專利名稱：：阿樸棉子酚酮及其用途的制作方法阿樸棉子酚酮及其用途發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明為藥用化學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及化合物阿樸棉子酚酮(apogossypolone)及其鹽和前體藥物。阿樸棉子酚酮起B(yǎng)cl-2家族蛋白抑制劑的作用。本發(fā)明還涉及阿樸棉子酚酮用于抑制過度增殖性細(xì)胞生長、用于在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和用于使細(xì)胞對細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)敏感的用途。相關(guān)技術(shù)侵害性的癌細(xì)胞表型為導(dǎo)致胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑失調(diào)的各種遺傳和外遺傳改變的結(jié)果(Ponder,Nature411:336(2001))。然而，所有癌細(xì)胞的共同特性是其衰竭以執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序，而因正常細(xì)胞凋亡機(jī)制中的缺陷導(dǎo)致缺乏適當(dāng)?shù)募?xì)胞凋亡程序是癌癥的標(biāo)志(Lowe等，Carcinogenesis21:485(2000))。目前癌癥療法中的大部分，包括化療劑、放射和免疫療法均通過間接誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡起作用。于是因正常細(xì)胞凋亡機(jī)制中的缺陷而導(dǎo)致癌細(xì)胞不能執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序通常與對化療、放射或免疫療法誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的抗性增加有關(guān)。因細(xì)胞凋亡缺陷而導(dǎo)致的不同來源的人癌對目前的治療方案產(chǎn)生原發(fā)性或獲得性抗性是目前癌癥療法中的主要問題(Lowe等，Carcinogenesis21:485(2000);Nicholson,Nature407:810(2000))。因此，目前和未來為改善癌癥患者存活和生活質(zhì)量而針對設(shè)計(jì)和研發(fā)新的分子靶-特異性抗癌療法的努力必須包括特異性把向癌細(xì)胞對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抗性的策略。在這方面，靶向在直接抑制癌細(xì)胞中細(xì)胞凋亡中起重要作用的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)物代表了用于新的抗癌藥物設(shè)計(jì)的非常富有希望的治療策略.已經(jīng)鑒定了兩類細(xì)胞凋亡的重要負(fù)調(diào)節(jié)物。笫一類調(diào)節(jié)物為細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑(IAPs)(Deveraux等，GenesDev.13:239(1999);Salvesen等，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.3:401(2002))。IAP蛋白有效抑制各種細(xì)胞凋亡刺激物，包括化療劑、放射和免疫療法在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。第二類細(xì)胞凋亡的重要負(fù)調(diào)節(jié)物為Bcl-2族蛋白(Adams等，Science281:1322(1998);Reed，Adv.Pharmacol.41:501(1997);Reed等，J,Cell.Biochem.60:23(1996))。Bcl-2為該族中的基本成員并且首先作為癌基因產(chǎn)物分離。Bcl-2族目前包括抗-細(xì)胞凋亡分子，諸如Bel-2和Bel-xL;以及促細(xì)胞凋亡分子，諸如Bax、Bak、Bid和Bad。Bcl-2和Bcl-xL在許多類型的人癌(例如乳腺、前列腺、結(jié)腸直腸、肺)中得到超表達(dá)，包括因?qū)е翨cl-2超表達(dá)的染色體易位(U4，18)引起的非何杰金淋巴瘤。這提示許多癌細(xì)胞類型依賴于Bel-2和/或Bcl-xL水平升高以幸免于其它細(xì)胞紊亂，其同時(shí)定義這些細(xì)胞為癌癥或前-癌癥細(xì)胞并且使它們嘗試完成細(xì)胞凋亡途徑。此外，已經(jīng)將Bcl-2族蛋白表達(dá)增加視為是對以不同途徑在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的癌癥治療藥物和放射產(chǎn)生抗性的基礎(chǔ)。認(rèn)為Bcl-2和Bcl-xL在肺瘤細(xì)胞遷移和侵入和由此的轉(zhuǎn)移中起作用。(Amberger等，CancerRes.58:149(1998);Wick等，REBSLett，440:419(1998);Mohanam等，CancerRes.53:4143(1993);Pedersen等，CancerRes.，53:5158(1993))。Bc卜2族蛋白看起來為腫瘤細(xì)胞提供在新的和非允許環(huán)境(例如轉(zhuǎn)移部位)中存活的機(jī)制，并且有助于臨床轉(zhuǎn)移癌擴(kuò)散的器官特異性模式.(Rubio,LabInvest.81:725(2001);Fernandez等，CellDeathDiffer.7:350(2000))。還認(rèn)為抗細(xì)胞凋亡蛋白，諸如Bcl-2和/或Bcl-xL例如通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。(Reed，Nature387:773(1997);Frisch等，Curr.Opin.CellBiol.9:701(1997);DelBufalo等，F(xiàn)ASEBJ.11:947(1997))。已經(jīng)廣泛綜述了用于乾向癌癥中的Bcl-2和Bcl-xL以恢復(fù)癌細(xì)胞的敏感性并且克服癌細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的抗性的治療策略(Adams等，Science281:1322(1998);Reed,Adv.Pharmacol.41:501(1997);Reed等，J.Cell.Biochem.60:23(1996))。目前，Bc卜2反義療法處于治療實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤的幾個(gè)III期臨床試驗(yàn)階段。棉酚為天然存在的來源于粗棉籽油(草棉屬)的雙重雙酚化合物。全性(Wu，Drugs38:333(1989))。近來已經(jīng)證實(shí)棉酚具有抗增殖作用(Flack等，J.Clin.Endocrinol.Metab.76:1019(1993);Bushu謂等，J.Neuro-Oncol.43:79，(1999);VanPoznak等，BreastCancerRes.Treat.66:239(2001))。近來已經(jīng)證實(shí)(-)-棉酚及其衍生物為Bel-2和Bcl-l的有效抑制劑并且具有強(qiáng)抗-癌活性(美國專利申請US2003/0008924)。發(fā)明概述通常公認(rèn)的是癌細(xì)胞或其支持細(xì)胞不能發(fā)生細(xì)胞凋亡響應(yīng)遺傳損傷或接觸細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物(諸如抗癌藥和放射)是癌癥發(fā)作和發(fā)展的主要因素.認(rèn)為誘導(dǎo)癌細(xì)胞或其支持細(xì)胞(例如腫瘤脈管系統(tǒng)中的新血管細(xì)胞)中的細(xì)胞凋亡實(shí)際上是市售的所有有效癌癥治療藥或放療或當(dāng)今實(shí)踐的普遍作用機(jī)制。細(xì)胞不能發(fā)生細(xì)胞凋亡的一個(gè)原因在于抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白表達(dá)增加和蓄積。本發(fā)明預(yù)期，患有癌癥的動(dòng)物接觸抑制抗-細(xì)胞凋亡Bc卜2族蛋白功能的治療有效量的藥物(例如，小分子)可以徹底殺滅癌細(xì)胞或支持細(xì)胞(其持續(xù)存活依賴于一種或多種Bcl-2族蛋白的過度活性的那些細(xì)胞)和/或使得這類作為群體的細(xì)胞對誘導(dǎo)細(xì)胞死亡活性的癌癥治療藥物或放療更為敏感。本發(fā)明預(yù)期，當(dāng)將抑制依賴于抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白功能的癌細(xì)胞中的過度增殖(如，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡)作為單一療法給予時(shí)，或當(dāng)以與誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的其它癌癥治療藥物或放療時(shí)間相關(guān)給予以使更大比例的癌細(xì)胞或支持細(xì)胞比僅用癌癥治療藥或單獨(dú)的放療治療的動(dòng)物中相應(yīng)比例的細(xì)胞易于執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序時(shí)，抗-細(xì)胞凋亡的Bcl-2家族蛋白的抑制劑將滿足對治療多種癌癥類型尚未滿足的需求。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，使用治療有效量的本發(fā)明化合物和一系列(acourseof)抗癌藥或放射的聯(lián)合療法與單獨(dú)使用上述化合物或抗癌藥/放射治療相比可以在這類動(dòng)物中產(chǎn)生更大的腫瘤反應(yīng)和臨床有益性。作為另一種方式，因?yàn)樗龅幕衔锟山档捅磉_(dá)抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白的所有細(xì)胞的細(xì)胞凋亡闊值，所以成功執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序響應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗癌藥/放射的活性的細(xì)胞比例增加?；蛘撸景l(fā)明的化合物能夠以較低且由此以低毒性和更為可耐受的劑量的抗癌藥和/或放射給藥，從而產(chǎn)生與單獨(dú)抗癌藥和/或放射的常規(guī)劑量相同的腫瘤反應(yīng)/臨床有益性。由于已知所有經(jīng)批準(zhǔn)的抗癌藥和放療的劑量，所以本發(fā)明關(guān)注它們與本發(fā)明化合物的各種組合。此外，由于本發(fā)明的化合物至少部分通過抑制抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白起作用，所以將癌細(xì)胞和支持細(xì)胞接觸治療有效量的所述化合物可以是時(shí)間上關(guān)聯(lián)的以與細(xì)胞執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序響應(yīng)抗癌藥或放療的嘗試相符。因此，在某些實(shí)施方案中，與某些時(shí)間關(guān)聯(lián)有關(guān)給予本發(fā)明的組合物可以提供尤其有效的治療實(shí)踐。本發(fā)明涉及阿樸棉子酚酮(式I)或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物，其用于抑制抗-細(xì)胞凋亡性Bc1-2家族蛋白的活性、抑制細(xì)胞過度增殖、在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、并增加細(xì)胞對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>本發(fā)明的化合物可用于治療、改善或預(yù)防響應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的疾病，例如特征在于細(xì)胞凋亡失調(diào)的疾病，包括過度增殖性疾病，諸如癌癥。在某些實(shí)施方案中，該化合物可以用于治療、改善或預(yù)防特征在于對癌癥療法產(chǎn)生抗性(例如為化學(xué)抗性、放射抗性、激素抗性等)的癌癥。在額外的實(shí)施方案中，該化合物可以用于治療、改善或預(yù)防轉(zhuǎn)移癌。在其它實(shí)施方案中，該化合物可以用于治療特征在于抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白超表達(dá)的過度增殖性疾病。與棉酚和阿樸棉子酚酮有關(guān)的其它化合物可用于治療、改善或預(yù)防響應(yīng)i秀導(dǎo)細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡的疾病，例如特征在于細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)障礙的疾病，包括過度增殖性疾病如癌癥。這類化合物包括棉子酚酸(式V)和gossypolonicacid(式VI)或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物。本發(fā)明提供含有對抑制細(xì)胞過度增殖、在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或使細(xì)胞對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑敏感治療有效量的本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物的藥物組合物。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物的試劑盒。該試劑盒可任選地含有用于將化合物和/或其它治療劑，例如，抗癌劑給予動(dòng)物的說明。本發(fā)明還提供制備本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物的方法。還提供用作合成阿樸棉子盼酮的中間體的化合物。圖/附圖簡述圖1表示阿樸棉子酚酮與Bcl-2和Bel-xL的結(jié)合。圖2表示阿樸棉子酚酮和其它棉酚衍生物對人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(亞克隆2LMP)細(xì)胞中細(xì)胞生長的抑制.圖3表示阿樸棉子酚酮和其它棉酚衍生物對人乳腺癌細(xì)胞系TWD細(xì)胞中細(xì)胞生長的抑制。圖4表示阿樸棉子酚酮和其它棉酚衍生物對人乳腺癌細(xì)胞系MDA-435細(xì)胞中細(xì)胞生長的抑制。圖5表示阿樸棉子酚酮和X-射線輻射對人前列腺癌細(xì)胞系PC-3異種移植棵鼠模型中腫瘤生長的抑制。圖6表示不同濃度Flu-Bid-21mer肽對Mc卜l蛋白的結(jié)合等溫線。圖7表示使用熒光-極化結(jié)合測定法測定的未標(biāo)記的BID21mer肽、阿樸棉子酚酮和(-)-棉酚對Mcl-l的竟?fàn)幮越Y(jié)合曲線。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及阿樸棉子酚酮或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物，其作為抗-細(xì)胞凋亡性Bcl-2家族蛋白抑制劑起作用。通過抑制抗-細(xì)胞凋亡性Bcl-2家族蛋白，阿樸棉子酚酮抑制細(xì)胞過度增殖、使細(xì)胞對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑敏感且，在一些情況下，本身誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，本發(fā)明涉及抑制細(xì)胞過度增殖方法、使細(xì)胞對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑敏感的方法和在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，包括使細(xì)胞與單獨(dú)的阿樸棉子盼酮或其鹽或前體藥物或和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的組合相接觸。本發(fā)明還涉及治療、改善或預(yù)防動(dòng)物中響應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的障礙的方法，包括給予動(dòng)物阿樸棉子酚酮或其鹽或前體藥物和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。這類障礙包括特征在于細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)障礙的那些和特征在于抗-細(xì)胞凋亡性Bcl-2家族蛋白超表達(dá)的那些。本發(fā)明另一方面涉及與棉酚或阿樸棉子酚酮有關(guān)的化合物，其也起抗-細(xì)胞凋亡性Bcl-2家族蛋白抑制劑的作用且其可用于本發(fā)明的實(shí)踐。這類化合物包括棉子酚酸和gossypolonicacid或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物。此處所用術(shù)語"Bcl-2家族蛋白"是指Bcl-2家族的抗-細(xì)胞凋亡性成員，包括但不限于Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-l、A1/BFL-1、B00-DIVA、Bcl-w、Bcl-6、Bcl-8和Bcl-y，和Bcl-2家族的促-細(xì)胞凋亡性成員，包括但不限于，Bak、Bax、Bad、tBid、Hrk、Bim、Bmf以及含有被阿樸棉子酚酮化合物調(diào)節(jié)的蛋白的其它Bcl-2同源性結(jié)構(gòu)域3(BH3).本文所用的術(shù)語"抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白的超表達(dá)"指的是與表達(dá)基礎(chǔ)水平的編碼抗-細(xì)胞凋亡Bc1-2族蛋白的mRNAs或具有基礎(chǔ)水平的抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白的相似的相應(yīng)非病理細(xì)胞相比，編碼抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白的mRMs水平升高(例如水平異常)和/或細(xì)胞中抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白水平升高。用于檢測細(xì)胞中編碼抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白的mRNAs水平或抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白水平的方法包括但不限于使用抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白抗體的蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué)法和核酸擴(kuò)增或直接RNA檢測法。與細(xì)胞中抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白的絕對水平同樣重要的是確定它們超表達(dá)抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白，這類細(xì)胞中，抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白相對于其它促-細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子(例如促-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白)的相對水平同樣也是如此。當(dāng)這兩種分子達(dá)到平衡，使得并非指抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白的水平時(shí)，促-細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)分子可足以使細(xì)胞執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序并且死亡，所述的細(xì)胞依賴于抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白才能存活。在這類細(xì)胞中，接觸抑制有效量的抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白抑制劑足以使得細(xì)胞執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序并且死亡。因此，術(shù)語"抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白的超表達(dá)"還指因促-細(xì)胞凋亡信號和抗-細(xì)胞凋亡信號的相對水平而導(dǎo)致細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞凋亡來響應(yīng)抑制有效量的抑制抗-細(xì)胞凋亡Bcl-2族蛋白功能的化合物。本文所用的術(shù)語"抗癌藥"和"抗癌藥物"指的是用于治療過度增殖性疾病，諸如癌癥(例如哺乳動(dòng)物中)的任意治療劑(例如化療化合物和/或分子治療化合物)、放療或外科手術(shù)。.此處所用術(shù)語"前體藥物"是指母"藥物"分子的藥理學(xué)非活性衍生物，其需要在靶生理學(xué)系統(tǒng)內(nèi)生物轉(zhuǎn)化(例如，自發(fā)的或酶促的)而釋放，或?qū)⑶绑w藥物(例如，酶促地、機(jī)械地、電磁地)轉(zhuǎn)化成活性藥物。前體藥物被設(shè)計(jì)用于克服與穩(wěn)定性、毒性、缺少特異性、或生物可利用率有限有關(guān)的問題，舉例性的前體藥物包括本身活性的藥物分子和化學(xué)掩蔽基團(tuán)(例如，可逆地抑制藥物活性的基團(tuán)).一些優(yōu)學(xué)轉(zhuǎn)化(辦如，磷酸化、氫化、脫氫化、糖基化)時(shí)，舉例性的前體藥物變成體內(nèi)或體外藥學(xué)活性的。前體藥物常常提供溶解性、組織相容性或在哺乳動(dòng)物生物體中延遲釋放的益處(JS辨如Bundgard，DesignofProdrugs,pp.7-9,21-24,Elsevier,Amsterdam(1985);和Silverman,TheOrganicChemistryofDrugDesignandDrugAction,pp.352-401，AcademicPress,SanDiego,CA(1992))。常見的前體藥物包括酸衍生物如通過阿樸棉子酚酮的羥基與適宜羧酸(例如，低級羧酸如乙酸)反應(yīng)制備的酯，和通過阿樸棉子酚酮的酮基與胺(例如，低級的一級或二級烷基胺)反應(yīng)制備的亞胺。此處所用術(shù)語"藥學(xué)上可接受的鹽"是指本發(fā)明化合物的任意鹽(例如，通過與酸或堿反應(yīng)獲得)，其在靶動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物)中是生理學(xué)耐受的。本發(fā)明化合物的鹽可得自無機(jī)或有機(jī)堿。堿的例子包括但不限于，堿金屬(例如，鈉和鋰)氫氧化物，堿土金屬(鄉(xiāng)如，激氫氧化物、氨、和式NW/的化合物等，其中W是Ch坑基。用于治療用途時(shí)，預(yù)計(jì)本發(fā)明化合物的鹽是藥學(xué)上可接受的。然而，發(fā)現(xiàn)非-藥學(xué)上可接受的酸和堿鹽業(yè)可用于藥學(xué)上可接受的化合物的制備或純化。本文所用的術(shù)語"治療有效量"指的是足以使得疾病的一種或多種癥狀得以改善，或預(yù)防疾病發(fā)展，或使得疾病退化的治療劑用量。例如，就治療癌癥而言，治療有效量優(yōu)選指的是產(chǎn)生如下效果的治療劑用量減緩腫瘤生長速率、減小腫瘤塊、減少轉(zhuǎn)移病灶的數(shù)量、增加至腫瘤進(jìn)展的時(shí)間，或?qū)⒋婊顣r(shí)間增加至少5%，優(yōu)選至少10%,至少15%，至少20%,至少25%，至少30%，至少35%，至少40%,至少45沐，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%，至少95%或至少100%。本文所用的術(shù)語"敏感'，和"致敏"指的是通過給予第一種活性劑(例如通式1的化合物)使得動(dòng)物或動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞對第二種活性劑的生物作用更為敏感或更具反應(yīng)性(例如促進(jìn)或阻止細(xì)胞功能的方面，包括但不限于細(xì)胞生長、增殖、侵入、血管發(fā)生或細(xì)胞凋亡)。可以將第一種活性劑對靶細(xì)胞的致敏作用測定為在給予第二種活性劑并給予或不給第一種活性劑時(shí)觀察到的指定生物作用(例如促進(jìn)或阻止細(xì)胞功能的方面，包括但不限于細(xì)胞生長、增殖、侵入、血管發(fā)生或細(xì)胞凋亡)的差異。致敏細(xì)胞的反應(yīng)相對于沒有第一種活性劑存在下的反應(yīng)可以增加至少10%，至少20%,至少30%，至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少100%，至少150%,至少200%，至少350%，至少300%,至少350%,至少400%,至少450%或至少500%。本文所用的術(shù)語"細(xì)胞凋亡失調(diào)"指的是細(xì)胞通過細(xì)胞凋亡發(fā)生細(xì)胞死亡的能力上的任何異常(例如遺傳缺陷)。細(xì)胞凋亡失調(diào)與各種病癥有關(guān)或由其誘導(dǎo)，包括例如自身免疫病(例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、移植物抗宿主病、重癥肌無力或斯耶格倫綜合癥)、慢性炎癥疾病(例如牛皮癬、哮喘或克羅恩病)、過度增殖性疾病(例如腫瘤、B細(xì)胞淋巴瘤或T細(xì)胞淋巴瘤)、病毒感染(例如皰疹、乳頭狀瘤或HIV)和其它疾病，諸如骨關(guān)節(jié)炎和動(dòng)脈粥樣硬化。應(yīng)注意當(dāng)失調(diào)由病毒感染誘導(dǎo)或與之相關(guān)時(shí)，病毒感染在失調(diào)發(fā)生或觀察到失調(diào)時(shí)可能檢測到，也可能無法檢測到。即病毒誘導(dǎo)的失調(diào)甚至可能在病毒感染癥狀消失后發(fā)生。本文所用的術(shù)語"過度增殖性疾病"指的是動(dòng)物體內(nèi)增殖細(xì)胞的局部群體不受通常正常生長限制的任意病癥。過度增殖性疾病包括腫瘤、贅生物、淋巴瘤等。如果贅生物不發(fā)生侵入或轉(zhuǎn)移，那么認(rèn)為贅生物為良性的，而如果它出現(xiàn)上述情況之一，那么認(rèn)為贅生物是惡性的。"轉(zhuǎn)移性"細(xì)胞指的是細(xì)胞可以侵入和破壞附近的身體結(jié)構(gòu).超常增生為細(xì)胞增殖的形式，包括組織或器官中細(xì)胞數(shù)量的增加，而結(jié)構(gòu)或功能沒有顯著改變。組織變形為細(xì)胞生長受控的形式，其中一種類型的完全分化的細(xì)胞取代了另一種類型的分化的細(xì)胞。活化的淋巴樣細(xì)胞的病理性生長通常導(dǎo)致自身免疫病或慢性炎癥病癥.本文所用的術(shù)語"自身免疫病"指的是生物體產(chǎn)生識別生物體自身分子、細(xì)胞或組織的抗體或免疫細(xì)胞的任何疾病。自身免疫病的非限制性實(shí)例包括自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、貝格爾病或IgA腎病、口炎性腹瀉、慢性疲勞綜合征、克羅恩病、皮肌炎、纖維肌痛、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、橋本甲狀腺炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、扁平苔癬、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、牛皮癬、風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、斯耶格倫綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼裔、1型糖尿病、潰瘍性結(jié)腸炎、白癜風(fēng)等。本文所用的術(shù)語"胂瘤性疾病"指的是良性(非-癌性)或惡性(癌性)的細(xì)胞的任何異常生長。本文所用的術(shù)語"抗腫瘤藥"指的是阻止靶向的(例如惡性)贅生物增殖、生長或擴(kuò)散的任意化合物。本文所用的術(shù)語"預(yù)防(prevent)"、"預(yù)防(preventing)"和"預(yù)防(prevention)"指的是減少動(dòng)物體內(nèi)病理細(xì)胞(例如過度增殖性或贅生性細(xì)胞)的出現(xiàn)。預(yù)防可以是完全的，例如在受試者體內(nèi)病理細(xì)胞總體上不存在。預(yù)防還可以是部分的，使得受試者體內(nèi)出現(xiàn)的病理細(xì)胞少于在不使用本發(fā)明時(shí)出現(xiàn)的病理細(xì)胞。本文所用的術(shù)語'，協(xié)同作用"指的是當(dāng)共同給予(例如同時(shí)或依次)阿樸棉子酚酮和第二種活性劑時(shí)獲得大于分別給予阿樸棉子酚酮和第二種活性劑時(shí)的累加作用的作用。這種協(xié)同作用使得阿樸棉子酚酮和/或第二種活性劑的給藥劑量較低或提供相同劑量下更大的功效。獲得的協(xié)同作用可以大于阿樸棉子酚酮化合物和第二種活性劑分別給藥時(shí)的累加作用的至少10%,至少20%，至少30%，至少40%,至少50%，至少60%，至少70%，至少80°/。，至少90°/。，至少100%，至少125%，至少150%,至少175%,至少200%,至少250%，至少300%，至少350%,至少400%或至少500%。例如，就治療癌癥而言，協(xié)同作用可以是腫瘤生長速率的降低、腫瘤塊的減小、轉(zhuǎn)移病灶數(shù)量的減少、達(dá)到腫瘤發(fā)展的時(shí)間增加或存活時(shí)間增加。正如此處所述，當(dāng)分別給藥時(shí)，阿樸棉子酚酮化合物和抗癌劑常常僅抑制腫瘤細(xì)胞增殖，而不會(huì)引起腫瘤塊消退.根據(jù)本發(fā)明，阿樸棉子酴酮化合物與抗癌劑的給藥用于引起腫瘤塊實(shí)際消退.共同給予阿樸棉子酚酮和抗癌藥可以使得較低劑量的阿樸棉子酚酮和/或抗癌藥的應(yīng)用成為可能，從而使得癌癥得到有效治療同時(shí)避免了任何對受試者的實(shí)質(zhì)性毒性。本發(fā)明抗-細(xì)胞凋亡性Bcl-2家族蛋白的抑制劑包括阿樸棉子酚酮(式I)或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物。本發(fā)明抗-細(xì)胞凋亡性Bcl-2家族蛋白的其它抑制劑包括棉子酚酸(式V)和gossypolonicacid(式VI)或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物。本發(fā)明的某些化合物可以立體異構(gòu)體包括旋光異構(gòu)體的形式存在，例如，(+)-阿樸棉子酚酮、(-)-阿樸棉子酚酮、(+)-棉子酚酸、(-)-棉子酚酸、(+)-gossypolonicacid、和(-)-gossypolonicacid。優(yōu)選，各自具有1%-100%對映異構(gòu)體過量的(+)-阿樸棉子酚酮、(-)-阿樸棉子酚酮、(+)-棉子酚酸、(-)-棉子酚酸、(+)-gossypolonicacid、和(-)-gossypolonicacid。在其中一個(gè)實(shí)施方案中,(+)-阿樸棉子酚酮、(-)-阿樸棉子酚酮、(+)-棉子酚酸、(-)-棉子盼酸、(+)-gossypolonicacid、和(-)-gossypolonicacid各自具有至少10%，20%，30%，40%，50%,60%，70%,80%，90%，91%，92°yi，93%，94%,95%,96%，97%,98%,99%或100%的對映異構(gòu)體過量.本發(fā)明包括所有立體異構(gòu)體和這類立體異構(gòu)體的外消旋混合物以及各自的對映異構(gòu)體，其可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備。本發(fā)明的化合物可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和實(shí)施例中公開的方法制備。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，阿樸棉子盼酮是通過流程I所示方法，從棉酚合成的，其中P是保護(hù)基團(tuán)。在選擇性實(shí)施方案中，手性HPLC柱可用于將(±)-阿樸棉子酚酮分離成其(+)和(-)對映異構(gòu)體。流程I在其中一個(gè)實(shí)施方案中，gossypolonicacid通過流程II所示方法，從棉酚合成。本發(fā)明還涉及制備阿樸棉子酚酮的方法，包括(a)使棉酚脫羰基，從而產(chǎn)生式II的化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>(b)保護(hù)式II化合物的羥基，從而產(chǎn)生式III的化合物，其中P是保護(hù)基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>(c)氧化式III的化合物，從而產(chǎn)生式IV的化合物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>(d)使式IV的化合物脫保護(hù)，從而產(chǎn)生阿樸棉子酚酮。棉酴可通過在堿性條件下，與溶劑中加熱棉酚而脫羰基。棉酚還可通過與HSCH2CH2SH在有BF3/Et20存在的條件下反應(yīng)而脫羰基。例如，約40-150iC，更優(yōu)選約85X:下在NaOH或KOH水溶液中加熱棉酚。該反應(yīng)優(yōu)選在惰性氣體(例如，氬或氮?dú)?下進(jìn)行。保護(hù)基團(tuán)"P"包括任意適合的保護(hù)基團(tuán)，如低級烷?；?、芳烷?；?、苯甲酰基和烷基/芳基曱硅烷基，例如，叔-丁基二甲基曱硅烷基.烷?；睦影ㄒ阴；?、丙?；?、叔-丁?；?，芳烷酰基的例子包括苯乙?；蚻-苯基-l-甲基乙酰基。式III羥基保護(hù)的化合物可通過使式11化合物與適宜試劑如相應(yīng)烷酸、芳烷酸或苯甲酸的酸酐或酰基卣反應(yīng)而制備。當(dāng)保護(hù)基團(tuán)是烷基或烷基/芳基甲硅烷基時(shí)，可使用相應(yīng)的甲硅烷基氯試劑。該反應(yīng)在有有機(jī)堿如N，N'-二異丙基乙胺、吡啶或二曱氨基吡啶存在的條件下，于室溫下并適宜的惰性溶劑中進(jìn)行長達(dá)12小時(shí)。式IV化合物可通過用適宜氧化試劑如高碘酸或氧化鉻(VI)，在適宜溶劑如二嚙烷、乙腈或乙酸中，在約40-i5or:，優(yōu)選約8o-i2or;下氧化式III化合物共10-600分鐘而制備。式IV化合物的分離可通過任意常規(guī)方法如萃取和色旙法實(shí)現(xiàn)。然后，阿樸棉子酚酮可通過除去式IV化合物的保護(hù)基團(tuán)而制備。當(dāng)保護(hù)基團(tuán)是烷?；?、芳烷?；虮郊柞；鶗r(shí)，它們可通過使式IV化合物與堿在適宜溶劑中反應(yīng)而除去。堿的例子包括碳酸鈉和鉀，和氫氧化鋰、鈉和鉀，適宜溶劑包括瞇如二嚙烷和極性非-質(zhì)子溶劑如二甲基甲酰胺和二甲亞砜。然后，可酸化阿樸棉子酚酮并通過提取分離，然后通過結(jié)晶/重結(jié)晶純化而提供純化阿樸棉子酚酮。本發(fā)明還涉及用作阿樸棉子酚酮，包括式n、III和IV化合物的合成中的中間體的化合物。本發(fā)明的重要方面在于阿樸棉子酚酮按照與棉酚相同的方式結(jié)合并抑制抗-細(xì)胞凋亡性Bcl-2蛋白。然而，阿樸棉子酚酮較之棉酚結(jié)合更緊密且為更有效的抑制劑，同時(shí)毒性較低。因此，阿樸棉子酚酮或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物可抑制過度增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并加強(qiáng)響應(yīng)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)信號的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。預(yù)計(jì)這些化合物使細(xì)胞，包括耐這種誘導(dǎo)劑的細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)劑敏感.本發(fā)明的抗-細(xì)胞凋亡性Bcl-2家族蛋白抑制劑可用于在被細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)治療、改善或預(yù)防的任意疾病中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，本發(fā)明提供用于靶向表現(xiàn)為超表達(dá)抗-細(xì)胞凋亡性Bcl-2家族蛋白的動(dòng)物的組合物和方法。在其中一些實(shí)施方案中，細(xì)胞(辦如，^勿應(yīng))顯示出與非-病理學(xué)樣品(例如，非-癌細(xì)胞)更高水平的一種或多種抗-細(xì)胞凋亡性Bcl-2家族蛋白.在其它實(shí)施方案中，細(xì)胞操作上表現(xiàn)出更高表達(dá)水平的抗-細(xì)胞凋亡性Bcl-2家族蛋白，這是由于實(shí)行細(xì)胞凋亡程序并在響應(yīng)抑制有效量的阿樸棉子酚酮時(shí)死亡，所述響應(yīng)發(fā)生至少部分是由于在這類細(xì)胞中，它們的存活取決于抗-細(xì)胞凋亡性Bcl-2家族蛋白功能。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法用于治療動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物受試者，包括但不限于人和獸類動(dòng)物)患病的細(xì)胞、組織、器官或病理情況和/或疾病狀態(tài)。在這方面，使用本發(fā)明的方法和組合物易于治療或預(yù)防各種疾病和病理情況。這些疾病和病癥的非限制性典型實(shí)例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、惡性黑素瘤、卵巢癌、腦癌、原發(fā)性腦癌、頭頸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌、頭或頸癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、維爾姆斯腫瘤、宮頸癌、睪丸癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、泌尿生殖器癌、甲狀腺癌、食道癌、骨髄瘤、多發(fā)性骨髄瘤、腎上腺癌、腎細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌、惡性胰腺胰島素瘤、惡性類癌瘤、絨毛膜癌、蕈樣霉菌病、惡性血鈣過多、宮頸超常增生、白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性髄細(xì)胞性白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、急性粒細(xì)胞性白血病、毛細(xì)胞性白血病、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、卡波西肉瘤、真性紅細(xì)胞增多、特發(fā)性血小板增多癥、何杰金病、非何杰金淋巴瘤、軟組織肉瘤、骨肉瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥和視網(wǎng)膜成神經(jīng)細(xì)胞瘤等；T和B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病、炎性疾病、感染、過度增殖性疾病、AIDS、變性疾病、血管疾病等。在某些實(shí)施方案中，所治療的癌細(xì)胞為轉(zhuǎn)移性的.在其它實(shí)施方案中，所治療的癌細(xì)胞對抗癌藥產(chǎn)生耐藥性。在某些實(shí)施方案中，適合于用本發(fā)明組合物和方法治療的感染包括但不限于由病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、阮病毒導(dǎo)致的感染。本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了給予有效量的阿樸棉子酚酮和至少一種額外的治療劑(包括但不限于化療劑、抗腫瘤藥、抗微生物劑、抗病毒藥、抗真菌藥和抗炎藥)和/或治療技術(shù)(例如外科手術(shù)和/或放療)的方法.在某些實(shí)施方案中，預(yù)計(jì)阿樸棉子酚酮與一種或多種治療劑的組合比單獨(dú)的每種化合物的給藥具有更大的作用。在其它實(shí)施方案中，預(yù)計(jì)阿樸棉子酚酮與一種或多種治療劑的組合與單獨(dú)的每種化合物的給藥相比可以產(chǎn)生協(xié)同作用(即大于累加作用)。預(yù)期許多合適的抗癌藥用于本發(fā)明方法。實(shí)際上，本發(fā)明預(yù)期但不限于許多抗癌藥的給藥，諸如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性劑；多核苷酸(例如反義物、核酶、siRNA);多肽類(例如酶和抗體)；生物模擬物(例如棉酚或BH3模擬物)；與Bcl-2族蛋白、諸如Bax結(jié)合的活性劑(例如寡聚物或復(fù)合物)；生物堿類；烷化劑；抗腫瘤抗生素；抗代謝物；激素；鉑化合物；單克隆或多克隆抗體(例如與抗癌藥、毒素、防衛(wèi)素綴合的抗體)、毒素；放射性核素；生物學(xué)反應(yīng)修飾劑(例如干擾素(例如IFN-a)和白細(xì)胞介素(例如IL-2));過繼免疫治療劑；造血生長因子；誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的活性劑(例如全反式視黃酸)；基因療法試劑(例如反義療法試劑和核苷酸)；肺瘤疫苗；血管發(fā)生抑制劑；蛋白體抑制劑；NF-KB調(diào)節(jié)劑；抗-CDK化合物；HDAC抑制劑等。適合于與所披露的化合物共同給藥的化療化合物和抗癌療法的大量其它實(shí)例為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗癌藥包括誘導(dǎo)或刺激細(xì)胞凋亡的活性劑。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性劑包括但不限于放射(例如x-射線、y射線、UV);激酶抑制劑(例如表皮生長因子受體(EGFR)激酶抑制劑、血管生長因子受體(VGFR)激酶抑制劑、成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR)激酶抑制劑、血小板衍生的生長因子受體(PDGFR)激酶抑制劑和Bcr-Abl激酶抑制劑(諸如GLEEVEC));反義分子；抗體(例如HERCEPTIN、RITUXAN、ZEVALIN、和AVASTIN);抗雌激素藥(例如雷洛昔芬和他莫昔芬)；抗雄激素藥(例如氟他胺、比卡魯胺、非那雄胺、氨魯米特、酮康唑和皮質(zhì)類固醇)；環(huán)加氧酶2(C0X-"抑制劑(例如塞來考昔、美洛昔康、NS-398和非類固醇抗炎藥)；抗炎藥(例如保泰松、DECADRON、DELTASONE、地塞米松、dexamethasoneintensol、DEX0NE、HEXADR0L、羥氯會(huì)、METICORTEN、0RADEX0N、0RAS0NE、羥布宗、PEDIAPRED、保泰松、PLAQUENIL、潑尼松龍、潑尼松、PREL0NE和TANDEARIL);和癌癥化療藥(例如伊立替康(CAMPTOSAR)、CPT-ll、氟達(dá)拉濱(FLUDARA)、達(dá)卡巴溱、地塞米松、米托蒽醌、MYL0TARG、VP-16、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、5-FU、多柔比星、吉西他濱、bortezomib、gefitinib、貝伐單抗、TAX0TERE或TAX0L);細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子；神經(jīng)酰胺類和細(xì)胞因子；十字孢堿等。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法提供了式(I)化合物和至少一種抗過度增殖藥或抗胂瘤藥；例如選自烷化劑、抗代謝物和天然產(chǎn)物(例如草藥和其它植物和/或動(dòng)物來源的化合物)。適用于本發(fā)明組合物和方法的烷化劑包括但不限于1)氮芥(例如雙氯乙基甲胺、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖(L-沙可來新)；和苯丁酸氮芥)；2)氮丙啶類和甲基蜜胺類(例如六甲蜜胺和塞替派)；3)磺酸烷基酯類(例如白消安)；4)亞硝基脲類(例如卡莫司汀(BCNU);環(huán)己亞硝脲(CCNU);司莫司汀(曱基-CC冊)；和鏈佐星(鏈唑霉素))；和5)三氮烯類(例如達(dá)卡巴溱(二甲基-三氮烯-咪唑羧酰胺)。在某些實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明組合物和方法的抗代謝物包括但不限于1)葉酸類似物(例如曱氨蝶呤(methotrexate)(甲氨蝶呤(amethopterin)));2)嘧啶類似物(例如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶)、氟尿嘧啶脫氧核苷(floxuridine)(氟尿嘧啶脫氧核苷(fluorode-oxyuridine))和阿糖胞苷(cytarabine)(阿糖胞普(cytosinearabinoside)));和3)噪呤類似物(例如巰噪呤(6-巰噪呤)、硫鳥嘌呤(6-硫鳥嘌呤)；和噴司他丁(2'-脫氧考福霉素(coformycin)))。在其它實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明組合物和方法的化療藥包括但不限于l)長春花生物堿(例如長春堿、長春新堿)；2)表鬼臼毒素(例如依托泊苷和替尼泊苷)；3)抗生素(例如更生霉素(放線菌素D)、柔紅霉素(道諾霹素；柔紅霉素)、多柔比星、博來審素、普卡霉素(光輝霉素)和絲裂霉素(絲裂霉素C));4)酶(例如L-天冬酰胺酶)；5)生物學(xué)反應(yīng)修飾劑(例如干擾素-a);6)鉑配位配合物(例如順鉑和卡鉑)；7)蒽二酮類(例如米托蒽醌)；8)取代的脲類(例如羥基脲)；9)丙卡巴肼衍生物(例如丙卡巴肼(N-丙卡巴肼))；10)腎上腺皮質(zhì)抑制劑(例如米托坦(o，p'-DDD)和氨魯米特)；11)腎上腺皮質(zhì)類固醇(例如潑尼松)；12)黃體酮(例如己酸羥孕酮、醋酸曱羥孕酮和醋酸甲地孕酮)；13)雌激素(例如己烯雌酚和乙炔雌二醇)；14)抗雌激素藥(例如他莫昔芬)；15)雄激素(例如丙酸睪丸酮和氟甲睪酮)；16)抗雄激素藥(例如氟他胺)；和17)促性腺激素釋放激素類似物(例如亮丙瑞林)。常用于癌癥療法環(huán)境(context)中的任意溶瘤細(xì)胞藥應(yīng)用于本發(fā)明的組合物和方法中。例如，美國食品與藥品監(jiān)督管理局保存有批準(zhǔn)應(yīng)用于美國的溶瘤細(xì)胞藥的處方集(formulary)。U.S.F.D.A.的國際對應(yīng)機(jī)構(gòu)保存有類似的處方集。表l中提供了批準(zhǔn)在美國使用的典型的抗腫瘤藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解有關(guān)全部美國批準(zhǔn)的化療藥所需的"產(chǎn)品標(biāo)簽"描述了典型的活性劑的批準(zhǔn)的適應(yīng)癥、給藥信息、毒性數(shù)據(jù)等。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>([D"Ser(But)6，Azgly'。歸H的乙酸鹽；焦"Glu-His-Trp~Ser-Tyr-D~Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2乙蜘旨[(yW^0"■(CA0^)ZoladexI卿lantAstraZenecaPharmaceuticals羥MHydr6aBristol-MyersSquibb棘莫林(由單克隆脈Ibritumomab與連接物-螯合物tiuxetan[N-[2-雙(羧甲基)氨基]-3-(對異硫氰酸根合苯基)-丙基]-[N-[2-雙傲?xí)趸?絲]-2-(曱^)-乙基]甘氨酸之間的疏^#形成的免疫綴#)ZevalinBiogenIDEC,Inc.,CambridgeMA伊達(dá)比星(5,12-萘二酮，9-乙絲-7-[(3-絲-2，3,6-三脫氧-(a)-L-來蘇-六吡喃糖基)氧基]-7,8,9，10-四氬-6，9,11-三羥基鹽紗，(7S-順^))IdamycinPharmacia&UpjohnCompany異Jf^t^(3-(2-氯乙勤-2-[(2-氯乙^)#JJ四氫-2H-l，3,2-氧雜氮#^環(huán)己烯2-氧^#■Bristol~MyersSquibb甲磺酸I腿Unib(4-[(4-甲基-1-哌溱基)甲基〗-N-[4-甲基-3-[[4-(3—比<^0-2-嘧錄]氨基]一苯基]苯曱,曱^Jt)GleevecNovartisAG,Basel,Switzerland干擾素a-2a(重)Roferon-AHoff腿nn-LaRoche,Inc.,Nutley,NJ干擾素a-2b(重艦)IntronA(凍干的重組干擾素j3-lb)ScheringAG，Ber1in，Germany伊立替康HC1((4S)"4，11-二乙基-4-輕基-9-[(4-哌啶子基哌啶子基)羰基氧基]-lH-吡喃并[3，，4，6,7]吲噢并[l，2-b〗^^-3，14(4H，12H)CamptosarPharmacia&UpjohnCompany來曲唑(4，4，-(1K"1，2，4-三峻-l-基亞甲^二怖FemaraNovartis亞葉酸(L-谷氨酸，N[4[[(2氛基-5-甲?；?1，4，5，6，7，8六氬4氧代6-喋，甲^^〗苯甲?；鵠，鈣鹽(l:l))Wellcovorin,LeucovorinI咖unex，Corp,，Seattle,WA左旋咪峻HC1((-)-(S)-2，3，5,6-四氫-6-^^咪峻并[2，l-b]汆峻一鹽妙(yy^sHC1)Erg咖isolJ咖senResearchFoundation,Titusville,NJ洛莫司汀(1-(2-氯-乙基)-3-環(huán)己基-l-亞辟基脲)CeeNUBristol~MyersSquibbMeclorethamine，氮芥(2-氯-N-(2-氯乙J0-N-曱基乙胺鹽)MustargenMerck<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>抗癌藥進(jìn)一步包括那些已經(jīng)鑒定具有抗癌活性但目前尚未被美國食品和藥品管理局或其它類似機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的化合物，或正在進(jìn)行新用途評價(jià)的化合物，實(shí)例包括但不限于3-AP，12-0-四癸?；鸩ù?13-乙酸酯，17AAG，852A,ABI-007,ABR-217620，ABT-751,ADI-PEG20，AE-941,AG-013736，AGRO100,阿拉諾新，AMG706，抗體G250，抗癌肽類，AP23573，apaziquone，APC8015，阿替莫德，ATN-161，atrasenten，阿扎胞苷，BB-10901，BCX-1777，貝伐單抗，BGOOOOl，比卡魯胺，BMS247550，bortezomib，莒蘚抑制素-1，布舍瑞林，釣三醇，CCI-779,CDB-2914，頭孢克將，西妥昔單抗，CG0070,西侖吉肽，氯法拉濱(clofarabine),考布他汀A4磷酸酯，CP-675，206，CP-724，714，CpG7909，姜黃，地西他濱，DENSPM，度骨化醇，E7070,E7389,ecteinascidin743，乙丙昔羅(efaproxiral)，依氟鳥氨酸，EKB-569，enzastaurin，埃羅替尼(erlotinib),依昔舒林，芬維A胺，flovopiridol,氟達(dá)拉濱，氟他胺，福莫司汀，F(xiàn)R901228,G17DT，galiximab，吉非替尼(gefitinib)，染料木黃酮，葡磷酰胺，GTI-2040，組氨瑞林，HKI-272，高三尖杉酯堿，HSPPC-96，hul4,18-白介素-2融合蛋白，HuMax-CD4，伊洛前列素，咪喹莫特，英夫利昔單抗，白介素-12，IPI-504，伊羅夫文，ixabepilone，拉帕替尼(lapatinib)，來那度胺(lenalidomide)，lestaurtinib，醋酸亮丙瑞林，LMB-9免疫毒素，lonafarnib，luni1iximab，馬磷酰胺，MB07133,MDX—010，MLN2704，單克隆抗體3F8，單克隆抗體J591，莫特沙芬，MS-275，MVA-MUC1-IL2，尼魯米特，硝基喜樹堿，諾拉曲塞二鹽酸化物，他莫昔芬，NS-9，06-芐基鳥嘌呤，利奧默森鈉(oblimersensodium)，ONYX-015，oregovomab，OSI-774，panitumumab，卡柏，PD-0325901，培美曲塞，PHY906,匹格列酮，吡非尼酮，pixantrone，PS-341，PSC833，PXDIOI，吡唑啉吖啶，R115777，RADOOl，豹蛙酶，蝴蝶霉素(rebeccamycin)類似物，rhu血管他汀蛋白，rhuMab2C4，羅格列酮，盧比替康，S-l，S-8184，沙粕，SB-15992,SGN-OOIO，SGN-40,sorafenib,SR31747A，ST1571，SU011248,辛二酰苯胺異羥肟酸，蘇拉明，talabostat，他侖帕奈，tariquidar，temsirolimus,TGFa-PE38免疫毒素，沙利度胺，胸腺法新，tipifarnib，替拉扎明，TLK286，trabectedin，三甲曲沙，葡糖醛酸酯，TroVax，UCN-l，丙戊酸，長春氟寧，VNP40101M，volociximab，vorinostat，VX-680,ZD1839,ZD6474,齊留通，和zosuquidar三鹽酸化物.用于與本發(fā)明化合物給藥的優(yōu)選常用抗癌藥包括但不限于阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、喜樹堿、放線菌素D、絲裂霉素C、順鉑、多西他賽、吉西他濱、卡柏、奧沙利柏、bortezomib、gefitinib和貝伐單抗?？梢灾苽溥@些活性劑并且將其單獨(dú)、在聯(lián)用的治療組合物中、在藥盒中使用或與免疫治療劑聯(lián)用等。為了更為詳細(xì)的描述抗癌藥和其它治療劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員參考了大量指導(dǎo)性手冊，包括但不限于Physician'sDeskReference和Goodman和Gilman的"PharmaceuticalBasisofTherapeutics"第9版，Eds.Hardman等，1996。本發(fā)明提供了用于給予阿樸棉子酚酮或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物與放療的方法。本發(fā)明并不限于用于給動(dòng)物遞送治療劑量的放射的類型、用量或遞送和給藥系統(tǒng)。例如，動(dòng)物可以接受光子放療、粒子束放療、其它類型的放療及其組合。在某些實(shí)施方案中，使用線性加速器將放射遞送給動(dòng)物，在其它實(shí)施方案中，使用Y刀遞送放射。放射源可以在動(dòng)物體外或體內(nèi)。外部放射治療是最常用的并且涉及使用例如線性加速器將高能輻射束通過皮膚定向于腫瘤部位.盡管射線束可以局限于腫瘤部位，但是它幾乎不可能避免正常健康組織的暴露。然而，外部放射通?？梢员换颊吆芎媚褪?。內(nèi)部射療法包括將射線發(fā)射源，諸如珠、金屬線、丸粒、膠嚢、顆粒等植入體內(nèi)的腫瘤部位或接近胂瘤部位，包括使用特異性靶向癌細(xì)胞的遞送系統(tǒng)(例如使用附著在與癌細(xì)胞結(jié)合配體上的顆粒).可以在治療后將這類植入物取出，或?qū)⑵湟苑腔钚誀顟B(tài)保留在體內(nèi)。內(nèi)部放射療法的類型包括但不限于近距離放射療法、間質(zhì)照射、腔內(nèi)照射、放射免疫療法等。動(dòng)物可以任選地接受放射致敏劑(例如雙唑泰栓、米索硝唑、動(dòng)脈內(nèi)Budr、靜脈內(nèi)碘去氧尿苷(IudR)、硝基咪唑、5-取代的-4-硝基咪唑類、2H-異吲哚二酮類、[[(2-溴乙基)-氨基]甲基]-硝基-lH-咪唑-l-乙醇、硝基苯胺衍生物、DNA-親和性低氧選擇性細(xì)胞毒素、面化DNA配體、1,2,4苯并三溱氧化物、2-硝基咪唑衍生物、含氟硝基吡咯衍生物、苯甲酰胺、煙酰胺、吖啶-嵌入劑、5->5克代四唑衍生物、3-硝基-1，2，4-三唑、4,5-二硝基咪唑矛汙生物、羥基化texaphrins、順鈾、絲裂霉素、tiripazamine、亞硝脲、巰嘌呤、氨甲蝶呤、氟尿嗜咬、博來霉素、長春新堿、卡鉑、表柔比星、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春地辛、依托泊苷、紫杉醇、熱(過高熱)等)、輻射防護(hù)劑(例如巰乙胺、氨基烷基二氫硫代磷酸酯、氨磷汀(WR2721)、IL-1、IL-6等)。放射致敏劑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的殺傷。輻射防護(hù)劑保護(hù)健康組織免受放射有害作用?？梢詫颊呓o予任意類型的放射，只要該放射劑量是患者可耐受的并沒有不可接受的不良副作用。放療的合適類型包括例如電離(電磁)放療(例如x-射線或y線)或粒子束放療(例如高線能量放射)。將電離放射定義為包括具有產(chǎn)生電離，即得電子或失電子的足夠能量的粒子或光子的放射(例如，如US5，770，581中所述，將該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容引入本文作為參考)。放射的作用至少可以部分受到臨床醫(yī)師控制。針對最大靶細(xì)胞暴露并且降低毒性優(yōu)選分次給予放射劑量。對動(dòng)物給予的總放射劑量優(yōu)選約為.Ol戈瑞(Gy)-約100Gy。更優(yōu)選在治療過程中給予約10Gy-約65Gy(例如約15Gy、20Gy、25Gy、30Gy、35Gy、40Gy、45Gy、50Gy、55Gy或60Gy).盡管在某些實(shí)施方案中，可以在1天的過程中給予完全放射劑量，但是理想的情況是將總劑量分次在幾天內(nèi)給予。理想的情況是，在至少約3天，例如至少5、7、10、14、17、21、25、28、32、35、38、42、46、52或56天(約l-8周)過程中給予放療.因此，每日放射劑量約為1-5Gy(例如約lGy、1.5Gy、1.8Gy、2Gy、2.5Gy、2.8Gy、3Gy、3.2Gy、3.5Gy、3.8Gy、4Gy、4.2Gy或4.5Gy)，優(yōu)選1-2Gy(例如1.5-2Gy)。每日放射劑量應(yīng)足以誘導(dǎo)靶向的細(xì)胞破壞。如果延長期限，優(yōu)選非每天給予放射，由此使動(dòng)物休息并且實(shí)現(xiàn)療法的效果。例如，理想的是在每周的治療中，連續(xù)5天給予放射并且在2天不給予，由此使每周有2天休息。然而，可以1天/周，2天/周，3天/周，4天/周，5天/周，6天/周或全部7天/周給予放射，這取決于動(dòng)物的反應(yīng)性和任何可能的副作用?？梢栽谥委熎谥腥我鈺r(shí)間開始放療。優(yōu)選在第l周或第2周中開始放射，并且在剩余的治療期間給予放射。例如，在包括6周的治療期的第1-6周或2-6周中給予放射，例如用于治療實(shí)體瘤?；蛘?，在包括5周的治療期的第1-5周或2-5周中給予放射。不過，本發(fā)明并不限于這些可仿效的放療給藥方案?？刮⑸镏委焺┮部梢杂米鞅景l(fā)明中的治療劑?？梢允褂媚軌驓?、抑制微生物，或使微生物減毒的任何活性劑以及預(yù)期具有這類活性的任意活性刑?？刮⑸飫┌ǖ幌抻谔烊缓秃铣煽股亍⒖贵w、抑制蛋白(例如防衛(wèi)素)、反義核酸、膜破裂劑等，可以將它們單獨(dú)使用或聯(lián)用。實(shí)際上，可以使用任意類型的抗生素，包括但不限于抗菌藥、抗病毒藥、抗真菌藥等。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以在下列條件中的一種或多種下對動(dòng)物給予抗-細(xì)胞凋亡性Bc1-2家族蛋白，如阿樸棉子酚酮或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物和一種或多種治療劑或抗癌藥以不同的周期；以不同的期限；以不同的濃度；通過不同的給藥途徑等。在某些實(shí)施方案中，在治療劑或抗癌藥之前，例如在給予治療劑或抗癌藥之前0.5、1、2、3、4、5、10、12或18小時(shí)、1、2、3、4、5或6天、1、2、3或4周給予阿樸棉子酚嗣。在某些實(shí)施方案中，在治療劑或抗癌藥之后，例如在給予抗癌藥之后0.5、1、2、3、4、5、10、12或18小時(shí)、1、2、3、4、5或6天、1、2、3或4周給予阿樸棉子酚酮。在某些實(shí)施方案中，同時(shí)，但以不同的時(shí)間表給予阿樸棉子酚酮或其鹽或前體藥物和治療劑或抗癌藥，例如，每日給予阿樸棉子酚酮或其鹽或前體藥物，而每周1次、每2周1次、每3周1次或每4周1次給予治療劑或抗癌藥。在其它實(shí)施方案中，每周1次給予阿樸棉子酚酮或其鹽或前體藥物，而每天、每周1次、每2周1次、每3周1次或每4周1次給予治療劑或抗癌藥。本發(fā)明化合物可與載體分子相連，從而提高化合物的細(xì)胞攝取。這類載體分子的例子包括載體肽如Fulda等人.，^fwre《:808(2002)，Arnt"a/.，/.C力e邁.277:44236(2002)和Yang等人.，Ca/ceryes.W:831(2003)描述的那些，融合肽(見例如U.S.Pat.5，965，404)和病毒和病毒的部分如空的殼體和病毒血細(xì)胞凝集素(見例如U.S.Pat.No.5,547,932)。其它載體分子包括細(xì)胞表面受體的配體如脫唾液酸糖蛋白(其結(jié)合脫唾液酸糖蛋白受體，見U.S.Pat.No.5，166，320)和細(xì)胞表面受體的抗體如T-細(xì)胞特異性抗體，例如抗-CD4抗體(見U.S.Pat.No.5,693,509)。本發(fā)明范圍內(nèi)的組合物包括所有的組合物，其中本發(fā)明的組合物以有效實(shí)現(xiàn)其指定目的的用量被包含。盡管個(gè)體需要不同，但是每種成分的有效量的最佳范圍的確定屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員能力的范圍。一般來說，對于響應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的疾病，可以每天口服給予哺乳動(dòng)物、例如人0.0025—50mg/kg接受治療的哺乳動(dòng)物體重的組合物或等量的其藥學(xué)上可接受的鹽。優(yōu)選口服給予約0.01-約10mg/kg以便治療、改善或預(yù)防這類疾病。就肌內(nèi)注射而言，劑量一般約為口服劑量的一半。例如，合適的肌內(nèi)劑量約為0.0025-約25mg/kg，并且最優(yōu)選約0.01-約5mg/kg。單位口服劑量可以包括約0.01-約50mg、優(yōu)選約0.1-約10fflg化合物?？梢砸愿髯院屑s0.1-約10mg、便利的是0.25-50mg化合物或其溶劑化物的1片或多片片劑或l?；蚨嗔Ｄz嚢每天l次或多次給予單位劑量。在局部用制劑中，化合物的存在濃度約為0.01-100mg/g載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物的存在濃度約為0.07-1.Omg/ml，更優(yōu)選約0.1-0.5mg/ml,最優(yōu)選約0.4mg/ml,除作為原料藥(rawchemical)給予阿樸棉子酚酮或其鹽或前體藥物或抗-細(xì)胞凋亡性Be1-2家族蛋白的抑制劑外，還可以將本發(fā)明的化合物作為含有合適的藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑的組成部分給予，所述的載體包括有利于將化合物加工成可以在藥物上使用的制劑的賦形劑和助劑。優(yōu)選制劑、特別是那些可以通過口服或局部給藥并且可以用于優(yōu)選給藥類型的制劑，諸如片劑、錠劑、緩釋錠劑和膠嚢、口腔清洗劑和漱口劑、凝膠、液體混懸液、潤發(fā)劑、發(fā)膠、香波且還有可以通過直腸給藥的制劑，諸如栓劑以及適合于通過注射、局部或口服給藥的適宜的溶液含有約0.01-99%、優(yōu)選約0.25-75%的活性化合物，還含有賦形劑?？梢詫⒈景l(fā)明的藥物組合物給予可能體驗(yàn)本發(fā)明化合物有益作用的任意動(dòng)物。在這類動(dòng)物中排在最前列的是哺乳動(dòng)物，例如人，不過本發(fā)明并不限于此。其它動(dòng)物包括獸類動(dòng)物(牛、綿羊、豬、馬、狗、貓等)。可以通過實(shí)現(xiàn)其指定目的的任意方式給予化合物及其藥物組合物。例如，可以通過非腸道、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、透皮、頰、鞘內(nèi)、顱內(nèi)、鼻內(nèi)或局部途徑進(jìn)行給藥。或者，或同時(shí)，可以通過口服途徑進(jìn)行給藥。給藥劑量取決于接受者的年齡、健康和體重、同時(shí)治療的類型(如果有的話)、治療頻率和所需作用的性質(zhì)。可以按照自身已知的方式，例如通過常規(guī)的混合、制粒、制錠、溶解或凍千法制備本發(fā)明的藥物制劑。因此，可以通過下列步驟獲得口服應(yīng)用的藥物制劑將活性化合物與固體賦形劑混合，任選地研磨所得混合物，并且如果需要或必要，在加入合適的助劑后加工顆?；旌衔锏玫狡净蝈V芯。特別地，合適的賦形劑為填充劑，諸如糖類，例如乳糖或蔗糖；甘露糖醇或山梨糖醇；纖維素制品；和/或磷酸鈣，例如磷酸三鈣或磷酸氫鈣；以及粘合劑，諸如淀粉糊(例如使用玉米淀粉、小麥淀粉、稻米淀粉、馬鈴薯淀粉)、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮，如果需要，可以加入崩解劑，諸如上述淀粉，且還有羧甲基淀粉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或其鹽，諸如藻酸鈉。助劑首先為流動(dòng)調(diào)節(jié)劑和潤滑劑，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸或其鹽，諸如硬脂酸鎂或硬脂酸釣，和/或聚乙二醇。如果需要，可以給錠芯包耐胃液的合適的包衣層。為了這一目的，可以使用濃糖溶液，它可以任選地含有阿拉伯樹膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。為了生產(chǎn)耐胃液的包衣層，使用合適的纖維素制品、諸如鄰苯二甲酸乙酰纖維素或鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素的溶液。例如，為了鑒定或表征活性化合物劑量的組合，可以向片劑或錠劑包衣層中加入染料(dyestuff)或色素?？梢钥诜褂玫钠渌幬镏苿┌ㄓ擅髂z制成的推入配合式膠嚢和由明膠和增塑劑、諸如甘油或山梨醇制成的密封軟膠嚢。推入配合式膠嚢可以含有顆粒形式的活性化合物，所述的顆粒中可以混合有填充劑、諸如乳糖；粘合劑、諸如淀粉；和/或潤滑劑、諸如滑石粉或硬脂酸鎂；和任選的穩(wěn)定劑。在軟膠嚢中，優(yōu)選將活性化合物溶于或懸浮于合適的液體中，諸如脂肪油或液體石蠟。此外，可以加入穩(wěn)定劑。可以通過直腸使用的可能的藥物制劑包括例如，由一種或多種活性化合物與栓劑基質(zhì)的組合組成的栓劑。合適的栓劑基質(zhì)為例如天然或合成甘油三酯類或鏈烷烴類。此外，還能夠使用由活性化合物與基質(zhì)的組合組成的直腸用明膠膠嚢。可能的基質(zhì)材料包括例如液體甘油三酯類、聚乙二醇類或鏈烷烴類。用于非腸道給藥的合適的制劑包括水溶性形式的活性化合物的水溶液，例如水溶性鹽和堿性溶液。此外，可以給予作為合適的油注射混懸液的活性化合物的混懸液，合適的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油，例如芝麻油；或合成脂肪酸酯類，例如油酸乙酯或甘油三酯類或聚乙二醇-400。含水注射混懸液可以含有增加該混懸液粘度的物質(zhì)，包括例如羧曱基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖，該混懸液中還可以任選地含有穩(wěn)定劑，優(yōu)選通過選擇合適的載體將本發(fā)明的局部用組合物配制成油、霜?jiǎng)?、洗劑、軟骨劑等。合適的載體包括植物油或礦物油、白凡士林(白軟石蠟)、支鏈脂肪或油、動(dòng)物脂肪和高分子量醇(大于c12)。優(yōu)選的載體為那些活性組分于其中可溶的載體。如果需要，還可以包括乳化劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑和抗氧化劑以及賦予(impart)顏色或香味的試劑。另外，還可以在這些局部用制劑中使用透皮滲透增強(qiáng)劑。這類增強(qiáng)劑的實(shí)例可以在美國專利US3，989，816和US4，444，762中找到。優(yōu)選由礦物油、自乳化蜂蠟和水的混合物配制霜?jiǎng)?，在該混合物中混合有溶于少量油、諸如杏仁油的活性組分。這類霜?jiǎng)┑牡湫蛯?shí)例為包括約40份水、約20份蜂蠟、約40份礦物油和約l份杏仁油的霜?jiǎng)??？梢酝ㄟ^將活性組分在植物油、諸如杏仁油中的溶液與溫?zé)岬能浭灮旌喜⑶沂乖摶旌衔锢鋮s來配制軟骨劑。這類軟骨劑的典型實(shí)例為包括按重量計(jì)約30%杏仁油和約70%白軟石蠟的軟骨劑。可以通過將活性成分溶于合適的高分子量醇、諸如丙二醇或聚乙二醇中便利地制備洗劑。下列實(shí)施例用于解釋本發(fā)明的方法和組合物，但不限于它們。臨床療法中通常遇到并且對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的條件和參數(shù)種類的其它合適的變型和修改屬于本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。實(shí)施例1熒光極化結(jié)合測定法使用重組人Bcl-2和Bcl-xL蛋白，用6-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(FAM)標(biāo)記的BidBH3肽和用6-(熒光素-5(6)-羧酰氨基(carboxamido))己酸(Flu)標(biāo)記的BakBH3肽研究并優(yōu)化Bel-2和Bcl-xL的熒光極化(FP)結(jié)合測定法。FP-結(jié)合測定法可測量抑制劑分別來自Bcl-2或Bel-xL蛋白替換Bid-FAM或Bak-Flu肽的能力。劑量-依賴性結(jié)合實(shí)驗(yàn)是在DMSO中連續(xù)稀釋試驗(yàn)化合物進(jìn)行的。進(jìn)行Bcl-2結(jié)合測定時(shí)，將抑制劑和預(yù)培養(yǎng)的重組His-融合可溶性Bcl-2蛋白(120nM)與Bid-FAM肽(10nM)溶于測定緩沖液(100mM磷酸鉀，pH7.5;100jag/ml牛y球蛋白；0.02%疊氮化鈉，購自Invitrogen，LifeTechnologies)中的5yl樣品加入到Dynex96-孔、黑色、圓底平板(FisherScientific)中，從而產(chǎn)生125|i1終體積?？偣?5種不同濃度的抑制劑通常用于確定繪圖的ICs。值，其中使用非線性最小平方分析，并使用GraphPadPrisii^軟件進(jìn)行曲線擬合。培養(yǎng)3-4小時(shí)后，使用ULTRAREADER(TecanU.S.Inc.,ResearchTrianglePark,NC測量極化值。L值是基于Bid-FAM肽與Bc卜2的L值，測量的ICs。值，和蛋白與Bid-FAM的濃度，使用改進(jìn)的Cheng-Prusoff方程式計(jì)算的。進(jìn)行Bcl-xL結(jié)合測定時(shí)，使用與沒有C-末端疏水尾部的His-tag融合的重組人Bcl-xL和Bak-Flu肽。按照與Bcl-2測定類似的方式進(jìn)行Bcl-xL測定，區(qū)別之處在于將60nMBcl-xL和5nMBak-Flu肽用于測定緩沖液(50mMTris-Bis，pH7.4;0.01%牛y球蛋白)中。未標(biāo)記的Bid和Bak肽，(-)-棉酚和阿樸棉子酚酮用作陽性對照。棉盼的非活性類似物用作陰性對照。實(shí)施例2棉酚類似物的設(shè)計(jì)(-)-棉酚已經(jīng)顯示出可在BH3結(jié)合槽位置結(jié)合Bcl-2和Bcl-xL并具有顯著的抗癌活性(U.S.PatentApplicationNo.2003/0008924)。(-)-棉酚的結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)反應(yīng)性醛。這兩個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)與蛋白中的賴氨酸殘基形成Schiff's堿并導(dǎo)致棉酚在動(dòng)物和人中的毒性。這種毒性盡管較輕，仍然限制了可給予患者的最大劑量。已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的努力來鑒定毒性較小且更緊密結(jié)合Bcl-2的棉酚類似物。設(shè)計(jì)兩種類似物，棉子酚酸(V)和gossypolonicacid(VI)來維持眵基團(tuán)和Bcl-2和Bcl-xL中精氨酸殘基(分別為Arg-139和Arg-141)之間的相互作用。經(jīng)測定，這兩個(gè)化合物分別具有120nM和280nM的Ki值，即較之(-)-棉酚些微更有效。然而，這些化合物中的兩個(gè)酸基團(tuán)在生理學(xué)。11=7.4)條件下帶負(fù)電荷，且可阻止進(jìn)入細(xì)胞，在PC-3細(xì)胞的細(xì)胞生長抑制的測定中，兩個(gè)化合物均具有大于10HM的IC5。值為了克服棉子酚酸和gossypolonicacid的低細(xì)胞-滲透性，，沒計(jì)并合成了更多化合物，阿樸棉子酚(VII)和阿樸棉子酚酮(I),其中棉酚的兩個(gè)醛基被完全除去。經(jīng)測定，阿樸棉子酚和阿樸棉子酚酮分別具有200nM和76nM的K;值。阿樸棉子酚酮與Bcl-2的結(jié)合曲線在圖1中表示。經(jīng)測定阿樸棉子酚酮與Bcl-xL的Ki值為1.27pM(圖1)。因此，阿樸棉子酚酮代表一種有效的小-分子抑制劑。ohho00vh，實(shí)施例3阿樸棉子酚酮的細(xì)胞生長抑制活性在PC-3和LnCap前列腺癌細(xì)胞系中進(jìn)行(-)-棉酚、阿樸棉子酚和阿樸棉子酚酮抑制細(xì)胞生長的活性的直接比較。3-5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，有關(guān)PC-3細(xì)胞系中4-6天MTT測定法中的細(xì)胞生長抑制，阿樸棉子酚與(-)-gossypol同樣有效，而阿樸棉子酚酮(ICs。==2.2jjM)始終比(-)-棉酚更有效達(dá)3-4倍(ICs。=6.5mM)。類似的結(jié)果在LnCap細(xì)胞系(阿樸棉子酚酮IC5。=1.3|iM，(-)-棉酚IC5。=4.7jaM)中發(fā)現(xiàn).然而，阿樸棉子酚非常不穩(wěn)定且樣品甚至在-201C和氮?dú)鈼l件下貯存時(shí)，也在l周內(nèi)迅速分解.相反，阿樸棉子酚酮非常穩(wěn)定，當(dāng)在室溫下貯存幾周而沒有氮?dú)獗Ｗo(hù)時(shí)，也沒有檢測到分解。使用MDA-MB-231(亞克隆2LMP)、T47D、和MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行其它細(xì)胞生長抑制研究。如上所述，試驗(yàn)外消旋棉酚、阿樸棉子酚、阿樸棉子酚酮、(+)-阿樸棉子酚、(-)-阿樸棉子酚和四-乙?；忝拮臃油?式VIII)。結(jié)果的概括在表2中提供。在MDA-MB-231細(xì)胞系中，阿樸棉子酚較之棉酚更有效約5-倍，而阿樸棉子酚酮較之棉酚更有效約9-倍(圖2)。在T47D細(xì)胞系中，阿樸棉子酚較之棉酚更有效約2.5-倍，而阿樸棉子酚酮較之棉酚更有效約2-倍(圖3)。在MDA-MB-435細(xì)胞系中，阿樸棉子酚較之棉酚更有效約3-倍，而阿樸棉子酚酮較之棉酚更有效約2-倍(圖4)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage41</formula>表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>實(shí)施例4阿樸棉子酚酮的毒性在本發(fā)明的研究過程中，預(yù)計(jì)棉酚在動(dòng)物和人中的主要毒性與其兩個(gè)反應(yīng)性醛基團(tuán)有關(guān)且這些醛的除去應(yīng)當(dāng)能夠顯著降低毒性。為了證實(shí)這種預(yù)測，使用兩種不同的給藥途徑(口服和靜脈內(nèi))，在小鼠中評價(jià)阿樸棉子酚酮和(-)-棉酚的最大耐受劑量(MTD)?？诜o藥時(shí)(口服管飼5天/周)，阿樸棉子酚酮的MTD高于240mg/kg,而(-)-棉酚的MTD為約50mg/kg。靜脈內(nèi)給藥時(shí)(每隔一天，3天/周)，阿樸棉子酚酮的MTD為約80mg/,而(-)-棉酚的MTD為約10mg/kg。在兩種給藥途徑中，阿樸棉子酚酮的MTD較之(-)-棉酚高8-倍。因此，小鼠可很好地耐受阿樸棉子酚酮且其毒性較之(-)-棉酚要低。實(shí)施例5阿樸棉子酚酮的抗腫瘤活性使用棵鼠的PC-3異種移植模型進(jìn)行阿樸棉子酚酮的體內(nèi)研究，從而評價(jià)單獨(dú)或與X-射線輻射組合的阿樸棉子酚酮的抗腫瘤活性。使用(l)阿樸棉子酚酮200mg/kgp.o.q.d.5x4周；(2)僅對腫瘤分別進(jìn)行X-射線輻射，將動(dòng)物身體屏蔽起來，劑量為2Gyq.d.5x3周，共30Gy;和(3)阿樸棉子酚酮與放療的組合治療具有已確定的PC-3異種移植物(150mm3大小)棵鼠。如圖5所示，單獨(dú)的阿樸棉子酚酮對腫瘤的作用有限。然而，阿樸棉子酚酮可顯著提高放療-介導(dǎo)的腫瘤抑制(P".0001，雙道ANOVA，n-10)。更顯著地，在第57天，阿樸棉子酚酮加放療可在IO個(gè)腫瘤的7個(gè)中實(shí)現(xiàn)完全的腫瘤消退，而單獨(dú)治療導(dǎo)致10個(gè)中有0個(gè)完全消退。數(shù)據(jù)表明阿樸棉子酚酮是有效的放射致敏劑且發(fā)現(xiàn)可用作治療深度的、激素不應(yīng)性前列腺癌和其它疾病的治療劑.實(shí)施例6阿樸棉子酚酮的合成(士)-阿樸棉子酚酮是如上面流程I所示從棉酚乙酸制備的。(±)-5，5'-二異丙基-3，3'-二甲基-[2，2'〗聯(lián)萘基一l，6，7，r,6',7'-六醇(hexaol)(II)氮?dú)狻?5X:條件下，在氫氧化鈉水溶液(40ml)中加熱棉酚乙酸(6.Og，10.4mmol)2h。將反應(yīng)混合物傾倒在含濃硫酸的水上。用醚萃取所得沉淀，并用水洗滌結(jié)合萃取物，真空濃縮得到粗產(chǎn)物II，其在不進(jìn)一步純化的條件下直接用于下一步。乙酸1，7，1'，，7'-五乙酰氧基-5，5'-二異丙基-3，-二甲基-[2，]聯(lián)萘-6-基酯(in)將乙酸酐(7.8ml，83.2mmol)加入到粗產(chǎn)物II溶液二氯甲烷(100ml)的溶液中，接著加入iV,iV，-二異丙基乙胺(14.5ml，83.2mmo1)。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)混合物12小時(shí)。通過加入結(jié)束反應(yīng)。加入氯仿，分層，并用氯仿萃取水相兩次。用鹽水洗滌結(jié)合萃取物，干燥，并真空濃縮。閃爍凝膠柱色譜(2%丙酮/氯仿)提供6.lg淺黃色固體的III，兩步產(chǎn)率82%。乙酸6，6',7'-三乙酰氧基-5，5'-二異丙基-3，3'-二甲基-l，4，1'，4'-四氧代-l，4，l'，4'-四氫-[2，2']聯(lián)萘-7-基酯(IV)將過碘酸(20g，87.7mmol)加入到111(2.0g，2.8mmol)溶于二-惡烷(30ml)的溶液中并于95X:攪拌反應(yīng)混合物15min。加入碎水終止反應(yīng)。加入乙酸乙酯，分層，并用乙酸乙酯萃取水相兩次。用鹽水洗滌結(jié)合萃取物，干燥，并真空濃縮.閃爍凝膠柱色謙(2%丙酮/氯仿)提供0.65g量黃色固體的IV，產(chǎn)率35%.6，7，6'，7'-四羥基-5，5'-二異丙基-3，3'-二甲基-[2，2']聯(lián)萘基-1，4，l'，4'-四酮，阿樸棉子酚酮(I)將10%碳酸鉀溶液(10ml)加入到IV(0.6g，0.91咖ol)溶于二喵烷(15ml)的溶液中，并于70t:攪拌反應(yīng)混合物5h。冷卻后，將4MHC1加入到溶液中，并調(diào)節(jié)pH至5。加入乙酸乙酯，分層，并用乙酸乙酯萃取水相兩次。用鹽水洗滌結(jié)合萃取物，干燥，并真空濃縮。從乙酸乙酯/己烷中重結(jié)晶得到0.44g棕黃色固體的阿樸棉子酚酮(1)，產(chǎn)率98°/。。實(shí)施例7GossypolonicAcid的合成(土)-Gossypolonicacid是如上面流程III所示，通過已經(jīng)才艮道過的方法(Rogers爭乂，/.J邁.C力e瓜^"ft2170(1938))從棉酚乙酸制備的。在有曱醇和氫氧化鉀存在的條件下，使用硫酸二曱酯將外消旋棉酚轉(zhuǎn)化成六甲醚。利用稀硝酸，六甲醚被氧化成gossypolonicacid四甲酸。甲酯是通過在有碳酸鉀存在的條件下，利用回流丙酮中的硫酸二曱酯獲得。全部六個(gè)甲基是在-20。C下，利用二氯甲烷中的三溴化硼而除去的，接著利用稀乙酸水溶液產(chǎn)生黃色固體的gossypolonicacid。'HNMR(300MHz，CDC13)57.62(s，2H)，6.04(s，2H)，4.26(m，J=6.9Hz，2H)，2.00(s，6H)，1.39(m，12H).實(shí)施例8Mcl-l蛋白的熒光極化結(jié)合測定人Mc卜l蛋白的表達(dá)和純化人Mcl-lcDNA購自0rigene。通過BamHI和EcoRI位點(diǎn)，使用oligos:5，-CGGGATCCGAGGACGAGTTGTACCGGCAG-3,(SEQIDNO:1)和5，-GGAATTCCTAGCCACCTTCTAGGTCCTCTAC-3，(SEQIDNO:2)將編碼氨基酸171-327的片段克隆到pHis-TEV栽體(一種修飾過的pBT栽體)。具有N-末端8xHis標(biāo)記的Mcl-l171-327aa蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中產(chǎn)生。37匸下，細(xì)胞在含抗生素的2xYT中生長至0.6的0D6。。密度。37"C下，利用0.4mMIPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)共4小時(shí).在含500mMNaCl，0.1%bME和40mLeupectin/Aprotin的50mMTrisPH8.O緩沖液中溶解細(xì)胞.使用Ni-NTA樹脂(QIAGEN)，按照制造商的說明，從可溶性部分中純化Mcl-l171-327aa蛋白.在25mMTrispH8.O緩沖液中，使用NaCl梯度，在SourceQ15柱(樹脂和柱子均來源于AmershamBiosciences)上進(jìn)一步純化該蛋白。將純化蛋白等分，并在有25%甘油存在的條件下，-80°0貯存。熒光極化結(jié)合測定優(yōu)化靈敏且定量的體外熒光極化(FP)結(jié)合測定法并用于測定阿樸棉子酚酮對Mcl-l蛋白，一種Bcl-2家族蛋白成員的體外結(jié)合親和性。^//￥c/-7潛合浙定.確立并優(yōu)化基于FP的方法，從而試驗(yàn)阿樸棉子酚酮對Mcl-l蛋白的結(jié)合親和性。進(jìn)行該測定時(shí)，將N-末端用6-羧基熒光素琥珀酰亞胺基酯(FAM)標(biāo)記的21-殘基BidBH3肽(QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR(SEQIDN0:3))用作熒光標(biāo)記(Flu-Bid-21)。使用恒定的探針濃度，lnM，并以逐漸增加、顯著高于蛋白-探針對預(yù)期iTd的濃度滴定，從而測定復(fù)合Flu-Bid-21探針和Mc卜l蛋白的解離常數(shù)(iQ。圖6舉例說明飽和實(shí)驗(yàn)中，單一-位點(diǎn)結(jié)合模型的非線性最小平方擬合，其中Mcl-l蛋白濃度從0變化到2nM,探針濃度恒定。熒光探針，F(xiàn)lu-Bid-21，顯示出對Mcl-l蛋白的較高結(jié)合親和性，K產(chǎn)O.83nM，動(dòng)態(tài)范圍AmP=122mP(AmP=結(jié)合肽的mP—游離肽的mP)。當(dāng)探針濃度降低時(shí)，研究A值變化的可能性。原則上，當(dāng)探針濃度高于真實(shí)的^值時(shí)，較高的探針濃度將導(dǎo)致更高的表觀/d值(Kenakin,PharmacologicalAnalysisofDrug-ReceptorInteraction,Lippincott-Raven，Philadelphia(1997))*在探針Flu-Bid-21的四種濃度下(5，2.5，1和0.5nM),相對于熒光探針獲得分別為l.32,1.05，0.83和0.70nM的表觀&值(圖6)。這些結(jié)果因此表明在寺中濃度下獲得的探針的表觀&值接近真實(shí)的A值。測定法的特異性通過用具有Ki=5.7±1.1nM的未標(biāo)記的Bid21mer肽竟?fàn)幮蕴鎿Q與Mcl-l結(jié)合的標(biāo)記過的Flu-Bid21mer加以證實(shí)，其與測定出的L(圖7)很一致，使用在MDS0中連續(xù)稀釋的試驗(yàn)化合物進(jìn)行劑量-依賴性竟?fàn)幮越Y(jié)合實(shí)驗(yàn)。將溶于測定緩沖液(IOOmMpotassiumphosphate,pH7.5;100ing/mlbovinegammaglobulin;0.02%sodiumazide，purchasedfromInvitrogenLifeTechnology)中的試驗(yàn)樣品和預(yù)培養(yǎng)的Mcl-1蛋白(5nM)和Flu-Bid-21mer肽(1nM)的5|nl樣品加入到Dynex96-孔、黑色、圓-底平板(FisherScientific)中，產(chǎn)生125pl終體積。各自測定時(shí)，對照組包括Mcl-1蛋白和Flu-Bid-21mer肽(等于0%抑制)和僅有的Flu-Bid-21mer肽(等于100%抑制)。培養(yǎng)3小時(shí)后，使用ULTRAREADER(TecanU.S.Inc.,ResearchTrianglePark,NC)測量極化值。ICs。值，即50%結(jié)合肽被替換的抑制劑濃度，是使用非線性最小平方分析從圖中測定的。曲線擬合使用GRAPHPADPRISM軟件(GraphPadSoftware,Inc.,SanDiego,CA)進(jìn)行。4吏用我們4目對于FP測定法研究出來的方程式，包括過量蛋白在竟?fàn)幮越Y(jié)合測定法中的影響，計(jì)算Ki值&=W5。/(I4。A^+[4/^+i)其中[I]s。表示50%抑制時(shí)自由抑制劑的濃度，[L]s。是50y。抑制時(shí)自由標(biāo)記探針的濃度，[P]。是0%抑制時(shí)自由蛋白的濃度，且Ka是蛋白-配體復(fù)合物的解離常數(shù)。該方程式源于竟?fàn)幮越Y(jié)合測定的基礎(chǔ)原則且它還可衍生用于準(zhǔn)確計(jì)算抑制劑Ki值的該新方程式中所需的溶液所有參數(shù)(Nikolovska-Coleska爭入.，ha/.》/oc力e邁.332:261(2004))。使用基于FP的測定法測定阿樸棉子酚酮的結(jié)合親和性。經(jīng)測定，阿樸棉子盼酮與Mcl-l的Ki值為0.051±0.02nM，結(jié)合曲線在圖7中表示，作為一種棉酚類似物，阿樸棉子酚酮顯示出與(-)-棉盼相比好3.5倍的結(jié)合親和性，K產(chǎn)O.18±0.01(圖7)。由于完整地描述了本發(fā)明，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可以在不影響本發(fā)明范圍或其任意實(shí)施方案的情況下，可在較寬和等同的條件、表述(formulation)和其它參數(shù)范圍內(nèi)實(shí)施本發(fā)明.將本文中引述的所有專利、專利申請和出版物的全部內(nèi)容完整地？I入本文作為參考。權(quán)利要求1.式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物。2.權(quán)利要求l的化合物，其是(-)-阿樸棉子酚酮或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物。3.權(quán)利要求1的化合物，其是(+)-阿樸棉子酚酮或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物。4.式VIII的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>或其藥學(xué)上可接受的鹽或前體藥物。5.含有權(quán)利要求1的化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。6.制備阿樸棉子酚酮的方法，包括(a)使棉酚脫羰基，從而產(chǎn)生式II的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(c)使式III的化合物氧化，從而產(chǎn)生式IV的化合物:lv;并<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(d)使式IV的化合物脫保護(hù)，從而產(chǎn)生阿樸棉子酚酮。7.制備阿樸棉子酚酮的方法，包括使式IV的化合物脫保護(hù)，從而產(chǎn)生阿樸棉子酚酮，其中P是保護(hù)基團(tuán)，8.在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，包括使細(xì)胞與權(quán)利要求1的化合物相接觸。9.使細(xì)胞對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑敏感的方法，包括使細(xì)胞與權(quán)利要求1的化合物相接觸。10.權(quán)利要求9的方法，還包括使細(xì)胞與細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑相接觸。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑是化療劑。12.權(quán)利要求10的方法，其中所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑是輻射。13.治療、改善或預(yù)防動(dòng)物中響應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的疾病的方法，包括給予所述動(dòng)物治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。14.權(quán)利要求13的方法，還包括給予所述動(dòng)物細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑是化療劑。16.權(quán)利要求14的方法，其中所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑是輻射。17.權(quán)利要求14的方法，其中所述響應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的疾病是過度增殖性疾病。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述過度增殖性疾病是癌癥。19.權(quán)利要求14的方法，其中所述權(quán)利要求1的化合物在所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑之前給予。20.權(quán)利要求14的方法，其中所述權(quán)利要求1的化合物與所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑同時(shí)給予。21.權(quán)利要求14的方法，其中所述權(quán)利要求1的化合物在所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑之后給予。22.治療、改善或預(yù)防動(dòng)物中過度增殖性疾病的方法，包括給予所述動(dòng)物治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述過度增殖性疾病是癌癥。24.權(quán)利要求22的方法，還包括給予所述動(dòng)物細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑是化療劑。26.權(quán)利要求24的方法，其中所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑是輻射。27.含有權(quán)利要求1的化合物的試劑盒。28.權(quán)利要求27的試劑盒，還含有細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。29.權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑是化療劑。30.權(quán)利要求27的試劑盒，還含有將所述化合物給予動(dòng)物的說明書。31.權(quán)利要求30的試劑盒，其中所述說明書是用于將所述化合物給予患有過度增殖性疾病的動(dòng)物。32.權(quán)利要求31的試劑盒，其中所述過度增殖性疾病是癌癥。全文摘要本發(fā)明涉及化合物阿樸棉子酚酮及其鹽和前體藥物。阿樸棉子酚酮起B(yǎng)c1-2家族蛋白抑制劑的作用。本發(fā)明還涉及阿樸棉子酚酮用于抑制過度增殖性細(xì)胞生長、用于在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和用于使細(xì)胞對細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)敏感的用途。文檔編號A61K31/12GK101132783SQ200580045303公開日2008年2月27日申請日期2005年11月2日優(yōu)先權(quán)日2004年11月2日發(fā)明者D·楊,J·陳,S·王,Z·尼科洛夫斯卡-科萊斯卡申請人:密執(zhí)安州立大學(xué)董事會(huì)