白介素-13抗體組合物的制作方法
【專利說明】白介素-13抗體組合物
[0001] 本申請是申請日為2006年09月29日、申請?zhí)枮?00680044973. 9 (國際申請?zhí)枮?PCT/GB2006/003650)、發(fā)明名稱為"白介素-13抗體組合物"的發(fā)明申請的分案申請。
[0002] 本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含白介素-13抗體，更具體的說是白介素-13單 克隆抗體，尤其是人白介素-13單克隆抗體。本發(fā)明還涉及純化所述抗體的方法和使用所 述組合物來治療白介素-13相關(guān)病癥諸如哮喘的用途。
[0003] 白介素（IL) -13是114個(gè)氨基酸的細(xì)胞因子，未修飾時(shí)的分子量是大 約12kDa。IL-13與IL-4最密切相關(guān)，二者在氨基酸水平具有30 %的序列同源 性。人IL-13基因位于染色體5q31，與IL-4基因鄰近[McKenzie, A. N. et al.，J Immunol, 1993. 150(12), 5436-5444 ；Minty, A. et al. , Nature, 1993. 362(6417), 248-50]〇
[0004] 盡管最初將IL-13鑒定為Th2⑶4+淋巴細(xì)胞衍生細(xì)胞因子，Thl⑶4+T細(xì)胞、⑶8+T 淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、及非T細(xì)胞群諸如肥大細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì) 胞和氣道平滑肌細(xì)胞也生成IL-13。
[0005] 已經(jīng)將IL-13與許多疾病聯(lián)系起來，具體有由炎性應(yīng)答引起的疾病。例如， 對未曾接受治療的（na'ive)、未被致敏的（non-sensitised)嚙齒類動(dòng)物的氣道施用 重組IL-13顯示出引起哮喘表型的許多方面，包括氣道炎癥、粘液生成和氣道高應(yīng)答 性（六!11〇['^118-1(&叩，]\1.6七31.，5(^611。6，1998.282(5397)，2258-2261 ;61'111^8,6· et al. , Science, 1998. 282 (5397), 2261-2263 ；Venkayya, R. , et al.,Am J Respir Cell Mol Biol, 2002. 26(2), 202-208 ；Morse, B. et al. , Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2002. 282(1)，L44-49]。在肺中特異性過表達(dá)IL-13的轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到類 似的表型。在該模型中，更長時(shí)間的暴露于IL-13還導(dǎo)致纖維化[Zhu，Z. et al.，J Clin Invest, 1999. 103(6)，779-788]。
[0006] 已經(jīng)將IL-13基因的許多遺傳多態(tài)性與變應(yīng)性疾病聯(lián)系起來。具體而言，已經(jīng)將 IL-13基因第130位精氨酸殘基被谷氨酰胺替代的的變體（Q130R)與支氣管哮喘、特應(yīng)性 皮炎（atopic dermatitis)和血清 IgE 水平升高聯(lián)系起來[Heinzmann，A.et al·，Hum Mol Genet, 2000. 9 (4), 549-559 ；Howard, T. D. et al.,Am J Hum Genet, 2002. 70 (I), 230-236 ； Kauppi, P. et al. , Genomics, 2001. 77 (1-2), 35-42 ；Graves, P. E. et al. , J Allergy Clin Immunol, 2000. 105(3), 506-513]。有些小組還將這種IL-13變體稱為Q110R變體（第110 位精氨酸殘基用谷氨酰胺替代），因?yàn)樗鼈儚陌被嵊?jì)數(shù)中排除了 20個(gè)氨基酸的信號序 列。
[0007] 還已經(jīng)將IL-13生成與變應(yīng)性哮喘聯(lián)系起來[van der Pouw Kraan, T. C. et al.，Genes Immun, 1999. I (1)，61-65]，而且在患有特應(yīng)性鼻炎（atopic rhinitis)(干草熱 (hay fever))、變應(yīng)性皮炎（濕疹）和慢性（鼻）竇炎的人類受試者中測量到升高的IL-13 水平。
[0008] 在哮喘外，已經(jīng)將IL-13與其它纖維變性疾患聯(lián)系起來。已經(jīng)在患有系 統(tǒng)性硬化的患者的血清中和患有其它形式肺纖維化的患者的支氣管-肺泡灌洗 (BAL)樣品中測量到升高的IL-13水平，達(dá)到比IL-4高1000倍[Hasegawa，M. et al. , J Rheumatol, 1997. 24(2), 328-332 ；Hancock, A. et al. , Am J Respir Cell Mol Biol, 1998. 18(1)，60-65]。
[0009] 已經(jīng)證明了 IL-13在小鼠肺中的過表達(dá)引起肺氣腫、粘液生成增加和炎癥， 這些癥狀反映了人慢性阻塞性肺?。–OPD)的各個(gè)方面[Zheng，T. et al.，J Clin Invest, 2000. 106(9)，1081-1093]。
[0010] 有人提出IL-13可能在炎性腸病的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮作用[Heller，F(xiàn). et al. , Immunity, 2002. 17 (5), 629-38],而且在有些何杰金氏病（Hodgkin' s disease) 患者的血清中檢測到與正常對照相比升高的IL-13水平[Fiumara，P. et al.，Blo od, 2001. 98(9), 2877-2878] 〇
[0011] 還認(rèn)為IL-13抑制劑在治療上可用于預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[Terabe，M. et al.，Nat Immunol, 2000.1 (6)，515-520]。在動(dòng)物模型中對IL-13的抑制還顯示出增強(qiáng)抗病毒疫苗， 而且對于HIV和其它感染性疾病的治療可能是有益的[Ahlers，J.D.et al.，Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99 (20) ,13020-13025]。
[0012] 致力于IL-13抑制的抗體法已有記載。例如，WO 2005/007699 (Cambridge Antibody Technology Limited)記載了一系列顯示出中和IL-13活性的人抗IL-13抗體分 子，而且宣稱它們可在治療IL-13相關(guān)病癥方面可能有用。
[0013] 依照本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種藥用組合物，其包含IL-13抗體及一種或 多種制藥學(xué)可接受賦形劑，并用乙酸鹽緩沖劑緩沖至pH 4. 5-6. 0。
[0014] 普遍知道抗體純化規(guī)程通常需要多種分離技術(shù)，諸如層析分離（例如蛋白A層析、 離子交換層析、諸如此類）。這種分離方式的后果是需要使用多種不同緩沖液。例如，WO 2004/076485中所記載的抗體純化規(guī)程需要50mM甘氨酸/甘氨酸鹽pH8. 0用于蛋白A層 析、50mM Tris-HCl ρΗ8·0 和 20mM 磷酸鈉 ρΗ6·5 用于 Q-S印harose 層析、及 25mM Tris-HCl ρΗ8· 6 用于 DEAE-sepharose 層析。
[0015] 相反，本發(fā)明只需要使用一種以固定濃度和預(yù)定pH存在于本發(fā)明組合物中的乙 酸鹽緩沖劑，其優(yōu)點(diǎn)在于這種緩沖劑存在于所有IL-13抗體純化步驟中。如此，這種緩沖劑 不僅用于純化過程開始時(shí)，而且用于整個(gè)純化過程，因此縮短了操作時(shí)間、降低了成本并提 高了產(chǎn)量。
[0016] 應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，"抗體"的術(shù)語包括免疫球蛋白，無論是天然的或者是部分或完全合成 的。該術(shù)語還覆蓋任何包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽或蛋白質(zhì)。
[0017] 包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體片段有諸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd和雙抗體等分子。
[0018] 有可能采用單克隆抗體和其它抗體，并且采用重組DNA技術(shù)來生成保留最初抗體 特異性的其它抗體或嵌合分子。這樣的技術(shù)可涉及將編碼免疫球蛋白可變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)的DNA導(dǎo)入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)。參見例如EP-A-184187; GB2188638A或EP-A-239400 ;及大量后續(xù)文獻(xiàn)。
[0019] 或者，可以生成攜帶⑶R衍生序列的新VH或VL區(qū)，即通過一種或多種選 定VH和/或VL基因的隨機(jī)誘變而在整個(gè)可變域中生成突變。Gram et al. ,PNAS USA, 1992. 89, 3576-3580記載了這樣一種技術(shù)，他們采用錯(cuò)誤傾向PCR。可使用的另一種方 法是針對 VH 和 VL 基因 CDR 區(qū)的誘變。Barbas et al·，PNAS USA 1994. 91，3809-3813 和 Schier et al.，J. Mol. Biol. 1996. 263, 551-567 披露這樣的技術(shù)。
[0020] 因?yàn)榭梢砸远喾N方法修飾抗體，術(shù)語"抗體"應(yīng)解釋為覆蓋任何包含具有所需特異 性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特定結(jié)合成員或物質(zhì)。如此，該術(shù)語覆蓋抗體片段和衍生物，包括任 何包含免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，無論是天然的或者是完全或部分合成的。因此還包 括包含免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或等同物且其與另一多肽相融合的嵌合分子。P-A-0120694 和EP-A-0125023及大量后續(xù)文獻(xiàn)中披露了嵌合抗體的克隆和表達(dá)。
[0021] 抗體工程領(lǐng)域可利用的其它技術(shù)使之有可能分離人抗體和人源化抗體。例如，可 以如Kontermann et al. , [2001 ；Antibody Engineering, Springer Laboratory Manuals] 所述來生成人雜交瘤。許多出版物，諸如Kontermann et al.(supra)and W092/01047 中詳細(xì)記載了為生成特定結(jié)合成員而建立的另一種技術(shù)，噬菌體展示。小鼠抗體基因 遭到滅活并用人抗體基因功能性替換同時(shí)小鼠免疫系統(tǒng)的其它成分保持完整的轉(zhuǎn)基因 小鼠可用于分離針對人抗原的人抗體。核糖體展示，一種將突變導(dǎo)入已知基因序列的 無細(xì)胞翻譯技術(shù)也可用于生成和/或優(yōu)化特定結(jié)合成員[Hanes and PlUckthun PNAS USA, 1994. 94, 4937-4942 ；He and Taussig Nucleic Acids Res. 1997. 25, 5132-5134 ； Schaffitzel et al. , J. Tmmunol. Methods, 1999. 231, 119-135 ；He et al.,J.Tmmunol. Methods, 1999. 231，105-117 ;He et al.，Methods Mol. Biol. 2004. 248, 177-189]。
[0022] 通過合成寡核苷酸并在合適的表達(dá)載體中進(jìn)行裝配，再用所得基因進(jìn)行表達(dá)，可 以制備合成的抗體分子，參見例如 Knappik et al.，J. Mol. Biol. 2000. 296, 57-86 ;Krebs et al. , Journal of Immunological Methods 2001. 254, 67-84。
[0023] 已經(jīng)顯示了完整抗體的片段可發(fā)揮結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的例子 有⑴由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；（ii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組 成的Fd片段；（iii)由單一抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；（iv)由VH 或 VL 結(jié)構(gòu)域組成的 dAb 片段[Ward, E. S. et al. , Nature, 1989. 341, 544-546 ; McCafferty et al. , Nature, 1990. 348, 5