專利名稱：肝硬化的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝硬化的治療，特別是用喹唑啉酮衍生物如鹵夫酮治療肝硬化。
肝硬化的原因有許多，包括由慢性酒精中毒，營養(yǎng)失調(diào)，血色素沉著，被動充血，高膽固醇血，接觸了毒藥或毒素如鉛，接觸藥物，免疫反應，遺傳決定的對某些物質(zhì)的敏感性，如可在肝豆狀核變性中見到的對銅敏感，以及傳染病如病毒性肝炎、梅毒和各種寄生蟲感染，包括但不限于曼氏血吸蟲病和日本血吸蟲病導致的肝纖維變性。出于下文中更詳細給出的理由，該病目前是不能治愈的，且常常致死。
肝硬化發(fā)病要經(jīng)過許多階段。首先，看到有各種脂肪變化的肝擴大。其次，明顯的纖維變性伴隨肝功能明顯降低。最后，肝開始萎縮，同時肝的大小和功能相應減小。肝的壞死在任何階段都可見到，但在晚期硬化中尤為顯著。通過顯微鏡觀察，晚期硬化時，肝的正常結(jié)構(gòu)明顯完全破裂。
當肝硬化進一步發(fā)展時，除了肝以外，還出現(xiàn)其他明顯的病理學變化。當肝中形成纖維變性組織時，門脈循環(huán)減少，進一步減少了肝的功能。這種循環(huán)減少導致側(cè)支靜脈循環(huán)增加，特別是在食管中。這些食管血管會破裂，引起嚴重出血。因此，盡管根本原因可發(fā)現(xiàn)是肝自身的特異性病理學變化，但肝硬化是一個影響不只限于肝的整體病理學過程。
肝硬化發(fā)病中的一個必然步驟是在肝中形成纖維變性組織。肝纖維變性是多數(shù)慢性肝病的特征，而并不僅僅是肝硬化的特征〔S.L.Friedan，《新英格蘭醫(yī)學雜志》3281828-35，1993〕。在肝纖維變性中，結(jié)締組織在肝中積聚，代替了正常的肝主質(zhì)，并降低了肝功能。在病理學過程中，該纖維變性組織取代了更復雜的正常肝組織，使得可用于正常功能、如去除血液中的毒性物質(zhì)的肝組織數(shù)量減少，逐漸中斷了肝內(nèi)血流。肝中形成纖維變性組織的特征在于異常大量的胞外基質(zhì)成分的沉積，包括至少五種類型的膠原，特別是I型、III型和IV型膠原，以及其他基質(zhì)蛋白〔L.Ala-Kokko，《生物化學雜志》24475-9，1987〕。
膠原的合成還涉及許多其他病理學情形。例如，與原發(fā)性纖維變性或繼發(fā)性纖維變性有關(guān)的臨床情形和疾病，諸如全身性硬化癥，移植物抗宿主疾病(GVHD)，肺纖維變性和大量自身免疫疾病，它們的區(qū)別特征是結(jié)締組織過度產(chǎn)生，從而導致了正常組織結(jié)構(gòu)和功能的破壞。這些疾病可以恰當?shù)亟忉尀閿_亂了細胞功能，其主要表現(xiàn)是過度膠原合成和沉積。膠原在纖維變性中的決定性作用已激勵了開發(fā)抑制其蓄積的藥物的嘗試〔K.T.Kivirikko，《醫(yī)學紀事》第25卷，113-126頁(1993)〕。
這些藥物可通過調(diào)節(jié)前膠原多肽鏈的合成、或通過抑制特異性翻譯后事件而起作用，由此減少胞外膠原纖維的形成或?qū)е滦阅芨淖兊睦w維的蓄積。不幸的是，雖然此蛋白質(zhì)在維持組織完整性中很重要，并且和多種疾病密切相關(guān)，但只有少數(shù)膠原合成抑制劑是可得到的。
例如，細胞毒性藥物已嘗試用于減慢產(chǎn)生膠原的成纖維細胞的增殖〔J.A.Casas等，Ann.Rhem.Dis.，46763，1987〕，諸如秋水仙堿，它減緩了膠原向胞外基質(zhì)中的分泌〔D.Kershenobich等人，《新英格蘭醫(yī)學雜志》352652，1992〕。
不幸的是，這些抑制劑中沒有一種是膠原型特異性的。而且，存在與干擾其他重要膠原分子，如經(jīng)典補體途徑中的Clq、神經(jīng)肌肉接頭終板的乙酰膽堿酯酶、膠固素和肝表面活性劑脫輔蛋白質(zhì)等的生物合成的毒性后果有關(guān)的嚴重憂慮。
可抑制膠原合成的其他藥物，如硝苯地平和苯妥英，也抑制其他蛋白質(zhì)的合成，從而非特異性阻斷了膠原的生物合成途徑〔T.Salo等，《口腔病理學醫(yī)學雜志》19404，1990〕。
膠原的交聯(lián)抑制劑，如β-氨基-丙腈，盡管可用作抗纖維變性藥，但也是非特異性的。它們長期使用會引起山黧豆中毒綜合征和干擾彈性發(fā)生(elastogenesis)，因為另一種纖維性結(jié)締組織蛋白質(zhì)-彈性蛋白也是交聯(lián)的。另外，膠原的交聯(lián)抑制作用是繼發(fā)性的，且膠原的過度產(chǎn)生不得不在其被膠原酶降解之前發(fā)生。因此，明顯需要作為抗纖維變性藥的膠原自身合成的特異型抑制劑。
美國專利5,449,678中公開了用于治療纖維變性疾病的這種特異型膠原合成抑制劑。該特異性抑制劑是一種與藥學有效量的、下式表示的藥學活性化合物形成的組合物
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；而R3是氫或低級鏈烯氧基-羰基，也包括其藥學上可接受的鹽。在這組化合物中，已發(fā)現(xiàn)鹵夫酮對于這種治療是尤為有效的。
美國專利5,449,678中公開了這些化合物在纖維變性疾病如硬皮病和GVHD的治療中是有效的。PCT申請WO 96/06616進一步公開了這些化合物可有效地治療再狹窄。前兩種疾病與膠原的過度沉積有關(guān)，它們可以用鹵夫酮抑制。再狹窄的特征在于血管損傷后，平滑肌細胞增殖，胞外基質(zhì)在受影響的血管腔中蓄積〔Choi等，《外科學文獻》130257-261，1995；美國專利5,449,678〕。
但是，鹵夫酮的體外作用并不總是預示其體內(nèi)作用。例如，如美國專利5,449,678中所證明，鹵夫酮在體外抑制I型膠原在骨軟骨細胞中的合成。然而，未報道用鹵夫酮治療的雞的骨斷裂率增加，這表明在體內(nèi)未見到該作用。因此，鹵夫酮在體內(nèi)的確切行為不能總是從體外研究得到正確的預言。
另外，還未證明鹵夫酮或其他相關(guān)喹唑啉酮有阻斷或抑制與肝硬化有關(guān)的病理學過程的能力。已測試了其他膠原合成、交聯(lián)和沉積抑制劑，如皮質(zhì)類固醇、青霉胺、甲氨蝶呤和秋水仙堿，對肝纖維變性的治療作用，但未證明它們是有效的〔S.L.Friedman，《新英格蘭醫(yī)學雜志》3281828-35，1993〕。盡管已顯示鹵夫酮對I型膠原合成具有特異性抑制作用，但這種抑制尚未顯示在肝硬化的治療中是有效的。的確，肝硬化的死亡率很高，而目前可得到的治療方法有顯著的副作用，且一般沒能有效地減慢或終止硬化的進一步發(fā)展。此外，在肝纖維變性的發(fā)病過程中，沉積了許多其他類型的胞外基質(zhì)成分，包括至少五種類型的膠原，特別是I、III和IV型膠原，以及其他基質(zhì)蛋白〔L.Ala-Kokko，《生物化學雜志》24475-9，1987〕。因此，僅抑制I型膠原合成不一定能減慢或終止肝纖維變性的發(fā)展。
因此，簡單地給予已顯示能在體外抑制膠原合成、沉積和交聯(lián)的化合物來試圖治療肝硬化是無效的。很明顯，對于這種不能治愈的疾病，需要的是能特異性減慢或終止體內(nèi)肝纖維變性的發(fā)病且沒有非特異性或毒性副作用的新治療方法。
因此，現(xiàn)已廣泛意識到需要治療肝硬化和纖維變性的方法，并且這將是非常有益的，該方法應實質(zhì)上抑制體內(nèi)纖維發(fā)生，而沒有不期望的非特異性或毒性副作用。
出乎意料地，如下文中實施例所述，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)鹵夫酮也可抑制體內(nèi)肝纖維變性的病理生理學過程，可能是通過抑制I型膠原合成實現(xiàn)的，但也可能是另一種或幾種機理起作用。當設(shè)想I型膠原合成的抑制為似乎合理的機理時，并不期望僅限于這種單一機理，而且也是不必要的，因為下文所列的體內(nèi)數(shù)據(jù)清楚地證明了鹵夫酮作為體內(nèi)肝纖維變性抑制劑的效能。
按照本發(fā)明的教導提供了一種治療肝硬化的組合物，包括藥學有效量的化合物與藥學上可接受的載體結(jié)合，該化合物是下式表示的化合物中的一員
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；R3是氫或低級鏈烯氧基。還包括其藥學上可接受的鹽。
按照本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，該化合物優(yōu)選為鹵夫酮。在下文中，術(shù)語“鹵夫酮”定義為下式表示的化合物
及其藥學上可接受的鹽。該組合物優(yōu)選包括該化合物的藥學上可接受的載體。
按照本發(fā)明的另一個實施方案，它提供了用于治療肝硬化的藥劑的制備方法，包括將藥學有效量的化合物置于藥學上可接受的載體中的步驟，該化合物為下式表示的化合物中的一員
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；R3是氫或低級鏈烯氧基-羰基。還包括其藥學上可接受的鹽。
按照本發(fā)明的另一個實施方案，它提供了治療主體肝硬化的方法，包括給予藥學有效量的下式表示的化合物的步驟
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；R3是氫或低級鏈烯氧基-羰基。還包括其藥學上可接受的鹽。
按照本發(fā)明的另一個實施方案，它提供了用于實質(zhì)上預防肝硬化發(fā)生的組合物，包括藥學有效量的化合物與藥學上可接受的載體結(jié)合，該化合物是下式表示的化合物中的一員
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；R3是氫或低級鏈烯氧基。還包括其藥學上可接受的鹽。
按照本發(fā)明的另一個實施方案，它提供了用于實質(zhì)上預防肝硬化發(fā)生的藥劑的制備方法，包括將藥學有效量的化合物置于藥學上可接受的載體中的步驟，該化合物為下式表示的化合物中的一員
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；R3是氫或低級鏈烯氧基-羰基。還包括其藥學上可接受的鹽。
按照本發(fā)明的另一個實施方案，它提供了實質(zhì)上預防主體發(fā)生肝硬化的方法，包括給予藥學有效量的下式表示的化合物的步驟
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；R3是氫或低級鏈烯氧基-羰基。還包括其藥學上可接受的鹽。
按照本發(fā)明的另一個實施方案，提供了一種治療肝纖維變性的組合物，包括藥學有效量的化合物與藥學上可接受的載體結(jié)合，該化合物是下式表示的化合物中的一員
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；R3是氫或低級鏈烯氧基。還包括其藥學上可接受的鹽。
按照本發(fā)明還提供了用于治療肝纖維變性的藥劑的制備方法，包括將藥學有效量的化合物置于藥學上可接受的載體中的步驟，該化合物為下式表示的化合物中的一員
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；R3是氫或低級鏈烯氧基-羰基。還包括其藥學上可接受的鹽。
還提供了治療主體肝纖維變性的方法，包括給予藥學有效量的下式表示的化合物的步驟
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；R3是氫或低級鏈烯氧基-羰基。還包括其藥學上可接受的鹽。
按照本發(fā)明的另一個實施方案，它提供了用于實質(zhì)上預防肝纖維變性發(fā)生的組合物，包括藥學有效量的化合物與藥學上可接受的載體結(jié)合，該化合物是下式表示的化合物中的一員
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；R3是氫或低級鏈烯氧基。還包括其藥學上可接受的鹽。
還提供了用于實質(zhì)上預防肝纖維變性發(fā)生的藥劑的制備方法，包括將藥學有效量的化合物置于藥學上可接受的載體中的步驟，該化合物為下式表示的化合物中的一員
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；R3是氫或低級鏈烯氧基-羰基。還包括其藥學上可接受的鹽。
按照本發(fā)明的另一個實施方案，它提供了實質(zhì)上預防主體發(fā)生肝纖維變性的方法，包括給予藥學有效量的下式表示的化合物的步驟
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；R3是氫或低級鏈烯氧基-羰基。還包括其藥學上可接受的鹽。
優(yōu)選的是，上文中所稱的所有化合物可以是由結(jié)構(gòu)式描述的化合物本身，和/或其藥學上可接受的鹽。
在下文中，術(shù)語“主體”是指給予鹵夫酮的人或低級動物。術(shù)語“病人”是指人主體。術(shù)語“治療”包括實質(zhì)上預防肝硬化或纖維變性的發(fā)生，以及一旦出現(xiàn)肝硬化或纖維變性后，減慢或終止其發(fā)展。短語“實質(zhì)上預防肝硬化或纖維變性的發(fā)生”應理解為是指預防這些疾病的臨床或臨床前癥狀的出現(xiàn)，包括預防與纖維變性和硬化過程自身直接相關(guān)的那些癥狀，如食管血管出血。
盡管在整個說明書中提到的是特異性喹唑啉酮衍生物“鹵夫酮”，但應理解其他喹唑啉酮衍生物也可以用于其用的地方，這些衍生物具有下列結(jié)構(gòu)式
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；R3是氫或低級鏈烯氧基-羰基。還包括其藥學上可接受的鹽。
現(xiàn)在將聯(lián)系某些優(yōu)選實施方案，用以下附圖和實施例來描述本發(fā)明，以便本發(fā)明的各個方面能得到更完全的理解和領(lǐng)會，但意圖并不是將本發(fā)明限制在這些特定實施方案內(nèi)。正相反，意圖在于包括由所附權(quán)利要求書定義的、可包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的所有選擇、改進和等價物。因此，包括優(yōu)選實施方案的下列附圖和實施例將用于說明本發(fā)明的實施，大家應理解，所顯示的這些特例是經(jīng)由實施例的方式，目的僅是為了闡述本發(fā)明優(yōu)選實施方案的討論，還有是為了提供被相信為是最有用的和容易理解的配制方法的說明，以及本發(fā)明的原理和概念方面的說明。
附圖的簡要說明此處僅利用實施例，并參照附圖來描述本發(fā)明，其中

圖1A-1D說明了鹵夫酮在大鼠肝中對膠原α1(I)基因表達的作用；圖2說明了鹵夫酮在大鼠肝中對羥脯氨酸濃度的作用；圖3A-3D說明了鹵夫酮在大鼠肝中對中度纖維變性的作用。
出乎意料地，如下文中實施例所述，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)鹵夫酮可抑制體內(nèi)肝硬化的病理學過程，可能是通過抑制I型膠原合成實現(xiàn)的，但也可能是另一種或幾種機理起作用。的確，不論該特異性機理如何，下列數(shù)據(jù)清楚地證明了鹵夫酮在體內(nèi)抑制肝纖維變性的病理學發(fā)展的效能。
有許多理由證明這種發(fā)現(xiàn)是出乎人們意料的。首先，鹵夫酮的體外行為與其體內(nèi)行為并不完全對應。用骨軟骨細胞觀察到的鹵夫酮在體內(nèi)和體外的不同作用可證明這一點。如美國專利5,449,678中所證明，鹵夫酮在體外抑制I型膠原在軟骨細胞中的合成。然而，未報道用鹵夫酮治療的雞的骨斷裂率增加，這表明在體內(nèi)未見到該作用。因此，鹵夫酮在體內(nèi)的確切行為不能總是從體外研究得到正確的預言。
其次，其他膠原合成、沉積和交聯(lián)抑制劑還未證明是能有效治療肝硬化的，這說明，單獨抑制膠原的產(chǎn)生不足以確定對肝纖維變性的治療是成功還是失敗。因此，發(fā)現(xiàn)鹵夫酮可成功地在合適的動物模型體內(nèi)抑制肝纖維變性是新穎且非顯而易見的。
第三，鹵夫酮僅顯示是I型膠原抑制劑。然而，肝中形成纖維變性組織的特征在于異常大量的胞外基質(zhì)成分的沉積，包括至少五種類型的膠原，特別是I、III和IV型膠原，以及其他基質(zhì)蛋白〔L.Ala-Kokko，《生物化學雜志》24475-9，1987〕。因此，鹵夫酮抑制I型膠原合成和沉積的能力不能預示鹵夫酮具有減慢、減少或其他改善肝纖維變性發(fā)病的能力。
第四，還沒有教導指出鹵夫酮可作為合適的預防性治療，用于防止哺乳動物如人的象肝纖維變性和硬化這樣的復雜病理生理學過程。例如，美國專利3,320,124僅教導，用與鹵夫酮有關(guān)的化合物預防雞的傳染病球蟲病。雞與任何哺乳動物包括人的生理學有很大差異。的確，一般不認為雞是可接受的哺乳動物的實驗模型，并且肯定不用作肝病如肝纖維變性和肝硬化的實驗模型。因此，該參考文獻沒有提示本發(fā)明化合物具有預防人或其他哺乳動物的肝纖維變性和肝硬化這種清楚的預防性治療作用，背景技術(shù)中的其他參考文獻也確實未作出這種提示。
第五，肝纖維變性和肝硬化之間的重要不同顯示了肝纖維變性發(fā)生的病理學過程的復雜性。肝硬化并不僅僅是一種與肝纖維變性有關(guān)的疾病。肝硬化的發(fā)病分許多階段進行，這可潛在地導致最后階段肝衰竭和壞死。從首先肝中出現(xiàn)脂肪改變到最后肝壞死的所有階段對于肝硬化的發(fā)生都是重要的。當肝硬化進一步發(fā)展時，除了肝以外，還出現(xiàn)其他明顯的病理學變化。當肝中形成纖維變性組織時，門脈循環(huán)減少，進一步減少了肝的功能。這種循環(huán)減少導致側(cè)支靜脈循環(huán)增加，特別是在食管中。這些食管血管會破裂，引起嚴重出血。因此，盡管根本原因可發(fā)現(xiàn)是肝自身的特異性病理學變化，但肝硬化是一個影響不只限于肝的整體病理學過程。本發(fā)明顯示，與在理論上認為應該是合適的、然而在體內(nèi)實驗中失敗的許多物質(zhì)相比，只有鹵夫酮可成功地完成這種治療。因此，鹵夫酮可成功地用于減慢和/或預防在肝硬化的病理學過程中產(chǎn)生的各種相互影響癥狀的出現(xiàn)，這一發(fā)現(xiàn)是新穎且非顯而易見的，并顯示出了明顯的創(chuàng)造性。
最后，所有其他在先技術(shù)文獻都只是教導了鹵夫酮對細胞如成纖維細胞和平滑肌細胞的功效。在肝中，伊藤細胞已顯示是肝纖維變性過程中產(chǎn)生的胞外基質(zhì)成分的來源，因此這種細胞型對于肝纖維變性的發(fā)病是決定性的〔S.L.Friedman，《新英格蘭醫(yī)學雜志》3281828-35，1993〕。但是，伊藤細胞是一種完全不同于成纖維細胞的細胞型。即使可以預測鹵夫酮對某種類型的細胞的行為，這種預測對于除了這種類型以外的細胞也肯定是不可靠的。因此，鹵夫酮對伊藤細胞的作用不可從其對成纖維細胞的作用預測出來。
因此，在先有技術(shù)中沒有任何關(guān)于鹵夫酮可在體內(nèi)用于治療肝纖維變性的教導。此外，鹵夫酮以及相關(guān)化合物減慢或終止肝中纖維變性發(fā)展的能力是新穎且非顯而易見的，并顯示了明顯的創(chuàng)造性。鑒于鹵夫酮在體外和體內(nèi)所顯示的應答不同，這種對于哺乳動物的體內(nèi)治療能力的證明是尤其出乎意料的。
參照下列說明性實施例和附圖可更加容易地理解本發(fā)明。應該注意，盡管參照只是針對鹵夫酮進行的，但應相信在美國專利3,320,124中描述和請求保護的其他喹唑啉酮衍生物也具有相似的性能，該文內(nèi)容結(jié)合在此作為參考。
本發(fā)明是用含有喹唑啉酮的化合物如鹵夫酮治療肝硬化。下面描述了具有特定藥物制劑的組合物，以及這些化合物的使用和制備方法。
盡管肝硬化的發(fā)病過程不完全清楚，但已成功研制出這種疾病的合適動物模型。通過給大鼠腹膜內(nèi)注射二甲基亞硝胺誘導產(chǎn)生肝纖維變性，具有相對短的起作用時間在給予大鼠二甲基亞硝胺的三周內(nèi)，肝纖維變性已很明顯〔A.M.Jezequel等，《肝臟病學雜志》5174-81，1987〕。
二甲基亞硝胺誘導的肝纖維變性的特征是胞外基質(zhì)成分的沉積增加，包括各種類型的膠原如I型膠原。因此，無論是二甲基亞硝胺誘導的肝纖維變性還是其他類型的肝纖維變性，對纖維變性的抑制取決于減慢或終止導致纖維變性組織產(chǎn)生的病理學過程。
因此，意欲用于抑制肝硬化的化合物必須用體內(nèi)實驗動物模型、諸如上述大鼠肝纖維變性的二甲基亞硝胺模型來測試其減慢或終止導致纖維變性組織沉積的病理學過程的能力。用I型膠原合成抑制劑鹵夫酮來進行這些實驗，在下面的實施例1和2中將更詳細描述。
另外，一旦已發(fā)現(xiàn)證明是有效的化合物，必須說明產(chǎn)生最大治療效能的特定制劑和給藥途徑。這些制劑和給藥途徑必須能使該化合物有效地吸收并釋放到預期治療部位，同時將由該化合物的系統(tǒng)分布引起的非特異性副作用減至最小。下面的實施例3到5中給出了含有喹唑啉酮的化合物如鹵夫酮的這些制劑和給藥途徑的說明性實施例。
實施例1鹵夫酮對大鼠肝的組織學和形態(tài)學作用對對照大鼠和二甲基亞硝胺處理的大鼠的肝樣品的組織學檢查顯示，二甲基亞硝胺在大鼠肝中誘導了特異性形態(tài)學改變，包括膠原纖維含量增加。鹵夫酮實質(zhì)上抑制了這些形態(tài)學改變的發(fā)生，使得大鼠肝的外觀更正常。該實驗方法如下。將雄性Sprague-Dawley大鼠分成四組。兩組腹膜內(nèi)注射1％二甲基亞硝胺的鹽水溶液，每周連續(xù)注射三天，持續(xù)三周，劑量為1ml/kg體重。該劑量方案將誘導嚴重的肝纖維變性。另兩組對照大鼠注射鹽水。從用二甲基亞硝胺注射的前三天開始，一個二甲基亞硝胺處理的大鼠組和一個對照組以5mg/kg餐重的劑量在飲食中加入鹵夫酮。在實驗結(jié)束時，將這些大鼠處死，取出肝并稱重。
對這些肝樣品進行組織學檢查。簡言之，將這些組織樣品集中到磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，在4℃下用4％聚甲醛的PBS溶液固定過夜。當樣品已用梯度乙醇溶液脫水后，制備連續(xù)的5μm切片，用氯仿清洗并植入Paraplast中。用0.1％夕利紅(Sirius red)和0.1％堅牢綠作為苦味酸中的復染劑對膠原和非膠原蛋白進行不同染色。此方法使膠原染成紅色〔Gascon-Barre，M.等，《組織化學與細胞化學雜志》37377-381，1989〕。
然后這些肝樣品與大鼠膠原α1(I)表達的探針雜交。對于與遺傳探針的雜交，將這些切片用二甲苯脫蠟，通過系列梯度乙醇溶液再水化，用蒸餾水沖洗5分鐘，然后在2X SSC中在70℃下培養(yǎng)30分鐘。這些切片再用蒸餾水沖洗并用鏈霉蛋白酶，0.125mg/ml在50mMTris-HCl，5mM EDTA，pH7.5中，處理10分鐘。消化后，載玻片用蒸餾水沖洗，用10％福爾馬林的PBS溶液后固定，并用0.2％甘氨酸封閉。封閉后，載玻片用蒸餾水沖洗，通過梯度乙醇溶液迅速脫水并空氣干燥數(shù)小時。在雜交前，從原始質(zhì)粒上切下1600bp大鼠膠原α1(I)插入片段pUC18，并將其插入到pSafyre質(zhì)粒中。用地高辛配基標記后，這些切片與此探針雜交〔M.Pines等，《基質(zhì)生物學》14765-71，1996〕。
圖1顯示了大鼠肝組織切片與大鼠膠原α1(I)探針的就地雜交。在對照大鼠的肝中(圖1A)或在單獨給予鹵夫酮的大鼠的肝中(圖1B)見到膠原α1(I)基因的弱表達。在單獨給予二甲基亞硝胺的大鼠的肝中見到膠原α1(I)基因的表達顯著增加(圖1C)?；虮磉_主要是在小葉周圍的中隔中，在稀疏的膠原性組織部位。與單獨給予二甲基亞硝胺的大鼠相比，給予鹵夫酮和二甲基亞硝胺的大鼠顯示出顯著減少的膠原α1(I)基因表達(圖1D)。盡管這種劑量的鹵夫酮實質(zhì)上減少了由二甲基亞硝胺引起的大鼠膠原α1(I)基因表達的增加，但它沒有完全抑制這種表達，還是可觀察到少量表達(見箭頭標記)。然而，大鼠膠原α1(I)基因表達實質(zhì)上減少了，表明鹵夫酮有效地對抗了二甲基亞硝胺對表達的誘導。
大鼠肝組織切片用夕利紅染色，以證明該組織的膠原含量，結(jié)果并未用圖顯示，因為組織學樣品必須查看顏色才知道作用情況。對照大鼠或單獨給予鹵夫酮的大鼠的肝組織中幾乎沒有觀察到膠原纖維。用二甲基亞硝胺處理的大鼠的肝顯示膠原含量增加，小葉周圍顯現(xiàn)出多束膠原，產(chǎn)生了大纖維性中隔。在給予二甲基亞硝胺和鹵夫酮的大鼠中，這些膠原束的增厚顯著減少，再次表明了鹵夫酮實質(zhì)上抑制由二甲基亞硝胺誘導的纖維變性的病理生理學過程的能力。
令人感興趣的是，在用相當高劑量的二甲基亞硝胺引起這種嚴重肝纖維變性時，用二甲基亞硝胺處理而未給予鹵夫酮的六只大鼠在三周實驗結(jié)束時死亡了四只。相反，給予二甲基亞硝胺和鹵夫酮的六只大鼠中只有一只死亡。沒有給予二甲基亞硝胺的那兩組中的六只大鼠都存活下來。因此，單獨的鹵夫酮沒有毒性，還能幾乎完全阻止二甲基亞硝胺誘導的死亡。
鹵夫酮還抑制了二甲基亞硝胺誘導的總的形態(tài)學水平的變化。單獨用二甲基亞硝胺處理的大鼠的肝重量顯著降低(4.5g和5.0g)，特別是當與對照大鼠或單獨給予鹵夫酮的大鼠對比時(分別為12±1g和11±1.5g)。給予鹵夫酮和二甲基亞硝胺的大鼠的肝重(8.5±1.7g)幾乎是單獨給予二甲基亞硝胺的大鼠的兩倍，雖然與對照大鼠相比稍有降低。
因此，鹵夫酮能在所有水平上防止二甲基亞硝胺誘導的纖維變性作用的出現(xiàn)幾乎消除了二甲基亞硝胺誘導的死亡，并顯著減少了由二甲基亞硝胺誘導的纖維變性的總的和細小的形態(tài)學變化。顯然，鹵夫酮防止在肝纖維變性的病理學過程中產(chǎn)生的形態(tài)學變化的作用是強有力的，而且是特異性的。
實施例2鹵夫酮在大鼠肝中對中度纖維變性的作用通過測量膠原α1(I)基因表達和羥脯氨酸含量，證明鹵夫酮實質(zhì)上完全阻止了少量二甲基亞硝胺誘導的纖維變性。所用的具體實驗方法與實施例1類似，只是用二甲基亞硝胺處理的大鼠僅給予0.25％二甲基亞硝胺的鹽水溶液，比在上述實施例1中所給的劑量低得多。而且，大鼠處死前的處理持續(xù)時間也更長相對于實施例1中的三周為四周。
如上述實施例1中所述測量膠原α1(I)基因表達。對于羥脯氨酸分析，將肝樣品在110℃下用6N HCl水解22小時。如Krom所述〔M.D.Krom，《化驗師》105305-16，1980〕，經(jīng)過Kjeldahl消化后，利用自動分析器通過分光光度法確定氮。在陽離子交換柱(BTC2710，Biotronik)上經(jīng)過柱后衍生后，通過氨基酸分析(Biotronik LC5000，Germany)確定相同水解產(chǎn)物中的單一膠原氨基酸羥脯氨酸。結(jié)果表示為肝總蛋白質(zhì)中的膠原百分數(shù)。
羥脯氨酸是一種膠原中相當大量存在的氨基酸，因此它可用作特定組織中膠原總濃度的指示劑。因此，如圖2所示，二甲基亞硝胺清楚地導致大鼠肝中羥脯氨酸濃度顯著增加，因此膠原濃度也顯著增加。這種增加通過用鹵夫酮處理而受到完全抑制。但是，給予大鼠鹵夫酮而不給予二甲基亞硝胺則沒有使羥脯氨酸濃度產(chǎn)生任何變化。因此，鹵夫酮的作用僅是抑制二甲基亞硝胺誘導的羥脯氨酸濃度的增加。
圖3C表明，這樣低劑量的二甲基亞硝胺仍使膠原α1(I)基因表達增加，特別是對血管周圍的細胞。圖3D顯示，鹵夫酮消除了這種增加的基因表達。與上述實施例1中一樣，再次證明了單獨的鹵夫酮對膠原α1(I)基因表達沒有作用(圖3B)，對照大鼠也沒有膠原α1(I)基因表達(圖3A)。
因此，鹵夫酮清楚地完全抑制了大鼠肝中二甲基亞硝胺誘導的膠原合成水平的升高。但是，單獨的鹵夫酮在大鼠中沒有顯示任何這樣的作用，表明鹵夫酮對于那些病理生理學過程、如由二甲基亞硝胺誘導的纖維變性引起的膠原合成的抑制作用是特異性的。另外，如實施例1和2中所證明，鹵夫酮顯然能實質(zhì)上完全消除由二甲基亞硝胺引起的生化和生理學變化。
實施例3利用膽管結(jié)扎誘導的纖維變性的抑制除了二甲基亞硝胺誘導的肝纖維變性外，還可得到第二種大鼠肝纖維變性模型。此模型是依靠膽管的手術(shù)結(jié)扎來誘導肝纖維變性，而不需要給予外源性物質(zhì)或毒性化學物質(zhì)，已顯示這是一種合適的研究人肝硬化的模型〔Kountaras，J.等，《英國實驗病理學雜志》65305-311，1984；Muriel，P.等，《肝臟病學雜志》2195-102，1994；Muriel，P.等，《應用毒理學雜志》15449-453，1995〕。因此，膽管結(jié)扎模型的特別有益之處在于任何保護性治療必須直接保護肝不出現(xiàn)纖維變性誘導的病理學變化，而不是間接地改變用于導致動物模型出現(xiàn)肝纖維變性的外源性物質(zhì)的作用。實驗方法如下。
將重200-250g的雄性Wistar大鼠分成四個實驗組，每組三只大鼠。第一組不進行膽管結(jié)扎手術(shù)，也不給予鹵夫酮。第二組不進行膽管結(jié)扎手術(shù)，但給予鹵夫酮。應注意，頭兩組中的所有動物都要經(jīng)歷假操作，包括實際手術(shù)過程的所有步驟，只是不結(jié)扎膽管。第三組進行膽管結(jié)扎手術(shù)，但不給予鹵夫酮。第四組進行膽管結(jié)扎手術(shù)，并給予鹵夫酮。實際手術(shù)過程與文獻中報道的基本相似〔Kountaras，J.等，《英國實驗病理學雜志》65305-311，1984〕。
所有動物隨意給予飲用水。給予鹵夫酮的大鼠在手術(shù)前一周和實驗持續(xù)期間，即手術(shù)后3天或7天，在正常大鼠飲食中加入濃度為5mg/kg餐重的鹵夫酮。實驗結(jié)束時將這些大鼠處死。如上述實施例1中所述，測量膠原含量(通過夕利紅染色)和膠原α1(I)基因表達。另外，利用Boerringher-Mannheim的日立自動分析器系統(tǒng)，比色測量血清堿性磷酸酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶濃度。結(jié)果如下。
在經(jīng)歷假操作的大鼠中未觀察到膠原合成。另外，這些大鼠沒有顯示體重或肝重有任何增加，或任何肝組織學變化。最后，無論是否給予鹵夫酮，這些大鼠在手術(shù)后3或7天都未顯示堿性磷酸酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶等酶濃度有任何變化。
相反，在用鹵夫酮處理和未用鹵夫酮處理的組中，經(jīng)歷膽管結(jié)扎的大鼠都觀察到這三種酶濃度升高。這些升高的濃度是肝纖維變性和肝硬化的病理學過程的特征性標志。但是，給予鹵夫酮的大鼠的這些酶濃度低于未給予鹵夫酮的大鼠。具體地說，未給予鹵夫酮的大鼠的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶濃度比給予了鹵夫酮的大鼠高56％，堿性磷酸酶濃度高257％，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶濃度高15％。因此，顯然鹵夫酮減少了經(jīng)歷膽管結(jié)扎的大鼠中酶濃度的升高程度。
此外，當經(jīng)歷膽管結(jié)扎且給予鹵夫酮的大鼠與僅經(jīng)歷膽管結(jié)扎的大鼠相比時，鹵夫酮顯著減少了膽管結(jié)扎誘導的膠原合成和膠原α1(I)基因表達的增加。因此，鹵夫酮顯然能抑制膽管結(jié)扎誘導的大鼠肝纖維變性模型中肝纖維變性的過程。
實施例4用于鹵夫酮給藥的合適制劑本發(fā)明的鹵夫酮和相關(guān)化合物，以及其藥學上可接受的鹽，可以用本領(lǐng)域中熟知的許多方式給予主體。在下文中，術(shù)語“主體”是指給予鹵夫酮的人或低級動物。例如，可以通過口服給藥，或胃腸外給藥，例如通過靜脈滴注或腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)注射。
用于口服給藥的組合物包括粉末劑或顆粒劑，在水中或非含水基質(zhì)中的懸浮液或溶液，扁囊劑，膠囊或片劑。增稠劑、稀釋劑、調(diào)味劑、分散助劑、乳化劑或粘合劑也是可取的。
用于胃腸外給藥的制劑包括但不限于無菌水溶液，它還可含有緩沖液、稀釋劑和其他合適的添加劑。
給藥量取決于癥狀的嚴重程度和主體對鹵夫酮或本發(fā)明的其他化合物之一及其藥學上可接受的鹽的響應能力。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地確定最佳劑量，給藥方法和重復率。
實施例5治療肝纖維變性和肝硬化的方法如上所述，鹵夫酮已顯示是肝纖維變性，肝硬化前體的有效抑制劑。以下實施例僅是為了說明用鹵夫酮或本發(fā)明的其他化合物之一及其藥學上可接受的鹽治療肝纖維變性和肝硬化的方法，意圖不在于限制。
該方法包括以下步驟將實施例4中所述的、在藥學上可接受的載體中的、鹵夫酮或本發(fā)明的其他化合物之一及其藥學上可接受的鹽給予主體進行治療。鹵夫酮按照有效劑量方法學給藥，優(yōu)選直到達到預定終點，如主體中肝纖維變性或肝硬化不再進一步發(fā)展，肝纖維變性或肝硬化受到抑制，或防止了肝纖維變性或肝硬化的形成。
這種治療針對的肝纖維變性類型的實例可有效地包括但不限于由慢性酒精中毒，營養(yǎng)失調(diào)，血色素沉著，被動充血，高膽固醇血，接觸了毒藥或毒素如鉛，接觸藥物，免疫反應，遺傳決定的對某些物質(zhì)的敏感性，如可在肝豆狀核變性中見到的對銅敏感，以及傳染病如病毒性肝炎、梅毒和各種寄生蟲感染，包括但不限于曼氏血吸蟲病和日本血吸蟲病導致的肝纖維變性。另外，這樣的治療對于病因?qū)W未知或不完全清楚的肝纖維變性疾病也是有效的。
特別是，在前面的實施例中描述的證據(jù)清楚地顯示，鹵夫酮和本發(fā)明的其他化合物適于治療由肝細胞毒性物質(zhì)的攝取引起的肝病。即使一般不具有肝細胞毒性的物質(zhì)以過量濃度存在時也會引起肝損害，例如藥物。由于肝是通過許多不同化學物質(zhì)的代謝而解毒的主要器官，因此肝細胞毒性物質(zhì)的攝取引起的肝病不是一個少見的現(xiàn)象。如實施例1中所述的二甲基亞硝胺誘導的肝纖維變性模型的實驗清楚地顯示了本發(fā)明對這種肝病的治療效能。
我們并不想用單一機理來限制本發(fā)明化合物的作用，因為肝纖維變性是已用本發(fā)明化合物實質(zhì)上預防或改善的肝硬化發(fā)病的必需基本因素，除了可治療以單獨的肝纖維變性為特征的那些疾病外，所有這些方法也可用于治療肝硬化。
實施例6含有鹵夫酮的藥劑的制備方法以下是鹵夫酮或本發(fā)明的其他化合物之一及其藥學上可接受的鹽的制備方法的例子。作為舉例描述的是鹵夫酮的制備，但應理解這種描述包括本發(fā)明其他化合物及其藥學上可接受的鹽，以及鹵夫酮自身的藥學上可接受的鹽的制備方法。首先，按照良好的藥物制備慣例合成鹵夫酮。美國專利3,338,909中給出了合成鹵夫酮及相關(guān)喹唑啉酮衍生物的方法的例子。其次，如實施例4中所述，再次按照良好的藥物制備慣例，將鹵夫酮置于合適的藥物載體中。
應理解，上述說明書的意圖僅在于作為實施例，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)還可能有許多其他實施方案。
權(quán)利要求
1.一種用于治療主體肝硬化的組合物，該組合物包含藥學有效量的下式表示的化合物及其藥學上可接受的鹽
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；和R3是氫或低級鏈烯氧基-羰基。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述化合物是鹵夫酮。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，它進一步包含藥學上可接受的載體。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中肝硬化是由肝細胞毒性物質(zhì)引起的。
5.一種用于治療主體肝纖維變性的組合物，它包含藥學有效量的下式表示的化合物及其藥學上可接受的鹽
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；和R3是氫或低級鏈烯氧基-羰基。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述化合物是鹵夫酮。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，它進一步包含藥學上可接受的載體。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中肝纖維變性是由肝細胞毒性物質(zhì)引起的。
9.用于治療主體肝硬化的藥劑的制備方法，它包含將藥學有效量的化合物置于藥學上可接受的載體中的步驟，所述化合物是下式表示的化合物中的一員及其藥學上可接受的鹽
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；和R3是氫或低級鏈烯氧基-羰基。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述化合物是鹵夫酮。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中肝硬化是由肝細胞毒性物質(zhì)引起的。
12.用于治療主體肝纖維變性的藥劑的制備方法，該方法包含將藥學有效量的化合物置于藥學上可接受的載體中的步驟，所述化合物是下式表示的化合物中的一員
其中R1是氫、鹵素、硝基、苯并、低級烷基、苯基或低級烷氧基；R2是羥基、乙酰氧基或低級烷氧基；和R3是氫或低級鏈烯氧基-羰基；及其藥學上可接受的鹽。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述化合物是鹵夫酮。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中肝纖維變性是由肝細胞毒性物質(zhì)引起的。
全文摘要
本發(fā)明公開了治療肝纖維變性和肝硬化的組合物,以及該組合物的使用和制備方法。該組合物包括喹唑啉酮衍生物,優(yōu)選鹵夫酮。
文檔編號A61K31/505GK1265034SQ98805389
公開日2000年8月30日 申請日期1998年5月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月23日
發(fā)明者M·皮尼斯, A·納格勒 申請人:哈達斯特醫(yī)療研究服務和開發(fā)有限公司, 以色列農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究組織