞病毒F和G蛋白質(zhì)。 由于作為載體的這種能力，破傷風(fēng)類毒素已經(jīng)使用了數(shù)十年，并且已經(jīng)確定了其安全 性特征。 針對多種細(xì)菌感染的莢膜多糖（CP)綴合物疫苗目前處于開發(fā)和臨床評價(jià)階段。在單 獨(dú)的注射劑中包含被組合的多種CP血清型目前正在研究之中。然而，將CP綴合物疫苗組 合在單獨(dú)的多價(jià)注射劑中可以導(dǎo)致不同組分之間的競爭并且不利地影響任何單獨(dú)綴合物 的免疫原性（Fattom等人，1999, Vaccine 17 :126-33,被全文并入本文作為參考）。 本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了多種用于將莢膜多糖綴合于蛋白質(zhì)的方法。多糖對載體蛋 白的綴合可以有效地使多糖更具免疫原性（Robbins，J. B.和R. Schneerson. 1990， Polysaccharide-protein conjugates ：A new generation of vaccines.J.Infect. Dis. 161 :821-832;被全文并入本文作為參考）。另一個(gè)綜述參見Contributions to Microbiology and Immunology, vol 10， Conjugate Vaccines, volume editions J.M. Cruse和R.E. Lewis，Jr.，1989(被全文并入本文作為參考）。在一個(gè)方法中，多糖 經(jīng)過弱酸水解，產(chǎn)生能夠與蛋白反應(yīng)以形成共價(jià)鍵的還原性端基（Anderson，P.A.，1983， Infect. Immun.，39 :233-238 ;被全文并入本文作為參考）。然而，參與綴合于蛋白質(zhì)的末端 糖基團(tuán)在半縮醛和醛之間存在有平衡，因此對蛋白質(zhì)的偶聯(lián)效率低。為了克服末端還原糖 的差反應(yīng)性，本領(lǐng)域中轉(zhuǎn)向輕度氧化以便在用于綴合于蛋白質(zhì)的多糖的末端位置引入穩(wěn)定 的醛基（參見，Jennings等人，美國專利第4, 356, 170號，同上）。 其它可用的方法，例如一些多糖的通過IO4氧化進(jìn)行活化，僅能產(chǎn)生每個(gè)多糖分子的 一個(gè)活性部位并且隨后對載體蛋白的偶聯(lián)產(chǎn)生單一末端的糖綴合物疫苗。這種方案出現(xiàn)在 例如用于C型、B型腦膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis)的糖綴合物疫苗和用于鏈 球菌A群的糖綴合物疫苗中。然而，每分子的單一活性部位限制了免疫原性增強(qiáng)的程度。 3.
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明提供具有多個(gè)活性部位的多糖，其允許通過綴合于適當(dāng)?shù)妮d體蛋白而生成免疫 原性交聯(lián)的糖綴合物疫苗。此外，所述方法還適用于任何包含氨基糖的多糖，這是優(yōu)于現(xiàn)有 的IO4氧化方法的明顯的優(yōu)點(diǎn)，所述IO 4氧化方法需要在糖鏈中具有兩個(gè)相鄰的（即鄰位 的）游離羥基（-OH)基團(tuán)。 本發(fā)明涉及制備免疫原性糖綴合物（特別是用于在受試者中誘導(dǎo)治療性免疫應(yīng)答的 藥物組合物中使用的免疫原性糖綴合物）的方法。本發(fā)明的免疫原性糖綴合物包含一種或 多種低聚糖或多糖，該低聚糖或多糖通過活性醛基綴合于一種或多種載體蛋白質(zhì)。與本領(lǐng) 域中已知的先前的綴合方法不同，本發(fā)明提供適用于任何包含至少一個(gè)氨基糖的多糖的方 法，該方法還產(chǎn)生保持抗原性的充分界定的可溶性綴合物。 本發(fā)明提供制備免疫原性糖綴合物的方法，其包括以下步驟：使包含一個(gè)或多個(gè)氨基 糖的低聚糖或多糖中的至少一個(gè)N-乙?；撘阴；?，形成具有至少一個(gè)，優(yōu)選多個(gè)氨基 糖的低聚糖或多糖，所述氨基糖包含伯氨基；用包括至少4個(gè)碳長度的不飽和烴基部分的 N-?；糠秩〈霾被械闹辽僖粋€(gè)，從而產(chǎn)生在一個(gè)或多個(gè)烴基部分的不飽和位置 處包括至少一個(gè)，優(yōu)選多個(gè)活性部位的低聚糖或多糖；使所述化合物與氧化劑接觸，在低聚 糖或多糖的一個(gè)或多個(gè)不飽和位置上產(chǎn)生活性醛（-CH0)基團(tuán)；以及使所述化合物與載體 蛋白綴合，從而產(chǎn)生免疫原性糖綴合物。 在可供選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備免疫原性糖綴合物的方法，其包括以下步 驟：用包括至少4個(gè)碳長度的不飽和烴基部分的N-?；糠秩〈途厶腔蚨嗵侵械闹辽僖?個(gè)N-乙酰基，從而產(chǎn)生在一個(gè)或多個(gè)烴基部分的不飽和位置處包括至少一個(gè)，優(yōu)選多個(gè)活 性部位的低聚糖或多糖；使所述化合物與氧化劑接觸，在低聚糖或多糖上的烴基部分的一 個(gè)或多個(gè)不飽和位置產(chǎn)生活性醛（-CH0)基團(tuán)；以及使所述化合物與載體蛋白綴合，從而產(chǎn) 生免疫原性糖綴合物。 根據(jù)本發(fā)明的方法，所述N-酰基部分包括不飽和的烴基部分。在某些實(shí)施方案中，所 述不飽和的烴基部分是C3、C4、C5、C6、C 7、C7、Cs、C9、C1?；駽 ^部分，并且可以在碳主鏈內(nèi)包括 一個(gè)或多個(gè)雙鍵。在某些實(shí)施方案中，所述不飽和的烴基部分僅包括一個(gè)雙鍵，即，一個(gè)不 飽和位置。在其它實(shí)施方案中，N-?；糠质荖-戊烯?；糠帧Ｋ霾伙柡偷腘-?；?分可以包含本文中所述的或本領(lǐng)域中已知的適合于在不飽和位置氧化為活性醛并且隨后 與載體蛋白綴合的任何不飽和的烴基部分，例如，不飽和的?；狒ɡ?，戊烯酸酐）或 不飽和的酰基鹵（例如，戊烯酰氯、丙烯酰氯）。 本發(fā)明的分子的氧化優(yōu)選局限于不飽和N-?；糠值碾p鍵（即，不飽和烴基部分的不 飽和位置）的氧化，因此在本文中定義的或本領(lǐng)域中已知的溫和條件下進(jìn)行，例如，如本領(lǐng) 域中已知的，在pH 4-9. 5的范圍內(nèi)使用高碘酸鹽進(jìn)行氧化。由于溫和的氧化條件，位置太 接近?；牟伙柡臀恢貌荒鼙谎趸?或不能形成活性醛基以允許隨后與載體蛋白綴合。 因此，為了用于本發(fā)明的方法，不飽和的烴基的不飽和位置（即，雙鍵的位置）既不在不飽 和烴基的碳1和碳2之間，也不在碳2和3之間（關(guān)于本領(lǐng)域中接受的和本申請中使用的 烴基的編號，參見例如，圖1)。在某些實(shí)施方案中，所述不飽和的烴基部分僅包括一個(gè)雙鍵。 在其它實(shí)施方案中，不飽和的烴基部分包括在主鏈碳鏈的末端兩個(gè)碳之間的雙鍵。 本發(fā)明另外提供免疫原性糖綴合物，其包含：a)包含一個(gè)或多個(gè)氨基糖的至少一個(gè)低 聚糖或多糖，以及b)與所述低聚糖或多糖綴合的載體蛋白；所述低聚糖或多糖制備如下： i)將所述一個(gè)或多個(gè)氨基糖的N-乙?；撘阴；?；ii)將所得到的氨基糖的伯氨基用 包括至少4個(gè)碳的不飽和烴基的N-酰基取代；以及iii)將所述不飽和烴基氧化，以生成在 主鏈的末端具有活性醛基的至少3個(gè)碳的烴基；根據(jù)本發(fā)明的方法，不飽和烴基的不飽和 (即，雙鍵）的位置既不在主鏈的碳1和碳2之間，也不在主鏈的碳2和碳3之間（關(guān)于碳 的編號，參見例如，圖1)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述不飽和的烴基鏈具有至少5個(gè)碳的長度。 在其它實(shí)施方案中，在氧化之前，烴基鏈的不飽和位置在不飽和烴基鏈的末端兩個(gè)碳之間。 根據(jù)本發(fā)明的方法，載體蛋白通過本領(lǐng)域中已知的和/或本文中所述的任何方法經(jīng)由活性 醛基綴合于至少一個(gè)多糖或低聚糖。 本發(fā)明還提供免疫原性糖綴合物，其包含：a)包含一個(gè)或多個(gè)氨基糖的至少一個(gè)低聚 糖或多糖，所述氨基糖包括一個(gè)或多個(gè)N-乙?；?，其中所述一個(gè)或多個(gè)N-乙?；呀?jīng)被 包括至少3個(gè)碳的烴基并在所述烴基主鏈的末端包括活性醛基的N-?；〈灰约癰)與 所述低聚糖或多糖綴合的載體蛋白。在優(yōu)選實(shí)施方案中，包括活性醛基的烴基鏈具有至少 4個(gè)碳的長度。根據(jù)本發(fā)明的方法，載體蛋白通過本領(lǐng)域中已知的任何方法（例如，還原胺 化）和/或本文中所述的任何方法，經(jīng)由活性醛基，綴合于至少一個(gè)多糖或低聚糖。 根據(jù)本發(fā)明，多糖或低聚糖的一個(gè)或多個(gè)氨基糖上的至少一個(gè)N-乙?；蝗〈?，以形 成如下（式I)的化合物：
其中R1是不飽和的c 3、c4、c5、c6、c7、c s、c9、C1?；騝 n經(jīng)基部分，其中fcmgarj表示多糖 或低聚糖的所述一個(gè)或多個(gè)氨基糖。在某些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基糖是多糖或 低聚糖的重復(fù)單位的組分。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基糖不是多糖或低聚糖 的重復(fù)單位的組分。在特定的實(shí)施方案中，R 1是例如C 3或C 4，使得分別形成N- 丁烯?；?N-戊烯酰基。在其它實(shí)施方案中，R1僅包含一個(gè)雙鍵，即，不飽和位置，所述雙鍵處于烴基 主鏈的末端2個(gè)碳之間。 所述不飽和的N-?；糠钟米魍ㄟ^將不飽和位置氧化為活性醛基并且隨后綴合于所 述蛋白質(zhì)，使低聚糖或多糖與載體蛋白綴合的連接部分。烴基部分的不飽和位置的氧化可 以通過本文中所述的和/或本領(lǐng)域中已知的任何方法進(jìn)行，例如使用高碘酸鹽。因?yàn)檠趸?可以裂解多糖鏈，所以本發(fā)明包括的氧化步驟僅在溫和條件下進(jìn)行，例如，在約4~約9. 5 的pH范圍，在低溫（例如，約4°C~約27°C )進(jìn)行。由于溫和的氧化條件，為了使不飽和位 置被有效地氧化，不飽和烴基部分的雙鍵不能處于不飽和烴基主鏈的碳1和碳2之間或碳 2和碳3之間（關(guān)于碳的編號，參見例如，圖1)。在根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案的非限制性實(shí)例中， 其中R 1是不飽和的C 3部分（形成式1中的N-丁烯酰基），所述N-酰基包括處于烴基主鏈 的碳3和碳4之間的雙鍵。在其它實(shí)施方案中，其中札包括多于3個(gè)碳的鏈，不飽和位置 可以處于大于碳4的位置。 根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)品和方法，在氧化和綴合之后，糖綴合物的蛋白質(zhì)和低聚糖或多糖通 過如下所示的連接共價(jià)連接（式Π 中的框內(nèi)部分）：
其中R2是飽和C 2、C3、C4、C5、C6、C 7、Cs、(：9或C i。經(jīng)基部分，并且其中NH(框內(nèi)）屬于蛋 白質(zhì)的伯冊12基團(tuán)之一，例如，賴氨酰基或精氨?；鶜埢?。式π的fsiigar}表示多糖或低 聚糖的所述一個(gè)或多個(gè)氨基糖。在某些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基糖是多糖或低聚 糖的重復(fù)單位的組分。在其它實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)氨基糖不是多糖或低聚糖的重 復(fù)單位的組分。式II的私衍生