快速有效治療缺鐵性貧血的鐵基納米復(fù)合物新配方的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 鐵是重要細(xì)胞活動(dòng)過程所必需蛋白質(zhì)的一種組分。含鐵蛋白質(zhì)在氧傳輸、ATP生 產(chǎn)、DNA合成以及其他生理過程中都具有重要作用[1-3]。富含生物可利用鐵的食物（如紅 肉）的低消耗或出血是缺鐵性貧血的主要原因。缺鐵性貧血的癥狀包括呼吸困難、頭痛、頭 暈、氣短、乏力、健忘、易倦，食欲減退，體重下降，并且注意力無法集中。出現(xiàn)這些癥狀的原 因是，紅細(xì)胞氧氣運(yùn)載能力下降。因此貧血與生活健康質(zhì)量的下降密切相關(guān)，其治療對(duì)提升 我們的健康和機(jī)能是必要的。
[0002] 據(jù)估計(jì)，發(fā)展中國(guó)家50%的孕婦存在缺鐵性貧血，而來自WHO的報(bào)告估計(jì)全球 46%的5~14歲兒童存在缺鐵性貧血，他們中的大部分來自發(fā)展中國(guó)家。在埃及，貧血仍 然是一個(gè)問題，其表明需要在整個(gè)國(guó)家推廣補(bǔ)鐵政策，而不僅僅是解決埃及兒童和孕婦的 鐵需求。
【背景技術(shù)】
[0003] 盡管鐵元素很重要，但是鐵過載和鐵儲(chǔ)備的顯著增加可能是對(duì)身體有害的。科學(xué) 家們發(fā)現(xiàn)鐵能增加脂質(zhì)過氧化，并導(dǎo)致癌癥形成。脂質(zhì)過氧化過程是由活性氧，如羥基自由 基所引發(fā)，并由過量鐵離子刺激。另一方面，缺鐵小鼠的快速累積銅元素，比正常小鼠高八 倍，并且由此，過量銅跟鐵一樣，也會(huì)催化脂質(zhì)過氧化。
[0004] 另外，缺鐵或缺銅小鼠的已經(jīng)顯示出在肝臟和血漿中累積甘油三酯。高濃度的甘 油三脂為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生提供更多的脂類基質(zhì)，并且這個(gè)可能會(huì)導(dǎo)致在缺陷小鼠的肝臟及 腎臟中丙二醛的高濃度。
[0005] 此外，已經(jīng)提出若干機(jī)理，其中提出鐵過載可能會(huì)影響癌癥的發(fā)展。已經(jīng)表明，過 量鐵可能會(huì)改變免疫狀態(tài)，在羥自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化過程中充當(dāng)共致癌物以及催化 劑。由于它們的能產(chǎn)生DNA加合物、DNA鏈斷裂以及調(diào)芐基因表達(dá)的能力，活性氧被認(rèn)為是 致癌的。通過干涉諸如銅和錳（Mn)的礦物質(zhì)的吸收，高膳食鐵含量能夠也加劇氧化應(yīng)激， 這些礦物質(zhì)的消耗會(huì)導(dǎo)致抗氧化酶活性降低，尤其是銅-鋅（Cu, Zn)和錳的超氧化物歧化 酶（SOD)的活性。綜合考慮，為解決缺鐵性貧血問題，應(yīng)按規(guī)定補(bǔ)鐵，特別是對(duì)兒童和孕婦， 但應(yīng)根據(jù)建議。因?yàn)殍F很難排出體外，應(yīng)格外注意以避免細(xì)胞鐵累積以及脂質(zhì)過氧化，氧化 應(yīng)激及癌癥的產(chǎn)生。這些難題提高了一種新種類/制劑的需求，其能夠1)通過其高吸收率 而確保鐵在體內(nèi)的可用性；2)具有短時(shí)間內(nèi)治愈缺鐵性貧血的能力；3)具有尚療效以克服 由于嚴(yán)重低Hb水平而危及生命的情況。
[0006] 為解決上述難題，我們制出納米氧化鐵顆粒的新配方，其含有三種不同的維生素， 維生素B9(葉酸）和維生素B3(煙酸）對(duì)所有細(xì)胞形成是必須的，維生素C(抗壞血酸）是 抗氧化劑，促進(jìn)鐵的吸收，同時(shí)避免鐵的誘裂作用[4]。已知的，煙酸的生化功能是合成吡啶 核苷酸，以及隨后在細(xì)胞呼吸中的作用。未成熟核紅細(xì)胞呼吸而且據(jù)推斷在該呼吸作用中 必須利用吡啶核苷酸。由于紅細(xì)胞的壽命很短，紅細(xì)胞生成所需的煙酸量很大。因此，在細(xì) 胞發(fā)育早期，由于輔酶的缺乏，隨著煙酸供應(yīng)量減少，可能會(huì)發(fā)生貧血[5]。
[0007] 當(dāng)身體中鐵儲(chǔ)量耗盡（血清鐵低，血清鐵蛋白低以及轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度低），紅細(xì)胞 生成受到鐵制約。這可以表現(xiàn)為平均紅細(xì)胞容積低、平均紅細(xì)胞血紅蛋白低、低色素紅細(xì)胞 百分升高、網(wǎng)織紅細(xì)胞的血紅蛋白（Hb)含量低[6]。如果不要求時(shí)限，服用口服鐵劑可以調(diào) 整血紅蛋白，相當(dāng)大的劑量（200mg)都是可以的。按要求服用口服鐵劑，血紅蛋白量在2~ 3周后開始升高，2個(gè)月后恢復(fù)正常水平，并在6月后消耗完鐵儲(chǔ)量；采用靜脈注射補(bǔ)鐵，血 紅蛋白量在1周后開始升高，響應(yīng)患者的百分比更高且鐵儲(chǔ)量被耗盡[7]。提高鐵儲(chǔ)量是有 利的，尤其是對(duì)接受紅血球生成刺激劑（ESAs)的患者[8]。
[0008]目前有三類安全的靜脈給藥的鐵劑產(chǎn)品，葡萄糖酸鐵、蔗糖鐵和低分子右旋糖酐 鐵。最好的能在一周后提高HP水平，通過每周兩次靜脈給藥，HP在一個(gè)月治療后恢復(fù)正常 水平。
[0009] 我們發(fā)現(xiàn)，被葉酸（維生素B9)、煙酸（維生素B3)，和/或抗壞血酸（維生素C) 包覆的氧化鐵納米復(fù)合物可以作為治療貧血的新配方或食物補(bǔ)充，而且它能提高RBC，并在 不到一周的時(shí)間內(nèi)將HP水平調(diào)整到正常值。
[0010] 本研究目的是檢驗(yàn)單劑量的被維生素混合物（葉酸、煙酸和抗壞血酸）包覆的納 米氧化鐵（磁鐵）顆粒用來在一周時(shí)間內(nèi)治療危及生命的缺鐵性貧血小鼠的能力。結(jié)果與 用三氯化鐵（母鐵源）的組相比較，以測(cè)量和區(qū)分納米和微米鐵補(bǔ)充劑的功效。我們制備 了被不同維生素包覆的氧化鐵納米顆粒。我們發(fā)現(xiàn)這些納米復(fù)合物提高了血紅蛋白水平而 且還提高了 RBC的形成。
[0011] 為確保被維生素B3、B9和C包覆的氧化鐵納米顆粒用于缺鐵性貧血的治療效果， 進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。哺乳動(dòng)物的血紅蛋白已經(jīng)降至4. 6g/dl，然后將單劑量的我們提出的新配 方藥物給哺乳動(dòng)物口服。4天時(shí)間內(nèi)，血紅蛋白水平和RBC恢復(fù)正常。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 第I部分：納米軼納米復(fù)合物的制備
[0013] _制備被維生素混合物（葉酸、煙酸和抗壞血酸）包覆的生物兼容的納米氧化鐵；
[0014] -用透射電子顯微鏡（TEM)圖像確定顆粒的尺寸和形狀。TEM圖像如圖1所示。
[0015] -用電感耦合等離子（ICP)對(duì)納米復(fù)合物中的元素鐵的制備的儲(chǔ)備溶液中的鐵含 量進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0016] 第II部分：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0017]-將五周大，重150~160g的威斯康星霍爾茨曼應(yīng)變白鼠分成6組，如下所示：
[0018] 小鼠組*
[0019]
[0020] *所有小鼠都用含鐵的均衡飲食和干凈自來水自由喂養(yǎng)。
[0021] _本研究中使用的所有方法都是依據(jù)NIH指南進(jìn)行。
[0022] 1、失血性貧血的誘發(fā)
[0023] 1~5組小鼠每天從眼內(nèi)眥抽血。用市售的試劑盒（都氏試劑），通過比色法對(duì)肝 素管中收集的血液樣品的血紅蛋白濃度進(jìn)行測(cè)量。當(dāng)小鼠生命危重且所有試驗(yàn)動(dòng)物的血紅 蛋白達(dá)到4-5g/dL范圍時(shí)，停止抽血。對(duì)照組的小鼠不進(jìn)行任何采血。
[0024] 2、劑量及治療藥
[0025] 在誘發(fā)危及生命的出血性貧血后，所有小鼠禁食6小時(shí)，然后口服不同的治療藥 和劑量。組1-3服用不同濃度（分別為2. 57、5. 14和10. 28mg Kg1小鼠體重，其分別相當(dāng) 于人類25、50、IOOmg的劑量）的I.Oml/小鼠的納米鐵（磁鐵），而組4服用10. 28mg Kg 1 的氯化鐵（I.Oml/小鼠；磁鐵的母體材料）。為這個(gè)實(shí)驗(yàn)分配兩個(gè)對(duì)照組；組5中，小鼠遭受 危及生命的失血性貧血并采用用納米磁鐵溶解的維生素混合物（抗壞血酸、葉酸和煙酸） 治療，組6中的小鼠不貧血，并服用蒸餾水（表1)。
[0026]
[0027] 表1 :小鼠組的治療藥，劑量以及血紅蛋白濃度（n = 3個(gè)小鼠）
[0028] 3、不同治療后的血紅蛋白濃度
[0029] 不同組的小鼠在口服不同治療藥后放置3天，然后用含鐵的均衡飲食和干凈自來 水自由喂養(yǎng)。在給藥后第4天和第7天收集血樣，并用比色法測(cè)定Hb濃度。
[0030]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0031]
[0032]表2:在誘發(fā)危及生命的失血性貧血期間以及在所有治療開始時(shí)小鼠組的血紅蛋 白濃度
[0033]
[0034]表3:所有治療1天前，4天后和7天后，小鼠組的血紅蛋白濃度
[0035]結(jié)果可以總結(jié)如下：
[0036] A.如表3中所述，用不同劑量的納米鐵補(bǔ)充劑治療危及生命的缺鐵性貧血小鼠， 在服用磁鐵后的僅4天內(nèi)，引起血紅蛋白濃度的顯著提高。
[0037] B.治療后7天，血紅蛋白濃度導(dǎo)致磁鐵治療組超過包括不貧血對(duì)照小鼠的所有其 他組的數(shù)據(jù)。
[0038]C.在用藥后第4天，2. 5mg磁軼的劑量能夠比其他兩個(gè)劑量50和IOOmg審好地調(diào) 整貧血小鼠的血紅蛋白濃度。
[0039] D.給藥后7天內(nèi)，HB7k平從4. 4升高.至14. 6g/dl,并穩(wěn)、定在13. 6走召過80天。 [0040]E.給貧血小鼠服用氯化鐵調(diào)整了Hb濃度，但是既沒有達(dá)到納米磁鐵組的水平，也 沒有達(dá)到不貧血對(duì)照組的水平。
[0041] F.給貧血小鼠服用維生素混合物（抗壞血酸、葉酸和煙酸）能夠顯著增加鐵的吸 收并提高血紅蛋白濃度，但是沒有達(dá)到或超過其他組的相同水平。
[0042] G.肝臟，脾臟，十二指腸，腎臟和大腦的組織病理學(xué)檢查結(jié)果并沒有顯示出任何