專利名稱：抑制凝血相關(guān)凝血因子的肝素成分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及用于治療心血管疾病的組合物和方法。更具體地說，本發(fā)明涉及通過施用特別是能夠(1)通過催化抗凝血酶滅活液相凝血酶和或者與凝塊中的血纖蛋白結(jié)合或者與一些其它表面結(jié)合的凝血酶；和(2)通過抗凝血酶III(ATIII)催化因子Xa滅活作用抑制凝血酶產(chǎn)生的中等分子量肝素(MMWH)成分來改變血栓形成和生長(zhǎng)。另外，本發(fā)明提供了用于治療心血管疾病的方法和組合物。
背景技術(shù)：
肝素通過結(jié)合抗凝血酶和大大提高其抑制激活的因子X(因子Xa)和凝血酶的比例而作為抗凝劑。肝素與抗凝血酶的相互作用是通過隨機(jī)分布在大約三分之一的肝素鏈上的獨(dú)特的五糖序列介導(dǎo)的。為了通過抗凝血酶催化凝血酶抑制作用，肝素必須同時(shí)結(jié)合酶和抑制劑。前提是該橋接功能需要最小分子量為5,400道爾頓的含五糖的肝素鏈。甚至即使五糖位于肝素鏈的中間而不是兩端的任一端，這種最小尺寸的肝素鏈也可能是長(zhǎng)度不足以橋接凝血酶和抗凝血酶。相反，較長(zhǎng)的含五糖的肝素鏈不管五糖在肝素鏈中的位置在哪里都能提供該橋接功能。
和肝素一樣，低分子量肝素(LMWH)通過激活抗凝血酶還起到抗凝劑的作用。但是在平均分子量是大約4500-5000道爾頓時(shí)，大多數(shù)LMWH鏈太短不能橋接凝血酶和抗凝血酶。結(jié)果，與肝素相比，LMWH抗凝血酶的抑制活性小得多。
盡管肝素是液相凝血酶的有效抑制劑，但是其局限性在于其滅活與血纖蛋白結(jié)合的凝血酶例如凝塊-結(jié)合的凝血酶的能力。與血纖蛋白結(jié)合的凝血酶對(duì)通過肝素-抗凝血酶復(fù)合物的滅活的抗性反映出肝素橋接凝血酶和血纖蛋白形成三元血纖蛋白-凝血酶-肝素復(fù)合物的事實(shí)。該三元復(fù)合物的形成將凝血酶對(duì)血纖蛋白的親和力提高了20倍(從Kd是3μM提高到Kd是150nM)。通過占據(jù)凝血酶上肝素結(jié)合位點(diǎn)，連接凝血酶和血纖蛋白的肝素鏈防止肝素-抗凝血酶復(fù)合物中的肝素橋接抗凝血酶和血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶。這解釋了為什么血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶受到保護(hù)不被肝素-抗凝血酶復(fù)合物滅活。
此外，平均分子量是4,500至5,000道爾頓下，大多數(shù)LMWH鏈太短不能橋接凝血酶和血纖蛋白。但是，因?yàn)榇蠖鄶?shù)LMWH鏈也太短不能橋接凝血酶和抗凝血酶，所以LMWH是液相和血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶兩者的不好的抑制劑。
從上述來看，本領(lǐng)域還有對(duì)于用于例如抑制與血栓形成相關(guān)的心血管疾病的改進(jìn)的肝素成分的需要。所有的理想肝素成分都是通過滅活血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶和通過阻斷凝血酶產(chǎn)生，從而防止一旦停止治療而出現(xiàn)的凝固作用再次激活，來平定血液凝固的那些肝素成分。更特別地，理想的肝素成分應(yīng)該是其中肝素鏈太短不能橋接凝血酶和血纖蛋白，但是有足夠的長(zhǎng)度橋接抗凝血酶和凝血酶。本發(fā)明滿足這些和其它需要。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了包括肝素鏈太短不能橋接凝血酶和血纖蛋白，但是有足夠的長(zhǎng)度橋接抗凝血酶和凝血酶的肝素鏈的中等分子量肝素(MMWH)成分。只有大于12,000道爾頓的肝素鏈對(duì)于凝血酶和血纖蛋白的橋接是有效的。因此，提供該橋接功能需要的肝素的最小分子量比橋接抗凝血酶和凝血酶需要的肝素的分子量大得多。因?yàn)槿绱耍O(shè)計(jì)本發(fā)明的MMWH成分符合該要求。分子量范圍是大約6000至大約12000道爾頓下，本發(fā)明的MMWH成分由肝素鏈或太短不能橋接凝血酶和血纖蛋白的寡糖硫酸酯組成。但是，具體選擇6000道爾頓的下限以保證MMWH成分的所有的肝素鏈都足夠長(zhǎng)來橋接抗凝血酶和凝血酶而不管五糖序列位于肝素鏈的哪里。因?yàn)檫@些原因，和肝素不一樣，本發(fā)明的MMWH成分同樣好地抑制血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶和液相凝血酶。
本發(fā)明的MMWH成分通過滅活血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶能平定血栓(例如，可互換地，凝塊)從而防止一旦中止治療，凝固再次激活，并且通過抑制因子Xa能阻斷凝血酶產(chǎn)生。因?yàn)槿绱?，本發(fā)明提供了使用MMWH成分治療心血管疾病的方法。正如上文所解釋的，本發(fā)明的MMWH成分是一般具有大約6,000道爾頓至大約12,000道爾頓，甚至更優(yōu)選大約8,000道爾頓至大約10,000道爾頓分子量范圍的寡糖硫酸酯的混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分具有大約9,000道爾頓的平均分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少31％的MMWH成分具有大于或等于7,800道爾頓的分子量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少25％的MMWH成分具有大于或等于10,000道爾頓的分子量。從標(biāo)準(zhǔn)的或者未分級(jí)的肝素能容易地制備這樣的MMWH成分。
此外，本發(fā)明的MMWH成分一般具有類似的抗因子Xa和抗因子IIa活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗-因子Xa和抗-因子IIa活性之比范圍是大約2∶1至大約1∶1，更優(yōu)選地，大約1.5∶1至大約1∶1。相反，LMWH，例如，具有比抗-因子IIa活性明顯高的抗-因子Xa活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分的抗-因子Xa活性范圍是大約80U/毫克至大約155U/毫克，優(yōu)選90U/毫克至大約150U/毫克，更優(yōu)選地，大約100U/毫克至大約125U/毫克。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分具有大約115U/毫克的抗-因子Xa活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分抗因子IIa活性范圍一般是大約20U/毫克至大約150U/毫克，優(yōu)選40U/毫克至大約100U/毫克，更優(yōu)選大約60U/毫克至大約75U/毫克。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分具有大約65U/毫克抗因子IIa活性。
如上所述，本發(fā)明的MMWH成分包括太短不能橋接凝血酶和血纖蛋白，但是有足夠的長(zhǎng)度橋接抗凝血酶和凝血酶的肝素鏈。結(jié)果，和肝素不一樣，本發(fā)明的MMWH成分滅活血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶和游離的凝血酶。此外，盡管大多數(shù)低分子量肝素(LMWH)鏈不具有足夠的長(zhǎng)度橋接凝血酶和血纖蛋白，但是它們也太短不能橋接抗凝血酶和凝血酶。結(jié)果，本發(fā)明的MMWH成分在滅活血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶方面比LMWH好得多。另外，盡管水蛭素能滅活血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶，但是因?yàn)槠涫悄傅倪x擇性抑制劑而對(duì)凝血酶產(chǎn)生沒有作用。結(jié)果，與水蛭素相反，本發(fā)明的MMWH成分通過抗凝血酶催化因子Xa滅活抑制凝血酶產(chǎn)生。因此，通過阻斷凝血酶產(chǎn)生以及通過抑制血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶，本發(fā)明的MMWH成分克服了肝素，LMWH和水蛭素的局限性，特別是在急性動(dòng)脈血栓的凝固中。
選擇的本發(fā)明的MMWH成分還涉及富集具有最佳分子量范圍特別提供這里詳述的有利性質(zhì)的寡糖。這些MMWH成分包括在于下面特征的一項(xiàng)，兩項(xiàng)，三項(xiàng)，四項(xiàng)，五項(xiàng)，或六項(xiàng)或更多的從肝素衍生的寡糖混合物(a)體外具有抗凝血酶-和肝素輔因子II(HCII)-相關(guān)的抗凝劑活性；(b)寡糖太短不能橋接凝血酶和血纖蛋白，但是有足夠的長(zhǎng)度橋接抗凝血酶或者HCII和凝血酶；(c)具有至少15％，20％，25％，30％，35％或40％的具有至少一個(gè)或多個(gè)五糖序列的寡糖；(d)富集分子量范圍是大約6,000至大約11,000；7,000至10,000；7,500至10,000；7,800至10,000；7,800至9,800；或7,800至9,600；8,000至9,600的寡糖；(e)寡糖具有大約7,800至10,000，優(yōu)選7,800至9,800，更優(yōu)選8,000至9,800的平均分子量；(f)至少30％，35％，40％，45％或50％的寡糖具有大于或等于6000道爾頓，優(yōu)選大于或等于8000道爾頓的分子量；(g)1.1至1.5，優(yōu)選1.2至1.4，最優(yōu)選1.3的多分散性；(h)具有類似的抗-因子Xa和抗-因子IIa活性，優(yōu)選抗-因子Xa活性和抗-因子IIa活性之比是大約2∶1至大約1∶1，更優(yōu)選地，大約1.5∶1至大約1∶1；(i)抗-因子Xa活性是大約80IU/毫克至大約155IU/毫克，優(yōu)選90IU/毫克至大約130IU/毫克，更優(yōu)選地，大約95IU/毫克至大約120IU/毫克，最優(yōu)選100-110IU/毫克；(j)抗-因子IIa活性是大約20IU/毫克至大約150IU/毫克，優(yōu)選40IU/毫克至大約100IU/毫克，更優(yōu)選地，大約80IU/毫克至大約100IU/毫克，最優(yōu)選大約90-100IU/毫克。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，選擇的本發(fā)明的MMWH成分具有(a)，(b)，(c)和(d)的特征；(a)，(b)，(c)和(e)的特征；(b)，(c)，(e)和(g)的特征；(b)，(d)，(c)，(e)和(h)的特征；(b)，(c)，(d)和(g)的特征；(b)，(e)，(g)，(i)和(j)的特征；(b)，(e)，(f)，(g)，(i)和(j)的特征；或者(a)至(j)的特征。
“富集寡糖”指包括至少50％，55％，60％，65％，70％，75％或80％具體或限制分子量(例如6,000至11,000；7,000至10,000；7,800至10,000；7,800至9,800；8,000至9,600)的寡糖。
作為它們的(1)通過催化抗凝血酶抑制血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶以及液相凝血酶，和(2)通過抗凝血酶催化因子Xa滅活抑制凝血酶產(chǎn)生的能力的結(jié)果，本發(fā)明的MMWH成分能被用來治療心血管疾病，包括不穩(wěn)定性咽峽炎，急性心肌梗塞(心臟病發(fā)作)，腦血管意外(中風(fēng))，肺栓塞，深靜脈血栓形成，動(dòng)脈血栓形成等。因?yàn)槿绱耍景l(fā)明提供了用于治療這樣的心血管疾病的方法和藥物組合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療受試者血栓疾病的方法，該方法包括對(duì)受試者施用藥學(xué)可接受劑量的本發(fā)明的MMWH成分。該成分可以含有大約6,000道爾頓至大約12,000道爾頓，甚至更優(yōu)選大約8,000道爾頓至大約10,000道爾頓分子量范圍的寡糖硫酸酯的混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分具有大約9,000道爾頓的平均分子量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分是具有這里描述的最佳分子量范圍的選擇的MMWH成分。在該實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選方面，血栓疾病包括但不限于靜脈血栓形成(例如深靜脈血栓形成)，動(dòng)脈血栓形成和冠狀動(dòng)脈血栓形成。在該實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分例如通過抑制血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶以及液相凝血酶，和通過抗凝血酶催化因子Xa滅活抑制凝血酶產(chǎn)生來抑制栓塞形成和生長(zhǎng)。優(yōu)選地，通過腸胃外給藥(例如通過靜脈內(nèi)，皮下和肌內(nèi)注射)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的化合物的給藥。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了有發(fā)生血栓形成危險(xiǎn)的受試者血栓形成的預(yù)防方法，該方法包括對(duì)受試者施用藥學(xué)可接受劑量的本發(fā)明的MMWH成分。該成分可以含有大約6,000道爾頓至大約12,000道爾頓，甚至更優(yōu)選大約8,000道爾頓至大約10,000道爾頓分子量范圍的寡糖硫酸酯的混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分具有大約9,000道爾頓的平均分子量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分是具有這里描述的最佳分子量范圍的選擇的MMWH成分。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，受試者由于破壞止血法的醫(yī)學(xué)癥狀(例如冠狀動(dòng)脈疾病，動(dòng)脈粥樣硬化等)而有增加的形成血栓的危險(xiǎn)。在該實(shí)施方案的另一個(gè)方面，受試者由于醫(yī)療方法(例如心臟手術(shù)(心肺旁路)，導(dǎo)管插入術(shù)(例如心臟導(dǎo)管插入術(shù)，經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù))，粥樣硬化斑切除術(shù)，修復(fù)裝置的替換(例如心血管閥門，血管移植，斯滕特印模等))而有增加的血栓形成的危險(xiǎn)。在該實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分可以在醫(yī)療方法之前，期間或之后給藥。此外，優(yōu)選通過腸胃外給藥(例如通過靜脈內(nèi)，皮下和肌內(nèi)注射)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的MMWH成分的給藥。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的MMWH成分在制備用于治療血栓疾病，或者對(duì)有血栓形成危險(xiǎn)的受試者預(yù)防血栓形成的藥物的用途；本發(fā)明的MMWH成分在制備用于抑制受試者血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶和凝血酶產(chǎn)生的藥物的用途；本發(fā)明的MMWH成分在制備用于治療深靜脈血栓形成的藥物的用途；和本發(fā)明的MMWH成分在制備用于預(yù)防受試者肺栓塞的藥物的用途。
從下面的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征，目的和優(yōu)點(diǎn)及其優(yōu)選實(shí)施方案變得顯而易見。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1A和1B說明不同的肝素濃度對(duì)凝血酶(IIa)結(jié)合血纖蛋白(A)和對(duì)凝血酶對(duì)血纖蛋白(B)的表現(xiàn)親和性的影響。
圖2說明在不存在和存在肝素下結(jié)合血纖蛋白單體-瓊脂糖的α-凝血酶(α-IIa)，γ-凝血酶(γ-IIa)，或RA-凝血酶(RA)的百分比。
圖3說明在不存在和存在250nM肝素下hirugen(Hg)，凝血酶原片段2(F2)或抗外位點(diǎn)(exosite)2抗體(Wab)對(duì)凝血酶(IIa)結(jié)合血纖蛋白單體-瓊脂糖的影響。
圖4說明其中凝血酶(IIa)通過外位點(diǎn)1結(jié)合血纖蛋白(Fn)并且肝素(Hp)結(jié)合Fn和IIa上的外位點(diǎn)2的三元血纖蛋白-凝血酶-肝素復(fù)合體。
圖5說明血纖蛋白單體(Fm)對(duì)在100nM肝素存在下抗凝血酶(■)或肝素輔因子II(●)對(duì)凝血酶的抑制作用的速率的影響。各點(diǎn)代表至少2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，而短劃線代表SD。
圖6A和6B說明4μM血纖蛋白單體(Fm)對(duì)在肝素不存在或指定濃度肝素存在下抗凝血酶(A)或肝素輔因子II(B)對(duì)凝血酶抑制作用的速率的抑制影響。各點(diǎn)代表至少2次實(shí)驗(yàn)的平均值，而短劃線代表SD。
圖7說明在肝素(Hp)存在下γ-凝血酶(γ-IIa)，Quick1異常凝血酶(dysthrombin)(Q1-IIa)或RA-IIa與血纖蛋白(Fn)的相互作用。形成無效三元復(fù)合體是因?yàn)棣?IIa和Q1-IIa具有改變的外位點(diǎn)1，而RA-IIa具有減小的對(duì)于Hp的親和性。
圖8說明二元或三元復(fù)合體形成對(duì)α-凝血酶(α-IIa)，γ-凝血酶(γ-IIa)，或RA-凝血酶(RA-IIa)對(duì)N-p-甲苯磺?；?Gly-Pro-Arg-p-硝基N-酰苯胺的水解的Km的影響。二元復(fù)合體包括凝血酶-血纖蛋白(IIa-Fn)，和凝血酶-肝素(IIa-Hp)，而三元復(fù)合體是凝血酶-血纖蛋白-肝素(IIa-Fn-Hp)。各條框代表至少兩次實(shí)驗(yàn)的平均值，短劃線代表SD。
圖9說明沒有分級(jí)分離的肝素(UFH)和6,000Da肝素級(jí)分(MMWH)對(duì)凝血酶(IIa)結(jié)合血纖蛋白的影響。
圖10說明4μM血纖蛋白單體對(duì)在肝素或本發(fā)明的MMWH成分存在下抗凝血酶(AT)或肝素輔因子II(HCII)對(duì)凝血酶抑制作用的速率的抑制影響。各條框代表至少2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，而短劃線代表SD。
圖11說明在預(yù)防模型研究中標(biāo)準(zhǔn)肝素(SH)，低分子量肝素(LMWH)，本發(fā)明的MMWH成分，和水蛭素(HIR)的累積效力，以％表示。
圖12說明標(biāo)準(zhǔn)肝素(SH)，低分子量肝素(LMWH)，本發(fā)明的MMWH成分，和水蛭素(HIR)對(duì)30分鐘累積血液流失的影響。
圖13A和13B說明在動(dòng)脈血栓形成模型中LMWH，本發(fā)明的MMWH成分的累積效力(A)，以及LMWH和本發(fā)明的MMWH成分對(duì)血液流失的影響(B)。
圖14給出本發(fā)明的MMWH成分和LMWH對(duì)APTT的比較影響。
圖15給出LMWH和本發(fā)明的MMWH成分對(duì)抗-Xa水平的比較影響。
圖16是該程序的示意圖。
圖17給出用本發(fā)明的MMWH成分治療之后以百分比表示的修飾的Wessler模型血塊重量。
圖18給出LMWH和本發(fā)明的MMWH成分的比較預(yù)防模型。
圖19給出LMWH和本發(fā)明的MMWH成分的比較預(yù)防模型。
圖20給出用本發(fā)明的MMWH成分治療之后以百分比表示的修飾的Wessler模型血塊放射性。
圖21給出LMWH和本發(fā)明的MMWH成分的比較預(yù)防模型。
圖22給出LMWH和本發(fā)明的MMWH成分的比較預(yù)防模型。
圖23給出LMWH和本發(fā)明的MMWH成分的比較治療模型。
圖24給出LMWH和本發(fā)明的MMWH成分的比較治療模型。
圖25給出LMWH和本發(fā)明的MMWH成分對(duì)血栓增加的比較。
圖26給出LMWH和本發(fā)明的MMWH成分對(duì)血栓增加的比較。
圖27給出對(duì)慢性兔模型血塊增加中的DVT用本發(fā)明的MMWH成分的治療。
圖28給出用本發(fā)明的MMWH成分對(duì)慢性兔模型DVT的治療，血塊重量的變化百分比。
圖29是肝素酶衍生的中等分子量(MMW)肝素±4μM血纖蛋白單體對(duì)凝血酶的AT抑制作用的速率的圖示。
圖30是亞硝酸衍生的中等分子量(MMW)肝素±4μM血纖蛋白單體對(duì)凝血酶的AT抑制作用的速率的圖示。
圖31是高碘酸衍生的中等分子量(MMW)肝素±4μM血纖蛋白單體對(duì)凝血酶的AT抑制作用的速率的圖示。
圖32是用肝素酶和亞硝酸衍生的MMW肝素通過AT對(duì)血纖蛋白單體的凝血酶抑制作用的速率的抑制倍數(shù)的圖示。
圖33是用高碘酸衍生的MMW肝素通過AT對(duì)血纖蛋白單體的凝血酶抑制作用的速率的抑制倍數(shù)的圖示。
圖34是用肝素酶衍生的中等分子量肝素對(duì)因子Xa的AT抑制作用的速率的圖示。
圖35是用亞硝酸衍生的中等分子量肝素對(duì)因子Xa的AT抑制作用的速率的圖示。
圖36是用高碘酸衍生的中等分子量肝素對(duì)因子Xa的AT抑制作用的速率的圖示。
圖37是UFH和肝素酶衍生的中等分子量肝素對(duì)凝血酶結(jié)合血纖蛋白血塊的影響的圖示。
圖38是UFH和亞硝酸衍生的中等分子量肝素對(duì)凝血酶結(jié)合血纖蛋白血塊的影響的圖示。
圖39是UFH和高碘酸衍生的中等分子量肝素對(duì)凝血酶結(jié)合血纖蛋白血塊的影響的圖示。
圖40是UFH和尺寸受限的肝素酶衍生的中等分子量肝素對(duì)凝血酶結(jié)合血纖蛋白血塊的影響的圖示。
圖41是UFH和尺寸受限的亞硝酸衍生的中等分子量肝素對(duì)凝血酶結(jié)合血纖蛋白血塊的影響的圖示。
本發(fā)明的詳細(xì)描述和優(yōu)選實(shí)施方案本發(fā)明提供了中等分子量肝素(MMWH)化合物，其(1)通過催化抗凝血酶抑制血纖蛋白結(jié)合的凝血酶和液相凝血酶；和(2)通過抗凝血酶催化因子Xa滅活抑制凝血酶產(chǎn)生。這些MMWH成分是具有大約6,000道爾頓至大約12,000道爾頓，甚至更優(yōu)選大約8,000道爾頓至大約10,000道爾頓分子量范圍的寡糖硫酸酯的混合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分具有大約9,000道爾頓的平均分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，MMWH成分的至少31％具有大于或等于7,800道爾頓的分子量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MMWH成分的至少25％具有大于或等于10,000道爾頓的分子量。
更特別地，本發(fā)明的MMWH成分能平定血栓的強(qiáng)血栓原(prothrombotic)活性。血栓的血栓原活性反映血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶和血小板-結(jié)合的激活因子X(因子Xa)的活性，血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶和血小板-結(jié)合的激活因子X兩者相對(duì)對(duì)通過肝素和LMWH的滅活的抗性。這解釋了為什么這些試劑在發(fā)生動(dòng)脈血栓形成中有有限的效力和為什么當(dāng)停止治療時(shí)發(fā)生凝固的再結(jié)合激活。此外，盡管與肝素相反，水蛭素能滅活血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶，但是它不能阻斷由血小板-結(jié)合的因子Xa觸發(fā)的凝血酶的產(chǎn)生。水蛭素滅活血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶的能力解釋了為什么定向凝血酶抑制劑用于短期控制動(dòng)脈血栓形成優(yōu)于肝素。但是，這些物質(zhì)的任何有益效果一旦停止治療會(huì)快速喪失，因?yàn)樗鼈儾荒茏钄嘤裳“?結(jié)合的因子Xa觸發(fā)的凝血酶的產(chǎn)生。
現(xiàn)在已經(jīng)確定血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶對(duì)通過肝素的滅活有抗性，因?yàn)楦嗡赝ㄟ^以高親和性結(jié)合血纖蛋白和凝血酶上的肝素-結(jié)合位點(diǎn)來橋接凝血酶和血纖蛋白，肝素-血纖蛋白和肝素-凝血酶二者之間相互作用的Kd大約為150nm。該三元血纖蛋白-凝血酶-肝素復(fù)合物中的凝血酶在其活性位點(diǎn)處經(jīng)歷構(gòu)象變化，這可能限制其與抗凝血酶的反應(yīng)性。此外，通過占據(jù)凝血酶上的肝素-結(jié)合位點(diǎn)，連接凝血酶和血纖蛋白的肝素鏈防止肝素-抗凝血酶復(fù)合物中的肝素橋接抗凝血酶和血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶。這解釋了為什么三元血纖蛋白-凝血酶-肝素復(fù)合物中的凝血酶受到保護(hù)不會(huì)被肝素或者被長(zhǎng)度足夠橋接凝血酶和抗凝血酶的LMWH鏈滅活。對(duì)于急性動(dòng)脈血栓形成對(duì)這些抗凝劑的抗性和中止治療之后凝固的再結(jié)合激活兩者的主要致因可能是肝素，LMWH或水蛭素不能平定血栓的強(qiáng)血栓原活性。
與肝素相反，通過滅活血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶和通過抗凝血酶催化因子Xa滅活作用抑制凝血酶產(chǎn)生，LMWH，水蛭素和本發(fā)明的MMWH成分能平定血栓原活性。更特別地，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的MMWH成分的肝素鏈太短不能橋接凝血酶和血纖蛋白，但是足夠長(zhǎng)來橋接抗凝血酶和凝血酶。結(jié)果，和肝素不一樣，本發(fā)明的MMWH成分滅活血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶和自由的凝血酶。此外，盡管大多數(shù)LMWH鏈不足夠長(zhǎng)以橋接凝血酶和血纖蛋白，而且它們也太短不能橋接抗凝血酶和凝血酶。結(jié)果，本發(fā)明的MMWH成分在滅活血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶方面比LMWH好得多。另外，盡管水蛭素能滅活血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶，但是它對(duì)凝血酶產(chǎn)生沒有作用，因?yàn)樗悄傅倪x擇性抑制劑。結(jié)果，與肝素相反，本發(fā)明的MMWH成分通過抗凝血酶催化因子Xa滅活來抑制凝血酶產(chǎn)生。因此，通過阻斷凝血酶產(chǎn)生以及通過抑制血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶，本發(fā)明的MMWH成分特別是在調(diào)理急性動(dòng)脈血栓形成方面克服了肝素，LMWH和水蛭素的局限性。
本發(fā)明的MMWH成分一般具有類似的抗因子IIa和抗因子Xa活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗-因子Xa活性和抗-因子IIa活性之比范圍是大約2∶1至大約1∶1，更優(yōu)選地，大約1.5∶1至大約1∶1。相反，LMWH，例如，具有比抗-因子IIa活性明顯高的抗-因子Xa活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分的抗-因子Xa活性范圍是大約90U/毫克至大約150U/毫克，更優(yōu)選地，大約100U/毫克至大約125U/毫克。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分具有大約115U/毫克的抗-因子Xa活性。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分抗因子IIa活性范圍一般是大約40U/毫克至大約100U/毫克，更優(yōu)選大約60U/毫克至大約75U/毫克。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分具有大約65U/毫克抗因子IIa活性。
選擇的本發(fā)明的MMWH成分還涉及富集具有最佳分子量范圍特別提供這里詳述的有利性質(zhì)的寡糖。這些MMWH成分包括特征在于體外具有抗凝血酶-和肝素輔因子II(HCII)-相關(guān)的抗凝劑活性的肝素衍生的寡糖的混合物。組合物包括太短不能橋接凝血酶和血纖蛋白，但是有足夠的長(zhǎng)度橋接抗凝血酶或者HCII和凝血酶的肝素鏈。特別地，組合物具有至少15％，20％，25％，30％，35％或40％的具有至少一個(gè)或多個(gè)五糖序列的肝素寡糖鏈。“五糖序列”指由三個(gè)D-葡糖胺和兩個(gè)糖醛酸殘基組成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元(參見下面的結(jié)構(gòu))。中心D-葡糖胺殘基包含獨(dú)特的3-O-硫酸根部分。 該五糖序列代表對(duì)抗凝血酶具有高親和性的肝素的最小結(jié)構(gòu)(Choay，J.等，生物化學(xué)生物物理研究通訊(Biochem Biophys ResComm)1983116492-499)。肝素通過該五糖序列與抗凝血酶橋接導(dǎo)致反應(yīng)中心環(huán)中構(gòu)象變化，這將抗凝血酶從慢抑制劑轉(zhuǎn)化為非常快的抑制劑。結(jié)果，本發(fā)明選擇的MMWH成分能通過催化抗凝血酶抑制血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶以及液相凝血酶和通過抗凝血酶催化因子Xa滅活抑制凝血酶的產(chǎn)生。優(yōu)選地，本發(fā)明選擇的MMWH成分是同樣好地抑制血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶和液相凝血酶的那些MMWH成分。
選擇的MMWH成分包括具有大約6,000至大約11,000分子量范圍的寡糖。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種MMWH成分，其富集分子量范圍是7,800至8,800；優(yōu)選7,800至8,600；更優(yōu)選7,800至8,500；最優(yōu)選8,000至8,500的寡糖。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種MMWH成分，其富集分子量范圍是9,000至10,000；優(yōu)選9,200至9,800；更優(yōu)選9,300至9,600；最優(yōu)選9,400至9,600的寡糖。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案還涉及包括平均分子量是7,800至8,800；優(yōu)選7,800至8,600；更優(yōu)選7,800至8,500；最優(yōu)選8,000至8,500的寡糖的本發(fā)明的MMWH成分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括平均分子量是9,000至10,000；優(yōu)選9,200至9,800；更優(yōu)選9,300至9,600；最優(yōu)選9,400至9,600的寡糖的本發(fā)明的MMWH成分。
選擇的MMWH成分可以具有1.1-1.5，優(yōu)選1.2-1.4，最優(yōu)選1.3的多分散性。
本發(fā)明選擇的MMWH成分可以具有類似的抗因子Xa和抗因子IIa活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗-因子Xa活性和抗-因子IIa活性之比范圍是大約2∶1至大約1∶1，更優(yōu)選地，大約1.5∶1至大約1∶1。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗-因子Xa活性范圍是大約80IU/毫克至大約155IU/毫克，優(yōu)選90IU/毫克至大約130IU/毫克，更優(yōu)選地，大約95IU/毫克至大約120IU/毫克，最優(yōu)選地，100-110IU/毫克。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗因子IIa活性范圍是大約20IU/毫克至大約150IU/毫克，更優(yōu)選40IU/毫克至大約100IU/毫克，最優(yōu)選大約80IU/毫克至大約100IU/毫克。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物具有大約90-100IU/毫克抗因子IIa活性。
可以從低標(biāo)準(zhǔn)物或者沒有分級(jí)的肝素或者從低分子量肝素(LMWH)制備本發(fā)明的MMWH成分。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過首先將沒有分級(jí)的肝素解聚得到低分子量肝素然后分離或分開感興趣的MMWH級(jí)分，可以從沒有分級(jí)的肝素獲得本發(fā)明的MMWH成分。沒有分級(jí)的肝素是由糖醛酸殘基(D-葡糖醛酸或L-艾杜糖醛酸)和D-葡糖胺酸殘基制成的重復(fù)二糖組成的多糖鏈的混合物。這些二糖的很多在糖醛酸殘基和/或葡糖胺殘基上被硫酸化。一般來說，沒有分級(jí)的肝素根據(jù)肝素來源和用來分離它的方法而具有大約6,000道爾頓至40,000道爾頓的平均分子量。本發(fā)明方法中使用的沒有分級(jí)的肝素可以是制藥質(zhì)量的商售肝素制劑或粗肝素制劑，例如從哺乳動(dòng)物組織或器官提取活性肝素獲得的那些。商售產(chǎn)品(USP肝素)可以從幾個(gè)來源得到(例如SIGMA化學(xué)品公司，圣.路易絲，孟山都)，一般作為堿金屬鹽或堿土金屬鹽(最通常作為肝素鈉)?；蛘呃帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方法，可以從哺乳動(dòng)物組織或器官特別是從例如來自牛，豬和綿羊的腸粘膜或肺提取沒有分級(jí)的肝素(參見例如Coyne Erwir.，肝素的化學(xué)和生物學(xué)(Chemistry and Biology of Heparin)(Lundblad，R.L.等(編著)，pp.9-17，Elsevier/North-Holland，紐約(1981))。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，沒有分級(jí)的肝素是豬腸肝素。
將肝素解聚的多種方法是已知的并且在科技文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)中都有大量報(bào)道，并且都可應(yīng)用于本發(fā)明。這樣的方法一般以化學(xué)反應(yīng)或酶促反應(yīng)為基礎(chǔ)。例如，通過芐基化后堿解聚；亞硝酸解聚；用肝素酶酶促解聚；過氧化解聚等，可以從標(biāo)準(zhǔn)的沒有分級(jí)的肝素制備低分子量肝素。一般地，選擇提供具有本發(fā)明的MMWH成分特別是具有最佳分子量范圍的本發(fā)明組合物的特征的組合物的方法。本發(fā)明組合物的期望的特征，即分子量范圍，平均分子量，多分散性，抗-因子Xa活性，抗-因子IIa活性等等，可以用標(biāo)準(zhǔn)方法證實(shí)(例如參見這里的實(shí)施例)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用亞硝酸解聚或肝素酶解聚從沒有分級(jí)的肝素制備本發(fā)明的組合物。
通過在控制的條件下，使沒有分級(jí)的肝素與化學(xué)試劑更特別地亞硝酸的作用接觸，可以解聚沒有分級(jí)的肝素。可以直接向肝素加入亞硝酸，或者，其可以就地生成。為了就地產(chǎn)生亞硝酸，向一種亞硝酸的衍生物加入控制量的一種酸。合適的酸包括有利地包含生物學(xué)可接受陰離子的那些酸，例如乙酸，更優(yōu)選地，鹽酸。合適的亞硝酸的衍生物包括鹽，醚-鹽，或者更優(yōu)選地，堿金屬鹽或堿土金屬鹽。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用亞硝酸的鹽，水溶性鹽，更優(yōu)選地使用堿金屬鹽，例如亞硝酸鈉(NaNO2)。
優(yōu)選在生理可接受介質(zhì)中進(jìn)行沒有分級(jí)的肝素的解聚，從而消除與使用對(duì)涉及的生物應(yīng)用可能是不利的溶劑相關(guān)的問題。這樣的生理可接受介質(zhì)包括但不限于水和水/醇混合物。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，水構(gòu)成優(yōu)選的反應(yīng)介質(zhì)。在進(jìn)行解聚反應(yīng)中，使用化學(xué)計(jì)量的試劑(例如亞硝酸)是所需的。使用化學(xué)計(jì)量的亞硝酸將保證當(dāng)達(dá)到期望的解聚程度時(shí)，亞硝酸被完全消耗。一般地，沒有分級(jí)的肝素與亞硝酸鈉(NaNO2)的重量比范圍從大約100至2-4，并且更優(yōu)選地，從大約100至3。使用化學(xué)計(jì)量的亞硝酸避免“淬滅”與例如氨基磺酸銨的動(dòng)力學(xué)(正在進(jìn)行的)反應(yīng)的需要，并且反之，防止混合的鹽(例如低分子量肝素中間體的鈉鹽和銨鹽)的形成。
另外，為了在最令人滿意的實(shí)驗(yàn)條件下獲得期望的產(chǎn)物，彼此調(diào)節(jié)其它參數(shù)，例如溫度和pH。例如，在大約0℃至30℃的溫度范圍下進(jìn)行解聚反應(yīng)。事實(shí)上，低于10℃的溫度能夠用于制備期望的產(chǎn)物。但是，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在環(huán)境溫度下，即在大約20℃和28℃中間，進(jìn)行解聚反應(yīng)。此外，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過首先降低然后提高反應(yīng)混合物的pH來起始和中止解聚反應(yīng)。為了引發(fā)解聚反應(yīng)，將反應(yīng)混合物的pH降低至大約2.5-3.5的pH值，并且更優(yōu)選地，降低至大約3.0。類似地，為了中止解聚反應(yīng)，將反應(yīng)混合物的pH升高至大約6.0-7.0的pH值，并且更優(yōu)選地，升高至大約6.75。應(yīng)該注意，通過利用例如淀粉-碘試紙檢查反應(yīng)混合物中是否存在亞硝離子，能監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)程。反應(yīng)混合物中不存在亞硝離子指示反應(yīng)完全。反應(yīng)完全需要的時(shí)間隨著使用的反應(yīng)物和反應(yīng)條件而不同。但是，一般情況下，大約1小時(shí)至大約3小時(shí)內(nèi)反應(yīng)將達(dá)到完全。
一旦反應(yīng)達(dá)到完全，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知且使用的多種不同的技術(shù)能回收本發(fā)明MMWH成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過沉淀，超濾或色譜方法從反應(yīng)混合物回收本發(fā)明MMWH成分。如果通過沉淀獲得期望的產(chǎn)物，則一般使用例如一種醇(例如無水乙醇)進(jìn)行沉淀。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，利用超濾方法從反應(yīng)混合物回收本發(fā)明MMWH成分?？梢杂欣厥褂酶鞣N截留分子量的超濾膜來脫鹽并且確定得到的MMWH成分的分子量特征。適合本發(fā)明使用的超濾系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知且使用的。商業(yè)上可獲得的Millipore Pellicon超濾裝置是例示的可以在本發(fā)明中使用的超濾系統(tǒng)。該裝置可以裝有各種截留分子量的膜。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用裝有6,000道爾頓截留分子量的膜的Millipore Pellicon超濾裝置對(duì)純水(即蒸餾水(dH2O))將得到的MMWH成分透析或超濾。
超濾之后，然后將保留液凍干，即冷凍-干燥，得到MMWH成分。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知且使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定得到的MMWH成分的分子量特征。這樣的技術(shù)包括，例如，GPC-HPLC，粘度測(cè)定，光散射，解聚過程中產(chǎn)生的官能團(tuán)的化學(xué)或物理化學(xué)測(cè)定等等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過高效尺寸排阻色譜結(jié)合多角激光散射(HPSEC-MALLS)測(cè)定得到的MMWH成分的分子量特征。典型地，得到的MMWH成分具有大約9,000道爾頓的平均分子量(Mw)。在本發(fā)明選擇的組合物中，平均分子量是大約7,800至10,000道爾頓，優(yōu)選7,800至9,800道爾頓。
本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解可以使得到的MMWH成分進(jìn)行進(jìn)一步的純化程序。這樣的程序包括但不限于凝膠滲透色譜，超濾，疏水相互作用色譜，親和色譜，離子交換色譜等。此外，如上所述，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知且使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定本發(fā)明的MMWH成分的分子量特征。正如所解釋的，在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過高效尺寸排阻色譜結(jié)合多角激光散射(HPSEC-MALLS)測(cè)定本發(fā)明的MMWH成分的分子量特征。
通過用肝素酶對(duì)肝素的酶促解聚可以制備本發(fā)明的MMWH成分(參見例如U.S.3,766,167和U.S.4,396,762)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，通過根據(jù)EP 0224236所述控制的肝素酶解聚來制備本發(fā)明的組合物，特別是具有最佳分子量范圍或者限制的分子量范圍的選擇的組合物(Nielsen和Ostergard；1987年4月11日公開的No.87303836.8)。利用該方法，通過用肝素酶解聚至相應(yīng)的數(shù)均分子量，可以制備具有期望的重均分子量的本發(fā)明的MMWH成分。該方法測(cè)定解聚過程中光吸收度的增加(優(yōu)選230-235nm，即ΔA235)，并且當(dāng)光吸收度達(dá)到相應(yīng)于期望的數(shù)均分子量和相應(yīng)的期望的重均分子量的計(jì)算值時(shí)中止解聚作用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過肝素的有限的高碘酸氧化/水解得到低分子量肝素，然后分離或分出感興趣的MMWH級(jí)分，可以獲得本發(fā)明的MMWH成分。在該方法的第一步驟中，肝素與有限量的高碘酸鈉接觸。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，高碘酸鈉的濃度范圍是大約1mM至大約50mM，更優(yōu)選大約5mM至大約20mM。該反應(yīng)混合物的pH范圍是大約3-11，更優(yōu)選大約6.5至大約7.5。有限的高碘酸鹽氧化作用一般進(jìn)行大約18小時(shí)。在該方法的第二步驟中，在高碘酸鹽氧化作用之后用金屬?gòu)?qiáng)堿例如NaOH進(jìn)行堿解。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，金屬?gòu)?qiáng)堿例如NaOH的濃度范圍是大約0.1N至大約1N，更優(yōu)選地，是大約0.25N。該步驟在大約0℃至大約50℃范圍，更優(yōu)選大約25℃的溫度下進(jìn)行大約1小時(shí)至大約10小時(shí)的時(shí)間，更優(yōu)選進(jìn)行3小時(shí)。用公知方法例如上述的凝膠過濾，離子交換色譜，超濾，透析，季銨鹽沉淀和有機(jī)溶劑沉淀獲得期望的MMWH成分。而且，該MMWH成分還可以用上述方法進(jìn)一步純化。
利用有限高碘酸鹽氧化作用/水解方法，制備結(jié)構(gòu)與已知的LMWH成分完全不同的MMWH成分。如上所述，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過用高碘酸鹽短時(shí)處理沒有分級(jí)的肝素得到在一些硫酸化糖醛酸殘基處被氧化的產(chǎn)物來制備本發(fā)明的MMWH成分。這些被氧化位點(diǎn)可以容易地被堿裂解。結(jié)果，本發(fā)明的MMWH成分的裂解不象用來制備LMWH的常規(guī)方法的一般情況下那樣有隨機(jī)性。此外，易于被高碘酸鹽氧化的2-0個(gè)硫酸化糖醛酸殘基以一定概率位于五糖序列相鄰處。結(jié)果，本發(fā)明的有限高碘酸鹽/水解方法可能產(chǎn)生該鏈的末端具有五糖序列的低分子量肝素鏈，這可以使得肝素鏈的剩余部分足夠長(zhǎng)來橋接凝血酶。
本發(fā)明的MMWH成分特別是能夠(1)通過催化抗凝血酶抑制血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶以及液相凝血酶；和(2)通過抗凝血酶催化因子Xa滅活作用抑制凝血酶產(chǎn)生。因?yàn)槿绱?，本發(fā)明的MMWH成分能夠用于治療多種重要的心血管疾病，包括不穩(wěn)定性咽峽炎，急性心肌梗塞(心臟病發(fā)作)，腦血管意外(中風(fēng))，肺栓塞，深靜脈血栓形成，動(dòng)脈血栓形成等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分可用于治療動(dòng)脈血栓形成。正因?yàn)槿绱?，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的MMWH成分可以被摻入到用于治療這樣的心血管疾病的藥物組合物中作為有效成分。本發(fā)明的藥物組合物單獨(dú)使用或者與常規(guī)的血栓治療例如施用組織纖溶酶原激活物(tPA)，鏈激酶等，與常規(guī)的抗血小板治療例如施用噻氯匹定等，以及與血管內(nèi)治療例如血管成形術(shù)，動(dòng)脈粥樣硬化斑消除術(shù)等相結(jié)合。
本發(fā)明的MMWH成分可以摻入到用于治療給藥的各種制劑中。更特別地，通過與合適的藥學(xué)可接受載體或稀釋劑混合可以將本發(fā)明的MMWH成分配制成藥物組合物，并且可以配制成各種制劑，優(yōu)選液體形式，例如漿液，溶液和注射劑。優(yōu)選通過腸胃外給藥(例如通過靜脈內(nèi)，皮下和肌內(nèi)注射)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的MMWH成分的給藥。此外，所述混合物可以局部而不是全身給藥，例如通過直接將混合物注射到皮下位點(diǎn)，經(jīng)常是在貯存或緩釋制劑中。
在“Remington’s制藥科學(xué)”(Remington’s PharmaceuticalScience)(Mack出版公司，Philadelpha，PA，17版(1985))可以查到適用本發(fā)明的合適的劑型，其中的教誨在這里引作參考。此外，藥物送遞方法的簡(jiǎn)要綜述參見Langer，科學(xué)(Science)2491527-1533(1990)，其中的教誨在這里引作參考?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備這里描述的藥物組合物，例如利用常規(guī)的混合，溶解，研磨，乳化，截留或凍干方法。下述方法和賦形劑僅是例子，絕非限制本發(fā)明。
優(yōu)選配制本發(fā)明的MMWH成分用于腸胃外給藥，例如通過注射，例如通過大丸劑注射或連續(xù)輸液。用于注射的制劑可以以單位劑量形式存在，例如在安瓿中或者在多劑量容器中，并加有防腐劑。所述組合物可以是這樣的形式，例如油性或含水賦形劑中的懸浮液，溶液或乳狀液，也可以含有配制試劑，例如懸浮劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑試劑。
一般情況下，用于腸胃外給藥的藥物制劑包括活性成分在水溶性形式中的水溶液。另外，活性成分的懸浮液可以制備成合適的油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或賦形劑包括脂肪油例如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。含水注射懸浮液可以含有提高懸浮液的粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉，山梨糖醇，或葡聚糖。任選地，所述懸浮液還可以含有合適的穩(wěn)定劑或者提高混合物的溶解度使制備高濃縮的溶液的試劑。或者，活性成分可以是用于在使用之前用合適的賦形劑例如滅菌無致熱原水允兌的粉末形式。
更特別地，對(duì)于注射劑，通過將其溶解于，懸浮于含水或不含水溶劑例如植物油或者其它類似的油，合成的脂肪酸甘油酯，高級(jí)脂肪酸或丙二醇的酯中，或者在其中乳化；并且如果期望，添加常規(guī)添加劑，例如增溶劑，等張劑，懸浮劑，乳化劑，穩(wěn)定劑和防腐劑，可以將所述MMWH成分配制成制劑。優(yōu)選地，可以在水溶液，優(yōu)選在生理相容緩沖液例如Hanks’s溶液，Ringer’s溶液，或者生理鹽水緩沖液中配制本發(fā)明的組合物。
除了上面描述的劑型之外，本發(fā)明的MMWH成分還可以配制成貯存制劑。通過包埋(例如皮下或肌肉)或者通過肌內(nèi)注射可以施用這樣的長(zhǎng)時(shí)間起作用的制劑。這樣，例如，所述成分可以與合適的聚合物或疏水性材料(例如作為在可接受油中的乳狀液)或離子交換樹脂，或微溶衍生物，例如作為微溶鹽一起配制。
適用于本發(fā)明的藥物組合物包括其中含有治療有效量的活性成分的組合物?！爸委熡行Я俊?，或者可互換使用的“藥學(xué)可接受劑量”，或者可互換使用的“抗凝劑有效量”指當(dāng)通過例如滅活血塊-結(jié)合的凝血酶，抗凝血酶催化因子Xa滅活抑制凝血酶產(chǎn)生等來治療例如上述的那些與血栓相關(guān)的心血管疾病時(shí)，為了實(shí)現(xiàn)期望的結(jié)果，例如抑制血栓增加，而存在的混合物，即MMWH成分的足夠量。施用的成分的量當(dāng)然將取決于要治療的患者，患者的體重，疾病的嚴(yán)重程度，給藥方式和臨床醫(yī)生的判斷。有效量的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)，特別是著眼這里提供的詳細(xì)描述的公開內(nèi)容。
可以對(duì)動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物，特別是人患者施用本發(fā)明的治療或組合物。所述動(dòng)物也包括家畜，包括馬，牛，綿羊，豬，貓，狗和動(dòng)物園動(dòng)物。
典型地，活性產(chǎn)物，即所述MMWH成分在藥物組合物中存在的濃度范圍是大約2微克/劑量至200微克/劑量，更優(yōu)選濃度范圍是大約5微克/劑量至50微克/劑量。日劑量根據(jù)具體MMWH的特異活性可以有大范圍的變化，但是通常以大約0.5微克/千克體重/天至大約15微克/千克體重/天的濃度范圍存在，更優(yōu)選地，以大約1微克/千克體重/天至大約5微克/千克體重/天的濃度范圍存在。
除了用于治療上述心血管疾病的藥物組合物中之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解活性產(chǎn)物即所述MMWH成分可以用作體外解釋血液凝固機(jī)理的試劑。
通過具體的實(shí)施例更詳細(xì)描述本發(fā)明。提供下面的實(shí)施例是為了詳細(xì)說明目的，而不是要以任何方式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識(shí)到可以變化或改變得到基本上相同的結(jié)果的各種非關(guān)鍵性參數(shù)。
實(shí)施例實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)觀察1.1當(dāng)前可獲得的抗凝劑的臨床局限性肝素，LMWH和定向凝血酶抑制劑在急性冠狀綜合癥中有局限性。對(duì)于患有不穩(wěn)定性咽峽炎的患者，當(dāng)停止用這些藥物治療之后會(huì)集中復(fù)發(fā)局部缺血作用(Theroux，P.，等(1992)N.Engl.J.Med.327141-145；Granger，C.B.，等(1996)，循環(huán)(Circulation)93870-888；Oldgren，J.，等(1996)，循環(huán)(Circulation)94(增刊1)I-431)。這是由于凝固的再次激活，因?yàn)橛邢嚓P(guān)的凝血酶原片段F1.2(F1.2)和血纖肽A(FPA)的血漿水平升高，分別反映出增加的凝血酶產(chǎn)生和凝血酶活性(Granger，C.B.，等(1995)，循環(huán)(Circulation)911929-1935).對(duì)于急性心肌梗塞患者，用組織纖溶酶原激活物(tPA)，鏈激酶的血栓治療誘導(dǎo)特征在于提高水平的FPA的前凝血酶狀態(tài)(Eisenberg，P.R.，等(1987)J.Am.Coll.Cardiol.10527-529；Owen，J.，等(1988)血液(Blood)72616-620)，其只是被肝素部分還原(Galvani，J.，等(1994)J.Am.Coll.Cardiol.241445-1452；Merlim，P.A.，等(1995)J.Am.Coll.Cardiol.25203-209)。這解釋了為什么輔助肝素不減少接受鏈激酶的患者復(fù)發(fā)局部缺血作用的發(fā)生(Collins，R.，等(1996)BMJ313652-659)，并且對(duì)給藥t-PA的那些只有可懷疑的好處(Collins，R.，等(1996)BMJ313652-659)。盡管水蛭素比作為血栓治療和對(duì)沒有接受血栓治療藥物的非-Q波梗塞的患者的輔助治療的肝素好，但是水蛭素的早期利益在30天內(nèi)就消耗掉了(GUSTO研究者(Investigator)(1996)N.Engl.J.Med.335(11775-782)。這些發(fā)現(xiàn)提示有持久的形成血栓的刺激物，其對(duì)肝素和水蛭素有抗性。
在冠狀血管成形術(shù)設(shè)立中可以看到類似的結(jié)果，盡管阿司匹林和高劑量肝素的6-8％的患者復(fù)發(fā)局部缺血作用。盡管在成功的冠狀血管成形術(shù)之后的頭72小時(shí)水蛭素優(yōu)于肝素，但是其好處30天即耗盡(Serruys，P.W.，等(1995)N.Engl.J.Med.333757-763)。類似地，在第7天，類水蛭素(hirulog)，一種半合成水蛭素類似物(Bittl，J.A.，等(1995)藥物雜志(J.Med.)333764-769)，在對(duì)急性心肌梗塞之后的不穩(wěn)定性咽峽炎接受血管成形術(shù)的患者預(yù)防復(fù)發(fā)性局部缺血作用方面比肝素更好；但是30天后，類水蛭素(hirulog)和肝素之間沒有差別(Bittl，J.A.，等(1995)藥物雜志(J.Med.)333764-769)。很可能急性動(dòng)脈血栓對(duì)肝素，LMWH和水蛭素的抗性以及當(dāng)中止治療時(shí)發(fā)生的凝固的再激活兩方面反映這些抗凝劑不能平定血栓的強(qiáng)血栓原活性。
1.2負(fù)責(zé)急性動(dòng)脈血栓的血栓原活性的因子血管損傷觸發(fā)動(dòng)脈血栓形成。動(dòng)脈粥樣斑的自發(fā)性或創(chuàng)傷性破裂暴露復(fù)合因子VII/VIIa的組織因子。然后因子VIIa/組織因子復(fù)合物通過激活因子IX和X而引發(fā)凝固作用。盡管因子VIIa/組織因子復(fù)合物中的因子VIIa被組織因子途徑抑制劑快速滅活(Broze GJ Jr(1995)Thromb.Haemost，7490-93)，動(dòng)脈血栓保留了血栓原性。
體外研究把動(dòng)脈血栓的前凝血?jiǎng)┗钚詺w因于(a)與血纖蛋白結(jié)合的凝血酶(Hogg.P.J.，等(1989)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊863619-3623；Weitz，J.I.，等(1990)，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)86385-391)，或(b)與血栓中的血小板結(jié)合的因子Xa(和可能因子IXa)(Eisenberg.P.R.，等(1993)臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)911877-1883)。血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶能局部激活血小板(Kumar.R.，等(1995)Thromb.Haemost.74(3)962-968)并且促進(jìn)凝固(Kumar.R.，等(1994)Thromb.Haemost.72713-721)，從而誘導(dǎo)強(qiáng)前凝血?jiǎng)顟B(tài)。通過觸發(fā)凝血酶產(chǎn)生，血小板-結(jié)合的因子Xa(和IXa)增強(qiáng)該前凝血?jiǎng)顟B(tài)。
血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶和血小板-結(jié)合的因子Xa(和IXa)都對(duì)肝素和LMWH引起的滅活作用有抗性(Hogg.P.J.，等(1989)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊863619-3623；Weitz，J.I.，等(1990)，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)86385-391；Teitel，J.M.，等(1983)臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)711383-1391；Pieter，J.，等(1988)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26315313-15318)，從而解釋了它們不能平定急性動(dòng)脈血栓的前凝血?jiǎng)┗钚?。水蛭素能滅活血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶(Weitz，J.I.，等(1990)，臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)86385-391)，但是不能阻斷血小板-結(jié)合的凝固因子觸發(fā)的凝血酶產(chǎn)生。在該概念的支持下，水蛭素降低FPA的水平，但是對(duì)患有不穩(wěn)定性咽峽炎患者的F1.2水平?jīng)]有影響(Granger，C.B.，等(1995)，循環(huán)(Circulation)911929-1935)。
大量證據(jù)證明血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶和血小板-結(jié)合的因子Xa對(duì)血栓的強(qiáng)前凝血?jiǎng)┯凶饔?。因此，水蛭素或者壁虱抗凝?TAP)(和肝素及LMWH不一樣滅活血小板-結(jié)合的因子Xa和自由因子Xa的因子Xa的定向抑制劑(Waxman.L.，等(1990)科學(xué)(Science)248593-596))不能阻斷當(dāng)在沒有抗凝的全血中培養(yǎng)時(shí)洗滌過的血漿塊促進(jìn)凝固的能力。相反，水蛭素和TAP的組合破壞血漿塊的前凝血?jiǎng)┗钚?，提示急性?dòng)脈血栓的平定需要不僅僅抑制血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶而且還阻斷血小板-結(jié)合的因子Xa觸發(fā)的凝血酶產(chǎn)生的試劑。開發(fā)這些試劑需要理解血纖蛋白-結(jié)合的IIa和血小板-結(jié)合的因子Xa受到保護(hù)不被肝素，LMWH和水蛭素滅活的機(jī)理。
1.3血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶受到保護(hù)不被肝素滅活的機(jī)理研究表明與血纖蛋白結(jié)合的凝血酶在肝素存在下比其不存在下更復(fù)雜，凝血酶/血纖蛋白相互作用的結(jié)果現(xiàn)在更加明確了。
1.3.1不存在肝素下凝血酶/血纖蛋白的相互作用不存在肝素下，α-凝血酶結(jié)合血纖蛋白，其Kd＝2μM。凝血酶上的底物結(jié)合位點(diǎn)外位點(diǎn)1介導(dǎo)結(jié)合(Fenton，J.W.II.等(1988)生物化學(xué)(Biochemistry)277106-7112)，因?yàn)棣?凝血酶(一種其中外位點(diǎn)1被切割的凝血酶的降解形式)和Quick1異常凝血酶(一種天然存在的凝血酶突變體，其中Cys置換了外位點(diǎn)1中的Arg67)不能結(jié)合，而RA-凝血酶(一種外位點(diǎn)2突變體(Ye，J.，等(1994)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26917965-17970)，由于Ala置換了93，97和101位的Arg殘基而有對(duì)肝素的降低的親和性)結(jié)合血纖蛋白，其親合力類似于α-凝血酶。
1.3.2肝素存在下凝血酶/血纖蛋白的相互作用當(dāng)存在肝素時(shí)，和凝血酶與血纖蛋白相互作用模式一樣，與血纖蛋白結(jié)合的凝血酶的量發(fā)生變化。肝素濃度達(dá)到250nM時(shí)，和凝血酶對(duì)血纖蛋白的表觀親和力所作用(圖1B)的一樣，結(jié)合血纖蛋白的凝血酶的量增加(圖1A)；但是在更高肝素濃度時(shí)，凝血酶結(jié)合(圖1A)和凝血酶對(duì)血纖蛋白的親和力逐漸降低(圖1B)。這些數(shù)據(jù)擴(kuò)展了證明固定濃度的肝素增強(qiáng)凝血酶與血纖蛋白結(jié)合的Hogg和Jackson的結(jié)果(參見Hogg，P.J.，等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)265241-247(1990))。
在肝素存在下，凝血酶結(jié)合的模式也改變。而不存在肝素下凝血酶通過外位點(diǎn)1結(jié)合血纖蛋白，肝素存在下見到的增強(qiáng)的α-凝血酶結(jié)合由外位點(diǎn)2介導(dǎo)，因?yàn)楦嗡貙ⅵ?凝血酶的結(jié)合增強(qiáng)到和α-凝血酶相同的程度，但是對(duì)RA-凝血酶的結(jié)合有極少影響(圖2)。此外，肝素存在下的過量的結(jié)合的α-凝血酶被抗外位點(diǎn)2的抗體或被凝血酶原片段2(F2)置換，凝血酶原片段2(F2)和肝素一樣也結(jié)合外位點(diǎn)2(Arni，R.K.，等，生物化學(xué)(Biochemistry)324727-4737)。相反，水蛭素原(hirugen)，一種合成的水蛭素C-末端類似物(Maraganore，J.，等(1989)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2648692-8698)，對(duì)凝血酶的肝素-依賴性結(jié)合沒有影響(圖3)。
這些發(fā)現(xiàn)解釋為表明三元血纖蛋白-凝血酶-肝素復(fù)合物形成，其中凝血酶直接通過外位點(diǎn)1結(jié)合血纖蛋白，并且肝素結(jié)合凝血酶上的血纖蛋白和外位點(diǎn)2兩者(圖4)。因?yàn)楦嗡貙?duì)于血纖蛋白的親和力(Kd＝180nM)類似于對(duì)α-凝血酶的親和力(Kd＝120nM)，所以才發(fā)生這種現(xiàn)象。肝素與血纖蛋白的相互作用是與五糖-無關(guān)的，因?yàn)榈陀H和性的肝素鏈對(duì)抗凝血酶和高親和性鏈一樣緊密結(jié)合。肝素對(duì)凝血酶結(jié)合的雙相作用(圖1)支持三元復(fù)合體形成的概念。因此，在肝素結(jié)合位點(diǎn)飽和之前肝素促進(jìn)凝血酶與血纖蛋白結(jié)合。較高肝素濃度下，隨著無效二元血纖蛋白-肝素和凝血酶-肝素復(fù)合物形成，凝血酶結(jié)合降低。
1.3.3凝血酶/血纖蛋白相互作用的結(jié)果抗凝血酶和肝素輔因子II(HCII)保護(hù)三元血纖蛋白-凝血酶-肝素復(fù)合物中的凝血酶不被滅活。HCII是血漿中發(fā)現(xiàn)的作為第二凝血酶抑制劑的天然存在的抗凝血酶。因此，在血纖蛋白單體存在下抗凝血酶或HCII對(duì)凝血酶滅活的肝素-催化率降低(圖5)。在很寬的肝素濃度范圍內(nèi)，在飽和量的血纖蛋白單體存在下抗凝血酶和HCII引起的滅活率與不存在情況下相比分別慢至多60-和250-倍(圖6A和6B)。為了保護(hù).必須占據(jù)兩個(gè)外位點(diǎn)血纖蛋白占據(jù)外位點(diǎn)1且肝素占據(jù)外位點(diǎn)2。因此，即使肝素通過與它們完整的外位點(diǎn)2結(jié)合并且將它們與血纖蛋白橋接而增強(qiáng)γ-凝血酶和Quick1異常凝血酶與血纖蛋白的結(jié)合，也不會(huì)受到保護(hù)不被滅活，因?yàn)?，它們的改變的外位點(diǎn)1不能與血纖蛋白相互作用(圖7)。RA-凝血酶易于失活，因?yàn)?，即使其以類似于?凝血酶的親和性結(jié)合血纖蛋白，其也由于外位點(diǎn)2處的突變而具有對(duì)肝素的降低的親和力(圖7)。
1.3.4三元血纖蛋白-凝血酶-肝素復(fù)合物中的凝血酶經(jīng)歷活性位點(diǎn)處的別構(gòu)變化所證據(jù)三元復(fù)合物形成誘導(dǎo)的凝血酶活性位點(diǎn)中別構(gòu)變化可能降低凝血酶與其底物或抑制劑的反應(yīng)性。在該概念的支持下，證明當(dāng)IIa在三元血纖蛋白-凝血酶-肝素復(fù)合物中被結(jié)合，但是不與二元凝血酶-肝素或凝血酶-血纖蛋白復(fù)合物結(jié)合時(shí)，合成底物的凝血酶介導(dǎo)的解離速率提高(圖8)。
實(shí)施例22.0中等分子量肝素的產(chǎn)生為了催化凝血酶抑制作用，肝素橋接抗凝血酶和凝血酶(Danielsson，A.，等(1986)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26115467-15473)。前提是該橋接功能要求具有最小分子量為5，400的肝素鏈(Jordan，R.E.，等(1980)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)22510081-10090)。因?yàn)榇蠖鄶?shù)LMWH分子小于5,400道爾頓，所以LMWH具有極小的抗凝血酶的抑制活性(Jordan，R.E.，等(1980)，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.) 22510081-10090)。因?yàn)楦嗡貥蚪幽负脱w蛋白形成三元血纖蛋白-凝血酶-肝素復(fù)合物，假設(shè)該功能也要求最小分子質(zhì)量的肝素鏈。此外，假設(shè)如果該最小分子質(zhì)量與橋接抗凝血酶和凝血酶所需要的不一樣，就有可能有其中肝素鏈太短不能橋接凝血酶和血纖蛋白但是足夠長(zhǎng)橋接抗凝血酶和凝血酶，從而克服肝素抗性的重要的機(jī)理這樣的窗口。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在這樣的窗口。例如，本發(fā)明的MMWH成分足夠長(zhǎng)來催化抗凝血酶對(duì)凝血酶的抑制作用，但是不促進(jìn)凝血酶結(jié)合血纖蛋白(圖9)。因此，與肝素相反，在血纖蛋白存在時(shí)抗凝血酶或HCII對(duì)MMWH-催化的凝血酶抑制作用的速度幾乎和血纖蛋白不存在時(shí)一樣(圖10)。
2.1中等分子量肝素的表征因?yàn)镸MWH的鏈足夠長(zhǎng)來橋接抗凝血酶和凝血酶，所以抗-因子IIa活性(即MMWH催化或激活抗凝血酶對(duì)因子IIa(凝血酶)抑制的能力)與其抗-因子Xa活性(即催化抗凝血酶對(duì)因子Xa抑制的能力)相同。相反，LMWH具有比抗-因子IIa活性更大的抗-因子Xa活性，因?yàn)?，多于一半的LMWH鏈太短不能橋接抗凝血酶和凝血酶。盡管沒有分級(jí)的肝素也具有同等的抗-因子Xa和抗-因子IIa活性，但它不同于本發(fā)明的MMWH成分之處在于，存在血纖蛋白時(shí)，由于沒有分級(jí)的肝素鏈足夠長(zhǎng)，不僅橋接抗凝血酶和凝血酶而且還橋接凝血酶和血纖蛋白，所以它不能催化凝血酶失活。
在其典型構(gòu)象中，本發(fā)明的MMWH成分的特異活性類似于沒有分級(jí)的肝素。因此，其抗-因子Xa和抗-因子IIa活性范圍可以分別是90-150U/毫克和40-100U/毫克。LMWH一般具有100U/毫克的特異抗-因子Xa活性，而其抗-因子IIa活性范圍根據(jù)具體LMWH制備的分子量分布范圍是20-50U/毫克。
實(shí)施例3本發(fā)明的MMWH成分與其它已知抗凝劑的藥效和安全性比較該實(shí)施例說明比較兔動(dòng)脈血栓形成預(yù)防模型中本發(fā)明的MMWH成分(圖中指示為V21)，LMWH，肝素和水蛭素的藥效和安全性的研究。結(jié)果表明本發(fā)明的MMWH比LMWH和肝素更有效并且比水蛭素更安全。改變動(dòng)脈血栓形成預(yù)防模型使得對(duì)相同動(dòng)物可以評(píng)價(jià)藥效和安全性兩方面。通過測(cè)定受傷兔主動(dòng)脈中經(jīng)90分鐘遠(yuǎn)側(cè)達(dá)到95％狹窄時(shí)的流量來評(píng)價(jià)藥效，通過使用兔耳模型測(cè)定經(jīng)30分鐘血液流失來評(píng)價(jià)安全性。以三個(gè)劑量水平比較四種混合物。以大丸劑和灌輸劑施用各混合物90分鐘。下面圖中列出的劑量代表大丸劑和灌輸劑/60分鐘，施用90分鐘。肝素劑量以單位/千克表示，LMWH和V21劑量以毫克/千克表示，水蛭素以毫克/千克表示。V21具有與LMWH類似的抗-Xa活性，并且是LMWH的抗-IIa活性的大約兩倍。因此，LMWH的特異活性是100抗-Xa單位/毫克和30抗-IIa單位/毫克。V21的特異活性是100抗-Xa單位/毫克和60抗-IIa單位/毫克，而肝素的特異活性是大約150抗-Xa單位/毫克和150抗-IIa單位/毫克。以下面的劑量比較抗凝劑。肝素50單位/千克和75單位/千克；LMWH和V210.5，1.0和1.5毫克/千克；水蛭素0.1/0.1，0.1/0.2和0.1/0.3毫克/千克。
為了比較的目的，就抗-Xa活性來說，50單位的肝素相當(dāng)于0.5毫克的LMWH或V21，但是是0.5毫克V21的抗-IIa活性的兩倍以上并且是LMWH的抗-IIa活性的大約4倍。對(duì)于相當(dāng)?shù)目?Xa活性，V21具有LMWH的抗-IIa活性的大約2倍。
該項(xiàng)研究中獲得的結(jié)果在圖11，12，和13中給出。圖11比較了使用經(jīng)90分鐘觀察患者保留的主動(dòng)脈累積時(shí)間的四種抗凝劑的藥效作為藥效的測(cè)出結(jié)果。100％累計(jì)效力反映完全有效，0％累計(jì)效力反映立即和持續(xù)的血栓閉塞。在對(duì)照動(dòng)物，在用低劑量肝素(50/50單位/千克)和低劑量LMWH(0.5/0.5毫克/千克)治療的兔中，立即發(fā)生狹窄的主動(dòng)脈凝結(jié)化并且在全部90分鐘內(nèi)保持閉塞。用所有的四種抗凝劑都有劑量響應(yīng)。但是，該模型對(duì)肝素和LMWH的抗血栓作用有抗性。因此，75/75單位/千克劑量的肝素和1.0毫克/1.0毫克/千克劑量的LMWH沒有效果(累計(jì)效力百分比分別是14％和2％)，并且LMWH1.5/1.5毫克/千克只表現(xiàn)出有限的效力(38％累計(jì)效力)。相反，該模型對(duì)V21和水蛭素的抗血栓作用非常有響應(yīng)。因此，0.5/0.5毫克/千克劑量的V21比75/75單位/千克劑量的肝素更有效，并且比1.0/1.0毫克/千克和1.5/1.5毫克/千克劑量的LMWH更有效。因此，V21至少比LMWH更有效三倍。
圖12說明四種抗凝劑對(duì)30分鐘血液流失的影響。用LMWH，V21和水蛭素觀察劑量響應(yīng)。表現(xiàn)更有效劑量下，V21比LMWH安全得多，表現(xiàn)出相等藥效劑量下，V21比水蛭素更安全。在產(chǎn)生相等程度血液流失劑量下，V21還比肝素有效得多。
圖13說明V21和LMWH的安全性和藥效的比較。以該數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)(即每組中三只動(dòng)物)，在重量基礎(chǔ)上，V21表現(xiàn)出比LMWH更有效大約4倍。因此，對(duì)于相等抗-Xa活性，V21比LMWH更有效4倍，而對(duì)于相等抗-IIa活性，V21效力大約是2倍。這樣的數(shù)據(jù)支持血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶促進(jìn)血栓形成的重要性，因?yàn)閂21抗血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶比LMWH或肝素更有效。在0.5毫克/千克和1.0毫克/千克劑量下，V21表現(xiàn)出與LMWH一樣安全(盡管它有效得多)，但是在1.5毫克/千克劑量下，LMWH比V21產(chǎn)生更多流血。因此，V21表現(xiàn)出比LMWH更有有益藥效與安全性曲線。
實(shí)施例4本發(fā)明的MMWH成分(V21)與LMWH比較研究在兔肝素-敏感性和肝素-抗性血栓形成模型中比較V21(lot#D32)與LMWH(依諾肝素)的藥效。肝素-敏感性模型是靜脈血栓形成預(yù)防模型，肝素-抗性模型是靜脈血栓形成治療模型。V21和LMWH對(duì)抗-因子Xa水平和對(duì)APTT具有類似的離體效果(圖14和15)。因此，在重量基礎(chǔ)上比較這兩種抗凝劑。
1.1預(yù)防模型
a.模型將體重3千克和4千克之間的27只雄性新西蘭白兔隨機(jī)分成3個(gè)治療組。
b.麻醉用肌內(nèi)氯胺酮(50毫克/千克)和噻拉嗪(2毫克/千克)的混合物誘發(fā)的麻醉并且用異氟烷(1-3％)和氧(1L/分鐘)保持。
c.外科手術(shù)腹側(cè)頸區(qū)被刮去并且將兩個(gè)22-計(jì)量器導(dǎo)管(Becton-Dickinson，Sandy，UT)插入左中心冠狀動(dòng)脈和緣冠狀靜脈用于取血樣和用于靜脈內(nèi)給藥治療。通過腹側(cè)頸皮膚切開暴露右面靜脈和頸外靜脈。從周圍組織分離2毫米切片頸靜脈并且使用4-0絲線縫合連接分支。這時(shí)收集對(duì)照動(dòng)脈血液樣品(將1.8毫升血液收集到0.2毫升3.6％檸檬酸鈉中)。將血樣離心并且將血漿貯存于-70℃用于血液凝固研究(A.PTT.TCT和抗-Xa)。施用I-126標(biāo)記的兔血纖蛋白原靜脈大丸劑(10微升至1,000,000,00CPM)。然后對(duì)兔隨機(jī)進(jìn)行下面的靜脈內(nèi)治療之一1. 1毫升鹽水的鹽水(n＝9)靜脈內(nèi)大丸劑2. 0.50亳克/千克(n3)，1.00毫克/千克(n3)，1.5毫克/千克(n＝3)劑量的低分子量肝素(n＝9)(Lovenox，依諾肝素鈉，lot#923，Rhone-Poulenc Rorer，Montreal，魁北克，加拿大)。
3. 0.50毫克/千克(n＝3)，1.00毫克/千克(n＝3)，和1.5毫克/千克(n＝3)劑量的V-21(n＝9)(D-32，lot#521982132)。
給藥治療之后4分鐘通過15個(gè)管的充氣氣球?qū)Ч?#4，F(xiàn)ogarty血小板切除術(shù)導(dǎo)管)將右頸靜脈破壞2厘米長(zhǎng)。通過右面靜脈將氣球?qū)Ч懿迦胗翌i靜脈。氣球靜脈傷害之后立即拔下導(dǎo)管并且取第二份動(dòng)脈血樣。另外，還采集1毫升血液用于測(cè)定放射性。然后通過在靜脈周圍放置兩條止血帶在2厘米右頸靜脈切片中誘導(dǎo)血液停滯。閉塞15分鐘之后切除頸靜脈切片并且放到預(yù)先稱重的棉團(tuán)上稱重。然后，采集第三個(gè)動(dòng)脈血樣用于血液凝固測(cè)試分析。
d.終點(diǎn)以靜脈片段中截留的血液的重量百分比計(jì)算血塊重量(％)。以1毫升全血放射性的百分比計(jì)算血塊放射性(％)。對(duì)血漿樣品分析APTT，TCT和抗-Xa。
附圖16給出了該程序的示意圖。
e.結(jié)果如圖16，17，和18(對(duì)于血塊重量)和圖19，20和21(血塊放射性)所示，在該肝素-敏感性模型中兩種物質(zhì)都有效，但是y21產(chǎn)生更大的劑量反應(yīng)并且在兩個(gè)更高劑量時(shí)比LMWH更有效。
1.2兔模型深靜脈血栓形成的治療a.24小時(shí)跟蹤該項(xiàng)研究的目的是比較對(duì)兔深靜脈血栓形成模型皮下施用V21和LMWH的效果。
通過肌內(nèi)注射氯胺酮(50毫克/千克)和噻拉嗪(2毫克/千克)麻醉24只沒有特殊病原體的雄性新西蘭白兔(體重3千克和4千克)。刮去腹側(cè)頸區(qū)并且用醇和碘溶液進(jìn)行準(zhǔn)備處理。用一個(gè)22-計(jì)量器靜脈導(dǎo)管(Angiocath，Becton-Dickinson Vascular Access，Sandy，Utah，USA)將靜脈導(dǎo)管和動(dòng)脈導(dǎo)管插入左中心冠狀動(dòng)脈和緣冠狀靜脈用于取血樣和用于靜脈內(nèi)給與液體和抗凝劑。將兔轉(zhuǎn)移到操作室并且保持吸入麻醉劑，所述麻醉劑由異氟烷(1-4％)，氧(1L/分鐘)和一氧化二氮(0.5L/分鐘)組成，用面罩送入。
b.血塊形成通過腹側(cè)皮膚切開暴露右頸外靜脈和面靜脈。通過0.5厘米距離兩處4-0絲線縫合實(shí)現(xiàn)面靜脈片段閉塞。在4厘米長(zhǎng)度中連接頸靜脈所有的分支。將Fogarty血小板切除術(shù)導(dǎo)管(#4Fr)通過面靜脈插入頸靜脈并且充氣。通過15個(gè)管的充氣氣球?qū)Ч軐㈩i靜脈破壞4厘米長(zhǎng)后拔下導(dǎo)管。受傷靜脈周圍兩處用4-0絲線縫合制造1.5厘米閉塞頸靜脈片段，然后用手指壓迫排空。從心房主動(dòng)脈排出1毫升動(dòng)脈血到1毫升針管中并且在滅菌試管中與大約1μCi碘-125標(biāo)記的兔血纖蛋白原混合。然后將0.6毫升放射性標(biāo)記的血液從試管排到1毫升針管中，并且首先將0.4毫升標(biāo)記血液平均分到兩個(gè)試管中并且使其凝固。然后通過家用插管(與PB#60連接的23計(jì)量針頭)將剩下的0.2毫升注射到閉塞的頸靜脈片段中。在試管中產(chǎn)生的血塊用作血塊稱重和放射性的基礎(chǔ)值。試驗(yàn)研究證明試管中產(chǎn)生的血塊和頸靜脈中產(chǎn)生的血塊的血塊重量或放射性有大約5％的差異。使頸靜脈中產(chǎn)生的血栓化膿30分鐘并且連接面靜脈。血栓形化膿兔隨機(jī)接受下面的處理25分鐘1)鹽水處理(n＝4)皮下注射無菌鹽水BID；
2)1毫克/千克BID劑量，皮下(n＝4)，和3毫克/千克BID劑量，皮下(n＝4)，低分子量肝素(依諾肝素鈉，Lovenox lot#923，Rhone-Poulenc Rorer，Montreal，魁北克)。
3)1毫克/千克BID皮下(n＝4)劑量，和3毫克/千克BID劑量皮下(n＝4)，V-21(D-32，lot#521982132)。
第一劑量的30％是靜脈給藥，70％皮下給藥；第二劑量只是皮下給藥。在去除止血帶之前30分鐘，用兩處絲線縫合將血栓固定在靜脈壁上防止其在手術(shù)后期間移動(dòng)。去除止血帶之后頸靜脈中沒有殘留狹窄。以常規(guī)方式縫合頸切口。使兔恢復(fù)呼吸100％氧氣并且轉(zhuǎn)移到恢復(fù)室。以24小時(shí)間隔使所有的兔安樂死。
c.血液收集在手術(shù)之前(對(duì)照)和血塊化膿之后5分鐘，1，3，6，9，12和24小時(shí)采集動(dòng)脈血。在各時(shí)間間隔采集2毫升檸檬酸化血液(9∶1比例，3.8％檸檬酸鈉)用于APTT.TCT和Xa測(cè)試。通過靜脈內(nèi)注射鹽水補(bǔ)償血液流失。
d.終點(diǎn)計(jì)算誘導(dǎo)凝固(在試管中產(chǎn)生血塊)時(shí)和終點(diǎn)后24小時(shí)時(shí)以毫克表示的血栓重量(AG Balances#104，Mettler Toledo，F(xiàn)isherScientific Limited，Whitby，Ontario)和血栓放射性(CPM)。
利用24小時(shí)血塊重量減去手術(shù)時(shí)試管中產(chǎn)生的血塊重量除以試管中產(chǎn)生的血塊重量乘以100計(jì)算血塊重量變化百分比(PCCW)。
以％表示的血塊(CA)增重計(jì)算如下AC＝PCCW-CLe.結(jié)果如圖23-28所示，在該肝素-抗性模型中，V21比LMWH更有效。
實(shí)施例5通過肝素的有限高碘酸氧化作用/水解制備本發(fā)明的MMWH成分1.1肝素的有限高碘酸氧化作用/水解研究將肝素溶解于重水中制成10％貯存液。將高碘酸鈉溶解于重水中制成100mM貯備溶液并且保持在4℃。室溫下，在2.5％肝素濃度下，在遞增高碘酸鹽濃度1mM，2.5mM，5mM，8mM，10mM和20mM下，高碘酸鹽氧化反應(yīng)進(jìn)行大約18小時(shí)。通過加入50mM乙二醇中止反應(yīng)并且溫育30分鐘。然后，向該反應(yīng)混合物加入0.25N NaOH，并且室溫下溫育3小時(shí)。反應(yīng)之后，用6N HCl將pH調(diào)節(jié)到pH7。使等分的各反應(yīng)混合物通過HPLC-GPC(G2000柱，0.5函數(shù)/分鐘，注入體積20微升)進(jìn)行分子量分析。與高碘酸鈉濃度漸增的肝素相比，5mM，8mM，10mM和20mM高碘酸鈉濃度下反應(yīng)的分子量分布減小。結(jié)果表明使用大約5mM和大約20mM之間的高碘酸鈉濃度并且在室溫下大約18小時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)期望的裂解。研究(沒有給出)表明，室溫下用0.25N NaOH室溫下用3小時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)最好的堿解。因此，該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中使用的反應(yīng)條件稱之為“有限高碘酸鹽/水解”條件。
1.2通過有限高碘酸鹽氧化作用/水解制備本發(fā)明的MMWH成分用有限高碘酸鹽/水解條件，7mM高碘酸鈉，處理100毫克肝素，并且通過P30凝膠-過濾色譜純化肝素。獲得分子量范圍大約6,000道爾頓至大約12,000道爾頓并且具有大約9,000道爾頓最高分子量的30毫克終產(chǎn)物，即V21-D32。
實(shí)施例6進(jìn)行研究來選擇具有最佳分子量范圍的MMWH成分并且鑒定容易按比例增加來獲得該范圍內(nèi)的肝素級(jí)分的制備方法。
選擇6,000和10,000之間的分子量范圍作為最佳分子量范圍。相當(dāng)于20個(gè)糖單元的6,000最小分子量的成分應(yīng)該提供具有足夠長(zhǎng)來橋接抗凝血酶和凝血酶的含有五糖鏈的肝素鏈。具有相當(dāng)于33個(gè)糖單元的最大分子量10,000，該鏈將(1)太短不能橋接凝血酶和血纖蛋白，一種需要40個(gè)糖單元或更多糖單元的現(xiàn)象，和(b)太短不能表現(xiàn)出對(duì)血漿蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合，一種30個(gè)糖單元或更多糖單元發(fā)生的現(xiàn)象。
肝素級(jí)分用肝素酶，亞硝酸或高碘酸鹽將沒有分級(jí)的肝素解聚得到大約6,000，8,000和10,000道爾頓的級(jí)分。通過這三種方法將產(chǎn)生的最初的級(jí)分多分散化，利用肝素酶或亞硝酸解聚制備這些分子量的尺寸更限制的級(jí)分。表1中說明這些級(jí)分的特征和它們的特異抗-Xa和抗-IIa活性。
對(duì)抗凝血酶的親合力如上所述測(cè)定各肝素級(jí)分對(duì)抗凝血酶的親合力(Weitz等，循環(huán)(Ciruculation)199999682-689)。簡(jiǎn)要地說，使用Perkin-ElmerLS50B發(fā)光光譜儀，200nm(6-nm狹縫寬)下激發(fā)含有2毫升20mMTris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl(TBS)中的100nM抗凝血酶的石英管，并且在340nm(6-nm狹縫寬)驅(qū)動(dòng)下及時(shí)連續(xù)檢測(cè)固有熒光。用微攪棒攪拌試管內(nèi)含物，并且用再循環(huán)水浴保持在25℃。在加入各種肝素級(jí)分的10毫克/毫升溶液5-10毫升之前(I0)和之后(I)測(cè)定固有熒光強(qiáng)度。連續(xù)滴定直到I沒有變化。實(shí)驗(yàn)之后，從時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線讀出I值并且計(jì)算I/I0值，并且對(duì)肝素濃度作圖。然后如前所述(Weits等，上文)分析數(shù)據(jù)。從該分析，能夠獲得化學(xué)計(jì)量，其說明為指示各肝素鏈中包含的五糖鏈的比例。
表2中總結(jié)了親合力。所有的說明都是估算的各級(jí)分中包含的五糖鏈的百分比。通過肝素酶或亞硝酸解聚制備的級(jí)分表現(xiàn)出類似的對(duì)抗凝血酶的親合力。盡管通過高碘酸鹽解聚制備的10,100Da級(jí)分表現(xiàn)出的對(duì)抗凝血酶的親合力類似于肝素酶或亞硝酸解聚得到的級(jí)分，但是高碘酸鹽衍生的低分子量級(jí)分具有與它們的降低的抗-IIa和抗-Xa活性相吻合的更低的親合力(表I)?？梢越忉尀椋豢紤]用于解聚的方法，隨著平均分子量增加，包含五糖鏈的百分比增加。
作為這些分析的對(duì)照，也研究了沒有分級(jí)的肝素，使用抗凝血酶柱通過親和色譜制備的高和低親合力級(jí)分的肝素，依諾肝素和合成的五糖。如表3所述，高親合力級(jí)分的肝素和合成的五糖表現(xiàn)出對(duì)抗凝血酶最高的親合力。只有這兩個(gè)制劑具有100％含五糖鏈。
對(duì)凝血酶的親合力如上所述測(cè)定多分散肝素酶，亞硝酸和高碘酸鹽-衍生的肝素級(jí)分對(duì)凝血酶的親合力，除了使用凝血酶代替抗凝血酶(Fredenburgh，JC等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.) 199727225493-25499).如表4所述，當(dāng)以微克/毫升表示親合力時(shí)，所有的級(jí)分表現(xiàn)出類似的對(duì)凝血酶的親合力。
在血纖蛋白單體不存在或存在下抗凝血酶對(duì)凝血酶抑制作用的肝素-催化的速率在沒有或有0-600微克/毫升濃度范圍的各種肝素級(jí)分存在下，測(cè)定抗凝血酶對(duì)凝血酶抑制作用的二級(jí)速率常數(shù)。在沒有或有4μM血纖蛋白單體存在下測(cè)定抗凝血酶對(duì)凝血酶抑制作用的肝素-催化的速率。如上所述制備血纖蛋白單體，如文獻(xiàn)所述分析數(shù)據(jù)(Becker DL等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，19992746226-6233)。
給出了用肝素酶(圖29)，亞硝酸(圖30)和高碘酸鹽-衍生的肝素級(jí)分(圖31)通過抗凝血酶血纖蛋白-單體對(duì)凝血酶的抑制速率的抑制作用。用血纖蛋白單體的背景抑制作用是通過測(cè)定血纖蛋白單體通過抗凝血酶對(duì)因子Xa滅活的肝素-催化的速率的抑制作用6倍(圖32和33)。用肝素酶或亞硝酸-衍生的肝素級(jí)分的凝血酶滅活速率的減小比用沒有分級(jí)的肝素的小。相反，用高碘酸鹽-衍生的肝素級(jí)分見到用血纖蛋白單體更大的抑制作用(圖31)。用尺寸-限制的肝素酶-衍生的級(jí)分，血纖蛋白單體產(chǎn)生不高于背景抑制作用的抑制作用。
抗凝血酶對(duì)因子Xa的肝素-催化的抑制作用如文獻(xiàn)所述(Becker等，上文)，在沒有或有0-1,500微克/毫升濃度范圍的各種肝素級(jí)分存在下，測(cè)定抗凝血酶對(duì)因子Xa抑制作用的二級(jí)速率常數(shù)。圖34-36分別詳細(xì)說明了用肝素酶，亞硝酸，和高碘酸鹽-衍生的級(jí)分的結(jié)果。當(dāng)以重量測(cè)定等量加入時(shí)，所有的肝素級(jí)分比沒有分級(jí)的肝素級(jí)分產(chǎn)生更小的抗凝血酶對(duì)因子Xa抑制作用的催化作用。
凝血酶結(jié)合血纖蛋白的增強(qiáng)如上文所述(Becker等，上文)，在沒有或有0-7500nM濃度范圍的各種肝素級(jí)分存在下，測(cè)定I125-標(biāo)記的凝血酶與血纖蛋白的結(jié)合。在這些實(shí)驗(yàn)中使用沒有分級(jí)的肝素作為對(duì)照。圖37-39分別詳細(xì)說明了用肝素酶，亞硝酸，和高碘酸鹽-衍生的肝素級(jí)分的結(jié)果。不考慮解聚方法，與低分子量級(jí)分相比，10,000Da級(jí)分將凝血酶與血纖蛋白的結(jié)合增強(qiáng)到更大的程度。這用尺寸更加限制的肝素酶或亞硝酸-衍生的級(jí)分最好地詳細(xì)說明(分別見圖40和41)。
肝素級(jí)分的抗凝血酶活性用體外循環(huán)來比較肝素級(jí)分的抗血栓活性。如上文所述(Becker等，上文)，向再鈣化的用125I-標(biāo)記的人血纖蛋白原增強(qiáng)效果的人全血加入不同濃度的各肝素級(jí)分，并且保持在37℃水浴中。然后使用蠕動(dòng)泵使血液通過40μ血液過濾器循環(huán)。通過(a)用一體化壓力計(jì)量器測(cè)定靠近過濾器的壓力，和(b)從血庫(kù)中連續(xù)取出血樣并且計(jì)量作為血纖蛋白原消耗指數(shù)的殘留放射性，來測(cè)定過濾器中血塊。也測(cè)定起始激活凝固時(shí)間。
如表5所示，不考慮解聚方法，10,000Da級(jí)分在10微克/毫升下有效。因此，在90分鐘的觀察時(shí)間里過濾器效力保持，并且血纖蛋白原消耗小于10％。在10微克/毫升濃度下，肝素酶-衍生的8,000Da級(jí)分有效。6,000Da肝素酶級(jí)分在14微克/毫升下有效。盡管14或16微克/毫升的5,600Da亞硝酸-衍生的級(jí)分效力保持，但是血纖蛋白原消耗分別是33％和20％。作為對(duì)照，也評(píng)價(jià)了依諾肝素。該藥物在10或20微克/毫升下無效，分別在30和55分鐘不能過濾。
表6詳細(xì)說明尺寸更加限制的肝素酶和亞硝酸-衍生的肝素級(jí)分的抗凝血酶活性。在10微克/毫升依諾肝素作為對(duì)照下，對(duì)所有的級(jí)分在10微克/毫升濃度下測(cè)試。除了5,300Da肝素酶-衍生的級(jí)分，所有的肝素級(jí)分有效保持效力90分鐘以上，并且將血纖蛋白原消耗減小至低于10％。相反，依諾肝素則無效，30分鐘時(shí)不能過濾，并且血纖蛋白原消耗73％。表7詳細(xì)說明尺寸更加限制的肝素酶和亞硝酸-衍生的肝素和高碘酸鹽級(jí)分的抗凝血酶活性。在10微克/毫升依諾肝素作為對(duì)照下，對(duì)所有的級(jí)分在10微克/毫升濃度下測(cè)試。肝素酶和亞硝酸衍生的級(jí)分氨基化效力有效。高碘酸鹽-衍生的級(jí)分和依諾肝素效力較低。
要明白上面的說明是為了詳細(xì)描述而不是限制性的。通過閱讀上面的說明，很多實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，本發(fā)明的范圍不應(yīng)該參照上述描述來確定，而應(yīng)該參照后面的權(quán)利要求書以及要求的權(quán)利要求等同全范圍來確定。所有文章和參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容，包括專利申請(qǐng)和專利公開，在這里對(duì)于所有目的全文引作參考。
表1LEO提供的肝素級(jí)分的表征解聚方法 分子量多分散性抗-IIa抗-Xa肝素酶 6,000 1.5721068,500 1.5100 13410,350 1.5152 111HNO25,600 1.5591188,200 1.4100 15210,300 1.4119 180IO4-6,700 1.511307,900 1.5194310,100 1.5438810,300 1.54284肝素酶 5,300 1.222818,450 1.2671169,750 1.387155HNO25,900 1.232957,700 1.3841239,300 1.2106 162
表2肝素級(jí)分對(duì)抗凝血酶的親合力和各級(jí)分中含五糖鏈的百分比葡萄糖胺聚糖 Kd含五糖nM ％肝素酶 6,000 91.2±15.9 14.88,050 61.7±4.2 20.810,350 48.0±7.8 27.0HNO25,600 55.6±0.2 16.08,200 42.5±9.1 25.210,300 37.5±2.9 31.5IO4-6,700 170.1±27.46.88,200 140.3±4.5 10.510,300 57.0±28.3 25.6肝素酶 5,300 421.6±72.315.98,450 167.0±17.029.49,750 138.4±2.2 32.2HNO25,900 32.8±0.3 21.17,700 23.1±4.1 26.99,300 17.0±0.3 36.6
表3沒有分級(jí)的肝素，對(duì)抗凝血酶有高或低親合力的肝素，依諾肝素和合成五糖對(duì)抗凝血酶的親合力和各制劑中含五糖鏈的百分比葡萄糖胺聚糖 Kd含五糖nM ％沒有分級(jí)的肝素31.7 43.1高親和性肝素 10.7 114低親和性肝素 6670.0 1.0依諾肝素 46.8 14.4五糖 31.0 102
表4肝素酶和亞硝酸-衍生的肝素級(jí)分對(duì)凝血酶的親合力葡萄糖胺聚糖KdKdnM μg/ml肝素酶 6,000 1517±1969.1±1.28.050 872±9 7.0±0.110,350 699±97 7.2±1.0HNO25,600 1288±92 7.2±0.58,200 695±37 5.7±0.310,300 632±51 6.5±0.5IO46,700 731±159 4.9±1.17,900 587±8 4.6±0.110,100 285±5 2.9±0.5
表5體外循環(huán)中肝素酶，亞硝酸和高磺酸鹽-衍生的肝素級(jí)分和依諾肝素的抗血栓活性葡萄糖胺聚糖 濃度 不能過濾時(shí)血纖蛋白起始的時(shí)間 消耗ACTμg/ml min ％ sec肝素酶 6kDa875 82 27110 ＞90 68 24812 ＞90 31 22614 ＞90 7 3358kDa540 70 241645 70 2308 ＞90 54 25610 ＞90 6 28210kDa 545 72 2316 ＞90 36 2998 ＞90 29 30010 ＞90 4 327HNO25.6kDa 10 ＞90 29 23812 ＞90 57 23514 ＞90 33 23816 ＞90 20 2648.2kDa 10 60 81 23911 ＞90 28 31312 ＞90 10 30116 ＞90 8 42810.3kDa 8 ＞90 14 30310 ＞90 28 28711 ＞90 7 34112 ＞90 7 359IO4-6.7kDa 10 45 68 -7.9kDa 10 90 73 29910.1kDa 10 ＞90 6 318依諾肝素10 30 73 20220 55 64 231
表6體外循環(huán)中10微克/毫升肝素酶亞硝酸-衍生的肝素級(jí)分和依諾肝素的活性比較葡萄糖胺聚糖不能過濾時(shí) 血纖蛋白 起始的時(shí)間原消耗ACTmin ％sec肝素酶 5,300 30 802058,450 ＞90 9 2839,750 ＞90 8 312HNO25,900 ＞90 112787,700 ＞90 5 3149,300 ＞90 8 557依諾肝素 30 73202
表7體外循環(huán)中10微克/毫升肝素酶、亞硝酸衍生的和高磺酸衍生的肝素級(jí)分和依諾肝素的活性比較葡萄糖胺聚糖 不能過濾時(shí) 血纖蛋白 起始的時(shí)間 原消耗ACTmin％ sec肝素酶8,450 ＞90 7.1 289HNO27,700 ＞90 5.6 296IO4 7,900 30 77 242依諾肝素 30 80 23權(quán)利要求
1.一種中等分子量肝素(MMWH)成分，其中包含分子量范圍大約6,000道爾頓至大約12,000道爾頓的寡糖硫酸酯的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的MMWH成分，其中所述MMWH成分(1)通過催化抗凝血酶抑制血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶和液相凝血酶，和(2)通過抗凝血酶催化因子Xa失活來抑制凝血酶產(chǎn)生。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的MMWH成分，其中所述MMWH成分具有大約40U/毫克至大約100U/毫克的抗因子IIa活性，和大約90U/毫克至大約150U/毫克的抗因子Xa活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的MMWH成分，其中所述MMWH成分具有大約60U/毫克至大約75U/毫克的抗因子IIa活性，和大約100U/毫克至大約125U/毫克的抗因子Xa活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的MMWH成分，其中所述MMWH成分具有大約65U/毫克的抗因子IIa活性，和大約115U/毫克的抗因子Xa活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的MMWH成分，其中所述MMWH成分包含分子量范圍大約8,000道爾頓至大約10,000道爾頓的寡糖硫酸酯的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的MMWH成分，其中所述MMWH成分具有大約9,000平均分子量。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的MMWH成分，其中所述寡糖硫酸酯的至少31％具有大于或等于大約7,800的分子量。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的MMWH成分，其中所述寡糖硫酸酯的至少25％具有大于或等于大約10,000道爾頓的分子量。
10.一種中等分子量肝素(MMWH)成分，特征在于下面特征的一項(xiàng)或多項(xiàng)的包含肝素衍生的寡糖的混合物(a)體外具有抗凝血酶-和肝素輔因子II(HCII)-相關(guān)的抗凝劑活性；(b)寡糖太短不能橋接凝血酶和血纖蛋白，但是有足夠的長(zhǎng)度橋接抗凝血酶或者HCII和凝血酶；(c)具有至少15％，20％，25％，30％，35％或40％的具有至少一個(gè)或多個(gè)五糖序列的寡糖；(d)富集分子量范圍是大約6,000至大約11,000；7,000至10,000；7,500至10,000；7,800至10,000；7,800至9,800；或7,800至9,600；8,000至9,600的寡糖；(e)寡糖具有大約7,800至10,000，優(yōu)選7,800至9,800，更優(yōu)選8,000至9,800的平均分子量；(f)至少30％，35％，40％，45％或50％的寡糖具有大于或等于6000道爾頓，優(yōu)選大于或等于8000道爾頓的分子量；(g)1.1至1.5，優(yōu)選1.2至1.4，最優(yōu)選1.3的多分散性；(h)具有類似的抗-因子Xa和抗-因子IIa活性，優(yōu)選抗-因子Xa活性和抗-因子IIa活性之比是大約2∶1至大約1∶1，更優(yōu)選地，大約1.5∶1至大約1∶1；(i)抗-因子Xa活性是大約80IU/毫克至大約155IU/毫克，優(yōu)選90IU/毫克至大約130IU/毫克，更優(yōu)選地，大約95IU/毫克至大約120IU/毫克，最優(yōu)選100-110IU/毫克；和(j)抗-因子IIa活性是大約20IU/毫克至大約150IU/毫克，優(yōu)選40IU/毫克至大約100IU/毫克，更優(yōu)選地，大約80IU/毫克至大約100IU/毫克，最優(yōu)選大約90-100IU/毫克。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的MMWH成分，其具有(a)，(b)，(c)和(d)的特征；(a)，(b)，(c)和(e)的特征；(b)，(c)，(e)和(g)的特征；(b)，(d)，(c)，(e)和(h)的特征；(b)，(c)，(d)和(g)的特征；(b)，(e)，(g)，(i)和(j)的特征；(b)，(e)，(f)，(g)，(i)和(j)的特征；或者(a)至(j)的特征。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的MMWH成分，其富集具有7,800至8,800，優(yōu)選7,800至8,600，更優(yōu)選7,800至8,500，最優(yōu)選8,000至8,500分子量范圍的寡糖。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的MMWH成分，其富集具有9,000至10,000，優(yōu)選9,200至9,800，更優(yōu)選9,300至9,600，最優(yōu)選9,400至9,600分子量范圍的寡糖。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的MMWH成分，其包含具有7,800至8,800，優(yōu)選7,800至8,600，更優(yōu)選7,800至8,500，最優(yōu)選8,000至8,500平均分子量的寡糖。
15.根據(jù)權(quán)利要求10的MMWH成分，其包含具有9,000至10,000，優(yōu)選9,200至9,800，更優(yōu)選9,300至9,600，最優(yōu)選9,400至9,600平均分子量的寡糖。
16.從沒有分級(jí)的肝素的肝素酶解聚或亞硝酸解聚衍生的權(quán)利要求10，11，12，13，14，或15中要求的MMWH成分。
17.治療患者血栓疾病的方法，包括對(duì)患者施用藥學(xué)可接受劑量的前面權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求的中等分子量肝素(MMWH)成分。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述血栓疾病是動(dòng)脈血栓形成，冠狀動(dòng)脈血栓形成，靜脈血栓形成或肺栓塞。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述MMWH成分通過注射給藥。
20.預(yù)防有發(fā)生血栓形成危險(xiǎn)的患者形成血栓的方法，包括對(duì)患者施用藥學(xué)可接受劑量的前面權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求的中等分子量肝素(MMWH)成分。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述患者由于破壞止血的醫(yī)學(xué)癥狀而有增加的發(fā)生血栓形成的危險(xiǎn)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述醫(yī)學(xué)癥狀是冠狀動(dòng)脈疾病或動(dòng)脈粥樣硬化。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述患者由于醫(yī)療過程而有增加的發(fā)生血栓形成的危險(xiǎn)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述醫(yī)療過程是心臟手術(shù)，心肺旁路術(shù)，導(dǎo)管插入術(shù)，或動(dòng)脈粥樣硬化斑切除術(shù)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述導(dǎo)管插入術(shù)是心臟導(dǎo)管插入術(shù)。
26.抑制患者血栓形成的方法，包括對(duì)患者施用藥學(xué)可接受劑量的前面權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求的中等分子量肝素(MMWH)成分步驟。
27.含有前面權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求的MMWH成分和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。
28.治療患者深靜脈血栓形成的方法，包括對(duì)接受矯形外科手術(shù)的患者施用藥學(xué)可接受劑量的前面權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求的中等分子量肝素(MMWH)成分。
29.預(yù)防患者肺栓塞的方法，包括對(duì)患者施用藥學(xué)可接受劑量的前面權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求的中等分子量肝素(MMWH)成分。
30.一種制備中等分子量肝素(MMWH)成分的方法，包括(a)使沒有分級(jí)的肝素進(jìn)行有限高碘酸鹽氧化反應(yīng)使得只氧化沒有分級(jí)的肝素的艾杜亞硝酸；(b)將步驟(a)的氧化的沒有分級(jí)的肝素進(jìn)行堿解；和(c)回收所述MMWH成分，其中所述MMWH成分包含分子量范圍大約8,000道爾頓至大約12,000道爾頓的寡糖硫酸酯的混合物。
31.前面權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求的MMWH成分在制備用于治療血栓疾病或者預(yù)防有發(fā)生血栓形成危險(xiǎn)的患者形成血栓的藥物的用途。
32.前面權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求的MMWH成分在制備用于抑制患者血纖蛋白-結(jié)合的凝血酶或凝血酶產(chǎn)生的藥物的用途。
33.前面權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求的MMWH成分在制備用于治療深靜脈血栓形成的藥物的用途。
34.前面權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求的MMWH成分在制備用于預(yù)防患者肺栓塞的藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于治療心血管疾病的成分和方法。更具體地說,本發(fā)明涉及通過施用特別是能夠(1)通過催化抗凝血酶滅活液相凝血酶和或者與凝塊中的血纖蛋白結(jié)合或者與一些其它表面結(jié)合的凝血酶;和(2)通過抗凝血酶III(ATIII)催化因子Xa滅活作用抑制凝血酶產(chǎn)生的物質(zhì)來改變血栓形成。本發(fā)明的成分和方法特別用于預(yù)防賁門旁路器循環(huán)中和接受腎透析的患者中血栓形成,和用于治療患有與血栓相關(guān)的心血管疾病或者有患與血栓相關(guān)的心血管疾病危險(xiǎn)的患者,所述與血栓相關(guān)的心血管疾病例如不穩(wěn)定性咽峽炎,急性心肌梗塞(心臟病發(fā)作),腦血管意外(中風(fēng)),肺栓塞,深靜脈血栓形成,動(dòng)脈血栓形成等。
文檔編號(hào)A61K31/727GK1371391SQ00812090
公開日2002年9月25日 申請(qǐng)日期2000年6月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月30日
發(fā)明者J·I·維茨, J·希爾斯 申請(qǐng)人:漢密爾頓市醫(yī)院研究發(fā)展有限公司