專利名稱：蛋白質(zhì)的口服釋放方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括可膨脹水凝膠基質(zhì)和包含在基質(zhì)中蛋白質(zhì)的組合物，和該組合物在將生物活性化合物以活性形式經(jīng)口腔釋放到脊椎動(dòng)物腸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在開發(fā)蛋白質(zhì)類化合物(如胰島素)的口服釋放系統(tǒng)的過程中存在兩個(gè)主要問題。第一個(gè)問題是許多蛋白質(zhì)在胃腸(GI)系統(tǒng)，主要是胃中被消化酶滅活。這個(gè)問題可以通過設(shè)計(jì)一種載體而被克服，所述載體在釋放藥物進(jìn)入GI道更適宜區(qū)域，特別是腸道低部區(qū)域之前保護(hù)蛋白質(zhì)免受胃苛刻環(huán)境的破壞。此外，可應(yīng)用蛋白酶抑制劑以阻滯存在于GI系統(tǒng)中能夠分解口服蛋白質(zhì)的酶的活性。另一問題是將完整的大肽穿過腸道基膜進(jìn)入血流的緩慢轉(zhuǎn)運(yùn)。研究者已經(jīng)嘗試借助于吸收增強(qiáng)劑來繞過障礙，所述吸收增強(qiáng)劑可幫助巨分子穿過屏障轉(zhuǎn)運(yùn)。然而，目前缺乏有效的可利用釋放載體。因此，期望有效的和相對低造價(jià)制備的口服釋放系統(tǒng)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及包括水凝膠基質(zhì)載體和生物活性化合物的組合物，以及組合物將化合物以活性形式釋入腸道的應(yīng)用。一種優(yōu)選的水凝膠基質(zhì)包括聚(甲基丙烯酸-g-乙二醇)交聯(lián)二甲基丙烯酸四甘酯共聚物網(wǎng)，即“P(MAA-g-EG)水凝膠”，由于酸性側(cè)基的存在和嫁接鏈上的醚基團(tuán)與質(zhì)子側(cè)基之間互聚絡(luò)合物的形成，水凝膠顯示出pH依賴性膨脹性質(zhì)。在酸性介質(zhì)，由于形成互聚絡(luò)合物，該系統(tǒng)相對不膨脹。在堿性溶液，側(cè)基電離和絡(luò)合物分離。這些水凝膠的pH依賴性膨脹加之它們的生物粘附特性使得這些水凝膠成為口服釋放蛋白質(zhì)的理想載體。
附圖簡述

圖1 P(MAA-g-EG)水凝膠中的可逆絡(luò)合作用。C代表裹入的生物活性化合物。
圖2 在37℃時(shí)，平衡聚合物體積分率作為樣品pH值的函數(shù)，所述樣品含有MW1000的PEG嫁接物和1∶1摩爾比的MAA∶EG。
圖3 37℃時(shí)，平衡篩孔尺寸作為樣品pH值的函數(shù)，所述樣品含有MW1000的PEG嫁接物和1∶1摩爾比的MAA∶EG。
圖4 37℃時(shí)丙羥茶堿于pH3.2(·)和7.4(●)和維生素B12于pH3.2( )和7.4(◎)的緩沖鹽溶液中的控制釋放。
圖5a 37℃時(shí)茶鹼自P(MAA-g-EG)水凝膠體外搏動(dòng)性釋放。
圖5b 37℃時(shí)萬古霉素自P(MAA-g-EG)水凝膠體外搏動(dòng)性釋放。
圖5c 37℃時(shí)胰島素自P(MAA-g-EG)水凝膠體外搏動(dòng)性釋放。
圖6 含比值1∶1 MAA/EG和分子量為1000PEG嫁接鏈的P(MAA-g-EG)水凝膠在pH值3.2和7.4時(shí)與牛下頜腺粘蛋白接觸時(shí)的粘附行為。
圖7 大鼠口服25U/kg(O)和50U/kg(·)負(fù)載于P(MAA-g-EG)水凝膠中的胰島素和50U/kg胰島素溶液(●)(N＝5)后的血糖濃度。
圖8 大鼠口服負(fù)載于的P(MAA-g-EG)水凝膠中的胰島素(25U/kg)在含抑肽酶(O)和不含抑肽酶(·)時(shí)及50U/kg胰島素溶液(●)(N＝5)后的血糖濃度。
圖9 健康(·)和糖尿病(O)雄性Wistar大鼠口服P(MAA-g-EG)明膠膠囊微球(胰島素劑量為25IU/kg體重)后的血糖反應(yīng)。
圖10 糖尿病雄性大鼠口服P(MAA-g-EG)Eudragit膠囊微球(25IU/kg體重)后的血糖反應(yīng)。
圖11 健康犬(25kg)口服P(MAA-g-EG)明膠膠囊微球(胰島素劑量為10IU/kg體重)后的血糖反應(yīng)。
圖12 糖尿病犬(25kg)口服P(MAA-g-EG)明膠膠囊微球(胰島素劑量為10IU/kg體重)后的血糖反應(yīng)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及通過口服給藥向脊椎動(dòng)物釋放生物活性蛋白質(zhì)和藥物的組合物。這里使用的術(shù)語活性化合物指對生命細(xì)胞有效的任何化合物，例如可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)生化作用的化合物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，口服給予的組合物包括可膨脹水凝膠基質(zhì)，和包含在可膨脹水凝膠基質(zhì)中的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。這里所用的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)包括暴露于低pH或暴露于恒溫動(dòng)物消化道中的酶之后生物活性被破壞或變小的任何蛋白質(zhì)。
水凝膠是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的水可膨脹性、交-聯(lián)的聚合物基質(zhì)。參見例如，Dresback于1980年9月2日提交的美國專利4,220,152，在此特意地在將其公開引入?yún)⒖?。已發(fā)現(xiàn)水凝膠是向脊椎動(dòng)物口服釋放蛋白質(zhì)的有效釋放載體?？衫盟z的可膨脹特性，當(dāng)組合物通過消化道時(shí)首先保護(hù)水凝膠內(nèi)容物免受胃惡劣環(huán)境的影響，然后將水凝膠內(nèi)容物釋入GI道更適宜區(qū)域，特別是腸道較低區(qū)域。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明組合物在通過胃時(shí)基本不膨脹并定位于小腸，在小腸部位水凝膠膨脹并伴隨著其內(nèi)容物的釋放。
水凝膠可充滿或負(fù)載各種生物活性化合物，包括但不限于藥物、生長激素、疫苗成分、維生素、類固醇和肽，并可作為此類生物活性化合物的口服釋放載體。隨著水凝膠在動(dòng)物消化系統(tǒng)中變成水合物，負(fù)載于水凝膠中的化合物以控制方式釋放。在一實(shí)施例中，本發(fā)明水凝膠基質(zhì)是由聚甲基丙烯酸構(gòu)成的粒狀形式，該聚甲基丙烯酸聚合物嫁接了一個(gè)離子性長鏈聚合物如聚乙二醇(PEG)。
水凝膠顆粒優(yōu)選在存在交聯(lián)劑的條件下通過甲基丙烯酸聚合反應(yīng)而合成。交聯(lián)劑可選自本領(lǐng)域人員已知的各種生物適合性交聯(lián)劑包括二甲基丙烯酸四甘酯、二甲基丙烯酸乙烯酯、二甲基丙烯酸二乙烯酯、二甲基丙烯酸三乙烯酯、二甲基丙烯酸四乙烯酯、二甲基丙烯酸五乙烯酯、相應(yīng)的二丙烯酸酯，或星形聚合物包括甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯或亞甲基雙丙烯酰胺基團(tuán)。聚合反應(yīng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的自由基引發(fā)劑如熱引發(fā)劑包括有機(jī)過氧化物或UV自由基引發(fā)劑來引發(fā)。
在一實(shí)施例中，水凝膠基質(zhì)包括與生物適合性交聯(lián)劑交聯(lián)的甲基丙烯酸和聚(二醇)單甲基丙烯酸酯(或單丙烯酸酯)的共聚物。本發(fā)明使用的“聚(二醇)單甲基丙烯酸酯”包括聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯、聚(丙二醇)單甲基丙烯酸酯和聚(乙烯/丙二醇)單甲基丙烯酸酯，其中聚(乙烯/丙烯乙二醇)單甲基丙烯酸酯是由羥基功能性甲基丙烯酸酯引發(fā)氧化乙烯和氧化丙烯混合物聚合形成的聚合物。結(jié)果聚(二醇)側(cè)基分子量為約200～約4000，更典型的是約200～約2000，在一實(shí)施例中為約200～約1200。甲基丙烯酸和聚(二醇)單甲基丙烯酸酯(或單丙烯酸酯)單體比值為約4∶1～約1∶4。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，水凝膠基質(zhì)包括甲基丙烯酸和聚(二醇)單甲基丙烯酸酯與二甲基丙烯酸四甘酯交聯(lián)的聚合物，“P(MAA-g-EG)水凝膠”。為制備所述聚合物，分子量約為200～約2000，更典型地是約200～約1200的聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯與甲基丙烯酸和二甲基丙烯酸四甘酯進(jìn)行共聚。甲基丙烯酸和聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯單體分子比約為4∶1～約1∶4。在另一實(shí)施例中，甲基丙烯酸和聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯單體分子比約為1∶1。交聯(lián)劑加入量約0.25～約10.00摩爾％，更優(yōu)選約0.25～約1.00摩爾％，在一實(shí)施例中約為0.75摩爾％。
水凝膠可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)負(fù)載所需的化合物。在一實(shí)施例中，P(MAA-g-EG)水凝膠形成大小范圍為直徑約50μm～約500μm，更優(yōu)選直徑約100-200μm的微粒。根據(jù)一實(shí)施例，通過形成聚合基質(zhì)并研磨基質(zhì)以形成所需平均顆粒大小的水凝膠顆粒從而制得水凝膠微粒。水凝膠微?？韶?fù)載所需化合物并使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包裝為標(biāo)準(zhǔn)片劑或膠囊劑。在一實(shí)施例中，水凝膠顆粒包入明膠膠囊。
根據(jù)一實(shí)施例，通過平衡分配使水凝膠負(fù)載生物活性化合物。尤其是，水凝膠在pH＞5.8并包含所負(fù)載組合物的溶液中成為水合物。然后回收水凝膠，再用pH＜5.8的溶液洗滌。然后干燥水凝膠并于4℃貯存。負(fù)載本發(fā)明水凝膠的另一方法包括將所需化合物的水溶液加到單體和交聯(lián)劑的溶液中以及引發(fā)混合物聚合反應(yīng)的步驟。
化合物通過交聯(lián)聚合物網(wǎng)擴(kuò)散的能力取決于凝膠膨脹程度和化合物的大小。水凝膠膨脹，交聯(lián)點(diǎn)之間的聚合物鏈伸展和網(wǎng)孔大小或相關(guān)長度，ξ，增加從而允許材料中更大溶質(zhì)滲透(見圖1)。平衡膨脹得到絡(luò)合網(wǎng)架，網(wǎng)架膨脹程度取決于存在于系統(tǒng)中的化學(xué)性和物理性交聯(lián)的數(shù)量。在P(MAA-g-EG)網(wǎng)架，平衡膨脹比值更主要取決于周圍環(huán)境的pH。
本發(fā)明P(MAA-g-EG)水凝膠，暴露于酸性條件(典型地是pH＜5.8)時(shí)形成暫時(shí)的物理性交聯(lián)，這是由于聚甲基丙烯酸酯基團(tuán)和側(cè)伸出的聚(二醇)基團(tuán)之間形成氫鍵。這些物理性交聯(lián)本質(zhì)上是可逆的，并取決于環(huán)境pH和離子強(qiáng)度。因此，交聯(lián)度和網(wǎng)眼大小，ξ，更主要取決于周圍環(huán)境的pH和離子強(qiáng)度。在酸性介質(zhì)，由于大分子間絡(luò)合物形成，故此系統(tǒng)相對不膨脹。在堿性溶液，側(cè)基離子化和絡(luò)合物分離。P(MAA-g-EG)水凝膠的平衡膨脹示于圖2。數(shù)據(jù)表示作為pH函數(shù)的水凝膠(PEG嫁接物分子量1000，MAA∶EG分子比1∶1)的聚合物體積分率。以等克分子量的MAA和EG在低pH值時(shí)為例，絡(luò)合程度高和膨脹狀態(tài)下凝膠中聚合物體積分率，V2，S，幾乎為0.70。然而，如果膨脹溶液的pH增加到高于pH＝4.6，則絡(luò)合物開始分離且主鏈延伸導(dǎo)致凝膠中平衡聚合物體積分率顯著降低。由于更多的水摻入到結(jié)構(gòu)中，所以該高度膨脹、無-絡(luò)合水凝膠包含的聚合物小于5％。
因?yàn)镻(MAA-g-EG)凝膠中的絡(luò)合/解絡(luò)現(xiàn)象，網(wǎng)架的網(wǎng)孔大小隨著有關(guān)的pH范圍不同而顯著不同。此外，得到了在不同pH溶液中輕度變形(小于10％)水凝膠的系數(shù)。使用這些數(shù)據(jù)，通過測定交聯(lián)(不論共價(jià)還是物理性的)之間聚合物鏈?zhǔn)孜蚕噙B長度，可計(jì)算出作為pH函數(shù)的網(wǎng)孔大小。平均網(wǎng)孔大小或相關(guān)長度引人注目地受膨脹溶液pH的影響(圖3)。在低pH溶液中，將出現(xiàn)絡(luò)合，P(MAA-g-EG)水凝膠網(wǎng)孔大小低至70。然而，隨著pH增加，物理性交聯(lián)分離，聚合物鏈延伸導(dǎo)致網(wǎng)孔大小乘以因子3而增加至幾乎210。更重要地，假定理想網(wǎng)架，擴(kuò)散可利用面積等于網(wǎng)孔大小的平方。于是，無-絡(luò)合水凝膠(pH大于5.2)較絡(luò)合水凝膠(pH小于5.2)的擴(kuò)散面積大9倍。由于絡(luò)合現(xiàn)象的可逆性質(zhì)，P(MAA-g-EG)水凝膠用于振蕩性釋放藥物非常理想。另外，由于小的pH變化可引起網(wǎng)架結(jié)構(gòu)大的變化，故這些材料可良好地作為肽和蛋白質(zhì)的載體。尤其是，本發(fā)明P(MAA-g-EG)水凝膠可作為分子量范圍為約1,000～約100,000，更優(yōu)選地為約1,000～約20,000的化合物的釋放載體。
在評價(jià)凝膠作為特定藥物載體潛能時(shí)的重要參數(shù)是有效分子大小(水動(dòng)力學(xué)直徑，dh)與網(wǎng)孔大小的比值。為了研究這些網(wǎng)架的大小-排除特性，研究了兩種不同分子大小的溶質(zhì)，即丙羥茶堿(分子量238，dh＝4.3)和維生素B12(分子量1355，dh＝17)，從絡(luò)合和無-絡(luò)合水凝膠中的釋放(圖4)。溶液pH＝3.2時(shí)，水凝膠聚合物高度絡(luò)合，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)顯著受阻。2小時(shí)內(nèi)從網(wǎng)架中釋放的維生素B12少于10％。然而，由于分子小，在同樣時(shí)間內(nèi)幾乎有30％的丙羥茶堿從凝膠中釋放。當(dāng)水凝膠與pH＝7.4的溶液接觸時(shí)，由于側(cè)酸基團(tuán)的離子化，致使水凝膠鏈間絡(luò)合分離。結(jié)果，水凝膠膨脹到很大的程度，允許維生素B12和丙羥茶堿自聚合物大量擴(kuò)散。
釋放數(shù)據(jù)擬合為平面系統(tǒng)經(jīng)典Fickian表達(dá)的溶液的短時(shí)近似值并計(jì)算丙羥茶堿和維生素B12通過絡(luò)合和無-絡(luò)合P(MAA-g-EG)水凝膠擴(kuò)散的擴(kuò)散系數(shù)(表1)。由于溶質(zhì)直徑與網(wǎng)孔大小的比值增加，大分子量溶質(zhì)，維生素B12，的轉(zhuǎn)運(yùn)較丙羥茶堿更顯著地受到絡(luò)合的影響。維生素B12自無-絡(luò)合水凝膠的擴(kuò)散系數(shù)較絡(luò)合水凝膠高出兩個(gè)數(shù)量級，而丙羥茶堿在無-絡(luò)合水凝膠的擴(kuò)散系數(shù)只高出絡(luò)合水凝膠一個(gè)數(shù)量級。
表1.丙羥茶堿和維生素B12在絡(luò)合和無-絡(luò)合P(MAA-g-EG)水凝膠中的擴(kuò)散系數(shù)。溶質(zhì) PH ξ() dh/ξ D3.12×108(cm2/s)丙羥茶堿3.2 70.8 0.060 0.403丙羥茶堿7.4194.4 0.022 9.38維生素B123.2 70.8 0.240 0.0168維生素B127.4194.4 0.087 6.75為進(jìn)一步研究P(MAA-g-EG)水凝膠作為維生素、藥物和氣體生物活性化合物口服釋放載體的能力，測定了在受激胃腸條件下各種化合物的搏動(dòng)性釋放。使用茶鹼(MW＝180.2)、萬古霉素(MW＝1485.7)和胰島素(MW＝5733.2)進(jìn)行體外釋放試驗(yàn)。見實(shí)施例1。通過平衡分配將每個(gè)化合物負(fù)載于P(MAA-g-EG)水凝膠中，然后將負(fù)載了化合物的水凝膠浸入200ml pH＝1.2受激胃液中2小時(shí)。接著將聚合物微粒轉(zhuǎn)移至pH＝6.8的磷酸緩沖液中。使用HPLC檢測釋入環(huán)境溶液的胰島素濃度，并將茶堿、萬古酶素和胰島素的結(jié)果分別用圖5a-5c顯示。
化合物自水凝膠基質(zhì)的釋放在酸性溶液中降低(見圖2，暴露的前2小時(shí))。然而，觀察到在pH 6.8緩沖液中化合物的快速釋放。隨著藥物分子量增加，這種現(xiàn)象趨向于更為明顯。例如P(MAA-g-EG)水凝膠是胰島素(MW＝5733.2)的有效釋放載體在試驗(yàn)的第一時(shí)段，在受激胃液(pH-1.3)中胰島素自聚合物的釋放小于10％。然而，將顆粒置入pH＝7.4緩沖液后，水凝膠快速膨脹使得胰島素快速釋放。結(jié)果表明嫁接共聚物P(MAA-g-EG)在發(fā)展口服胰島素釋放系統(tǒng)方面是有益的。這里使用的術(shù)語胰島素旨在包括純化的人和動(dòng)物天然胰島素以及它們的衍生物，如胰島素脂蛋白(lispro)和重組形式的胰島素，及胰島素或胰島素衍生物的單價(jià)或二價(jià)鹽。
此外，由于作為附著促進(jìn)劑的嫁接PEG鏈的存在，P(MAA-g-EG)水凝膠顯示出強(qiáng)的粘膜粘附特性。而且，P(MAA-g-EG)水凝膠的粘膜粘附性強(qiáng)烈地依賴于環(huán)境液的pH(見圖6)。凝膠和粘膜之間的粘附在刺激性腸道狀態(tài)條件下(pH＝7.4)顯著高于刺激胃環(huán)境狀態(tài)時(shí)。然而，為了真實(shí)地比較凝膠的粘膜粘附特性，將粘附功標(biāo)準(zhǔn)化以解釋聚合物凝膠部分。水凝膠的標(biāo)準(zhǔn)化粘附功在無-絡(luò)合態(tài)時(shí)高出兩個(gè)數(shù)量級。相應(yīng)地，當(dāng)它們通過胃并保持絡(luò)合狀態(tài)時(shí)P(MAA-g-EG)水凝膠的粘膜粘附特性會(huì)相對較低。在到達(dá)腸道后鏈間絡(luò)合解離，因此相對于與胃粘膜的粘附性，凝膠對腸道粘膜粘附性增加。因而，口服給予脊椎動(dòng)物后，胰島素載體在胰島素被吸收區(qū)域(即在腸道)的駐留時(shí)間大大增加。
不同pH值時(shí)水凝膠粘附性的不同是由于PEG鏈在每個(gè)材料中的移動(dòng)性不同。在高度膨脹、無-絡(luò)合狀態(tài)，側(cè)PEG鏈?zhǔn)怯坞x的并作為粘附的錨方便地穿透粘膜。在絡(luò)合狀態(tài)，P(MAA-g-EG)水凝膠中的側(cè)PEG鏈與主鏈形成絡(luò)合物，并且不能與粘膜表面相互作用。
根據(jù)本發(fā)明，水凝膠組合物可用于將治療有效量的蛋白質(zhì)施予脊椎動(dòng)物。方法包括將包括包含于水凝膠載體中蛋白質(zhì)的組合物對脊椎動(dòng)物口服給藥的步驟。包含于水凝膠基質(zhì)中的組合物可進(jìn)一步包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的蛋白酶抑制劑、可藥用載體、穩(wěn)定劑和生物適合性填充劑。
一優(yōu)選的水凝膠載體是P(MAA-g-EG)，在一實(shí)施例中P(MAA-g-EG)水凝膠基質(zhì)包含包括胰島素的可藥用組合物。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，胰島素組合物進(jìn)一步包括蛋白酶抑制劑或吸收促進(jìn)劑。包含于P(MAA-g-EG)水凝膠內(nèi)的包括胰島素的組合物已經(jīng)顯示出在將胰島素釋入動(dòng)物血流方面具有驚人的有效性(見實(shí)施例3和4)。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)將水凝膠基質(zhì)典型地制備成微粒形式并包裝于適宜的口服釋放載體內(nèi)(即片劑、膠囊等)。
在一實(shí)施例中，釋放系統(tǒng)由聚(甲基丙烯酸)與聚(乙二醇)的交聯(lián)共聚物和所包含的胰島素組成。在組合物通過胃的苛刻環(huán)境時(shí)，由于共聚物結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)pH敏感性膨脹行為而使胰島素得以保護(hù)，所以該系統(tǒng)特別有效。側(cè)PEG鏈也起到粘附促進(jìn)劑作用而增加水凝膠載體在打算釋放部位的駐留時(shí)間。如實(shí)施例2中指出的那樣，水凝膠的粘膜粘附性明顯地受pH的影響，由此與粘附于胃表面相比更宜于粘附于腸道表面。此外，側(cè)PEG聚合物的存在作為肽穩(wěn)定劑并幫助保持生物活性化合物如胰島素的生物活性。
水凝膠共聚物中形成的鏈間絡(luò)合物對環(huán)境液體的性質(zhì)和pH以及共聚物組合物和嫁接鏈長度敏感。在胃的酸性環(huán)境，由于由羧酸質(zhì)子與嫁接鏈上醚基團(tuán)之間的氫鍵穩(wěn)定的互聚物絡(luò)合物的形成，水凝膠呈絡(luò)合狀態(tài)。由于孔眼小，ξ，在這些狀態(tài)時(shí)具有至少1000分子量的化合物(例如胰島素)不能方便地通過膜擴(kuò)散，因而這些化合物免受胃的苛刻環(huán)境的破壞。隨著顆粒通過胃并進(jìn)入腸道，環(huán)境pH增加超過凝膠的轉(zhuǎn)變pH。絡(luò)合物立即解離，網(wǎng)孔迅速增大導(dǎo)致分子量小于100,000的化合物釋放。因此，P(MAA-g-EG)水凝膠可用作分子量范圍為約1,000～約100,000化合物的有效的口服釋放載體。
實(shí)施例1P(MAA-g-EG)水凝膠內(nèi)容物的pH依賴性釋放研究了P(MAA-g-EG)水凝膠作為不同大小三種化合物的釋放載體的能力茶堿(MW 180.2)、萬古酶素(MW 1485.7)和胰島素(MW5733.2)。
在37℃通過甲基丙烯酸和聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯的自由基溶液聚合反應(yīng)制備P(MAA-g-EG)水凝膠，生成的低聚物鏈與二甲基異丁烯酸四甘酯交聯(lián)。將生成的水凝膠在去離子水中漂洗一周以除去未反應(yīng)單體和未-交聯(lián)的低聚物鏈，真空干燥并研磨成平均顆粒直徑為100-150μm的粉末。
利用茶堿(MW 180.2)、萬古酶素(MW 1485.7)和胰島素(MW 5733.2)進(jìn)行藥物摻入實(shí)驗(yàn)。將每一個(gè)藥物溶于pH 7.4的磷酸緩沖液中并將P(MAA-g-EG)水凝膠加入到藥物溶液中，通過平衡分配負(fù)載水凝膠。然后將水凝膠基質(zhì)與酸性溶液接觸，從而誘導(dǎo)互聚絡(luò)合物形成，由此降低水凝膠基質(zhì)網(wǎng)孔的大小。接著過濾收集水凝膠微球并真空干燥。用HPLC分析檢測起始溶液中殘留藥物量的濃度和洗脫游離水凝膠所得過濾液中藥物濃度來計(jì)算摻入效率。
按照日本藥典(Japanese Pharmacopoeia(JP))攪拌方法進(jìn)行藥物釋放實(shí)驗(yàn)。37℃以100rpm在JP的1液(pH 1.2)、2液(pH 6.8)中用槳攪拌組合物。用1液處理2小時(shí)后，過濾收集聚合物樣本并轉(zhuǎn)移至pH 6.8的2液中。HPLC檢測藥物濃度。
實(shí)驗(yàn)開始后30分鐘胰島素?fù)饺胨z基質(zhì)的平均摻入效率達(dá)94％，因此認(rèn)為該聚合物是胰島素的適宜載體。茶堿、萬古酶素和胰島素自P(MAA-g-EG)水凝膠釋放結(jié)果分別顯示于圖5a、5b、5c。在酸性溶液中化合物自水凝膠基質(zhì)的釋放降低(見暴露前2小時(shí))。然而，在pH6.8緩沖液中觀察到化合物的快速釋放。隨著藥物分子量增加，這種趨勢變得更為明顯；實(shí)驗(yàn)的第一階段在受激胃液(pH-1.3)中胰島素自聚合物的釋放小于10％。然而，將顆粒置入pH＝7.4緩沖液后，水凝膠迅速膨脹使得胰島素快速釋放。結(jié)果表明嫁接共聚物P(MAA-g-EG)在開發(fā)口服胰島素釋放系統(tǒng)中是有用的。
實(shí)施例2體外粘膜粘附研究使用溶液聚合技術(shù)將P(MAA-g-EG)水凝膠制成薄膜。在pH＝3.2和7.4的DMGA緩沖鹽液將水凝膠漲大平衡。將膨脹水凝膠切成直徑20cm的盤狀并置入25℃和90％RH的張力測驗(yàn)器中。鑒于用膠粘劑將膠凝的牛頜下粘蛋白樣本固定于低口，使用氰基丙烯酸酯醫(yī)用膠粘劑將聚合物樣本粘附于檢測器的上柄。將兩口拉在一起15分鐘然后以1mm/min速度分開。測定分離力作為位移的函數(shù)。分離功，等于按曲線下面積計(jì)算的生物粘附功。
由于P(MAA-g-EG)水凝膠可以阻滯蛋白酶抑制劑的作用，又能附于腸道壁粘膜，使得緊密接觸并由此有助于藥物的吸收，故P(MAA-g-EG)水凝膠可以很好地起到胰島素載體的作用。
當(dāng)包含胰島素的水凝膠置于腸道液中，水凝膠迅速膨脹而使胰島素釋放。包含胰島素的P(MAA-g-EG)微粒在磷酸緩沖鹽溶液中膨脹1小時(shí)，然后移至腸液中。使用EIA試劑盒檢測胰島素在腸液中的蛋白分解。在蛋白水解酶存在時(shí)，大于50％的胰島素生物活性維持1小時(shí)以上。相反，當(dāng)胰島素溶于腸液中，生物活性迅速喪失。P(MAA-g-EG)水凝膠起到保護(hù)胰島素的作用，這是由于水凝膠將鈣結(jié)合到離子化側(cè)基上，而這種結(jié)合反過來阻滯蛋白水解酶的作用。
此外，由于作為粘附促進(jìn)劑的嫁接PEG鏈的存在，使得P(MAA-g-EG)水凝膠顯示出粘膜粘附特性。P(MAA-g-EG)水凝膠的粘膜粘附性強(qiáng)烈地依賴于環(huán)境液的pH(圖6)。圖6曲線下面積等于凝膠和粘膜之間的粘附力。在刺激腸pH(pH＝7.4)條件下，凝膠和粘膜之間的粘附力顯著增大。然而，為真實(shí)比較水凝膠的粘膜粘附性，將粘附功標(biāo)準(zhǔn)化以解釋聚合物凝膠部分(見表2)。標(biāo)準(zhǔn)化的粘附功在無-絡(luò)合狀態(tài)水凝膠要高出絡(luò)合水凝膠2個(gè)數(shù)量級。相應(yīng)地，水凝膠對腸道粘膜的粘附要大大超過對胃粘膜的粘附。因此，胰島素載體在胰島素能夠吸收部位的駐留時(shí)間大大增加。
表2.含比值1∶1MAA/EG和分子量為1000嫁接PEG鏈的P(MAA-g-EG)水凝膠的粘附功pH粘附功聚合物體積分率，O2，s標(biāo)準(zhǔn)化的粘附功W*106(J) W/(O2，s)2/3*106(J)3.2 5.380.693 62.17.4 9.340.049 6720水凝膠在不同pH值的不同粘附性是由于PEG鏈在每種材料中的移動(dòng)性。在高度膨脹的無-絡(luò)合狀態(tài)時(shí)，嫁接PEG鏈?zhǔn)怯坞x的并作為粘附的錨很容易穿透粘膜。在絡(luò)合狀態(tài)，嫁接PEG鏈在P(MAA-g-EG)中與主鏈形成絡(luò)合物，因而不能穿透凝膠/粘膜界面和形成臨時(shí)錨。
實(shí)施例3胰島素大鼠給藥的體內(nèi)研究通過甲基丙烯酸和聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯的自由基溶液聚合反應(yīng)制備嫁接共聚物。將生成的水凝膠在去離水中漂洗7天以除去未反應(yīng)單體和未-交聯(lián)的低聚物鏈，將水凝膠真空干燥并研磨成粉末。過濾粉末得到平均顆粒直徑為100-150μm的顆粒。通過平衡分配負(fù)載晶狀豬胰島素(26.9U/mg)。過濾負(fù)載了藥物的顆粒并洗去表面藥物及進(jìn)行真空干燥。
雄性Wistar大鼠(200g)禁食24小時(shí)。仰臥位固定大鼠，給予負(fù)載了胰島素的聚合物明膠膠囊微粒，明膠膠囊在胃中立即溶化。實(shí)驗(yàn)前和給藥后0.25、0.5、1、2、4、6和8小時(shí)由頸靜脈采集0.2ml等份血液樣本進(jìn)行血清葡萄糖檢測。3000rpm離心3分鐘分離血清并冷凍血清至分析時(shí)使用。使用EIA試劑盒通過酶聯(lián)免疫分析法測定血清胰島素水平。使用B-測試試劑盒用葡萄糖氧化酶方法測定血清葡萄糖水平。
圖7概括了大鼠接受包含在P(MAA-g-EG)微粒中的胰島素劑量后的血糖反應(yīng)。接受聚合物劑型后2小時(shí)內(nèi)，觀察到強(qiáng)的低血糖效應(yīng)(血糖水平降低)。血糖水平的下降強(qiáng)烈地取決于胰島素劑量。在接受胰島素溶液的大鼠未觀測到反應(yīng)。
給予包括包含胰島素和蛋白酶抑制劑即抑肽酶的P(MAA-g-EG)水凝膠組合物的效果由圖8表示。對照組大鼠給予的是無蛋白酶的含胰島素水凝膠(作為比較)，一組給予50U/kg胰島素溶液(作為對照)。接受聚合物劑型胰島素的這兩組大鼠在給藥后2小時(shí)內(nèi)血糖濃度大幅度下降。而那些接受胰島素和蛋白酶抑制劑即抑肽酶聯(lián)合用藥的大鼠其血糖水平下降最大。抑肽酶阻滯腸道酶的降解作用并使胰島素局部釋放而保持較長時(shí)間活性。所以，在接受水凝膠胰島素和蛋白酶抑制劑組合物(包膠囊于P(MAA-g-EG)水凝膠中)的大鼠轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血流的胰島素量最高，導(dǎo)致血液葡萄糖濃度的較大降低。
實(shí)施例4糖尿病大鼠和犬的體內(nèi)研究通過施予鏈佐星誘導(dǎo)健康雄性Wistar大鼠患糖尿病。通過施予四氧嘧啶使健康犬患糖尿病。用大量自由基、甲基丙烯酸和聚(乙二醇)二異丁烯酸酯(PEG MW＝1000)懸浮聚合反應(yīng)制備P(MAA-g-EG)微球。加入作為交聯(lián)劑的二異丁烯酸四甘酯。加入占單體總量0.5％的作為熱反應(yīng)引發(fā)劑的2，2’-偶氮二異丁腈(AIBN)。
通過將胰島素平衡分配入P(MAA-g-EG)微粒中完成藥物負(fù)載。牛胰島素溶于200μl 1N NaOH中。用20ml磷酸緩沖液(pH＝7.4)稀釋胰島素溶液并用200μl 0.1N NaOH校準(zhǔn)。將最初干燥的P(MAA-g-EG)在胰島素溶液中膨脹24小時(shí)而完成負(fù)載。然后過濾顆粒并用100ml 0.1N HCL溶液洗滌從而微粒塌陷并“擠出”殘留的緩沖液。真空干燥負(fù)載了藥物的微球并貯于4℃。用HPLC分析初液和洗滌的過濾液中胰島素濃度來測定負(fù)載程度。
在施予負(fù)載胰島素的P(MAA-g-EG)水凝膠之前，雄性Wistar大鼠(250g)禁食24小時(shí)。仰臥位固定大鼠，使用明膠膠囊和EudragitL100制備的膠囊將負(fù)載了胰島素的P(MAA-g-EG)微粒和對照溶液灌胃。明膠膠囊在胃中迅速溶化，而Eudragit膠囊以顯著慢的速度溶解。
試驗(yàn)期間，大鼠分籠(每籠4只動(dòng)物)并可進(jìn)水。給藥后0.25、0.5、1、2、4、6和8小時(shí)由頸靜脈采集0.2ml等份血液樣本。3000rpm離心3分鐘分離血清。使用葡萄糖B-測試試劑盒用葡萄糖氧化酶方法測定血清葡萄糖水平。
糖尿病犬(25kg)在服用制劑之前禁食24小時(shí)。使用明膠膠囊的聚合物劑型口服投藥。在投藥時(shí)喂食犬。
試驗(yàn)期間，將犬關(guān)進(jìn)籠內(nèi)并允許進(jìn)水。自留置導(dǎo)管采集血液樣本。使用便攜式葡萄糖分析儀測定血清葡萄糖水平。
雖然許多系統(tǒng)能夠有效地降低口服含胰島素聚合物載體后的健康動(dòng)物的血糖水平，但在糖尿病動(dòng)物未觀察到類似的結(jié)果。糖尿病和健康大鼠在口服含胰島素P(MAA-g-EG)明膠膠囊微粒(劑量25IU/kg)后的血糖反應(yīng)由圖9表示。糖尿病大鼠的血液葡萄糖水平下降至起始水平的40％。血糖水平下降持續(xù)超過8小時(shí)，而事實(shí)上糖尿病動(dòng)物的血糖水平下降程度大于健康動(dòng)物。此外，在糖尿病動(dòng)物觀察到低血糖效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間更長。
糖尿病大鼠口服負(fù)載胰島素的P(MAA-g-EG)Eudragit膠囊微粒(劑量25IU/kg)后的血糖反應(yīng)見圖10。單次給藥后接受這些劑量的大鼠的葡萄糖水平下降超過50％至少8小時(shí)。用Eudragit包膠囊的微粒較明膠膠囊更為有效，大概是由于包在Eudragit膠囊中的微粒因Eudragit膠囊的緩慢溶解而暴露于上GI道惡劣環(huán)境的時(shí)間短的緣故。
健康犬在口服單聚合物劑型(10IU/kg)后血糖顯著下降。0時(shí)，喂食犬，機(jī)體的正常反應(yīng)維持在基礎(chǔ)水平。喂食后，血糖水平升高，然而，由于胰島素在小腸上段的攝取，給藥后2時(shí)內(nèi)血糖水平下降超過20％。此外，與前面在大鼠觀察到的一致，8小時(shí)點(diǎn)附近，出現(xiàn)第二次下降反應(yīng)，可能由于胰島素的結(jié)腸吸收。還有，8小時(shí)后血糖水平穩(wěn)定下降，可能由于胰島素的結(jié)腸吸收所致。
糖尿病犬的葡萄糖反應(yīng)也證實(shí)了口服后的胰島素?cái)z取。糖尿病犬的血糖水平由口服的含胰島素的P(MAA-g-EG)明膠膠囊微粒(劑量10IU/kg)控制。喂食并給予聚合物劑型，最初犬的葡萄糖水平迅速升高。然而，由于胰島素的吸收，1小時(shí)后葡萄糖水平在接下來的3個(gè)小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。接受聚合物劑型的糖尿病犬其血糖水平較未接受胰島素的犬低40％。
口服胰島素釋放系統(tǒng)必須能夠保護(hù)藥物免受胃的惡劣環(huán)境的破壞并使胰島素在長時(shí)段內(nèi)以生物活性構(gòu)象形式存在以便沿GI道到達(dá)吸收的更適宜區(qū)域如小腸上段。由于其性質(zhì)，絡(luò)合P(MAA-g-EG)水凝膠是此應(yīng)用的理想載體。
P(MAA-g-EG)水凝膠經(jīng)口服途徑能夠有效釋放生物活性胰島素。這些材料已經(jīng)顯示出降低糖尿病大鼠和犬的血糖水平并維持血糖在正常水平附近超過8小時(shí)。這些材料功能良好，由于胰島素包含在水凝膠中不被釋放直至材料到達(dá)小腸上段。在小腸中，水凝膠強(qiáng)烈地粘附于粘膜使得載體和吸收位點(diǎn)密切接觸。此外，聚合物起到阻滯腸道蛋白水解酶活性的作用使得胰島素在吸收前長時(shí)間保持活性狀態(tài)。據(jù)信聚合物對酶功能的抑制作用衍生自聚合物與酶功能所必需的陽離子，如鈣，形成絡(luò)合物的能力。
權(quán)利要求
1.一種口服給藥的藥學(xué)組合物，所述組合物包括可膨脹水凝膠基質(zhì)和包含在此基質(zhì)中的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，所述水凝膠基質(zhì)包括甲基丙烯酸和聚(二醇)單甲基丙烯酸酯的交聯(lián)共聚物。
2.權(quán)利要求1所述組合物，其中聚(二醇)單甲基丙烯酸酯是聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯。
3.權(quán)利要求1所述組合物，其中水凝膠基質(zhì)是與二甲基丙烯酸四甘酯交聯(lián)。
4.權(quán)利要求2所述組合物，其中甲基丙烯酸和聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯的分子比是約1∶1。
5.權(quán)利要求4所述組合物，其中蛋白質(zhì)分子量為約1,000～約20,000。
6.權(quán)利要求4所述組合物，其中蛋白質(zhì)是胰島素。
7.權(quán)利要求4所述組合物，其中聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯的分子量為約200～約4000。
8.權(quán)利要求4所述組合物，其中水凝膠是顆粒形并包于膠囊內(nèi)。
9.權(quán)利要求8所述組合物，其中膠囊是明膠膠囊。
10.權(quán)利要求4所述的組合物，進(jìn)一步包括蛋白酶抑制劑。
11.施予脊椎動(dòng)物的胰島素口服釋放組合物，所述組合物包括包含于P(MAA-g-EG)水凝膠中的胰島素。
12.權(quán)利要求1 1所述的組合物，進(jìn)一步包括蛋白酶抑制劑。
13.權(quán)利要求11所述組合物，其中水凝膠是顆粒形并包于膠囊內(nèi)。
14.權(quán)利要求13所述組合物，其中膠囊是明膠膠囊。
15.將治療有效量的蛋白質(zhì)施予脊椎動(dòng)物的給藥方法，所述方法包括將權(quán)利要求1所述組合物口服給藥施予所述脊椎動(dòng)物的步驟。
16.制備權(quán)利要求1所述組合物的方法，包括以下步驟甲基丙烯酸和聚(二醇)二甲基丙烯酸酯和交聯(lián)劑的聚合形成水凝膠基質(zhì)；所述水凝膠基質(zhì)與蛋白質(zhì)的水溶液接觸，其中溶液的pH值大于約5.4；和調(diào)整溶液的pH至小于約5.4；并分離含蛋白質(zhì)的水凝膠基質(zhì)。
17.權(quán)利要求16所述方法，其中聚(二醇)單甲基丙烯酸酯是聚(乙二醇)單甲基丙烯酸酯。
全文摘要
描述了對脊椎動(dòng)物口服給藥的生物活性組分的組合物和方法。該方法包括將組合物口服給藥施予脊椎動(dòng)物的步驟,所述組合物包括可膨脹水凝膠基質(zhì)和包含在水凝膠基質(zhì)中的生物活性組分。
文檔編號A61K38/28GK1259045SQ98805351
公開日2000年7月5日 申請日期1998年4月2日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月2日
發(fā)明者N·A·佩帕斯, A·M·洛曼, T·納蓋, M·莫里施塔 申請人:普渡研究基金會(huì)