一種Ag@Au核殼納米材料制備及其檢測汞離子的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及環(huán)境中汞離子檢測領(lǐng)域，具體是制備脫氧核糖酶修飾的Ag@Au核殼結(jié)構(gòu)，應(yīng)用其構(gòu)建電化學(xué)DNA傳感器，用于檢測汞離子。一種Ag@Au核殼納米材料制備及其檢測汞離子的方法，制備Ag@Au核殼結(jié)構(gòu)，并用脫氧核糖酶修飾該納米顆粒，用作標(biāo)記物構(gòu)建電化學(xué)DNA傳感器，用于重金屬離子Hg2+的檢測。納米材料的制備方法簡單、快速、成本低，以此為標(biāo)記物的DNA傳感器具有較好的選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。
【專利說明】
一種Ag @ A u核殼納米材料制備及其檢測未禹子的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境中汞離子檢測領(lǐng)域，具體是制備脫氧核糖酶修飾的AgOAu核殼結(jié) 構(gòu)，應(yīng)用其構(gòu)建電化學(xué)DNA傳感器，用于檢測汞離子。
【背景技術(shù)】
[0002] 對汞離子的檢測方法主要有原子光譜法（OresteE.，JesusA.，01iveiraR.， Si 1vaM·，VieiraM·，RibeiroA·，2013·Microchem·J·109，5-9·和ElandJ·，F(xiàn)eifelR·， 2004. J.Phys.Chem. A. 108,9721-9725.)、電感耦合等離子體-質(zhì)譜（HongY.，RifkinE.， BouwerE·，2011·Environ·Sci·Technol·，45(15)，6429-6436和JacksonB·，TaylorV·， BakerR.，Miller，E.，2009.Environ.Sci.Technol. ,43(7) ,2463-2469.)和熒光法（ZhuY.， MaT·，RenT·，YuanZ·，2014.ACSAppl.Mater·Interfaces·6，16344-16351·和LiuX.，ShuX.， ZhouX·，ZhangX·，ZhuJ·，2010 · J·Phys · Chem·A· 114，13370-13375)等，雖然這些方法具有靈 敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，但其在環(huán)保防護(hù)、操作速度、定量檢測等方面各有不足之處;盡管有的已實(shí) 現(xiàn)了自動化，但由于專用儀器、專用試劑價格昂貴，目前尚不能在實(shí)驗室普及應(yīng)用。因而發(fā) 展新的檢測技術(shù)，降低檢測成本，加快檢測速度和在線能力以適應(yīng)大規(guī)模篩查已成為亟待 解決的問題。為了滿足現(xiàn)代環(huán)境檢測需求，電化學(xué)DNA傳感器應(yīng)運(yùn)而生。它是將高靈敏的傳 感技術(shù)與特異性DNA反應(yīng)結(jié)合起來，監(jiān)測汞離子與DNA結(jié)合的生物傳感器，具有快速、靈敏、 選擇性高、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于環(huán)境檢測。其中，電化學(xué)傳感器由于其設(shè)備小型化， 簡化分析過程，測量過程自動化等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)成為檢測重金屬離子的有力的方法。
[0003] 近幾年，納米材料的快速發(fā)展與應(yīng)用為傳感器的發(fā)展提供了廣闊的前景。無機(jī)納 米材料在新型功能材料如選擇性催化、分子識別、超高純度分離、生物傳導(dǎo)材料、光電材料、 磁性材料和芯片等新材料開發(fā)中顯示了誘人的應(yīng)用前景，而成為當(dāng)今化學(xué)和材料學(xué)科中最 為活躍的研究領(lǐng)域之一。尤其是核殼結(jié)構(gòu)的無機(jī)納米材料，可以通過調(diào)節(jié)合成方法對核殼 結(jié)構(gòu)納米粒子的材料組成、粒徑大小、形貌形狀、表面性質(zhì)等進(jìn)行控制，這對于核殼結(jié)構(gòu)材 料的催化能力的改善有著積極的影響，有利于在催化領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。Au曾經(jīng)被認(rèn)為是沒 有催化能力的金屬，用在核殼納米粒子中用卻可以用來提高催化效應(yīng)，比如與單金屬納米 粒子相比，核殼結(jié)構(gòu)的Au/Pt、Au/Pd納米粒子的催化性能更好，更重要的是這種催化性能是 可以被控制的。
[0004] 本文選擇制備Ag@Au核殼結(jié)構(gòu)，并用脫氧核糖酶修飾該納米顆粒，用作標(biāo)記物構(gòu)建 電化學(xué)DNA傳感器，用于重金屬離子Hg 2+的檢測。納米材料的制備方法簡單、快速、成本低，以 此為標(biāo)記物的DNA傳感器具有較好的選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：如何提供一種汞離子快速檢測的DNA傳感器，以 Ag@Au核殼結(jié)構(gòu)作為標(biāo)記物在常規(guī)條件下實(shí)現(xiàn)對汞離子的檢測，并具有較低的檢測限，且能 用于實(shí)際環(huán)境水樣的檢測。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:脫氧核糖酶修飾的AgOAu核殼結(jié)構(gòu)的制備方法，按照 如下的步驟進(jìn)行 步驟一、將氯金酸水溶液溶解在二次蒸餾水中，加熱至沸騰，然后加入檸檬酸三鈉水溶 液，繼續(xù)加熱，溶液的顏色由灰黃色變成深紅色，繼續(xù)加熱15分鐘，冷卻至室溫，制得納米金 溶液； 步驟二、取步驟一制備的納米金溶液，加入聚乙烯吡咯烷酮水溶液，攪拌5分鐘，隨后加 入抗壞血酸水溶液，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH到8.5，在攪拌的情況下，逐滴加入硝酸銀水 溶液，顏色由紅色變?yōu)榱咙S色，然后將溶液離心清洗，即制得AgOAu核殼納米顆粒； 步驟三、將步驟二制備的AgOAu核殼納米顆粒與DNA2和DNA3在4°C的環(huán)境下孵育12小 時，對生成產(chǎn)物離心，用二次蒸餾水清洗后得到DNA2-Ag@Au-DNA3復(fù)合物，加入氯化血紅素 Hemin，C34H32ClN4〇4Fe水溶液形成hemin/G四鏈體結(jié)構(gòu)，生成物用二次蒸餾水清洗多次后，離 心得到脫氧核糖酶修飾的AgOAu核殼結(jié)構(gòu)，既DNA2-Ag@Au-DNAzyme復(fù)合物。
[0007]作為一種優(yōu)選方式:步驟一中，氯金酸水溶液的量為1-1.8a毫升，質(zhì)量百分比濃度 為1%;二次蒸餾水的量為100_180a毫升;梓檬酸三鈉水溶液的量為2.5-4.5&_升，質(zhì)量百分 比濃度為1%;步驟二中，納米金溶液的量為8-14.4a毫升；聚乙烯吡咯烷酮水溶液的量為 0.65-1.17a毫升，質(zhì)量百分比濃度為1%;抗壞血酸水溶液的量為85-153a微升，濃度為100毫 摩爾/升;硝酸銀水溶液的量為〇. 92-1.5a毫升，濃度為100毫摩爾/升;步驟三中，DNA2是寡 核苷酸5' -SH-AAAAATTTCCTTTGCTTT-3'水溶液，濃度為1微摩爾/升，DNA3是寡核苷酸5' -SH-GGGTAGGGCGGGTTGGGT-3'水溶液，濃度為1微摩爾/升，加入量都為250-400a微升，氯化血紅 素水溶液Hemin，C34H32ClN4〇4Fe的濃度為0.2暈?zāi)?升，加入量為500_800a微升，a為正整 數(shù)。
[0008] 利用脫氧核糖酶修飾的AgOAu核殼結(jié)構(gòu)構(gòu)建傳感器檢測汞離子的方法:將干凈的 金電極放入DNA1溶液中，在4 °C下孵育6-12h，然后取出金電極放在巰基己醇中孵育2-5小 時，封閉未特異性結(jié)合的活性位點(diǎn)，取出金電極后在室溫下依次孵育不同濃度的汞離子，使 得汞離子與DNA1特異性結(jié)合，然后將修飾好的金電極在DNA2-Ag@Au-DNA Zyme復(fù)合物中在室 溫下孵育40-60分鐘，然后用PBS溶液清洗2-5次，構(gòu)建成電化學(xué)DNA傳感器;將電化學(xué)傳感器 使用方波沖伏安法(SWV )檢測汞離子水溶液的濃度。
[0009] 作為一種優(yōu)選方式:干凈的金電極是指用Al2〇3粉末打磨，然后分別在去離子水，丙 酮，乙醇中超聲清洗，用電化學(xué)工作站在〇. 5摩爾/升硫酸溶液中從0.3伏到1.5伏的范圍內(nèi) 測試循環(huán)伏安曲線6-8次。
[0010] 作為一種優(yōu)選方式:依次孵育不同濃度的汞離子是指將金電極依次在濃度為0納 摩爾/升、1納摩爾/升、2.5納摩爾/升、5納摩爾/升、10納摩爾/升、20納摩爾/升、50納摩爾/ 升、1〇〇納摩爾/升的汞離子中保持室溫下孵育40分鐘。
[0011] 作為一種優(yōu)選方式:將電化學(xué)傳感器使用方波伏安法SWV檢測汞離子的濃度是指， 將電化學(xué)傳感器在過氧化氫H2〇 2濃度為0.25毫摩爾/升、磷酸濃度為0.2毫摩爾/升、pH為7.4 的溶液中以100毫伏/秒的掃描速率在〇_〇. 3伏進(jìn)行測試，汞離子的濃度檢測范圍是1納摩 爾/升到100納摩爾/升，在此范圍內(nèi)，汞離子濃度與電流信號成線性相關(guān)性，對應(yīng)的線性方 程為y=_〇 . 05149X-0.10816，其中，X是汞離子的濃度，單位是納摩爾/升，y是檢測的電流信 號，單位是微安。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明方法制備Ag@Au核殼納米顆粒，構(gòu)建電化學(xué)DNA傳感 器對汞離子進(jìn)行檢測。此電化學(xué)傳感器具有較好的靈敏度，并且檢測速度快，準(zhǔn)確率高，檢 測汞離子有較好的專一性。
[0013]本發(fā)明選擇制備AgOAu核殼結(jié)構(gòu)，并用脫氧核糖酶修飾該納米顆粒，用作標(biāo)記物構(gòu) 建電化學(xué)DNA傳感器，用于重金屬離子Hg2+的檢測。納米材料的制備方法簡單、快速、成本低， 以此為標(biāo)記物的DNA傳感器具有較好的選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。
【附圖說明】
[0014] 圖1是Au納米顆粒透射電子顯微鏡(TEM)圖（10納米）； 圖2是AgOAu核殼納米顆粒透射電子顯微鏡(TEM)圖（10納米）； 圖3是使用方波伏安法SWV檢測汞離子的濃度的電流和電勢圖； 圖4是使用方波伏安法SWV檢測汞離子的濃度的電流與汞離子的濃度圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] -種AgOAu核殼納米顆粒的制備方法，按照如下的步驟進(jìn)行 步驟一、將1-1.8毫升氯金酸(水溶液質(zhì)量百分比濃度為1%)溶解在100-180毫升二次水 中，加熱至沸騰，然后加入2.5-4.5毫升檸檬酸三鈉(水溶液質(zhì)量百分比濃度為1%)，繼續(xù)加 熱，溶液的顏色由灰黃色變成深紅色，繼續(xù)加熱15分鐘，然后冷卻至室溫，制得納米金；圖1 中可以看到金納米顆粒的直徑大概有16納米，從圖1中知金納米顆粒的表面光滑并具有均 質(zhì)結(jié)構(gòu)的納米球結(jié)構(gòu)。
[0016] 步驟二、取8-14.4毫升納米金溶液，加入0.65-1.17毫升聚乙烯吡咯烷酮（水溶液 質(zhì)量百分比濃度為1%)，攪拌5分鐘，隨后加入85-153微升抗環(huán)血酸水溶液(濃度為100毫摩 爾/升），用100毫摩爾/升的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)溶液的pH到8.5,在攪拌的情況下，逐滴加 入0.92-1.5毫升硝酸銀水溶液(濃度為100毫摩爾/升），顏色由紅色變?yōu)榱咙S色，然后將溶 液離心清洗，即制得AgOAu核殼納米顆粒；圖2中可以看到AgOAu納米顆粒的核殼結(jié)構(gòu)，直徑 大概有20納米。
[0017] 步驟三、取1-1.8毫升48髓11核殼納米顆粒與250-400微升0財2(1毫摩爾/升）和 250-400微升DNA3(1毫摩爾/升)在4°C的環(huán)境下孵育12小時，對生成產(chǎn)物離心，用二次蒸餾 水清洗后得到DNA2-Ag@Au-DNA3復(fù)合物，加入氯化血紅素 Hemin (C34H32ClN4〇4Fe )(濃度為0.2 毫摩爾/升，加入量為500-800微升），生成物用二次水清洗多次后，離心得到的DNA2-Ag@Au-DNAzyme復(fù)合物。
[0018] 利用制備的AgOAu核殼納米顆粒作為探針檢測汞離子的方法，首先將金電極用 Al2〇3粉末打磨，然后分別在去離子水，丙酮，乙醇中超聲清洗，用電化學(xué)工作站在0.5摩爾/ 升硫酸溶液中從0.3伏到1.5伏的范圍內(nèi)測試循環(huán)伏安曲線6-8次，即得到干凈的金電極。將 干凈的金電極放入DNA 1溶液中，在4 °C孵育12小時，然后取出金電極放在巰基己醇中孵育5 小時封閉未特異性結(jié)合的活性位點(diǎn)，取出金電極后依次在濃度為〇納摩爾/升、1納摩爾/升、 2.5納摩爾/升、5納摩爾/升、10納摩爾/升、20納摩爾/升、50納摩爾/升、100納摩爾/升的汞 離子中保持室溫下孵育40分鐘，使得汞離子與DNA1特異性結(jié)合，然后將修飾好的金電極在 DNA2-Ag@Au-DNAZyme復(fù)合物中保持室溫下孵育40分鐘，然后用PBS溶液清洗2-5次，構(gòu)建成 電化學(xué)傳感器;將電化學(xué)傳感器使用方波沖伏安法SWV(使用CHI-660E電化學(xué)工作站的方波 伏安法SWV)檢測汞離子的濃度。
[0019] 將電化學(xué)傳感器使用方波伏安法SWV檢測汞離子的濃度是指，將電化學(xué)傳感器在 過氧化氫H2〇2濃度為0.25毫摩爾/升、磷酸濃度為0.2毫摩爾/升、pH為7.4的溶液中以100毫 伏/秒的掃描速率在〇-〇. 3伏進(jìn)行測試，電化學(xué)傳感器對汞離子是非線性吸附，當(dāng)汞離子的 濃度在0-1納摩爾/升時，觀察到空白緩沖液的電流信號近似-0.1微安，當(dāng)汞離子的濃度在1 納摩爾/升時，得到的電流信號開始大于-0.1微安，汞離子的濃度檢測范圍是1納摩爾/升到 100納摩爾/升，如圖3和圖4所示，在此范圍內(nèi)，汞離子的濃度與電流信號成線性相關(guān)性，其 線性相關(guān)系數(shù)平方是0.992，對應(yīng)的線性方程為y=-0.05149x-0.10816(R 2=0.992，n=24)，其 中，χ是汞離子的濃度，單位是納摩爾/升，y是檢測的電流信號，單位是微安。其最低檢測限 為0. 03納摩爾/升i信噪比為3)，與其它檢測方法相比，構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器具有較低 的檢測限和較寬β?檢測范圍（R是線性相關(guān)系數(shù)，R 2是線性相關(guān)系數(shù)的平方，η代表的是實(shí)驗 次數(shù))。
[0020] 汞離子濃度與電流信號的對應(yīng)關(guān)系如下表所示 ' 實(shí)際樣品分析 ' ' '
' ' ' ' ' 用構(gòu)建的電化學(xué)傳感器檢測自來水中添加的汞離子，添加的汞離子濃度分別為10納摩 爾/升、20納摩爾/升、50納摩爾/升，由線性相關(guān)方程y=-0.05149Χ-0.10816計算得到自來水 和汾河水中的汞離子濃度分別為10.8納摩爾/升、19.5納摩爾/升、47.8納摩爾/升，回收率 為108%、97.5%、95.6%，證明該傳感器可以用來檢測實(shí)際環(huán)境水樣品中的萊離子濃度。
[0021] 專一性分析 將制得的電化學(xué)傳感器分別在空白緩沖溶液、1〇〇納摩爾/升的不同干擾物質(zhì)(Ca2+，Mg2 +，2112+^62+，(：〇2+)的緩沖溶液中孵育40分鐘后，用磷酸緩沖溶液充分洗滌，然后檢測其方波 伏安信號，構(gòu)建的電化學(xué)傳感器與上述五種干擾物質(zhì)作用后的還原峰電流信號變化均很 小，約為-0.1微安左右。和空白組比較，干擾物質(zhì)產(chǎn)生的電流變化小于2%。相反，當(dāng)構(gòu)建的電 化學(xué)傳感器與5納克/毫升的汞離子作用時，還原峰電流變化顯著，為-0.55微安。說明由 DNA2-Ag@Au-DNAZyme復(fù)合物構(gòu)建的電化學(xué)DNA傳感器對檢測汞離子有較好的專一性。
【主權(quán)項】
1. 一種AgOAu核殼納米材料的制備方法，其特征在于按照如下的步驟進(jìn)行 步驟一、將氯金酸水溶液溶解在二次蒸餾水中，加熱至沸騰，然后加入檸檬酸三鈉水溶 液，繼續(xù)加熱，溶液的顏色由灰黃色變成深紅色，繼續(xù)加熱15分鐘，冷卻至室溫，制得納米金 溶液； 步驟二、取步驟一制備的納米金溶液，加入聚乙烯吡咯烷酮水溶液，攪拌5分鐘，隨后加 入抗壞血酸水溶液，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH到8.5，在攪拌的情況下，逐滴加入硝酸銀水 溶液，顏色由紅色變?yōu)榱咙S色，然后將溶液離心清洗，即制得AgOAu核殼納米顆粒； 步驟三、將步驟二制備的AgOAu核殼納米顆粒與DNA2和DNA3在4°C的環(huán)境下孵育12小 時，對生成產(chǎn)物離心，用二次蒸餾水清洗后得到DNA2-Ag@Au-DNA3復(fù)合物，加入氯化血紅素 Hemin，C34H32ClN4〇4Fe水溶液形成hemin/G四鏈體結(jié)構(gòu)，生成物用二次蒸餾水清洗多次后，離 心得到脫氧核糖酶修飾的AgOAu核殼結(jié)構(gòu)，既DNA2-Ag@Au-DNAzyme復(fù)合物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的AgOAu核殼納米材料的制備方法，其特征在于:步驟一中，氯金 酸水溶液的量為1_1.8&_升，質(zhì)量百分比濃度為1%;二次蒸餾水的量為100_180a毫升;梓檬 酸三鈉水溶液的量為2.5-4.5a毫升，質(zhì)量百分比濃度為1%;步驟二中，納米金溶液的量為8-14.4a_升；聚乙稀吡略燒酮水溶液的量為0.65-1.17&_升，質(zhì)量百分比濃度為1%;抗壞血 酸水溶液的量為85-153a微升，濃度為100毫摩爾/升;硝酸銀水溶液的量為0.92-1.5a毫升， 濃度為100毫摩爾/升；步驟三中，DNA2是寡核苷酸5' -SH-AAAAATTTCCTTTGCTTT-3'水溶液， 濃度為1微摩爾/升，DNA3是寡核苷酸S^SH-GGGTAGGGCGGGTTGGGTj'水溶液，濃度為1微摩 爾/升，加入量都為250-400a微升，氯化血紅素水溶液Hemin，C 34H32ClN4〇4Fe的濃度為0.2毫 摩爾/升，加入量為500 -800a微升，a為正整數(shù)。3. 利用權(quán)利要求1制備的AgOAu核殼納米材料構(gòu)建傳感器檢測萊離子的方法，其特征在 于:將干凈的金電極放入DNA1溶液中，在4°C下孵育6-12小時，然后取出金電極放在巰基己 醇中孵育2-5小時，封閉未特異性結(jié)合的活性位點(diǎn)，取出金電極后在室溫下依次孵育不同濃 度的汞離子水溶液，使得汞離子與DNA1特異性結(jié)合，然后將修飾好的金電極在DNA2-Ag@Au-DNAzyme復(fù)合物中在室溫下孵育40-60分鐘，然后用PBS溶液清洗2-5次，構(gòu)建成電化學(xué)DNA傳 感器，利用電化學(xué)DNA傳感器通過方波沖伏安法SWV檢測汞離子的濃度。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用權(quán)利要求1制備的AgOAu核殼納米材料構(gòu)建傳感器檢測汞 離子的方法，其特征在于:干凈的金電極是指用Al 2〇3粉末打磨，然后分別在去離子水，丙酮， 乙醇中超聲清洗，用電化學(xué)工作站在〇. 5摩爾/升硫酸溶液中從0.3伏到1.5伏的范圍內(nèi)測試 循環(huán)伏安曲線6_8次。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用權(quán)利要求1制備的AgOAu核殼納米材料構(gòu)建傳感器檢測汞 離子的方法，其特征在于:DNA1是寡核苷酸5' -SH-AAAATTTTGCTTTGGTTT-3'。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用權(quán)利要求1制備的AgOAu核殼納米材料構(gòu)建傳感器檢測汞 離子的方法，其特征在于：依次孵育不同濃度的汞離子是指將金電極依次在濃度為0納摩 爾/升、1納摩爾/升、2.5納摩爾/升、5納摩爾/升、10納摩爾/升、20納摩爾/升、50納摩爾/升、 100納摩爾/升的汞離子中保持在室溫孵育40-60分鐘。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述利用權(quán)利要求1制備的AgOAu核殼納米材料構(gòu)建傳感器檢測汞離 子的方法，其特征在于:將電化學(xué)傳感器使用方波伏安法SWV檢測汞離子的濃度是指，將電 化學(xué)傳感器在過氧化氫H 2〇2濃度為0.25毫摩爾/升、磷酸濃度為0.2毫摩爾/升、pH為7.4的溶 液中以100毫伏/秒的掃描速率在o-o. 3伏進(jìn)行測試，汞離子的濃度檢測范圍是1納摩爾/升 至ij100納摩爾/升，在此范圍內(nèi)，汞離子濃度與電流信號成線性相關(guān)性，對應(yīng)的線性方程為y =-0.05149x-0.10816，其中，X是汞離子的濃度，單位是納摩爾/升，y是檢測的電流信號，單 位是微安。
【文檔編號】G01N27/48GK105973971SQ201610328325
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】張冰, 孟紅云, 王雪, 馮苗苗, 常宏宏, 高文超, 李興, 魏文瓏
【申請人】太原理工大學(xué)