蛋白包覆鐵基磁性納米顆粒作為磁熱療劑的應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白包覆鐵基磁性納米顆粒作為磁熱療劑的應用，屬于生物納米材料醫(yī)學應用領域。
【背景技術(shù)】
[0002]近些年，磁性納米顆粒由于其獨特的磁學性能而被廣泛應用在生物醫(yī)學各個領域，比如藥物傳送、免疫分析和磁共振成像等。尤其是磁性納米顆粒在磁熱療應用中可以作為一種介質(zhì)通過熱來殺死癌細胞。磁性納米顆粒作為磁熱療介質(zhì)要滿足對癌癥有效治療的同時，其與細胞接觸也伴隨著諸多風險，比如磁性納米顆粒在各種生物醫(yī)學應用中生物相容性和生物安全等問題。
[0003]目前已經(jīng)報道磁性納米顆粒在生物體系中弓丨起毒性主要是由于活性氧(ROS )的產(chǎn)生，它會直接破壞DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)體而導致細胞死亡。各種生物相容性良好的有機聚合物被用來表面修飾磁性納米顆粒，以降低其毒性，如沒有經(jīng)過表面修飾的超順磁鐵氧化物納米顆粒的毒性要比生物相容性良好的聚乙烯醇(PVA)修飾后的納米顆粒大；檸檬酸修飾后的超順磁鐵氧化物納米顆粒能引起鼠內(nèi)巨噬細胞氧化應激而未引起細胞毒性。通常來說，對于一定尺寸的磁性納米顆粒，在用聚合物進行表面修飾以提高其生物相容性和溶膠穩(wěn)定性后，其磁熱性能明顯下降。這可能是由于在用聚合物修飾后，磁性納米顆粒的飽和磁化值相對會下降，同時布朗弛豫對熱的貢獻也會減小，因此導致弱的磁熱性能。如何在保證具有生物相容性和膠體穩(wěn)定性的同時，其磁熱性能不會有所下降。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題和需求，本發(fā)明目的是提供一種蛋白包覆鐵基磁性納米顆粒作為磁熱療劑的應用，該磁熱療劑既具有高的磁熱療性能，能形成穩(wěn)定的磁溶膠，同時也有很好的生物相容性。
[0005]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
蛋白包覆鐵基磁性納米顆粒作為磁熱療劑的應用，所述磁熱療劑以鐵基磁性納米顆粒為核，并在此磁納米顆粒核的表面用蛋白質(zhì)包覆形成穩(wěn)定的磁性水溶膠；所述的鐵基磁性納米顆粒為鐵磁或亞鐵磁納米晶顆粒，具體為Fe、FePt、Fe304、FeCO或MFe2O4，其中M為Mn、Co、Ni或Zn，鐵基磁性納米顆?；驗镚d、Mn、Zn、N1、Co摻雜的鐵基磁性納米顆粒。
[0006]上述的鐵基磁性納米顆粒的粒徑在5-500 nm之間，粒徑分布不大于15%。
[0007]所述的鐵基磁性納米顆粒的表面用類人膠原蛋白進行包覆，鐵基磁性納米顆粒與類人膠原蛋白的質(zhì)量比為1:0.01?1:100。
[0008]上述磁熱療劑負載有抗癌化療劑阿霉素，阿霉素、柔紅霉素、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、洛鉑、博萊霉素，多西他賽、吉西他賓、異長春花堿、羥基喜樹堿。
[0009]本發(fā)明使用蛋白包覆的鐵基納米顆粒作為磁熱療介質(zhì)，該磁熱療介質(zhì)具有好的生物相容性，穩(wěn)定的磁溶膠，同時具有更高的磁熱療性能。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明生物鐵基納米磁熱療劑表面用蛋白所修飾后具有很好的膠體分散穩(wěn)定性、生物相容性，打破了理論以及實驗中鐵基磁性納米顆粒表面被有機聚合物包覆后有效磁質(zhì)量減小而導致差的磁熱療性能的錯誤概念，該生物納米磁熱療劑具有更高的磁熱療性能，可有效地殺死癌細胞，在磁熱療和熱化療聯(lián)用以及抗腫瘤診療一體化方面有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0011]圖1A為實施例1的9 nm Fe3O4納米顆粒透射電鏡示意圖；圖1B為實施例1的Fe3O4納米顆粒尺寸統(tǒng)計圖；
圖2為實施例1的9 nm Fe3O4納米顆粒包覆類人膠原蛋白和未包覆類人膠原蛋白分別在交變磁場下隨時間的溫度變化曲線；
圖3為實施例1的9 nm Fe3O4納米顆粒包覆類人膠原蛋白和未包覆類人膠原蛋白不同濃度Fe、培養(yǎng)不同時間的細胞毒性實驗結(jié)果圖；
圖4A為實施例2的17 nm Fe3O4納米顆粒透射電鏡示意圖；圖4B為實施例2的Fe 304納米顆粒尺寸統(tǒng)計圖；
圖5為實施例2的17 nm Fe3O4納米顆粒包覆類人膠原蛋白和未包覆類人膠原蛋白分別在交變磁場下隨時間的溫度變化曲線；
圖6為實施例2的17 nm Fe3O4納米顆粒包覆類人膠原蛋白和未包覆類人膠原蛋白不同濃度Fe、培養(yǎng)不同時間的細胞毒性實驗結(jié)果圖；
圖7為實施例3的15 nm Fe3O4納米顆粒包覆牛血清蛋白和未包覆牛血清蛋白分別在交變磁場下隨時間的溫度變化曲線；
圖8為實施例3的15 nm Fe3O4納米顆粒包覆牛血清蛋白和未包覆牛血清蛋白不同濃度Fe、培養(yǎng)不同時間的細胞毒性實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0012]以下參照附圖及實施例對發(fā)明做進一步詳細說明。
[0013]實施例1
9 nm Fe3O4的制備:參考文獻 Journal of Materials Chemistry 2012, 22,8235-8244。
[0014]類人膠原蛋白的制備:類人膠原蛋白是一種新型的生物材料，分子量為97 kDa。它是將人體膠原蛋白的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)酶切后的一段基因重組于E.coli (大腸桿菌)內(nèi)，經(jīng)過高密度發(fā)酵、分離、復性、純化工藝生產(chǎn)的一種高分子生物蛋白。該蛋白與從動物提取的膠原蛋白不一樣，類人膠原蛋白有較低的免疫原性，很容易溶解在水溶液中。而且，類人膠原蛋白有很好的生物相容性，可以進一步被用于組織工程。參考中國專利ZLOl106757.8 一種類人膠原蛋白及其生產(chǎn)方法。
[0015]將9 nm Fe3O4磁性納米顆粒分散在正己烷中，得到固體物含量為20 mg/mL的Fe3O4磁性納米顆粒的正己烷溶液，取該溶液2 mL，加入10 mL超純水和30 mg十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，超聲攪拌20 min使形成微乳液，加入0.057 mL NaClO溶液，攪拌反應50min，然后調(diào)節(jié)溶液pH值=12.5，再加入0.285 mL NaClO溶液和0.8 mg RuCl3，繼續(xù)攪拌反應I h，反應結(jié)束后，利用外加磁場將Fe3O4磁性納米顆粒從溶液中分離出來，棄去上清溶液，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒用超純水清洗3次，分散在超純水中，即得到水相分散的Fe 304磁性納米顆粒。
[0016]用去離子水將上述水相磁性微球洗滌三次并磁分離，取10 mg磁性微球分散于ImL PBS (PH = 7.4)緩沖溶液中，接著向溶液中加入2 mg EDC，震蕩均勻。再將磁性微球和I mL含有類人膠原蛋白的PBS (PH = 7.4)緩沖溶液混合，在25° C的搖床中反應2小時，磁性分離去上清，用PBS (PH = 7.4)緩沖溶液洗滌2次。
[0017]圖1A表明本發(fā)明實施例1所得的Fe3O4納米顆粒透射電鏡示意圖。將制備的Fe3O4納米顆粒滴加在300孔的銅網(wǎng)上，自然干燥后，于透射電鏡(加速電壓為200 kV)下觀測粒子的大小和形態(tài)。結(jié)合圖1B的顆粒直徑統(tǒng)計圖，可以看出該Fe3O4納米顆粒尺寸為9 nm左右，大小、形貌均一，尺寸分布窄。
[0018]將實施例1制備的相同鐵濃度的包覆類人膠原蛋白和未包覆類人膠原蛋白的Fe3O4納米粒子分別被置于交變磁場中，設置磁場參數(shù)為:場強H =500 0e, f = 366 kHz,進行體外升溫實驗，結(jié)果見圖2。由圖2可知，在最開始的時候，包覆類人膠原蛋白前和后的升溫速率幾乎是一致的，但是在100秒后，包覆類人膠原蛋白的Fe3O4納米顆粒的升溫速率要比在包覆之前的快。
[0019]磁熱療劑最終會應用到體內(nèi)或臨床，評估其生物相容性是非常重要的。用類人膠原蛋白包覆Fe3O4納米顆粒后去培養(yǎng)成纖維BHK細胞。用CCK-8來檢測其生物毒性。從圖3可以得出，隨著樣品Fe濃度的增加，細胞毒性增加。培養(yǎng)時間為24小時后，在濃度為12.5yg/mL到50 μ g/mL Fe之間，包覆類人膠原蛋白前后的Fe3O4納米顆粒均有很好的生物相容性。但是當濃度為100 μ g/mL Fe的樣品去培養(yǎng)該細胞后，對于包覆類人膠原蛋白之前的樣品，細胞活性約為0.8，但是包覆類人膠原蛋白之后，細胞的毒性仍然很弱，細胞的活性約為I。培養(yǎng)時間為48小時后，對于未包覆類人膠原蛋白的樣品，在濃度為12.5 μ g/mL到100 μ g/mL Fe之間，細胞活性為0.6-0.8之間，而包覆類人膠原蛋白后，其細胞活性均在I左右。因為類人膠原蛋白有很好的生物相容性，因此