夠下調(diào)Swiprosin-I的表達水平。它們可以是化合物、化學小分子、生物分 子。所述的生物分子可以是核酸水平（包括DNA、RNA)的，也可以是抑制Swiprosin-I表達 的病毒產(chǎn)品。
[0052] 所述的Swiprosin-I抑制劑是指任何可降低Swiprosin-I的活性、降低 Swiprosin-I的穩(wěn)定性、下調(diào)Swiprosin-I的表達、減少Swiprosin-I有效作用時間的物 質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對于下調(diào)Swiprosin-I有用的物質(zhì)。例如，所述的抑制 劑是：核酸抑制物，蛋白抑制劑，核酸酶，核酸結(jié)合分子，只要其能夠下調(diào)Swiprosin-I的表 達。
[0053] 實施例ISwiprosin-I過表達小鼠血腦屏障通透性增加
[0054] 一、Swiprosin-I過表達小鼠制備
[0055] 1 材料
[0056] 質(zhì)粒pcDNA-CAG(序列如SEQ ID NO. 7所示）由南方模式生物研究中心提供，DH5a 購自天根生物公司，EFDH2 cDNA購于Source Bioscience;各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接 酶、T4 DNA polymerase、Taq酶及PCR相關(guān)試劑購自Takara及NEB公司；膠回收Kit購自天 根生物公司，質(zhì)粒抽提Kit購于Qiagen公司；抗羊源Swiprosin-I多克隆抗體購自Imgenex 公司。
[0057] 轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒構(gòu)建用引物及轉(zhuǎn)基因陽性鼠鑒定用引物的序列如下：
[0058]
[0059] 2 方法
[0060] 2. 1轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的構(gòu)建
[0061] 以 EFDH2-CDNA 為模板，PCR 擴增 EFHD2(1115bp)。PCR 體系為：模板 DNA : ltil,5XPrime STAR buffer ：4 y I, dNTP ：I y I, Primer mix ：2 y I, Prime STAR HS DNA Polymerase :0? 2 y 1，ddH20 :11. 8 y 1。反應(yīng)程序為：95 °C 3min，98 °C 15sec， 55。(：-68。(：1586(3,72。(：11111113〇86(3,721€5111111，35個循環(huán)。用83111111和出11(1111酶切EFHD2片段及pcDNA-CAG，并連接（連入pcDNA-CAG載體的EFHD2片段的序列如SEQ ID NO. 8 所示）。通過酶切及測序驗證最終載體。
[0062] 2. 2轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
[0063] 以Sail酶切轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒，回收5. 5kb的DNA片段用于顯微注射。取5-6周齡 C57BL/6J雌鼠超排后與性成熟的C57BL/6J雄鼠交配，挑選見栓鼠取受精卵，培養(yǎng)在M16培 養(yǎng)液中。純化后的質(zhì)粒DNA溶解在TE緩沖液中，濃度為5ng/ y 1，以M2為體外操作液，將 DNA注射到受精卵的雄原核中，注射后的受精卵移植到0. 5天假孕鼠的輸卵管，每只假孕鼠 輸卵管單側(cè)移卵約25枚。
[0064] 2.3小鼠基因組的制備
[0065] 移植后的假孕鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，待仔鼠出生10天左右剪取鼠尾0. 3cm，加 450 y 1裂解液及50 y 1蛋白酶K(10mg/ml)，56°C消化過夜。離心取上清，無水乙醇沉淀， 70%乙醇洗滌，稍晾干后溶解于200 y 1純水中。
[0066] 2. 4 PCR鑒定轉(zhuǎn)基因陽性鼠
[0067] Swiprosin-1上設(shè)計引物efdhul和efdhll，反應(yīng)條件為：95 °C 3min變性后， 95°C 30s，60°C 30s，72°C Imin進行35個循環(huán)后，72°C 5min，陽性小鼠應(yīng)擴增出I. Ikb片段 (TakaRa LA Taq with GC Buffer RR02AG)〇
[0068] Western blot檢測陽性小鼠大腦中蛋白水平。
[0069] 3 結(jié)果
[0070] 3. I pcDNA-CAG-EFHD2轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)基因片段的制備
[0071] EFHD2基因克隆到pcDNA-CAG載體中，經(jīng)酶切和序列分析證實，各組成元件正確， 且閱讀框正確。轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖1 ;質(zhì)粒線性化后及電泳分離結(jié)果見圖2。
[0072] 3. 2 Swiprosin-I過表達小鼠的鑒定
[0073] PCR鑒定和Western blot檢測結(jié)果見圖3。結(jié)果表明成功獲得轉(zhuǎn)基因陽性鼠，轉(zhuǎn) 基因陽性鼠大腦中Swiprosin-I蛋白水平顯著升高，為對照組的2. 88倍。
[0074] 二、Swiprosin-I過表達小鼠血腦屏障通透性檢測
[0075] 1 材料
[0076] 水合氯醛購于國藥集團化學試劑有限公司，伊文思藍、三氯乙酸購于生工生物。
[0077] 2 方法
[0078] 伊文思藍的相對分子量為960. 82g/mol，它可以與血漿白蛋白高效的以非共價的 方式結(jié)合。在可見光下呈現(xiàn)藍色，633nm處呈現(xiàn)紅色熒光。生理狀態(tài)下，伊文思藍進入血液 后與血漿白蛋白結(jié)合，無法透過血腦屏障；在血腦屏障通透性增加時，伊文思藍可以透過血 腦屏障，進入腦實質(zhì)中，對其進行定量檢測可以作為評價血腦屏障功能破壞程度的依據(jù)。
[0079] 2. 1 取材
[0080] Swiprosin-I過表達小鼠與對照小鼠尾靜脈注射2 % (wt/vol)伊文思藍溶液 0. lml/10g。2h后，小鼠腹腔注射3. 5% (wt/vol)水合氯醛全身麻醉（350mg/kg)。小鼠腹 側(cè)向上固定于鼠板，自胸骨劍突處腹部皮膚剪開，沿胸腔兩側(cè)向上，打開胸腔，可避免造成 大量出血。暴露心臟，用注射器尖端扎入左心室處，剪開右心房。打開蠕動栗，心臟灌流生 理鹽水，控制流速為l〇ml/min，灌流時間統(tǒng)一為5min，至心臟流出無色澄明液體。
[0081] 2. 2 檢測
[0082] 2. 2. 1熒光定量檢測
[0083] Swiprosin-I過表達小鼠心臟灌流后，取腦，將小腦與腦干去除，保留大腦。將大腦 半球表面用生理鹽水清洗，吸干表面液體。每個大腦半球分別稱重，記錄。將大腦移入2ml 離心管中，向其中吸入50% (wt/vol)三氯乙酸溶液lml，用勻漿器勻漿。勻漿液體離心， 16,000gX20min。上清液吸出，沉淀棄去。收集上清液，在多功能酶標儀（TECAN Infinite M200 PRO)定量分析，激發(fā)波長為620nm，吸收波長為680nm處檢測熒光。
[0084] 2.2.2熒光圖片檢測
[0085] Swiprosin-I過表達小鼠心臟灌流生理鹽水后，心臟灌流4%多聚甲醛溶液，流速 為10ml/min，至小鼠四肢抽動，尾巴甩動后，將流速調(diào)整為5ml/min。繼續(xù)灌注5min。將小鼠 腦小心取出，避免損傷大腦表面。將腦組織表面清洗干凈，放置于15%蔗糖溶液中4°C過夜 脫水，至樣本沉底后，換入30%蔗糖溶液中，4°C脫水，至標本完全沉底，預(yù)計時間為24h~ 48h左右。將樣本冰凍切片，厚度為16 ym。于熒光顯微鏡下觀察，正常情況下腦組織中無 伊文思藍紅色熒光出現(xiàn)，或僅局限分布于血管內(nèi)；當血腦屏障破壞時，在血管周圍會出現(xiàn)紅 色浸潤區(qū)域。
[0086] 3 結(jié)果
[0087] 結(jié)果見圖4、圖5、圖6。表明Swiprosin-I過表達小鼠相比于野生型小鼠大腦中伊 文思藍滲出增加。
[0088] 三、免疫組織熒光檢測緊密連接蛋白claudin-5、occludin、ZO-I表達改變與形態(tài) 分布
[0089] 1 材料
[0090] 多聚甲醛購于生工生物工程（上海）股份有限公司，蔗糖購于國藥集團化學試劑 有限公司，抗鼠源P-actin單克隆抗體、抗鼠源GAPDH單克隆抗體、DAPI染液購于碧云天 生物技術(shù)研究所，抗兔源claudin-5多克隆抗體購于Millipore公司，抗兔源occludin多 克隆抗體、抗兔源ZO-I多克隆抗體購于Invitrogen公司。
[0091] 2 方法
[0092] 2. 1免疫組織熒光染色
[0093] 2. I. 1樣品處理及冰凍切片制備