專利名稱：誘導(dǎo)抗黑素瘤患者肺轉(zhuǎn)移的抗－腫瘤應(yīng)答的方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考根據(jù)35 U.S.C.§119，本申請(qǐng)要求了1998年4月9日提交的臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)No.60/081256的優(yōu)先權(quán)，其全部公開(kāi)內(nèi)容引作參考。政府資金參考本文所描述的本發(fā)明是美國(guó)公共健康協(xié)會(huì)NIH資助號(hào)CA29348資助或授予的工作過(guò)程中完成的。美國(guó)政府對(duì)本發(fā)明享有一定權(quán)利。
Fujiwara等,J.Immunol.,1984,132,1571揭示結(jié)合半抗原三硝基苯(TNP)的小鼠腫瘤細(xì)胞將在鼠類系統(tǒng)中誘導(dǎo)抗未修飾腫瘤細(xì)胞的系統(tǒng)免疫性，前提是在沒(méi)有半抗原特異性抑制T細(xì)胞存在下小鼠首先對(duì)半抗原致敏。得自處理過(guò)的小鼠的脾細(xì)胞完全地特異性地抑制未處理受體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。Hood等,I Immunol.,1987,138,3573揭示用結(jié)合TNP的紫外光誘導(dǎo)的“退化性”腫瘤免疫的小鼠能排斥非免疫性的結(jié)合了TNP的“進(jìn)行性”腫瘤。此外，這些小鼠接著抵抗未結(jié)合的“進(jìn)行性”腫瘤的攻擊。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)體系中，F(xiàn)ujiwara等,J.Immunol.,1984,133,510證明環(huán)磷酰胺預(yù)處理后對(duì)三硝基氯苯(TNCB)敏感的小鼠通過(guò)腫瘤細(xì)胞的原位半抗原化作用可能會(huì)治愈大的腫瘤(10mm)；接著，這些動(dòng)物特異性抵抗未結(jié)合的腫瘤細(xì)胞的攻擊。但是，這些結(jié)果不能證明從人自身性腫瘤分離到的半抗原化細(xì)胞在免疫治療中是否是有效的和是否能誘導(dǎo)腫瘤退化。
最近證實(shí)了與未修飾的組織起交叉反應(yīng)的T細(xì)胞的存在。Weltzien和同事的揭示從用TNP-修飾的同源淋巴細(xì)胞免疫的小鼠產(chǎn)生的Ⅰ類MHC-限制的T細(xì)胞克隆對(duì)MHC-相關(guān)的，TNP-修飾的“自身”肽產(chǎn)生應(yīng)答。Ortmann,B.,等,J.Immunol.,1992,148,1445。另外，已經(jīng)確定了用TNP-修飾的淋巴細(xì)胞免疫小鼠導(dǎo)致脾T細(xì)胞的發(fā)育，其顯示體外對(duì)TNP-修飾的細(xì)胞第二增殖和細(xì)胞毒性響應(yīng)。Shearer,G.M.Eur.J.Immunol.,1974,4,527。
這些實(shí)驗(yàn)共同特性是用其中沒(méi)有誘導(dǎo)抑制細(xì)胞的介質(zhì)中的半抗原致敏。來(lái)自環(huán)磷酰胺預(yù)處理的TNCB-致敏的小鼠的脾細(xì)胞表現(xiàn)出放射抗性“擴(kuò)增的輔助細(xì)胞功能”，即它們特異性地?cái)U(kuò)大抗-TNP細(xì)胞毒性的體外產(chǎn)生。此外，一旦這些擴(kuò)增的輔助細(xì)胞被體外暴露給TNP-結(jié)合的自身淋巴細(xì)胞激活，則它們能增加對(duì)不相關(guān)抗原(包括腫瘤抗原)的細(xì)胞毒性(Fujiwara等，1984)。Flood等(1987)，上文，證明這種增強(qiáng)的輔助細(xì)胞活性由具有Lyt-1+,Lyt-2-,L3T4+,I-J+表型的T細(xì)胞介導(dǎo)，并且推測(cè)這些細(xì)胞是抗抑制細(xì)胞，即一類新的免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞。
用黑素瘤對(duì)患者的免疫治療表明，用第一抗原匙孔血藍(lán)蛋白致敏之前三天，以高劑量(1000mg/M2)或低劑量(300mg/M2)給予環(huán)磷酰胺顯著增強(qiáng)了對(duì)該抗原的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的獲得(Berd等,Cancer Res.,1982,42,4862；Cancer Res.,1984,44,1275)。低劑量環(huán)磷酰胺預(yù)處理使轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者對(duì)由于注射自身性黑素瘤疫苗應(yīng)答的自身性黑素瘤細(xì)胞產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)(Berd等，Cancer Res.,1986,46,2572；Cancer Invest.,1988,6,335)。給予環(huán)磷酰胺導(dǎo)致外周血淋巴細(xì)胞非特異性T抑制細(xì)胞功能的減弱(Berd等.,CancerRes.,1984,44,5439；Cancer Res.,1987,47,3317)，可能是由于減少了CD4+，CD45R+抑制性誘導(dǎo)T細(xì)胞(Berd等，Cancer Res.,1988,48,1671)。該免疫治療方案的抗腫瘤效果顯示受到開(kāi)始給予疫苗和對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)之間過(guò)長(zhǎng)的間隔的限制(Berd等，Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.,1988,29,408(#1626))。因此，對(duì)于提高這樣一種疫苗的治療效果使其更具免疫原性存在要求。
現(xiàn)在，大多數(shù)腫瘤免疫學(xué)家贊同T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤塊是通過(guò)免疫系統(tǒng)破壞腫瘤細(xì)胞的先決條件。結(jié)果，注意力主要放在什么變成已知為“TIL”治療，在這方面NCI的Dr.Stephen Rosen berg是先驅(qū)者。Dr.Rosen berg和其它人從人癌轉(zhuǎn)移灶提取出了幾種天然存在的T淋巴細(xì)胞，并且通過(guò)將其在體外與白細(xì)胞介素2(IL-2)(一種T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)因子)一起培養(yǎng)而將其數(shù)量大大擴(kuò)大。Topalian等，J.Clin.On Col.,1988,6,839。但是這種治療還不是非常有效的，因?yàn)樽⑸涞腡細(xì)胞的局限性在于它們有“回到”腫瘤位點(diǎn)的能力。
據(jù)信人黑色素瘤表達(dá)獨(dú)特的為T(mén)淋巴細(xì)胞識(shí)別的表面抗原。Old,L.J.,Cancer Res.,1981,41,361；Van der Bruggen,P.,等，Science,1991,254,1643；Mu kherji,B.,等，J.Immunol.,1986,136,1888；和Anichini,A.,等，J.Immunol.,1989,142,3692。但是，本發(fā)明人所做工作之前的免疫治療方案的局限性在于難以體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)于該抗原的有效的T細(xì)胞-介導(dǎo)的應(yīng)答。
二十世紀(jì)六十年代末和七十年代初，英國(guó)St.Barthlomew’s醫(yī)院R.Powles研究小組對(duì)化療減輕癥狀之后的急性骨髓性白血病(AML)患者進(jìn)行了一系列疫苗治療研究。他們使用了帶有BCG的異源AML細(xì)胞作為佐劑。進(jìn)行了幾次試驗(yàn)，都使用小的試樣規(guī)格(N=10-15)。與單獨(dú)的化療相比，使用化療和免疫治療的組合在某種程度上延長(zhǎng)了存活時(shí)間，但是沒(méi)有延長(zhǎng)不復(fù)發(fā)情況的存活時(shí)間。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的毒性；沒(méi)有發(fā)現(xiàn)自身免疫性(例如對(duì)正常骨髓的毒性?；仡櫰饋?lái)這些試驗(yàn)存在一些技術(shù)問(wèn)題1)使用的是同種異體白血病細(xì)胞而不是自體白血病細(xì)胞；2)疫苗中白血病細(xì)胞的劑量是過(guò)量的(最多109個(gè)細(xì)胞/劑)；3)BCG劑量非常高并且BCG給藥的時(shí)間和部位與白血病細(xì)胞疫苗分離；和4)在患者接受細(xì)胞毒性藥物(保持或者鞏固化療)的同時(shí)給予疫苗。
治療人癌癥所使用的常規(guī)治療一般來(lái)說(shuō)是不成功的。在本發(fā)明人工作之前，給予疫苗組合物也不能可靠地誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的產(chǎn)生。因此，本領(lǐng)域仍然需求治療癌癥特別是癌轉(zhuǎn)移的新方法。現(xiàn)在，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)了在轉(zhuǎn)移黑素瘤患者體內(nèi)誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答的有效方法，特別是誘導(dǎo)腫瘤消退的有效方法。
因此，一方面，本發(fā)明涉及通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物優(yōu)選對(duì)人施用包括有效量的至少一種下述物質(zhì)的組合物而誘導(dǎo)抗黑素瘤轉(zhuǎn)移的抗腫瘤應(yīng)答的方法(ⅰ)基本上處于非生長(zhǎng)期的半抗原修飾的同源哺乳動(dòng)物黑素瘤細(xì)胞，(ⅱ)半抗原修飾的黑素瘤細(xì)胞膜，(ⅲ)從所述半抗原修飾的黑素瘤細(xì)胞或膜分離的肽和(ⅳ)能介導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答的T細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)至少一種下面的抗腫瘤應(yīng)答腫瘤壞死，腫瘤消退，腫瘤炎癥，通過(guò)激活的T淋巴細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)，穩(wěn)定疾病和患者存活時(shí)間的延長(zhǎng)。
另一方面，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)抗肺轉(zhuǎn)移的抗腫瘤應(yīng)答的方法，優(yōu)選完全或部分消退轉(zhuǎn)移和/或延長(zhǎng)存活時(shí)間。
另一方面，本發(fā)明涉及分離的哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)的用半抗原修飾的黑素瘤細(xì)胞或膜，從這樣的細(xì)胞和膜分離的肽，和能介導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答的T細(xì)胞，以及它們的組合物。
另一方面，本發(fā)明提供含有治療有效量的哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的用半抗原修飾的黑素瘤細(xì)胞或膜，從這樣的細(xì)胞和膜分離的肽，T細(xì)胞，或者其適合對(duì)患有轉(zhuǎn)移黑素瘤優(yōu)選肺轉(zhuǎn)移的哺乳動(dòng)物施用的組合的疫苗組合物和劑型。
在本發(fā)明的另一方面，所述組合物含有一種佐劑，例如卡介菌(Bacillus Calmette Guerin)(BCG),QS-21，去毒的內(nèi)毒素和細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-4,γ-干擾素，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15和GM-CSF。
發(fā)明的詳細(xì)描述本文引述的所有專利，專利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)在這里引作參考。在不一致的情況下，以本公開(kāi)內(nèi)容為準(zhǔn)。
本發(fā)明涉及通過(guò)給予有效量的含有至少一種下述物質(zhì)的組合物而誘導(dǎo)抗黑素瘤(優(yōu)選肺轉(zhuǎn)移)的抗腫瘤應(yīng)答的方法(ⅰ)基本上處于非生長(zhǎng)期的半抗原-修飾的同源哺乳動(dòng)物黑素瘤細(xì)胞，(ⅱ)半抗原-修飾的黑素瘤細(xì)胞膜，(ⅲ)從所述半抗原-修飾的黑素瘤細(xì)胞或膜分離的肽和(ⅳ)能介導(dǎo)例如轉(zhuǎn)移消退的抗腫瘤應(yīng)答的T細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞、膜、肽和T細(xì)胞具有誘導(dǎo)至少一種下述抗腫瘤應(yīng)答的性質(zhì)腫瘤壞死，腫瘤消退，腫瘤炎癥，通過(guò)激活的T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，遲發(fā)型超敏反應(yīng)，和患者生存時(shí)間的延長(zhǎng)。所述細(xì)胞、膜，肽和它們的組合物能引發(fā)具有浸潤(rùn)哺乳動(dòng)物腫瘤性質(zhì)的T淋巴細(xì)胞，引發(fā)對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤的炎癥免疫應(yīng)答，引發(fā)對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤的延遲型超敏反應(yīng)和/或體外刺激T淋巴細(xì)胞。
本發(fā)明的黑素瘤細(xì)胞、膜、肽和T細(xì)胞和它們的組合物可以用來(lái)治療哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的黑素瘤，包括治療轉(zhuǎn)移性和原發(fā)性黑素瘤。轉(zhuǎn)移性黑素瘤可以包括淋巴結(jié)，肺和皮下轉(zhuǎn)移。用本發(fā)明的制劑、組合物和方法可以治療Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期或Ⅳ期癌癥，優(yōu)選治療Ⅲ期和Ⅳ期。根據(jù)本發(fā)明治療的肺轉(zhuǎn)移優(yōu)選是小的肺轉(zhuǎn)移。為了本發(fā)明的目的，“小的”肺轉(zhuǎn)移直徑小于大約2cm，優(yōu)選直徑小于大約1.5cm，最優(yōu)選直徑小于大約1cm。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物黑素瘤轉(zhuǎn)移局限于所述哺乳動(dòng)物的肺部。根據(jù)本發(fā)明要治療的肺轉(zhuǎn)移可以是單個(gè)或多個(gè)小結(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明用來(lái)治療家畜，例如貓科、犬科、馬科和?？频某蓡T。
應(yīng)該明白本說(shuō)明書(shū)關(guān)于分離的黑素瘤細(xì)胞的使用的任何公開(kāi)內(nèi)容同樣適用于使用黑素瘤細(xì)胞、膜、肽、T細(xì)胞或者它們的組合。本發(fā)明的制劑和它們的組合物黑素瘤細(xì)胞、膜、肽和T細(xì)胞在本文中統(tǒng)稱為本發(fā)明的制劑。此外，術(shù)語(yǔ)“提取物”可以用來(lái)統(tǒng)指破碎的黑素瘤細(xì)胞，分離的黑素瘤細(xì)胞膜和黑素瘤細(xì)胞肽。
本發(fā)明的分離的黑素瘤細(xì)胞，膜或肽從哺乳動(dòng)物優(yōu)選人的黑素瘤細(xì)胞制備。黑素瘤細(xì)胞的來(lái)源可以是肺、淋巴結(jié)或皮下腫瘤塊，包括轉(zhuǎn)移塊。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這些材料從貓、犬、馬或牛科動(dòng)物的黑素瘤分離。本發(fā)明的T細(xì)胞從腫瘤塊例如轉(zhuǎn)移的肺和淋巴結(jié)塊分離，并且可以體外擴(kuò)增。
對(duì)于本發(fā)明目的，黑素瘤細(xì)胞意指包括全黑素瘤細(xì)胞和破壞的黑素瘤細(xì)胞兩者。在本發(fā)明疫苗組合物中使用的黑素瘤細(xì)胞以及從中分離膜和肽的那些黑素瘤細(xì)胞可以是活細(xì)胞、減毒細(xì)胞或死細(xì)胞。施與患者后不生長(zhǎng)和分裂的黑素瘤細(xì)胞(即它所基本上處于不生長(zhǎng)狀態(tài))可以在本發(fā)明中使用。如果對(duì)患者施用，則這樣的細(xì)胞是優(yōu)選的。如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“不生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞”指活細(xì)胞、減毒細(xì)胞或死細(xì)胞，GO期細(xì)胞，全細(xì)胞或破碎細(xì)胞(或者全細(xì)胞和破碎細(xì)胞兩者)，即在體內(nèi)不分裂的細(xì)胞。懸浮不生長(zhǎng)狀態(tài)細(xì)胞的常規(guī)方法是技術(shù)人員公知的并且可以在本發(fā)明中使用。例如，可以在使用前照射細(xì)胞使其不生長(zhǎng)和分裂?？梢砸岳?500R照射黑素瘤細(xì)胞?？梢詮姆巧L(zhǎng)狀態(tài)的黑素瘤細(xì)胞或者能體內(nèi)生長(zhǎng)和分裂的黑素瘤細(xì)胞分離黑素瘤細(xì)胞膜和肽。優(yōu)選地，在后一種情況下，黑素瘤細(xì)胞膜或肽制劑沒(méi)有污染能體內(nèi)分裂的黑素瘤細(xì)胞。
從可以是淋巴結(jié)、肺和皮下來(lái)源的黑素瘤細(xì)胞分離黑素瘤細(xì)胞、膜和肽。優(yōu)選地，黑素瘤細(xì)胞源自要治療的同一患者。黑素瘤細(xì)胞優(yōu)選是同源的(例如自體性的)。定義為“同源性的”黑素瘤細(xì)胞不需要與受治療患者的腫瘤細(xì)胞或非腫瘤，體細(xì)胞遺傳上完全相同(即100％)。腫瘤細(xì)胞和患者之間MHC分子的遺傳上的同一性一般就足夠了。另外，黑素瘤細(xì)胞上的特定抗原和患者腫瘤細(xì)胞上存在的抗原之間可能存在遺傳同一性?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域公知的方法測(cè)定遺傳同一性。對(duì)于本發(fā)明的目的，經(jīng)遺傳工程改變(例如使用重組DNA技術(shù))而變得與例如患者的特殊的MHC分子和/或患者癌細(xì)胞上特定抗原遺傳相同的黑素瘤細(xì)胞也包含在術(shù)語(yǔ)“同源性”黑素瘤細(xì)胞的含義內(nèi)。而且，這樣的細(xì)胞也可以稱之為“MHC-相同”或“MHC-相容”。來(lái)自遺傳不同的相同物種的哺乳動(dòng)物的黑素瘤細(xì)胞，例如同種異體細(xì)胞也可以用于本發(fā)明黑素瘤細(xì)胞膜和肽的制備。黑素瘤細(xì)胞可以是，但不局限于自活組織檢查樣品或者組織培養(yǎng)解離的細(xì)胞。從同種異體細(xì)胞和干細(xì)胞分離的細(xì)胞膜也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
黑素瘤細(xì)胞膜可以包括所有細(xì)胞膜，例如外膜、核膜、線粒體膜、液泡膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、高爾基復(fù)合體膜和溶酶體膜。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，大于大約50％的膜是黑素瘤細(xì)胞質(zhì)膜。優(yōu)選地，大于大約60％的膜由黑素瘤細(xì)胞質(zhì)膜組成，大于大約70％是更優(yōu)選的，80％是更優(yōu)選的，90％是更加優(yōu)選的，95％是更加優(yōu)選的，99％是最優(yōu)選的。
優(yōu)選地，分離后的膜基本上沒(méi)有核和細(xì)胞。例如，如果在大約2×108細(xì)胞當(dāng)量(c.e.)的膜材料中含有少于大約100個(gè)細(xì)胞和/或細(xì)胞核，則認(rèn)為膜制劑基本上不含有細(xì)胞核或細(xì)胞。細(xì)胞當(dāng)量是從指定數(shù)目的細(xì)胞分離的膜的量。分離的基本上沒(méi)有細(xì)胞和/或細(xì)胞核的黑素瘤細(xì)胞膜可以含有淋巴細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞膜。
優(yōu)選地，分離的黑素瘤細(xì)胞膜是外細(xì)胞膜，即黑素瘤細(xì)胞質(zhì)膜。本發(fā)明的膜制劑可以含有全部的外膜或者其部分。含有一部分外膜的本發(fā)明分離的膜含有外膜的至少一種MHC分子部分和/或熱激蛋白部分。膜片段的大小并不是關(guān)鍵的。
可以例如用半抗原修飾分離的黑素瘤細(xì)胞以及黑素瘤細(xì)胞膜。這樣修飾的黑素瘤細(xì)胞和膜具有至少一種下列性質(zhì)(ⅰ)引發(fā)浸潤(rùn)受治療哺乳動(dòng)物的腫瘤的T淋巴細(xì)胞，(ⅱ)引發(fā)抗哺乳動(dòng)物腫瘤的炎癥免疫應(yīng)答，和(ⅲ)引發(fā)對(duì)哺乳動(dòng)物腫瘤的遲發(fā)型超敏反應(yīng)應(yīng)答。經(jīng)修飾的腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞也具有體外刺激T細(xì)胞的性質(zhì)。
本發(fā)明的肽可以從半抗原修飾的黑素瘤細(xì)胞或膜中分離。本發(fā)明的肽可以是半抗原修飾的。對(duì)于本發(fā)明的目的，肽是兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的化合物。肽優(yōu)選具有低分子量，大約1000kD至大約10000kD，更優(yōu)選大約1000至大約5000。肽優(yōu)選可以是大約8至大約20個(gè)氨基酸，另外肽可以被半抗原化?？梢詮募?xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)部或者這兩處的任何組合分離到肽。提取物對(duì)于癌細(xì)胞類型可能是特定的(對(duì)于正常細(xì)胞來(lái)說(shuō))。本發(fā)明的肽包括但不限于結(jié)合主要組織相容性復(fù)合體或者細(xì)胞表面相關(guān)蛋白(例如熱激蛋白)的肽。這種肽可以是癌基因或突變的抗癌基因編碼的蛋白質(zhì)。各種肽或者含有小肽的黑素瘤細(xì)胞或膜的級(jí)分也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。含有小肽的級(jí)分是具有刺激T細(xì)胞的能力并且含有在特定的純化步驟中一起分離的肽的黑素瘤肽的級(jí)分。例如，從HPLC柱洗脫出的樣品集合體可以代表這樣一種含有小肽的級(jí)分。
本發(fā)明所使用的肽具有刺激T淋巴細(xì)胞的性質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定來(lái)鑒定肽刺激T細(xì)胞的能力，例如通過(guò)測(cè)定T細(xì)胞攝入的標(biāo)記的核苷酸或者通過(guò)測(cè)定細(xì)胞因子的產(chǎn)生，所述細(xì)胞因子例如但不限于γ-干擾素，腫瘤壞死因子(TNF)和IL-2。
從同種異體黑素瘤細(xì)胞分離的同種異體黑素瘤細(xì)胞膜和肽也可以在使用同源(例如自體性的)抗原呈遞細(xì)胞的本發(fā)明的方法中使用。該方法允許用來(lái)自不是患者本身黑素瘤來(lái)源的黑素瘤細(xì)胞膜或肽免疫患者。同源性抗原呈遞細(xì)胞處理同種異體膜或肽，使得患者的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)可以對(duì)它們產(chǎn)生應(yīng)答。
本說(shuō)明書(shū)中提到的黑素瘤細(xì)胞、膜或肽(修飾的或未修飾的)包括可以貯存或給藥的該制劑的任何形式，例如懸浮于稀釋劑、作為片劑、冷凍或者凍干。
能介導(dǎo)腫瘤消退或者另外的抗腫瘤的特異性免疫應(yīng)答(根據(jù)所證實(shí)的，例如通過(guò)T細(xì)胞體外擴(kuò)增，或者T細(xì)胞細(xì)胞毒性)的哺乳動(dòng)物T細(xì)胞也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。T細(xì)胞可以通過(guò)用含有相同腫瘤類型的半抗原化細(xì)胞的組合物對(duì)患者免疫而體內(nèi)引發(fā)或者可以通過(guò)體外克隆從這樣的T細(xì)胞產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的人T細(xì)胞表達(dá)Vβ受體，其可以是Vβ1,Vβ5,Vβ13或Vβ14。本發(fā)明方法中使用的T細(xì)胞可以是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，或者更通常地，是腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)，即與細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤的免疫性相關(guān)的效應(yīng)淋巴細(xì)胞的一種類型。從患者分離到的T細(xì)胞可以是CD8+T細(xì)胞和Ⅰ類MHC特異性的。
本發(fā)明的細(xì)胞、膜、肽和T細(xì)胞可以單獨(dú)地或者與其它化合物結(jié)合在本發(fā)明的方法中使用，包括但不限于本發(fā)明的其它組合物。因此，細(xì)胞、膜、肽或T細(xì)胞可以單獨(dú)使用或者共同施用。對(duì)于本發(fā)明的目的，共同施用包括一起施用或依次施用。另外，本發(fā)明的制劑可以與其它化合物一起施用，所述其它化合物包括但不限于細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素-2，白細(xì)胞介素-4,γ-干擾素(IPN-γ)，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15和GM-CSF。也可以和其它癌癥治療相結(jié)合使用，包括但不限于化療，放療，抗體，和反義寡核苷酸。然而，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是其可以單獨(dú)用作癌治療，使得不需要其它的治療。
本發(fā)明的組合物可以含有本發(fā)明的分離的黑素瘤細(xì)胞、膜、肽、T細(xì)胞(修飾的或未修飾的)或者它們的組合和藥學(xué)可接受載體或稀釋劑，例如但不限于Hanks溶液，鹽水，磷酸鹽緩沖鹽水，蔗糖溶液和水。一般情況下，根據(jù)想要的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)實(shí)踐來(lái)選擇藥學(xué)可接受載體?；钚猿煞峙c載體的比例自然取決于組合物的化學(xué)性質(zhì)、溶解性和穩(wěn)定性，以及所采用的劑量，并且可以使用本領(lǐng)域的一般知識(shí)來(lái)優(yōu)選。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物是含有有效量的分離的半抗原修飾的黑素瘤細(xì)胞、膜、肽、T細(xì)胞或它們的組合的疫苗組合物。對(duì)于本發(fā)明的目的，“有效量”是實(shí)現(xiàn)期望的結(jié)果所需要的量。例如，在誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答的方法中，“有效量”指具有引起至少一種下面現(xiàn)象的性質(zhì)的黑素瘤細(xì)胞、膜、肽或T細(xì)胞的量腫瘤壞死、腫瘤消退、腫瘤炎癥，通過(guò)激活的T淋巴細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)和患者生存期的延長(zhǎng)。類似地，在體外刺激T細(xì)胞的方法中，“有效量”指產(chǎn)生T細(xì)胞刺激的細(xì)胞、膜或肽的量。
疫苗組合物每劑量可以含有例如至少104個(gè)黑素瘤細(xì)胞，優(yōu)選至少105個(gè)細(xì)胞，最優(yōu)選至少106個(gè)細(xì)胞。一劑量是單次施用給藥的疫苗組合物的量。關(guān)于黑素瘤膜，疫苗組合物每劑量可以含有例如至少104c.e.分離的膜，優(yōu)選至少105c.e.，最優(yōu)選至少106c.e.。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗組合物每劑量含有大約105至大約2.5×107個(gè)細(xì)胞，c.e.膜，或者它們的組合，更優(yōu)選大約5×106個(gè)細(xì)胞/c.e.。在另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗組合物每劑量含有從大約105至大約2.5×107個(gè)細(xì)胞，c.e.膜，或者它們的組合分離的黑素瘤細(xì)胞肽，更優(yōu)選地從大約5×106個(gè)細(xì)胞/c.e.分離。要使用的本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞、膜或肽的量一般取取于象化合物對(duì)于癌細(xì)胞的親合性，存在的癌細(xì)胞的量和組合物的溶解度這樣的因素。可以根據(jù)患者的體重和臨床狀況決定劑量。
本發(fā)明的疫苗組合物可以以適合真皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)和皮下給藥的劑量形式包裝?；蛘咚鰟┝啃问娇梢院性诮o藥時(shí)用例如合適的稀釋劑重新配制的本發(fā)明的分離的制劑。半抗原本發(fā)明的黑素瘤細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞膜和黑素瘤肽可以作為修飾的、未修飾的或者修飾的和未修飾的組合來(lái)使用。對(duì)于本發(fā)明的目的，修飾的包括但不限于用半抗原修飾。不單獨(dú)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(但是增強(qiáng)抗另一種它所綴合或以其它方式連接的分子的免疫應(yīng)答)的任何小分子可以作為半抗原。一般情況下，使用的分子應(yīng)該小于大約1000mw。
本領(lǐng)域公知多種半抗原，例如TNP(Kempkes等，J.Immunol.1991,147:2467)；磷酸膽堿(Jang等，Eur.J.Immunol.1991,21:1303)；鎳(Pistoor等，J.Invest、Dermatol.1995 105:92)；砷酸鹽(Nalefski和Rao,J.Immunol.1993,150:3086)。
一般情況下，適合在本發(fā)明中使用的半抗原具有結(jié)合親水性氨基酸(例如賴氨酸)的性質(zhì)。半抗原可以通過(guò)賴氨酸的ε-氨基或-COOH基團(tuán)與細(xì)胞綴合。另外，也可以使用可以通過(guò)重氮偶聯(lián)結(jié)合疏水性氨基酸例如酪氨酸和組氨酸的半抗原。適合在本發(fā)明中使用的半抗原的例子是二硝基苯基，三硝基苯基，N-碘代乙?；?N′-(5-磺酰基(sulfonic)-1-萘基)乙二胺，三硝基苯磺酸，異硫氰酸熒光素，砷酸苯異硫氰酸酯(arsenic acid benzene isothiocyanate)，三硝基苯磺酸，磷酸膽堿，對(duì)氨基苯磺酸，對(duì)氨苯基砷酸，二硝基苯-S-芥(mustard)(Nahas和Leskowitz,Cellular Immunol.1980 54:241)和它們的組合。根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的，技術(shù)人員能選擇用于本發(fā)明的半抗原。例如，通?？梢允褂眠t發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)試驗(yàn)測(cè)定半抗原。佐劑在一個(gè)實(shí)施方案中，黑素瘤細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞膜、肽或T細(xì)胞和免疫佐劑一起施用。所述佐劑具有增強(qiáng)對(duì)本發(fā)明制劑的免疫應(yīng)答的性質(zhì)。佐劑的代表性例子是BCG，或合成的佐劑，含有從皂樹(shù)(Quillajasaponaria)的樹(shù)皮純化的均勻的皂甙的QS-21(Mccune等，Cancer1979 43:1619)，小棒桿菌，Corynebacterium parvum，普遍意義的皂甙，去毒的內(nèi)毒素和細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介-2，白細(xì)胞介素-4，γ-干擾素(IFN-γ)，白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15，GM-CSF和它們的組合。
應(yīng)該明白可以優(yōu)化佐劑。換句話說(shuō)，技術(shù)人員可以使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定要使用的最佳佐劑。本發(fā)明制劑的制備方法可以如下制備在本發(fā)明中使用的黑素瘤細(xì)胞。根據(jù)如下文獻(xiàn)所述處理腫瘤Berd等(1986)，上文，Sato等(1997),美國(guó)專利號(hào)No.5290551和美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)No.08/203004,08/479016,08/899905,08/942794，或者相應(yīng)的PCT申請(qǐng)PCT/US96/09511，其各自在這里全文引作參考。簡(jiǎn)要地說(shuō)，通過(guò)解離抽提細(xì)胞，例如通過(guò)用膠原酶和DNA酶酶解，通過(guò)在混料器中機(jī)械解離，通過(guò)用鑷子挑開(kāi)，使用研缽和研杵，使用解剖刀片切成小碎片。
通過(guò)使用例如低滲休克，機(jī)械解離和酶解破碎細(xì)胞，并且通過(guò)離心分離不同的細(xì)胞成分，從黑素瘤細(xì)胞制備黑素瘤細(xì)胞膜。簡(jiǎn)要地說(shuō)，可以使用下面的步驟裂解腫瘤細(xì)胞，從裂解的腫瘤細(xì)胞去除細(xì)胞核以獲得沒(méi)有細(xì)胞核的腫瘤細(xì)胞，接著獲得沒(méi)有細(xì)胞和細(xì)胞核的基本上純的膜，并且使腫瘤細(xì)胞膜接觸半抗原以獲得半抗原修飾的腫瘤細(xì)胞膜?？梢愿鶕?jù)Heike等的方法進(jìn)行膜分離。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)連續(xù)離心去除完整的細(xì)胞和細(xì)胞核，直到根據(jù)顯微鏡觀察膜基本上不含細(xì)胞核和細(xì)胞。例如，可以以低速度，例如大約500-2000克將裂解的細(xì)胞離心大約5分鐘。分離程序使得大約2×108細(xì)胞當(dāng)量(c.e.)的膜材料中留有少于大約100個(gè)細(xì)胞和/或細(xì)胞核。例如以大約100000克超離心例如大約90分鐘可以沉淀含有膜的核后的上清液。沉淀含有全部的膜。膜可以再懸浮于例如大約8％蔗糖，5mM Tris,pH7.6并在大約-80℃下冷凍備用。可以使用任何稀釋液，優(yōu)選是作為穩(wěn)定劑的。為了測(cè)定膜制劑的質(zhì)量(大約6×107c.e.膜)，可以在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。細(xì)胞菌落應(yīng)該不生長(zhǎng)，光學(xué)顯微鏡檢測(cè)不到細(xì)胞或細(xì)胞核。
可以通過(guò)已知方法用DNP或者其它半抗原對(duì)制備的細(xì)胞或膜進(jìn)行修飾，例如通過(guò)Miller和Claman的方法，J.Immunol.,1976,117,1519，其全文在此引作參考，該方法包括在無(wú)菌條件下將腫瘤細(xì)胞或膜與半抗原一起培育30分鐘，接著用無(wú)水鹽水洗滌。通過(guò)使用單克隆抗半抗原抗體的流式細(xì)胞儀證實(shí)半抗原的修飾作用。
解離的細(xì)胞或分離的膜可以新鮮使用或者例如在控速冷凍機(jī)中或者在液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。?xì)胞和膜以備解凍使用。優(yōu)選地，在給予患者之前不久解凍細(xì)胞或膜。例如，在對(duì)患者進(jìn)行皮試或治療的那一天，可以解凍細(xì)胞或細(xì)胞膜。任選地，可以沖洗細(xì)胞或細(xì)胞膜，和任選地在2500R下照射?？梢栽俅螞_洗，然后懸浮于沒(méi)有酚紅的Hanks平衡鹽溶液。
可以如上制備同種異體黑素瘤細(xì)胞膜。但是在給予受者之前，它們要與同源(例如自身性)抗原呈遞細(xì)胞共培養(yǎng)。同源的抗原呈遞細(xì)胞處理同種異體的膜，使得患者的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)可以對(duì)它們產(chǎn)生應(yīng)答。該方法允許用源自患者自身腫瘤之外的來(lái)源的黑素瘤細(xì)胞膜免疫患者。同種異體黑素瘤細(xì)胞膜與抗原呈遞細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間，培養(yǎng)時(shí)間自大約幾小時(shí)至大約幾天不等。然后沖洗膜脈沖的抗原呈遞細(xì)胞并對(duì)患者注射。
可以用多種方法制備抗原呈遞細(xì)胞，包括例如Grabbe等，1995和Siena等，1995的方法。簡(jiǎn)要地說(shuō)，例如通過(guò)靜脈穿刺或者通過(guò)白細(xì)胞除去法從要免疫的患者獲得血液。或者可以獲得骨髓。通過(guò)梯度離心從這些來(lái)源的任一來(lái)源分離單核白細(xì)胞。可以通過(guò)用針對(duì)抗原的單克隆抗體CD34陽(yáng)性選擇來(lái)進(jìn)一步純化白細(xì)胞。可以在組織培養(yǎng)基(例如補(bǔ)充有例如胎牛血清，集合的人血清或自身血清這樣的血清的RPMI-1640)中培養(yǎng)和擴(kuò)增純化的白細(xì)胞?；蛘?，可以使用沒(méi)有血清的培養(yǎng)基。為了刺激抗原呈遞細(xì)胞的生長(zhǎng)，可以向培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子。細(xì)胞因子包括但不局限于粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，白細(xì)胞介素-4(IL-4)，TNF(腫瘤壞死因子)，白細(xì)胞介素-3(IL-3)，F(xiàn)LT3配體和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。
在培養(yǎng)基中分離和擴(kuò)增的抗原呈遞細(xì)胞可以是例如樹(shù)突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和朗氏細(xì)胞。
本發(fā)明的肽可以根據(jù)Rotzschke等確立的技術(shù)從細(xì)胞分離，Nature,1990,348,252，其公開(kāi)內(nèi)容在這里全文引作參考。用弱酸，例如但不限于三氟乙酸，處理細(xì)胞。然后將細(xì)胞離心并取上清液。通過(guò)凝膠過(guò)濾(G25 Sepharose,Pharmacia)從上清液去除分子量大于5000的化合物。上清液的剩余部分在反相HPLC柱(Superpac Pep S,Pharmacia LKB)上分離，使用0.1％三氟乙酸(TFA)中增加乙腈濃度的梯度洗脫，洗脫速率為1毫升/分鐘，級(jí)分規(guī)格/毫升。根據(jù)Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉巷實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉巷、紐約(1989)的方法，通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)獲得含小肽鏈的級(jí)分，濃縮并冷凍。通過(guò)使它們與自身B類淋巴母細(xì)胞結(jié)合，然后測(cè)定它們刺激黑素瘤特異性T淋巴細(xì)胞的能力來(lái)對(duì)級(jí)分篩選免疫活性。
通過(guò)公知技術(shù)從活組織中分離T細(xì)胞，例如制備單細(xì)胞懸浮液，過(guò)濾，排除單核細(xì)胞和通過(guò)使亞群在TCR-亞型特異性抗體存在下和/或在IL-2存在下和/或在超抗原存在下擴(kuò)增來(lái)分離表達(dá)特殊TCR型的亞群?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知技術(shù)體外擴(kuò)增感興趣的T細(xì)胞。
具體地說(shuō)，可以如下從腫瘤制備T淋巴細(xì)胞。通過(guò)用0.14％膠原酶、0.03％DNA酶和任選地2.5U/ml透明質(zhì)酸酶(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)的混合物在室溫下消化3小時(shí)從腫瘤制備單細(xì)胞懸浮液。細(xì)胞通過(guò)一層尼龍no.100網(wǎng)層過(guò)濾、洗滌，并再懸浮于例如Hanks緩沖鹽水中。通過(guò)在補(bǔ)充有10％合并的人血清的終體積為2ml的RPMI-1640中在塑料皿中淘選混合物排除細(xì)胞混合物中的單核細(xì)胞并培養(yǎng)一星期。根據(jù)例如PCT/US93/05213中所公開(kāi)的，通過(guò)將T細(xì)胞暴露給抗體和/或免疫刺激細(xì)胞因子(例如IL-2)和/或超抗原而擴(kuò)增細(xì)胞。體外刺激4至5星期后可以測(cè)定T細(xì)胞的活性。也可以使用包被有各種抗體(例如抗-BV14或抗-CD8+)的Dynabeads(DYNAL,LakeSuccess，紐約)純化T細(xì)胞，以加快T細(xì)胞擴(kuò)增前后純化T細(xì)胞的純度和速度。T細(xì)胞體外擴(kuò)增的可替換的方法包括使用腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞表達(dá)的T細(xì)胞受體的超抗原或單克隆抗體或者使用免疫刺激細(xì)胞因子，例如TNF,γ-干擾素和白細(xì)胞介素(IL-1,IL-2,IL-12等)。誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答的方法本發(fā)明涉及通過(guò)給予有效量的含有至少一種下述物質(zhì)的組合物誘導(dǎo)抗黑素瘤抗腫瘤應(yīng)答的方法(ⅰ)基本上處于非生長(zhǎng)期的半抗原修飾的同源哺乳動(dòng)物黑素瘤細(xì)胞，(ⅱ)半抗原修飾的黑素瘤細(xì)胞膜，(ⅲ)從所述半抗原修飾的黑素瘤細(xì)胞或膜分離的肽和(ⅳ)能介導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答例如消退黑素瘤的T細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明治療的黑素瘤包括轉(zhuǎn)移性黑素瘤，其可以是肺、淋巴結(jié)或皮下轉(zhuǎn)移，并且優(yōu)選是肺轉(zhuǎn)移。根據(jù)本發(fā)明治療的肺轉(zhuǎn)移優(yōu)選是小的肺轉(zhuǎn)移。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物的黑素瘤轉(zhuǎn)移限于所述哺乳動(dòng)物的肺轉(zhuǎn)移。也可以根據(jù)本發(fā)明治療原發(fā)性癌。也可以根據(jù)本發(fā)明治療Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期或Ⅳ期癌癥，優(yōu)選Ⅲ期和Ⅳ期。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以治療家畜。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)單一肺轉(zhuǎn)移和多發(fā)肺轉(zhuǎn)移的哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)進(jìn)行了治療。小的轉(zhuǎn)移特別適于根據(jù)本發(fā)明治療。這樣的轉(zhuǎn)移病灶的大小可以是直徑大約2cm，優(yōu)選小于大約1.5cm，最優(yōu)選小于大約1cm。這樣的治療產(chǎn)生的抗腫瘤應(yīng)答可以部分或完全消退轉(zhuǎn)移腫瘤或可以是穩(wěn)定性疾病?！巴耆毕酥复蠹s100％消退至少一個(gè)月，更優(yōu)選至少三個(gè)月?！安糠帧毕酥赶舜蠹s50％以上至少一個(gè)月，更優(yōu)選至少三個(gè)月?！胺€(wěn)定性”疾病指疫苗治療后沒(méi)有明顯腫瘤生長(zhǎng)的狀況。本發(fā)明治療后觀察到的另一種抗腫瘤應(yīng)答是生存期的延長(zhǎng)。
給予本發(fā)明疫苗組合物之前，通過(guò)對(duì)皮膚施用可以對(duì)受者免疫用來(lái)修飾腫瘤細(xì)胞和膜的半抗原。例如可以使用二硝基氟苯(DNFB)使患者產(chǎn)生抗DNP的免疫性。接著(例如大約二星期后)，可以對(duì)患者注射本發(fā)明的制劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在給予疫苗之前沒(méi)有免疫患者。
在給予本發(fā)明組合物之前可以施用藥學(xué)可接受量的低劑量環(huán)磷酰胺或者另一種低劑量化療藥。給予半抗原化疫苗組合物后可以任選地給予藥學(xué)可接受量的沒(méi)有半抗原化的組合物。也可以根據(jù)本發(fā)明的方法施用沒(méi)有半抗原化的組合物。
可以施用(例如反復(fù)注射)組合物共至少三次，優(yōu)選至少六次治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，給藥的總次數(shù)可以是8次(包括起始給藥)，在另一個(gè)實(shí)施方案中可以是10次?？梢杂舍t(yī)生設(shè)計(jì)適合特定患者狀況的接種方案。注射疫苗可以例如每星期，每?jī)尚瞧诨蛎克男瞧?。可以給予加強(qiáng)疫苗。優(yōu)選地，給予一次或兩次加強(qiáng)疫苗?？梢栽诶绯醮谓o藥之后大約六個(gè)月或大約一年后給予加強(qiáng)疫苗。
可以在癌癥的常規(guī)治療例如手術(shù)后使用本發(fā)明。切除的腫瘤或收集的腫瘤細(xì)胞可以用來(lái)根據(jù)上文所述制備腫瘤細(xì)胞和膜。
本發(fā)明的制劑可以通過(guò)任何合適途徑給藥，包括接種和注射，例如真皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下。每次疫苗治療可以在多個(gè)位點(diǎn)給藥。例如每次給藥，可以通過(guò)在至少兩處，優(yōu)選三處連續(xù)的位點(diǎn)真皮內(nèi)注射給予疫苗組合物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在上臂或腿部給予疫苗組合物。
可以通過(guò)給予各種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物來(lái)提高疫苗的效力。這些藥劑通過(guò)直接或間接刺激免疫應(yīng)答而起作用。本發(fā)明的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物包括但不限于白細(xì)胞介素-12，白細(xì)胞介素-15和γ-干擾素。在一個(gè)實(shí)施方案中，在每次疫苗注射之后給予IL-2。對(duì)有炎癥反應(yīng)的患者給予IL-2可以引起腫瘤塊內(nèi)的T淋巴細(xì)胞增生并且變得更具活性。增加的T細(xì)胞數(shù)目和提高的功能能力導(dǎo)致腫瘤的免疫破壞和消退。
修飾的腫瘤細(xì)胞、膜和肽各具有刺激T細(xì)胞的性質(zhì)?！按碳ぁ睂?duì)于本發(fā)明目的來(lái)說(shuō)指誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖以及體外通過(guò)T細(xì)胞的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。通過(guò)攝入修飾的核苷酸，例如但不限于3H胸苷，125IUDR(碘代脫氧尿苷)；和對(duì)活細(xì)胞染色的染料，例如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)可以檢測(cè)和測(cè)定T細(xì)胞的增殖。另外，例如但不局于IFNγ，腫瘤壞死因子(TNF)和IL-2這樣的細(xì)胞因子的產(chǎn)生在表現(xiàn)出T細(xì)胞增殖中可能是有用的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的試驗(yàn)可以檢測(cè)和測(cè)定細(xì)胞因子的產(chǎn)生。細(xì)胞因子的產(chǎn)生應(yīng)該高于背景水平，其一般高于25皮克/毫升，優(yōu)選高于100皮克/毫升。
下面非限制性實(shí)施例進(jìn)一步詳述本發(fā)明。
對(duì)3/16的患者觀察到部分應(yīng)答(PR)(計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)記錄)。第4個(gè)患者表現(xiàn)出進(jìn)行性的腫瘤消退，＜50％消退至今(穩(wěn)定的疾病)。PR的詳細(xì)情況如下患者1多個(gè)(＞50)小的(5-10mm直徑)肺小結(jié)消退90％；患者2直徑1cm的實(shí)體小結(jié)消退75％；患者31cm的小結(jié)完全消退，兩個(gè)伴生小結(jié)部分消退。所有應(yīng)答都出現(xiàn)在轉(zhuǎn)移灶限于肺的患者身上。直到接種治療開(kāi)始后4-6個(gè)月，在反應(yīng)者身上的腫瘤消退才是明顯的。4名PR或穩(wěn)定病情的患者的存活期分別是34.5個(gè)月，8.5+個(gè)月，9.2+個(gè)月和17+個(gè)月。因此，DNP-黑素瘤細(xì)胞疫苗可以誘導(dǎo)放射照相術(shù)記錄的黑素瘤轉(zhuǎn)移灶的消退。小的肺轉(zhuǎn)移病灶特別敏感于免疫破壞。
可以如下治療小而多肺轉(zhuǎn)移黑素瘤患者和肺轉(zhuǎn)移黑素瘤患者。疫苗組合物可以含有最少2.5×106c.e.排除錐蟲(chóng)藍(lán)的黑素瘤細(xì)胞膜和最多7.5×106c.e.黑素瘤細(xì)胞膜，懸浮于0.2ml Hanks溶液中。每一次疫苗治療可以由向鄰近位點(diǎn)三次注射組成。
可以用1ml無(wú)菌水或磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.2(PBS)重新配制凍干的材料。可以在無(wú)菌緩沖鹽水中制備合適的稀釋液。然后在注射之前可以取0.1ml與疫苗混合。第一和第二疫苗可以與0.1ml的1∶10稀釋的Tice BCG(“Tice-1”)混合。BCG是從Organon Teknika公司(Durham,NC)獲得的Tice株(Pasteur Institute株的亞株)。第三和第四疫苗可以與0.1ml的1∶100稀釋液(“Tice-3”)混合)。第五和第六和加強(qiáng)疫苗可以與0.1ml的1∶1000稀釋液(“Tice-5”)混合。理想的疫苗反應(yīng)是不大于小的(＜5mm)中心潰瘍的炎性丘疹。
可以通過(guò)在前臂上真皮內(nèi)注射0.1ml試驗(yàn)材料進(jìn)行皮試，通過(guò)測(cè)量硬結(jié)的平均直徑評(píng)價(jià)48小時(shí)時(shí)的DTH。對(duì)下面的材料進(jìn)行測(cè)試1)1×106沒(méi)有用DNP修飾的和用DNP修飾的自身黑素瘤細(xì)胞膜；可以使用酶解的(TCE)和機(jī)械解離的(TCM)黑素瘤細(xì)胞；2)3×106沒(méi)有用DNP修飾的和用DNP修飾的自身外周血淋巴細(xì)胞；3)Hanks溶液；和4)PPD-中間強(qiáng)度。也通過(guò)對(duì)上臂腹側(cè)表面皮膚施用200μg DNFB并且在48小時(shí)時(shí)檢查硬結(jié)圈的面積可以測(cè)試對(duì)DNFB的接觸過(guò)敏性?？梢栽诮o予疫苗六星期期滿后進(jìn)行全套DTH試驗(yàn)。預(yù)處理DTH試驗(yàn)可以限于DNP-修飾的黑素瘤細(xì)胞膜，PPD和稀釋液。設(shè)計(jì)該方案以避免1)患者對(duì)DNP-修飾的淋巴細(xì)胞敏化和2)通過(guò)注射未修飾的黑素瘤細(xì)胞使患者有耐受(tolerizing patients)。
可以對(duì)所有患者采集血液用于淋巴細(xì)胞和血清的分離和深低溫保存，每一次都進(jìn)行皮試。可以周期性地測(cè)定對(duì)自身癌細(xì)胞的反應(yīng)，這一點(diǎn)通過(guò)增殖，細(xì)胞因子釋放和細(xì)胞毒性來(lái)測(cè)定。
可以在疫苗治療開(kāi)始之前對(duì)患者評(píng)定轉(zhuǎn)移病灶。疫苗治療頭六個(gè)星期之后，可以每三個(gè)月進(jìn)行一次評(píng)定?？梢栽诘诙曛羞B續(xù)進(jìn)行評(píng)定，在第三年中每四個(gè)月評(píng)定一次，之后每六個(gè)月評(píng)定一次。一年評(píng)定中反應(yīng)的患者可以接受最后一次加強(qiáng)疫苗注射。然后在不再治療的情況下跟蹤他們的狀況。
也可以進(jìn)行功效研究來(lái)確定DNP疫苗是否延長(zhǎng)了這些患者不復(fù)發(fā)的時(shí)間和/或總的存活時(shí)間?？梢詼y(cè)定存活參數(shù)(Kaplan-Meier方法)。
參考文獻(xiàn)Anichini,A.,等,免疫學(xué)雜志(J.Immunol.),1989,142(10):3692Andreasen,R.B.,等,Scand.J.Haematol,1986,37:323-332Ashman,L.K.,等，Cancer Immunol.,Immunother.,1987,25:250-256Berd,D.等，癌癥研究(Cancer Res.),1982,42:4862Berd,D.等，癌癥研究(Cancer Res.),1984,44:1275Berd,D.等，癌癥研究(Cancer Res.),1984,44:5439Berd,D.等，癌癥研究(Cancer Res.),1986,46:2572Berd,D.等，癌癥研究(Cancer Res.),1987,47:3317Berd,D.等，癌癥研究(Cancer Invest.),1988,6(6):337Berd,D.等，癌癥研究(Cancer Res.),1988,48:1671Berd,D.等，Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.,1988,29:408(#1626)Berendt,M.J.和R.J.North.,J.Exp.Med.,1980,151:69Caron,P.C.和Scheinberg,D.A.,Current opinion in Oncology,1994,6:14-22Eilber,F.R.和Morton,D.L.,癌癥(Cancer),1970,25:362-267Fearon,E.R.,等，細(xì)胞(Cell),1990,60:397Flood,P.M.等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.),1987,138(10):3573Foon,K.A.,等，Arch Intern Med,1983,143:1726-1731Fujiwara,H.等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.),1984,132(3):1571Fujiwara,H.等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.),1984,133(1):509Grabbe,S.,等，Immunol.Today 1995 16(3):117-121Heike,M.等，J.Immunother 1994 15:165-174.Horowitz,M.,等，血液(Blood),1990,75:555-562Jang等，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)1991 21:1303Keating,M.J.,等，Acute Leukemia.In:DeVita VT,Hellman,S.和Rosenberg,S.A.,編著，Cancer:Principles and Practice ofOncology，第四版，Philadelphia:Lippincott,1993,1938-1964Kempkes等，免疫學(xué)雜志(J.ImmunoL)1991 147:2467Kim,B.S.和Jang,Y.S.,歐州免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.),1992,22:775-782Lotze等，生物反應(yīng)雜志(J.Biol.Response),1982,3:475Martin,S.,等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.),1993,151:678-687McCune等，癌癥(cancer),1979,43:1619Meuer,S.C.等，Lancet,1989,1:15Miller,SD,Claman,HN,免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1976 117(5):1519-1526.Mitchison,Transplant.Proc.,1970,Ⅱ(2):92Morre,JD,Morre,DM.,生物技術(shù)(Biotechniques)1989 7:946Mukherji,B.,等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.),1986,136(5):1888Nahas等，細(xì)胞免疫學(xué)(Cellular Immunol.)1980 54:241Nalefski和Rao,免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1993 150:3806Old,L.J.,癌癥研究(Cancer Res.),1981,41:361Ortmann,B.,等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.),1992,148(5):1445Pistoor等，J.Invest.Dermatol.1995 105:92Powles,R.,癌癥(Cancer),1974,34:1558-62Powles,R.L.,等.,Lancet,1977,2:1107-1109Rosenberg,等，科學(xué)(Science),1986,233:1318Rosenberg,S.,Immunology Today,1988,9:58-62Ruiter,D.J.,Seminars in Cancer Biology,1991,2:35Sato T,等，Clin Immunol Immunopath 1997 85:265-272.Sato T,等，Clin Immunol Immunopath 1995 74(1):35-43Shearer,G.M.歐州免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.),1974,4:527Si ena,S.,等，Exp.Hematol.1995 23:1463-1471Talmadge,J.E.等，癌癥研究(Cancer Res.),1987,47-5725Topalian,S.L.等，臨床癌癥雜志(J.Clin.Oncol.),1988,6(5):839Towsend,S.E.和J.P.Allison,科學(xué)(Science),1993,259:368Tsutsui,H.,等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.),1992,149(2):706Van der Bruggen,PL.,等，科學(xué)(Science),1991,254:1643West,W.H.等，New Engl.J.Med.,1987,316(15):898Wysocki等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),1978,75(16):2844美國(guó)專利號(hào)No.5,290,551(Berd),1994美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)No.08/203,004美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)No.08/479,016美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)No.08/899,905美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)No.08/942,794美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)No.08/025,012PCT US96/0951權(quán)利要求
1．一種誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物抗黑素瘤轉(zhuǎn)移的抗腫瘤應(yīng)答的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用含有治療有效量的至少一種下述物質(zhì)的組合物(ⅰ)基本上處于非生長(zhǎng)期的半抗原-修飾的同源哺乳動(dòng)物黑素瘤細(xì)胞，(ⅱ)半抗原-修飾的黑素瘤細(xì)胞膜，(ⅲ)從所述半抗原-修飾的黑素瘤細(xì)胞或膜分離的肽和(ⅳ)能介導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答的T細(xì)胞；其中所述轉(zhuǎn)移位于所述哺乳動(dòng)物的肺。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述抗腫瘤應(yīng)答是至少一種下述情況腫瘤壞死，腫瘤消退，腫瘤炎癥，通過(guò)激活的T淋巴細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)，穩(wěn)定的疾病和延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。
3．權(quán)利要求1的方法，其中所述抗腫瘤應(yīng)答是轉(zhuǎn)移的完全或部分消退。
4．權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
5．權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞膜是同源黑素瘤細(xì)胞膜或同種異體的黑素瘤細(xì)胞膜。
6．權(quán)利要求5的方法，其中所述黑素瘤細(xì)胞膜是同種異體的并且所述組合物進(jìn)一步包含一種抗原呈遞細(xì)胞。
7．權(quán)利要求1的細(xì)胞膜，其中所述膜包括含有MHC分子，熱激蛋白或者它們的組合的膜級(jí)分。
8．權(quán)利要求1的方法，其中所述半抗原選自二硝基苯基，三硝基苯基，N-碘代乙?；?N′-(5-磺?；?1-萘基)乙二胺，三硝基苯磺酸，異硫氰酸熒光素，砷酸苯異硫氰酸酯，三硝基苯磺酸，對(duì)氨基苯磺酸，對(duì)氨苯基砷酸，二硝基苯-S-芥和它們的組合。
9．權(quán)利要求1的方法，其中所述半抗原是二硝基苯基。
10．權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包括一種佐劑。
11．權(quán)利要求10的組合物，其中所述佐劑選自卡介菌，QS-21，去毒的內(nèi)毒素和細(xì)胞因子。
12．權(quán)利要求1的方法，其中所述給藥是以一定時(shí)間間隔重復(fù)至少六次。
13．權(quán)利要求12的方法，其中所述給藥每星期重復(fù)一次。
14．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在給予所述組合物之前給予治療有效量的環(huán)磷酰胺。
15．權(quán)利要求14的方法，其中所述的治療有效量的環(huán)磷酰胺包括在給予所述組合物之前給予大約300mg/M2劑量的環(huán)磷酰胺。
16．一種誘導(dǎo)患黑素瘤的哺乳動(dòng)物抗轉(zhuǎn)移的抗腫瘤應(yīng)答的方法，包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用含有治療有效量的至少一種下述物質(zhì)的組合物(ⅰ)基本上處于非生長(zhǎng)期的半抗原-修飾的同源哺乳動(dòng)物黑素瘤細(xì)胞，(ⅱ)半抗原-修飾的黑素瘤細(xì)胞膜，(ⅲ)從所述半抗原-修飾的黑素瘤細(xì)胞或膜分離的肽和(ⅳ)能介導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答的T細(xì)胞；其中所述轉(zhuǎn)移是小的肺轉(zhuǎn)移。
17．權(quán)利要求16的方法，其中所述抗腫瘤應(yīng)答是至少一種下述情況腫瘤壞死，腫瘤消退，腫瘤炎癥，通過(guò)激活的T淋巴細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)，穩(wěn)定的疾病和延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。
18．權(quán)利要求16的方法，其中所述抗腫瘤應(yīng)答是肺轉(zhuǎn)移的完全或部分消退。
19．權(quán)利要求16的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
20．權(quán)利要求16的方法，其中所述的膜是同源黑素瘤細(xì)胞膜或同種異體黑素瘤細(xì)胞膜。
21．權(quán)利要求20的方法，其中所述黑素瘤細(xì)胞膜是同種異體的而且所述組合物進(jìn)一步包含一種抗原呈遞細(xì)胞。
22．權(quán)利要求16的細(xì)胞膜，其中所述膜包括含有MHC分子，熱激蛋白或它們的組合的膜級(jí)分。
23．權(quán)利要求16的方法，其中所述半抗原選自二硝基苯基，三硝基苯基，N-碘代乙?；?N′-(5-碘?；?1-萘基)乙二胺，三硝基苯磺酸，異硫氰酸熒光素，砷酸苯異硫氰酸酯，三硝基苯磺酸，對(duì)氨基苯磺酸，對(duì)氨苯基砷酸，二硝基苯-S-芥和它們的組合。
24．權(quán)利要求16的方法，其中所述半抗原是二硝基苯基。
25．權(quán)利要求16的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包括一種佐劑。
26．權(quán)利要求25的組合物，其中所述佐劑選自卡介菌，QS-21，去毒的內(nèi)毒素和細(xì)胞因子。
27．權(quán)利要求16的方法，其中所述給藥是以一定時(shí)間間隔重復(fù)至少六次。
28．權(quán)利要求27的方法，其中所述給藥每星期重復(fù)一次。
29．權(quán)利要求16的方法，進(jìn)一步包括在給予所述組合物之前給予治療有效量的環(huán)磷酰胺。
30．權(quán)利要求29的方法，其中所述的治療有效量的環(huán)磷酰胺包括在給予所述組合物之前給予大約300mg/M2劑量的環(huán)磷酰胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)施用有效量的含有至少一種下述物質(zhì)的組合物誘導(dǎo)抗轉(zhuǎn)移黑素瘤的抗腫瘤應(yīng)答的方法:(i)基本上處于非生長(zhǎng)期的半抗原－修飾的同源哺乳動(dòng)物黑素瘤細(xì)胞,(ii)半抗原－修飾的黑素瘤細(xì)胞膜,(iii)從所述半抗原－修飾的黑素瘤細(xì)胞或膜分離的肽和(iv)能介導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答例如消退黑素瘤的T細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明治療的轉(zhuǎn)移黑素瘤包括限于肺的轉(zhuǎn)移黑素瘤,并且優(yōu)選是小的肺轉(zhuǎn)移。本發(fā)明進(jìn)一步涉及黑素瘤細(xì)胞,分離的黑素瘤細(xì)胞膜,從這樣的細(xì)胞或膜分離的肽和具有誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答性質(zhì)的T細(xì)胞,含有這樣的細(xì)胞、膜、肽、T細(xì)胞或它們的組合的組合物,以及它們的分離和制備的方法。
文檔編號(hào)A61K35/28GK1301174SQ99806236
公開(kāi)日2001年6月27日 申請(qǐng)日期1999年4月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月9日
發(fā)明者D·伯德 申請(qǐng)人:托馬斯杰斐遜大學(xué)