一種適用于兔病毒性出血癥蜂膠滅活疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種適用于兔病毒性出血癥蜂膠滅活疫苗的制備方法，屬于生物制藥領(lǐng)域。
發(fā)明背景
[0002]兔病毒性出血癥又稱兔瘟，是由兔病毒性出血癥病毒引起的一種急性、高度接觸性傳染病，以呼吸系統(tǒng)出血、肝臟壞死、實(shí)質(zhì)臟器水腫、瘀血、出血和高死亡率為特性。本病于1984年首次發(fā)現(xiàn)于我國江蘇省，迅速蔓延至全國，之后世界各地均有發(fā)生。本病常爆發(fā)性流行，發(fā)病率及死亡率極高，給兔業(yè)養(yǎng)殖帶來了巨大危害，是目前規(guī)?；脠龅闹饕獋魅静≈弧Ｍ貌《拘猿鲅Y病毒屬杯狀病毒科。本病毒僅能凝集人的“O”型紅細(xì)胞，而不凝集馬、牛、羊、犬、豬、雞、鴨、兔、大鼠、豚鼠和倉鼠的紅細(xì)胞，這種凝集特性比較穩(wěn)定，在一定范圍內(nèi)不受溫度、PH值、有機(jī)溶劑及某些無機(jī)離子的影響，但可以被RHDV抗血清特異性抑制。該病毒只有一種血清型。該病毒在病兔的所有組織器官、體液、分泌物和排泄物中存在，尤其以肝、脾、腎、肺以及血液中含量最高。目前該病毒尚不能在各種原代或傳代細(xì)胞中繁殖。且該病毒能夠抵抗多種極端環(huán)境，包括低PH、高溫和反復(fù)凍融，使其能夠在自然環(huán)境中保持穩(wěn)定。
[0003]1984年，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)教研組提出了使用組織滅能苗加入氫氧化鋁或弗氏不完全佐劑緊急預(yù)防接種以控制疫情的方法，并收到了較好效果。同年，江蘇農(nóng)學(xué)院利用兔瘟華西系強(qiáng)毒HC-84毒株接種易感兔，取病死兔的肝、脾、腎作為制苗材料，將材料無菌搗碎，用生理鹽水1:10稀釋后過濾，加福爾馬林溶液充分混勻、滅能，制得“兔瘟”疫苗。該疫苗免疫期為6個月。目前最好預(yù)防措施就是采取上述臟器滅活疫苗進(jìn)行免疫。
[0004]蜂膠以其免疫防御、免疫自穩(wěn)、免疫監(jiān)視等方面的優(yōu)勢功能迅速成為當(dāng)前佐劑開發(fā)熱潮中的一支新軍。而其在畜禽用疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用昭示其存在巨大的市場前景。蜂膠含有大量的類黃酮(黃酮、黃酮醇和黃烷酮)、芳香酸、脂族酸及其酯，以及萜烯類物質(zhì)，是一種具有廣譜生物學(xué)活性和免疫增強(qiáng)作用的天然物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、消炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和促進(jìn)組織再生等作用，這些特性使得蜂膠作為佐劑能快速、高效、持久的增強(qiáng)疫苗免疫效果，為疫苗提供綠色、環(huán)保、安全的佐劑功效。由于蜂膠具有良好的防腐抑菌效果，在制備兔病毒性出血癥滅活疫苗的過程中嚴(yán)格各項(xiàng)操作，疫苗中未添加硫柳汞等防腐劑，減少疫苗中外源物質(zhì)的引入，增加疫苗的安全性。蜂膠疫苗的特殊超微結(jié)構(gòu)使得其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，耐熱抗冷，提前中和抗體的產(chǎn)生，延長免疫保護(hù)期等一系列優(yōu)點(diǎn)。張君等人在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用蜂膠佐劑制備的滅活疫苗與用其他佐劑制備的滅活疫苗同時免疫家兔，并進(jìn)行了攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明，加入蜂膠的疫苗家兔全部健活，而后組全部死亡，體現(xiàn)較好的生理作用。
[0005]綜上，本發(fā)明的目的在于分離及培育一種毒力穩(wěn)定的強(qiáng)毒毒株，并加入優(yōu)質(zhì)蜂膠與之混合來制備滅活疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0006]本發(fā)明提供一種兔病毒性出血癥蜂膠滅活疫苗，該疫苗副作用小，免疫效果可達(dá)90%以上，具有較好的免疫安全性。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0008]—種兔病毒性出血癥滅活疫苗，包括抗原和佐劑，所述抗原為兔病毒性出血癥CVCCAV272菌株，所述佐劑為蜂膠乙醇浸出液，配苗時每毫升疫苗中蜂膠干物質(zhì)含量為8-15mg，還包括l-3mg的黃芪多糖。
[0009]根據(jù)本發(fā)明，所述疫苗中不含有硫柳汞。
[0010]—種如上述任一項(xiàng)所述的兔病毒出血癥蜂膠滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟:
[0011]1.兔病毒性出血癥強(qiáng)毒毒株CVCC AV272菌株的選育；
[0012](I)無菌采集免病毒性出血癥病死兔肝臟，置無菌的玻璃研磨器中，邊研磨，邊按質(zhì)量比10%加入無菌生理鹽水制備成勻漿，用5號篩過濾。凍融3次后，加入青鏈霉素各1000IU/mL，3000r/min離心20min，吸取上清液，分裝入無菌小玻璃瓶，低溫冰箱(_20°C )中保存。
[0013](2)將制備的兔肝組織病毒懸液用無菌生理鹽水在96孔“V”型板上連續(xù)倍比稀釋進(jìn)行血凝價的測定，以紅細(xì)胞100%凝集的最高稀釋度作為判定終點(diǎn)
[0014](3)將分尚的兔病毒性出血癥各毒株，用生理鹽水分別稀釋為4個血凝單位的病毒懸液，各病毒分尚株分別與等量的抗兔病毒性出血癥病毒特異性血清充分混勾，37°C作用30min，期間振搖2?3次，同時設(shè)陽性對照組和陰性對照組。中和完畢后，將以上各組各加入一排96孔“V”型板上，每孔25 μ L，然后于每孔中再加入25 μ L人“O”型紅細(xì)胞，充分振蕩后37°C作用30min，觀察結(jié)果。
[0015](4)將各毒株分別作10 \10 2、10 3、10 4、10 5倍稀釋，分別接種50?55日齡健康易感兔5只，頸部皮下注射1.0mL/只，連續(xù)觀察10天，記錄攻毒試驗(yàn)兔發(fā)病及死亡情況。
[0016](5)選取兔病毒性出血癥病毒分離株中毒力較強(qiáng)毒株，制備滅活疫苗進(jìn)行免疫原性鑒定。取50?55日齡健康易感兔10只，頸部皮下注射滅活疫苗1.0mL/只，14天后，連同條件相同的對照兔5只，各頸部皮下注射1: 10稀釋的兔病毒性出血癥病毒分尚株病毒液
1.0mL/只，觀察10天，記錄對照組及免疫組試驗(yàn)兔免疫保護(hù)及發(fā)病死亡情況。
[0017]根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)篩選出HA血凝效價高、兔病毒性出血癥病毒毒力最強(qiáng)及免疫原性好的純凈毒株CVCC AV272菌株，用該毒株制備的滅活組織疫苗。
[0018]2.將選育的毒株CVCC AV272菌株接種易感兔，剖取肝臟組織，加入優(yōu)選的蜂膠乙醇浸出液，按照常規(guī)方法進(jìn)行滅活疫苗的制備，具體步驟如下:按每毫升疫苗中含兔病毒性出血癥病理組織多0.05g，蜂膠干物質(zhì)含量為8?15mg，黃芪多糖l_3mg的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)預(yù)配苗的總量、兔病毒性出血癥病理組織量以及蜂膠乙醇浸出液的濃度，分別計算出所需兔病毒性出血癥病理組織懸液、蜂膠乙醇浸出液及注射用水的量。先將所需量的注射用水置配苗乳化罐中，然后加入所需量的兔病毒性出血癥病理組織懸液低速(2000rpm)攪拌5分鐘，然后緩慢加入蜂膠乙醇浸出液，2000rpm攪拌15?20分鐘，使其充分混合乳化。
[0019]本發(fā)明中的兔病毒性出血癥病毒CVCC AV272菌株是發(fā)明人自全國各地區(qū)養(yǎng)殖場疑似兔病毒性出血癥的病死兔中分離的自然感染毒，從血凝價、特異性、毒力、免疫原性、純凈性方面進(jìn)行鑒定，篩選出的毒力強(qiáng)、免疫原性好、血凝價高的菌株。
[0020]優(yōu)選地，每暈升兔病毒性出血癥滅活疫苗中含有0.05g兔病毒性出血癥肝臟病理組織(HA彡1:256)，蜂膠干物質(zhì)8-15mg，黃芪多糖l_3mg。
[0021]優(yōu)選地，在制造疫苗時，將兔病毒性出血癥病毒CVCC AV272菌株用生理鹽水作10倍稀釋，接種50-55日齡健康易感家兔，每只頸部皮下注射1.0mL/只，無菌采集接種后12-72小時以內(nèi)死亡時間在I小時內(nèi)家兔的具有典型病理變化的肝臟組織，剔除肝臟周圍的結(jié)締組織。
[0022]優(yōu)選地，在無菌采集接種后12-72小時以內(nèi)死亡時間在I小時內(nèi)家兔的具有典型病理變化的肝臟，并剔除肝臟周圍的結(jié)締組織。
[0023]優(yōu)選地，家兔選自50-55日齡的兔病毒出血癥抗體為陰性的兔種。
[0024]優(yōu)選地，將剔除結(jié)締組織的死亡家兔的肝臟組織用滅菌生理鹽水搗碎，研磨、過濾后配成組織懸液，兔病毒性出血癥病理組織與滅菌生理鹽水的比例為1:9 (W/V)，低溫冰箱(-2