、批號 042K01351 Sigma);谷氨酸（批號91K0096 Sigma);小瓶（BV0030,3ml白色管形玻璃小瓶）；塞子 (3101820,13mm V-324432/50Gray Butyl Serum塞子，不含乳膠）；封鉛（CS0001，13mm-條 鋁封）；濾膜 〇· 2 μ m (批號 476291 Nalgene? AC，批號 M2MN00586 ZapCap?:)。編碼 HIV 抗原gpl20的ALVAC病毒VCP307 (批號PX-0246與批號PX-0230)用于下述實(shí)驗(yàn)的示例性 病毒。
[0025] 方法-DH
[0026] 由于冷凍干燥和保存等操作可能改變pH，測定ALVAC冷凍干燥制劑的pH對于衡量 穩(wěn)定性十分重要。pH計(jì)（VWR科技產(chǎn)品SB301，Symphony)用標(biāo)準(zhǔn)pH緩沖液（Orion應(yīng)用溶 液，pH緩沖劑7.00、10.01和4.01)校正，它包括了預(yù)期的pH樣品范圍。將部分新鮮樣品 放入試管中，將電極浸入試管中。當(dāng)數(shù)字顯示器顯出恒定讀數(shù)時(shí)，就記錄讀數(shù)至兩位小數(shù)。
[0027] 摩爾滲誘壓濃度
[0028] 摩爾滲透壓濃度是水溶液的總?cè)苜|(zhì)濃度。滲透壓計(jì)測量的是不考慮分子量或離 子電荷的溶質(zhì)顆粒數(shù)。本項(xiàng)研宄采用依賴于冰點(diǎn)降低以測量摩爾滲透壓濃度的Advanced Micro-Osmometer 3300型微滲透壓計(jì)。滲透壓計(jì)按照生產(chǎn)說明書用50m0sm/kg和850m0sm/ kg標(biāo)準(zhǔn)曲線校正。通過運(yùn)行Clinitrol 290參比溶液來檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。將20 μ 1樣品加到 柱塞中，并插入滲透壓計(jì)樣品口以進(jìn)行測量。當(dāng)數(shù)字顯示器顯示恒定讀數(shù)時(shí)，記錄讀數(shù)。
[0029] 殘留水分
[0030] 殘留水分（RM)是在最初干燥后保留在冷凍干燥產(chǎn)品中結(jié)合水的含量。本項(xiàng)研宄 所使用的用于測試殘留水分的卡爾?費(fèi)歇爾技術(shù)（Karl Fisher Technique)，通過容量滴定 來測定含水量。所測量的是殘留水分占干產(chǎn)品總重量的重量百分比。殘留水分是穩(wěn)定性指 標(biāo)，因?yàn)楸４嫫陂g暴露在濕氣中會使產(chǎn)品不穩(wěn)定。歐洲藥典（第V版）推薦的殘留水分為 3%以下。這樣的殘留水分有助于避免微生物生長并防止化學(xué)降解和物理降解?？?費(fèi)歇 爾庫侖法（Karl Fisher Coulometric Method)與設(shè)計(jì)用來用電流測定法測定終點(diǎn)的CA-06 型自動滴定系統(tǒng)（Mitsubishi公司）聯(lián)用的試驗(yàn)方法一起使用。在相對濕度保持在15%以 下的干燥箱內(nèi)用五氧化二磷進(jìn)行操作，干風(fēng)恒流~5ml/分鐘，溫度范圍20-25°C。用置于干 燥箱內(nèi)的Sartorius天平稱重。
[0031] 感染滴度（CCIDfJ
[0032] CCID5tl是用于測定病毒滴度（感染力）的技術(shù)，在本研宄的情況下，是測定冷凍干 燥ALVAC制劑溶解后的滴度。滴度用感染50 %給定批次接種的細(xì)胞培養(yǎng)物所需要的病毒稀 釋量表示。該測定法依賴于細(xì)胞致死病毒顆粒（能夠引起致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE)的病毒） 的存在和檢出。通常在96孔板中，使宿主細(xì)胞生長至匯合的健康單層培養(yǎng)物，向其中加入 等量的病毒稀釋液。孵育時(shí)，病毒進(jìn)行復(fù)制，釋放出子代病毒體，這些病毒體反過來再感染 健康細(xì)胞。在一段時(shí)間內(nèi)發(fā)生致細(xì)胞病變效應(yīng)，記錄各孔是否存在CPE。隨著每次稀釋孔數(shù) 目的增加，該方法變得更加準(zhǔn)確。本項(xiàng)試驗(yàn)對測定保存期間減毒ALVAC病毒活性的損失是 至關(guān)重要的。
[0033] 按照標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP)編號22 Η)-039 V. 1. 0,在96孔板上連續(xù)滴定ALVAC 病毒冷凍干燥產(chǎn)品的樣品。將QT35(鵪鶉）細(xì)胞懸液加到各96孔板中。在36°C ±1°C下 孵育6天后，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE)的孔。用最小二乘方法計(jì)算產(chǎn)品中病毒的濃 度，用50 %感染量/ml產(chǎn)品的數(shù)值表示。
[0034] 冷凍zP燥操作過程
[0035] 凍干法是一種脫水技術(shù)，其中通過將濕的物質(zhì)冷凍后將所得冰在真空下通過升華 過程（無需熔融）蒸發(fā)，達(dá)到干燥狀態(tài)。這一過程常規(guī)分為三個(gè)階段：預(yù)冷凍、一級干燥或 升華干燥及二級干燥或解吸干燥。基于ALVAC表達(dá)載體的24小時(shí)冷凍干燥操作過程按下 表2概述方法進(jìn)行：
[0036] 表2-冷凍干燥機(jī)操作過程
[0037] 對穩(wěn)定制劑的各種組分，例如氨基酸、糖（蔗糖、山梨糖醇、甘露醇）和聚合物（聚 乙烯吡咯烷酮（PVP))對不同穩(wěn)定制劑的貢獻(xiàn)進(jìn)行了定性和定量評價(jià)。組分和濃度見表 3。然后用以下實(shí)驗(yàn)評價(jià)制劑穩(wěn)定性：外觀、溶解時(shí)間、溶解后外觀、氫離子濃度負(fù)冪指數(shù) (pH)、殘留水分和感染力（CCID50)。
[0038] 每種穩(wěn)定制劑都在層流條件下制備。對于每種制劑，調(diào)節(jié)各制劑的pH至約7. 2和 約7. 4之間。各制劑經(jīng)過0. 2 μπι聚二氟乙烯（PVDF) -次性濾膜過濾、貼標(biāo)簽、指定批號后， 在5 °C保存直到凍干。
[0039] 在冷凍干燥前一天，將病毒ALVAC粗品（溶于IOmM Tris (pH 9. 0)緩沖溶液）在 30°C ±2°C水浴中融化。對粗品進(jìn)行2次稀釋（1/2和1/6)以制備120ml最終的散裝產(chǎn)品 (FBP)。用濃的穩(wěn)定制劑制備第一稀釋液，用穩(wěn)定制劑與注射用水（WFI)按1 : 2稀釋制備 第二稀釋液。
[0040] 準(zhǔn)備進(jìn)行包括許多步驟的冷凍干燥法。首先，用3ml US玻璃小瓶在隔離區(qū)中裝入 0.3ml FBP，每批制劑裝400個(gè)小瓶。第二，將所有小瓶裝到4個(gè)不同層架的托盤中，新配的 冷凍干燥穩(wěn)定制劑P06和P07用作對照。為了防止擠壓，每個(gè)盤都位于每個(gè)層架的中間，并 留有空間以避免層架之間相互接觸。將裝有溫差電偶的小瓶放在冷凍室的前方，以便能夠 監(jiān)測產(chǎn)品的溫度。最后，進(jìn)行適當(dāng)?shù)?4小時(shí)ALVAC凍干操作過程（見材料與方法）。
[0041] 運(yùn)行之后，取出小瓶，蓋上PVC(Poly-Vinyl-Carbon)塞子并用鋁蓋（Alu-Alu cap)加蓋密封。在取出小瓶時(shí)，從托盤邊緣、中部、前后方觀察小瓶凍干塊的均勻性。分析 凍干機(jī)圖表以確保操作過程所進(jìn)行的每個(gè)步驟都沒有遇到問題。然后將小瓶保存于-20°C 以備進(jìn)一步取樣和測定。
[0042] 用實(shí)時(shí)和加速穩(wěn)定性研宄，對制劑對凍干蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的作用進(jìn)行了研宄。每次 實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)間點(diǎn)和不同溫度下（-20°〇、2-8°〇、35-39°〇，第1_6周、第8周、第12周、第 26周和第52周）進(jìn)行，每一批取5個(gè)樣品進(jìn)行分析。記錄每個(gè)樣品的下列特性：凍干物 (Lyophilizate)的外觀、溶解時(shí)間、溶解后的外觀、pH和感染滴度（CCID 5tl)。
[0043] 然后用具有最適特性的制劑進(jìn)一步進(jìn)行穩(wěn)定性研宄。每次實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)間點(diǎn)和不 同溫度下（_20°C、2-8°C、37°C和45°C，分別在第0天、第3天、第7天、第11天、第14天、第 21天、第25天、第28天、第35天、第56天、第84天、第182天和第364天）進(jìn)行，每批取 4-6個(gè)樣品進(jìn)行分析。然后記錄每個(gè)樣品的以下特性：凍干物的外觀、溶解時(shí)間、溶解后的 外觀、pH、殘留水分和感染滴度（CCID5tl)。對于對照、F12 (η = 6)，在第45周時(shí)增加額外的 觀察點(diǎn)。
[0044] 冷凍干燥ALVAC制劑F12的最終穩(wěn)定性研宄（較早前研宄樣品的額外時(shí)間點(diǎn)），在 23-27°C下，用一套小瓶在第1周、第3周、第5周、第8周和第12周進(jìn)行（η = 6)。然后評 價(jià)制劑的感染滴度（CCID5tl)、pH、復(fù)原時(shí)間、外觀和摩爾滲透壓濃度。
[0045] 穩(wěn)宙制劑
[0046] 開發(fā)出幾種新的穩(wěn)定制劑并進(jìn)行了試驗(yàn)。每種制劑所包括的組分見表3。應(yīng)當(dāng)理 解的是，當(dāng)將PVP40加到制劑中時(shí)，要特別注意。攪拌速度在特定時(shí)間內(nèi)應(yīng)當(dāng)增加，然后當(dāng) PVP40溶解時(shí)應(yīng)降低。如果速度不增加的話，通常會出現(xiàn)不需要的聚集體?；旌系臅r(shí)間和速 度取決于所制備的體積，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的一樣。
[0047] 實(shí)駘結(jié)果
[0048] 凍干物的外觀
[0049] 保存于-20°C和5°C 52周后，對不同制劑凍干物的外觀進(jìn)行評價(jià)。第一批實(shí)驗(yàn)中 制劑F9、F10、Fll和F12凍干塊的外觀符合所要求的規(guī)格（光滑，白色藥層，不從小瓶邊緣 皺縮）。這些所需要的"凍干塊"外觀規(guī)格表明，該制劑能夠通過保護(hù)病毒和其周圍環(huán)境避 免塌陷或熔融，從而保持病毒的理化完整性。凍干塊的塌陷可能由過激的凍干過程或保存 條件（例如長期保存或高溫）所致。已經(jīng)確定具有合適凍干塊外觀的制劑提供適于病毒穩(wěn) 定性的環(huán)境。還已經(jīng)確定的是之前所使用的20種必需氨基酸和非必需氨基酸的混合物可 用高濃度的L-精氨酸、L-丙氨酸、絲氨酸和/或甘氨酸替換而又不影響凍干物的結(jié)構(gòu)外觀。
[0050] 其它幾種制劑出現(xiàn)起泡/熔融，從小瓶邊緣皺縮，而且呈不均勻的外觀（即不是光 滑的白色藥層）；就這一點(diǎn)而言，這些因?yàn)椴环贤庥^標(biāo)準(zhǔn)而不予采用。如下所述，這種外 觀與溶解時(shí)間不需要的增加有關(guān)。這些不被采用制劑的每一種都缺少分散劑（即聚乙烯吡 咯烷酮（PVP40)、山梨糖醇），因此表明這些組分對凍干塊結(jié)構(gòu)的重大影響。對于這些出現(xiàn) 松散或從小瓶邊緣皺縮的制劑，凍干塊根據(jù)外觀標(biāo)準(zhǔn)也不予采用。
[0051] 溶解時(shí)間、溶解后的外觀、DH和摩爾滲誘壓濃度
[0052] 在-20°C和5°C下保存52周后，與其它在15秒鐘以內(nèi)溶解的穩(wěn)定制劑（F10-12) 相比，制劑F9的溶解時(shí)間略有增加。每支小瓶用Iml NaCl 0.4%復(fù)原，手工混合直到整個(gè) 凍干塊溶解。結(jié)果表明加入PVP40對最終產(chǎn)品的溶解時(shí)間有著積極作用。對于保存在脅迫 條件（35-37°C )下的那些樣品，所有制劑的溶解時(shí)間都有相當(dāng)?shù)脑黾?，?5秒鐘至超過1 分鐘不等。此外，如果凍干塊外觀出現(xiàn)熔融，則產(chǎn)品粘在小瓶上，使凍干物復(fù)原變得困難。
[0053] 對于所有試驗(yàn)條件下的所有制劑，pH在7. 5±0. 5單位之間時(shí)保持穩(wěn)定。
[0054] 對于制劑F12,摩爾滲透壓濃度范圍為350±100m0sm/kg。
[0055] 殘留水分（RM)
[0056] 制劑F12的殘留水分結(jié)果< 3%，符合歐洲藥典（第V版）的建議。未對其它制劑 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0057] 表4-殘留水分-制劑F12
[0058] 感染滴度
[0059] 活性下降超過約10-20%時(shí)被視為病毒活性顯著下降。所有制劑似乎都在-20°C 和2_8°C保存52周后保持感染滴度不變，同時(shí)未觀察到明顯損失。所有被測制劑與對照相 似，證實(shí)了該方法的精確性（±〇.31og 10CCID5(l/ml)。在脅迫條件下，在35-37°C下保存整 整8周時(shí)，對照和被測制劑的感染滴度均保持不變。
[0060] 液體制劑與冷凍干燥制劑的穩(wěn)宙件
[0061] 根據(jù)上述結(jié)果，選擇F12 (冷凍干燥）與液體制劑（ALVAC的IOmM Tris-HCl溶液、 0. 9% NaC