一種測定娑羅子提取物純化過程中多指標成分含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速測定娑羅子提取物七葉皂苷鈉大孔樹脂上樣和洗脫過程中多指標成分含量并快速判斷洗脫終點的方法。該方法包括以下步驟：（1）掃描近紅外光譜并收集大孔樹脂流出液樣本；（2）采用參比方法測定樣本中多元指標含量；（3）建立大孔樹脂純化過程的近紅外多元校正模型；（4）模型評價；（5）洗脫終點快速判斷。本發(fā)明具有快速、無損、可同時檢測多組分等優(yōu)點，可用于中藥生產過程的在線分析，為中藥生產質量控制提供一種新的思路。
【專利說明】一種測定娑羅子提取物純化過程中多指標成分含量的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥生產過程的質量檢測方法，涉及一種近紅外光譜技術快速測定娑羅子提取物大孔樹脂純化過程中多指標成分含量的檢測方法。
【背景技術】
[0002]近年來，中藥注射劑安全性事件頻發(fā)，不良反應報告的數(shù)量也有所增多。中藥注射劑生產過程中工況不穩(wěn)定以及人為操作差異等原因，常常造成中藥注射劑質量不穩(wěn)定，產品安全性無法得到保證，因此，加強中藥注射劑生產過程的質量檢測對提高中藥注射劑的安全性、保障患者的切身利益具有重大意義。
[0003]注射用七葉皂苷鈉可用于腦水腫創(chuàng)傷和手術后引起的腫脹的治療，也用于靜脈回流障礙性疾病，其原藥材是七葉樹科植物天師栗的干燥成熟果實(娑羅子)。娑羅子化學成分復雜，包含皂苷類、黃酮類、香豆素類、有機酸類、留醇類化合物和其他氨基酸等，主要藥效成分是α-七葉皂苷鈉和β-七葉皂苷鈉。藥理研究表明，七葉皂苷鈉具有很強的消炎、抗?jié)B出、消除腫脹和增加靜脈張力及促進淋巴回流的作用。七葉皂苷鈉作為娑羅子的主要藥效成分，其含量對最終產品藥效有著較大的影響，而大孔樹脂純化工藝是影響七葉皂苷鈉含量的關鍵工藝。另外，由于七葉皂苷鈉上帶有兩個糖基，由于工藝的波動，可能會帶來糖苷鍵斷裂和糖的生成，檢測大孔樹脂純化過程中糖含量的變化有助于了解產品質量變化。固含量也在一定程度上可以明顯反應中藥生產過程的質量變化。因此，大孔樹脂純化工藝中多指標成分含量的在線檢測對于注射用七葉皂苷鈉產品質量穩(wěn)定性研究十分必要。
[0004]目前，傳統(tǒng)的測定方法如HPLC，樣品處理過程復雜，操作繁瑣且分析時間過長，難以實現(xiàn)在線檢測。近紅外光譜分析技術是一種快速無損的現(xiàn)代分析技術，它綜合運用了計算機技術、光譜技術和化學計量學等多個學科的最新研究成果，以其獨特的優(yōu)勢在石油化工、農業(yè)食品、煙草工業(yè)以及醫(yī)藥行業(yè)等多個領域得到了日益廣泛的應用。與傳統(tǒng)分析方法相比，近紅外光譜技術具有快速分析、樣品處理簡單等特點，并且近紅外光在光纖中具有良好的傳輸特性，因此可以用于樣品的快速檢測，非常適合用于中藥生產過程的在線分析和遠程監(jiān)控?！耙环N近紅外光譜測定丹參提取液中鞣質含量的方法”(專利申請?zhí)?201010125515.6)通過構建近紅外光譜定量校正模型快速計算丹參提取液中鞣質含量，可有效解決丹參提取液中鞣質含量監(jiān)控問題，保證丹參注射液質量。但是目前還極少有將近紅外光譜技術應用于大孔樹脂純化過程的快速檢測中，本發(fā)明將近紅外光譜技術應用于七葉皂苷鈉大孔樹脂純化過程在線檢測中。文獻已報道過采用高效液相色譜法測定注射用七葉皂苷鈉中七葉皂苷鈉A和B的含量，注射用七葉皂苷鈉產品中主要含有七葉皂苷鈉Α、Β、C、D，還含有少量的糖元、苷元、脫?；慕到猱a物和其他雜質，本發(fā)明利用近紅外光譜技術對七葉皂苷鈉大孔樹脂純化過程中七葉皂苷鈉Α、B、C、D以及含糖量和固含量進行同時監(jiān)測，可以更為全面地評價七葉皂苷鈉有效成分含量。此外，高效液相色譜法耗時長，每次分析需要20min，難以達到實時監(jiān)測的效果，而近紅外則可以在Imin內獲得各個指標成分的含量結果，可以真正做到實時監(jiān)測生產過程質量變化，因此，可以更加有效地降低批次間的差異性，有助于提高產品的穩(wěn)定性、安全性和有效性。
[0005]另外，大孔樹脂洗脫終點是大孔樹脂純化過程的一個關鍵點，洗脫終點的快速判斷可以使大孔樹脂純化過程操作更為合理，對實現(xiàn)大孔樹脂在線監(jiān)測具有重要意義。洗脫過程終點是指有效成分含量相對濃度變化率RRCR趨于設定閾值時的取樣點。移動塊標準偏差法(MBSD法)是一種常用的終點判斷方法，已有文獻報道采用MBSD法快速判斷中藥提取終點，但還未見將其用于大孔樹脂洗脫過程終點的快速判斷中。MBSD法基本原理為:連續(xù)幾次采集的光譜信號之間的標準偏差變化率小于一定值時，可認為己經到達提取工藝終點。具體操作步驟:首先確定用于計算標準偏差的連續(xù)光譜條數(shù)n，即確定移動塊窗口寬
度，接著計算終點判斷開始時測得的η條光譜之間的標準偏差)然后計

I n-\ ，
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算SJA平均值s —‘ 1其中Xu為第j條光譜在波數(shù)i處的吸光度值，為窗口內η條光
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譜在波數(shù)i處的吸光度值的平均值，m為選取的波數(shù)總數(shù)。按時間順序剔除原η條光譜中最早的那條光譜，并加入最后那條光譜的下一條的光譜，重新計算Sp S。依次重復剔除、加入和計算操作，最后對偏差平均值S作圖，并根據S的變化率判斷提取終點到達與否。本發(fā)明將MBSD法終點判斷原理應用于七葉皂苷鈉大孔樹脂純化過程，可以實現(xiàn)洗脫終點的快速判斷。

【發(fā)明內容】
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[0006]本發(fā)明的目的是提供一種快速測定大孔樹脂純化過程中多種指標成分含量以及快速判斷大孔樹脂洗脫過程終點的方法；本方法利用化學計量學軟件建立大孔樹脂純化過程中多種指標成分含量的近紅外校正模型，以快速預測純化過程中的多指標成分含量，并采用MBSD法快速判斷大孔樹脂洗脫過程終點，從而實現(xiàn)對大孔樹脂純化過程的在線分析，為產品生產過程的質量控制奠定基礎。
[0007]本方案的目的是通過以下技術方案實現(xiàn):
[0008](I)大孔樹脂上樣和洗脫過程校正集樣本的收集:在大孔樹脂上樣和洗脫過程間隔0.5h取樣。
[0009](2)校正集樣本多指標成分含量參照值的測定:
[0010]a) HPLC法測定樣本中總七葉皂苷鈉和七葉皂苷鈉A、B、C、D的含量；
[0011]色譜條件:色譜柱為Phanomenex, C18 (IOOmmX 4.6mm, 2.6 μ m);流動相:A 為 0.5%磷酸溶液，B為乙腈，梯度洗脫；檢測波長:220nm ;柱溫:30°C ;流速:lml/min。
[0012]b)用折光計法測定大孔樹脂上樣和洗脫過程中流出液的含糖量；
[0013]c)用稱重法測定大孔樹脂上樣和洗脫過程中流出液的固含量；
[0014](3)校正集樣本近紅外光譜數(shù)據采集:
[0015]使用近紅外光譜儀掃描校正集樣本，光譜范圍為4000~12000CHT1，得到校正集樣本近紅外光譜數(shù)據。[0016](4)校正模型的建立:
[0017]采用化學計量學軟件和偏最小二乘法建立大孔樹脂純化過程中多指標含量多元校正模型。首先對校正集光譜進行異常點判別，去除異常點，同時對光譜數(shù)據進行平滑、微分等預處理，并選擇合適的波段進行建模。微分可以消除基線漂移，而同時會引入高頻噪聲，平滑可以有效去除高頻噪聲對信號的影響。另外，波段選擇可以避免引入過多冗余信息，提聞1旲型性能。
[0018](5)校正模型的評價:
[0019]采用相關系數(shù)R、交叉驗證均方差(RMSECV)、相對分析誤差(RPD)等指標來分別評價所建立的各指標成分的校正模型。
[0020](6)校正模型的預測:
[0021]掃描預測集樣本的近紅外光譜，將所建立的校正模型用于預測集樣本中有效成分含量的快速測定。
[0022](7)洗脫終點的快速判斷:
[0023]采用移動塊標準偏差法(MBSD法)進行洗脫終點快速判斷。
【具體實施方式】
[0024]近紅外光譜快速檢測七葉皂苷鈉大孔樹脂純化過程有效成分的方法，其檢測步驟如下:
[0025](I)大孔樹脂上樣和洗脫過程校正集樣本的收集:
[0026]收集不同批次大孔樹脂上樣和洗脫過程中樣本80個
[0027](2)校正集樣本多指標成分含量參照值的測定
[0028]A.HPLC法測定樣本中總七葉皂苷鈉和七葉皂苷鈉A、B、C、D的含量:
[0029]色譜條件:色譜柱為Phanomenex, C18 (IOOmmX 4.6mm, 2.6 μ m);流動相:A 為 0.5%磷酸溶液，B為乙腈，按表1進行梯度洗脫；檢測波長:220nm ;柱溫:30°C ;流速:lml/min。
[0030]標準曲線繪制:精密稱取七葉皂苷鈉對照品124.0Smg置于25mL量瓶中，以甲醇溶解并定容作為儲備液。將儲備液按梯度進行稀釋，配成5個不同濃度的工作液，進樣分析，并記錄各自峰面積。以色譜峰面積Y對進樣濃度X進行線性回歸。七葉皂苷鈉A的回歸方程為:Y=2225.5Χ-4.242，R2=0.9999 ;七葉皂苷鈉 B 的回歸方程為:Υ=1867.7Χ-17.386，R2=0.9999，結果表明七葉皂苷鈉A在192.6~1540.6 μ g、七葉皂苷鈉B在140.5~1123.7μ g范圍內線性關系良好。
[0031]樣品測定:將取得的樣品稀釋至相應倍數(shù)，按照上述色譜條件進行含量測定。
[0032]B.用折光計法測定大孔樹脂上樣和洗脫過程中流出液的含糖量:
[0033]蘸取樣品藥液2~3滴，滴于已校正的阿貝折光計棱鏡面中央，閉合棱鏡，靜置lmin。旋調使明暗界限清晰，并使其分界線恰在接物鏡的十字交叉點上。讀取目鏡視野中的含糖量百分數(shù)。
[0034]C.用稱重法測定大孔樹脂上樣和洗脫過程中流出液的固含量:
[0035]稱定烘干至恒重的西林瓶(兩次烘干后重量小于Smg)^，取樣品約2mL至扁形瓶，稱重X1，水浴蒸干，105°C烘18h，取出置干燥器內冷卻30min，迅速稱重X2。
[0036]含固量=(X2-X0)/ (X1-X0)[0037](3)校正集樣本近紅外光譜數(shù)據采集
[0038]使用近紅外光譜儀掃描校正集樣本，光譜范圍為4000~UOOOcnT1，掃描次數(shù)32次，分辨率8CHT1，得到校正集樣本近紅外光譜數(shù)據。
[0039](4)校正模型的建立
[0040]采用化學計量學軟件和偏最小二乘法建立七葉皂苷鈉大孔樹脂純化過程中多指標含量多元校正模型。首先對校正集光譜進行異常點判別，去除異常點，同時選擇合適的波段，并采用平滑、一階導數(shù)對光譜數(shù)據進行預處理，然后采用偏最小二乘法進行定量校正模型的建立。
[0041](5)校正模型的評價
[0042]采用相關系數(shù)R、交叉驗證均方差(RMSECV)、相對分析誤差(RPD)等指標來分別評價所建立的各指標成分的校正模型。大孔樹脂上樣和洗脫過程模型評價結果分別見表1和表2。
[0043]表1大孔樹脂上樣過程近紅外模型評價
[0044]
【權利要求】
1.一種近紅外光譜快速測定七葉皂苷鈉大孔樹脂上樣和洗脫過程中多指標成分含量的方法，其特征在于，通過以下步驟實現(xiàn): (1)校正集樣本的收集:收集不同批次七葉皂苷鈉大孔樹脂上樣和洗脫過程流出液樣本80個; (2)校正集樣本多指標成分含量的測定: a)用高效液相色譜法測定樣本中總七葉皂苷鈉、七葉皂苷鈉A、七葉皂苷鈉B、七葉皂苷鈉C和七葉皂苷鈉D含量； b)用折光計法測定樣本中含糖量； c)用稱重法測定樣本中固含量； (3)校正集樣本的近紅外光譜采集:使用近紅外光譜儀掃描樣本，得到近紅外光譜數(shù)據； (4)校正模型的建立:選擇合適的光譜波段和預處理方法，獲取特征光譜數(shù)據，使用多元校正方法，構建校正集樣本上述各指標性成分含量與近紅外特征光譜之間的校正模型，用于樣本指標性成分含量的預測； (5)校正模型的評價:采用相關系數(shù)R、交叉驗證均方差(RMSECV)、相對分析誤差(RPD)等指標來分別評價所 建立的各指標成分的校正模型； (6)校正模型的預測:掃描預測集樣本的近紅外光譜，將所建立的校正模型用于預測集樣本中有效成分含量的快速測定； (7)洗脫終點的快速判斷:采用移動塊標準偏差法(MBSD法)進行洗脫終點快速判斷。
2.根據權利要求書I所述的一種近紅外光譜快速測定七葉皂苷鈉大孔樹脂上樣和洗脫過程中多指標成分含量的方法，其特征在于，采用總七葉皂苷鈉、七葉皂苷鈉A、七葉皂苷鈉B、七葉皂苷鈉C和七葉皂苷鈉D、含糖量、固含量作為定量指標。
3.根據權利要求書I所述的一種近紅外光譜快速測定七葉皂苷鈉大孔樹脂上樣和洗脫過程中多指標成分含量的方法，其特征在于，近紅外光譜采集方式及條件為:使用透射法采集近紅外光譜，相關參數(shù)為:掃描光譜波長范圍為4000~UOOOcnT1，掃描次數(shù)32次，分辨率8Crn^10
4.根據權利要求書I所述的一種近紅外光譜快速測定七葉皂苷鈉大孔樹脂上樣和洗脫過程中多指標成分含量的方法，其特征在于，通過波段優(yōu)化選擇合適的建模波段，并采用一階導數(shù)和平滑對近紅外光譜進行預處理。
5.根據權利要求書I所述的一種近紅外光譜快速測定七葉皂苷鈉大孔樹脂上樣和洗脫過程中多指標成分含量的方法，其特征在于，應用偏最小二乘法建立多元校正模型。
6.根據權利要求書I所述的快速判斷洗脫終點的方法，其特征在于，采用移動塊標準偏差法結合近紅外光譜快速判斷洗脫終點。
【文檔編號】G01N21/25GK103808665SQ201310516594
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權日:2012年11月9日
【發(fā)明者】薛云麗, 劉雪松, 范艷麗, 丁海嬰, 王龍虎, 陳勇, 吳永江 申請人:山東綠葉制藥有限公司