專利名稱：透明質(zhì)酸酶在制備用于治療眼科疾病中液化玻璃體液的眼用制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及用于對(duì)人或其它哺乳動(dòng)物的眼睛給藥治療的酶制劑，更具體地說，涉及用一種或多種酶治療影響哺乳動(dòng)物眼睛的視網(wǎng)膜和/或玻璃體液的眼科疾病的方法。
背景技術(shù)：
人眼睛的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)在人體中，眼睛的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)包括“玻璃體”，玻璃體位于晶狀體的后面，并占眼球腔約五分之四的體積。玻璃體由被稱為玻璃體液的膠狀物質(zhì)構(gòu)成。一般情況下，正常人眼睛的玻璃體液含有約99％的水和1％的大分子物質(zhì)，大分子包括膠原、透明質(zhì)酸、可溶性糖蛋白、糖以及其它低分子量代謝物。
視網(wǎng)膜基本上是在眼球內(nèi)部后表面上形成的神經(jīng)組織層。視網(wǎng)膜環(huán)繞有稱為脈絡(luò)膜層的細(xì)胞層。視網(wǎng)膜可分成參與視覺機(jī)制的視覺部分和不參與視覺機(jī)制的非視覺部分。視網(wǎng)膜的視覺部分含有視網(wǎng)膜桿和視網(wǎng)膜錐體，它們都是有效的視覺器官。有大量動(dòng)脈和靜脈進(jìn)入視網(wǎng)膜中央，并向外展開以給視網(wǎng)膜提供血液循環(huán)。
玻璃體的后部與視網(wǎng)膜直接接觸。纖維狀絲網(wǎng)從視網(wǎng)膜延伸出，并穿入或插入玻璃體以將玻璃體和視網(wǎng)膜連接在一起。
玻璃體出血的原因、治療和臨床后遺癥糖尿病性視網(wǎng)膜病、創(chuàng)傷和其它眼科疾病有時(shí)會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管破裂或滲漏，結(jié)果使血液流到眼睛的玻璃體液中(即玻璃體出血)。這種玻璃體出血一般表現(xiàn)為玻璃體液的去霧狀或渾濁。
玻璃體出血時(shí)常，但不總是伴有視網(wǎng)膜的破裂或脫離。當(dāng)玻璃體出血伴有視網(wǎng)膜破裂或脫離時(shí)，迅速診斷和外科修復(fù)視網(wǎng)膜的破裂或脫離非常重要。不能迅速診斷和外科修復(fù)視網(wǎng)膜的破裂或脫離會(huì)使視網(wǎng)膜破裂或脫離區(qū)域的光感受器細(xì)胞發(fā)生壞死。視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的壞死會(huì)導(dǎo)致失明。此外，視網(wǎng)膜脫離長(zhǎng)時(shí)間未修復(fù)會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步的玻璃體出血和/或在出血位點(diǎn)形成纖維組織。纖維組織的形成會(huì)導(dǎo)致在玻璃體和視網(wǎng)膜之間形成不利的永久性纖維附著。
用于修復(fù)視網(wǎng)膜破裂和脫離的外科手術(shù)一般需要外科醫(yī)師能夠透過玻璃體液觀察視網(wǎng)膜的損傷區(qū)域(即“透過玻璃體觀察視網(wǎng)膜”)。當(dāng)玻璃體出血已經(jīng)發(fā)生時(shí)，玻璃體內(nèi)存在的出血后的積血會(huì)使玻璃體變得非常渾濁以致于外科醫(yī)師不能透過玻璃體現(xiàn)察視網(wǎng)膜。玻璃體的這種出血性可需要6-12個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間來變得足夠清澈以能透過玻璃體觀察視網(wǎng)膜。然而，鑒于視網(wǎng)膜破裂或脫離的診斷或治療被延遲有可能導(dǎo)致并發(fā)癥，通常不希望等待玻璃體內(nèi)的出血后積血自然清除。
此外，即使玻璃體出血不伴有視網(wǎng)膜破裂或脫離時(shí)，通常也難以驗(yàn)證沒有發(fā)生視網(wǎng)膜破裂或脫離，因?yàn)闇啙岬牟Ａw妨礙了醫(yī)師對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行常規(guī)眼底鏡檢查。而且，玻璃體內(nèi)存在的出血后積血可能會(huì)嚴(yán)重削弱病人受損傷眼睛的視覺或使視覺完全模糊，并且這種不利作用會(huì)持續(xù)到出血后的積血基本上或完全清除為止。
因此，玻璃體內(nèi)存在的出血后積血會(huì)導(dǎo)致許多臨床問題，包括a)不能通過視覺觀察進(jìn)行檢測(cè)和診斷出血和/或視網(wǎng)膜任何所伴隨的破裂或脫離的位點(diǎn)和病因，b)全部或部分削弱受損傷眼睛的視覺，和c)削弱或阻礙通常用于修復(fù)出血位點(diǎn)和/或修復(fù)任何所伴隨的視網(wǎng)膜破裂或脫離的透過玻璃體的外科手術(shù)治療的進(jìn)行。
當(dāng)玻璃體出血已導(dǎo)致玻璃體變模糊或渾濁時(shí)，醫(yī)師可能要選擇進(jìn)行稱為玻璃體切除術(shù)(vitrectomy)的操作，其中是將所有(或部分)玻璃體從眼睛內(nèi)部取出，并代之以澄清液體。進(jìn)行玻璃體切除術(shù)是為了使醫(yī)師能進(jìn)行必需的視網(wǎng)膜檢查和/或出血及任何所伴隨的視網(wǎng)膜破裂或脫離的外科修復(fù)。這種玻璃體切除術(shù)是技術(shù)性非常強(qiáng)的操作，并伴有數(shù)種嚴(yán)重缺陷、危險(xiǎn)和并發(fā)癥。在這些缺陷、危險(xiǎn)和并發(fā)癥中，潛在的是，除去玻璃體會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜進(jìn)一步脫離或破裂和/或除去玻璃體會(huì)引起已變?nèi)醯囊暰W(wǎng)膜血管進(jìn)一步出血。
現(xiàn)有技術(shù)中透明質(zhì)酸酶和其它酶的眼科應(yīng)用為了將玻璃體切除術(shù)操作期間導(dǎo)致視網(wǎng)膜進(jìn)一步脫離或破裂的可能性減到最少，美國專利5292509(Hageman)已提出，在取出玻璃體之前，將一些不含蛋白酶的葡萄糖胺聚糖酶注射到玻璃體中，以使玻璃體與視網(wǎng)膜分離或脫離。玻璃體的這種脫離或分離是為了將切除玻璃體時(shí)視網(wǎng)膜發(fā)生進(jìn)一步破裂或脫離的可能性減至最小?？捎糜趯⒉Ａw與視網(wǎng)膜分離的葡萄糖胺聚糖酶的具體實(shí)例包括軟骨素酶ABC，軟骨素酶AC，軟骨素酶B，軟骨素4-硫酸酯酶，軟骨素6-硫酸酯酶，透明質(zhì)酸酶和β-葡糖苷酸酶。
雖然已知透明質(zhì)酸酶具有多種眼科應(yīng)用，包括在美國專利5292509(Hageman)中描述的玻璃體切除術(shù)輔助應(yīng)用，但是以前出版的論文指出，當(dāng)以超過1 IU的劑量，即以15、30、50和150 IU的劑量給藥到玻璃體內(nèi)時(shí)，透明質(zhì)酸酶對(duì)視網(wǎng)膜和/或眼睛的其它解剖學(xué)結(jié)構(gòu)具有毒性。參見，玻璃體內(nèi)給予透明質(zhì)酸酶的安全性；Gottlieb，J.L.；Antoszyk，A.N.，Hatchell，D.L.和Soloupis，R.，《眼視覺科學(xué)研究》(Invest Ophthalmol Vis Sci)3111，2345-52(1990)。
其它研究人員證實(shí)了一些透明質(zhì)酸酶制劑的眼毒性，他們提出，這些透明質(zhì)酸酶制劑用作毒性刺激劑，以在動(dòng)物毒性模型中誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)-誘導(dǎo)的眼睛新血管形成。參見，視網(wǎng)膜前新血管形成的兔實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，Antoszyk，A.N.，Gottlieb，J.L.，Casey，R.C.，Hatchell，D.L.和Machemer，R.，《眼視覺科學(xué)研究》(Invest Ophthalmol Vis Sci)321，46-51(1991)。
不幸的是，以前還不知道所報(bào)道的透明質(zhì)酸酶的治療活性和毒性是否廣泛適用于所有透明質(zhì)酸酶制劑，或不知道透明質(zhì)酸酶的療效和/或毒性是否僅適用于含有一定賦形劑的透明質(zhì)酸酶制劑或得自特定來源的透明質(zhì)酸酶。這種考慮非常重要，因?yàn)殡S透明質(zhì)酸酶的來源和溶劑和/或其它與透明質(zhì)酸酶混合的制劑組分的不同，現(xiàn)有技術(shù)中所用的各種透明質(zhì)酸酶制劑的純度和特征(例如分子量分布)也有可能不同。
現(xiàn)有技術(shù)中用于眼睛給藥的透明質(zhì)酸酶制劑的純度和特征術(shù)語“透明質(zhì)酸酶”通常指能解聚一些粘多糖如透明質(zhì)酸的內(nèi)-β-葡糖苷酸酶。Myer，K.等人《酶》(The Enzymes)；第4卷，第2版，第447頁，Academic Press，Inc.，New York(1960)。
透明質(zhì)酸酶使透明質(zhì)酸和軟骨素硫酸A和C的內(nèi)-N-乙酰基己糖胺鍵水解，主要生成四糖殘基。
有重要證據(jù)表明，不同來源的透明質(zhì)酸酶在酶的分子量分布和具體的酶活性方面不同。鑒于可從不同來源，包括牛睪丸、羊睪丸、一些細(xì)菌如鏈霉菌屬細(xì)菌、和一些無脊椎動(dòng)物如水蛭中分離透明質(zhì)酸酶，分子量分布和酶活性的這種差異頗值得注意。
據(jù)報(bào)道，已將Wydase透明質(zhì)酸酶制劑對(duì)哺乳動(dòng)物的眼睛給藥，來進(jìn)行各種臨床和試驗(yàn)應(yīng)用，包括用于治療青光眼以及在將玻璃體從眼睛中取出的玻璃體切除術(shù)進(jìn)行期間用于促進(jìn)玻璃體液化。
雖然據(jù)報(bào)道已有一些透明質(zhì)酸酶制劑在注射入或局部施予眼睛時(shí)顯示出理想的療效，但是考慮到這類制劑通過眼內(nèi)注射的常規(guī)臨床給藥的安全性，應(yīng)注意透明質(zhì)酸酶和/或硫柳汞防腐劑的潛在毒性。
因此，本領(lǐng)域需要配制和開發(fā)出新的透明質(zhì)酸酶制劑，其能以足以產(chǎn)生最佳療效的劑量水平對(duì)眼睛給藥，而不引起眼毒性。
此外，鑒于存在上述與出血后積血從玻璃體內(nèi)自然清除很緩慢有關(guān)的問題，本領(lǐng)域需要闡明并開發(fā)出新的方法和操作，以促進(jìn)出血后積血從眼睛玻璃體內(nèi)的清除，從而可透過玻璃體進(jìn)行眼底(包括視網(wǎng)膜)觀察，而不需要取出玻璃體(即全部或部分玻璃體切除術(shù))。
另外，也需要預(yù)防和治療由視網(wǎng)膜血管化的損傷或病變導(dǎo)致或造成血視網(wǎng)膜屏障損傷的哺乳動(dòng)物眼睛的各種疾病。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了治療哺乳動(dòng)物眼科疾病的酶方法。通過將一定量的能有效地液化被治療眼睛的玻璃體液而不對(duì)眼睛造成毒性損害的透明質(zhì)酸酶對(duì)眼睛給藥，能防止視網(wǎng)膜的新血管形成以及增加對(duì)視網(wǎng)膜有毒性的物質(zhì)從玻璃體中清除的速度。玻璃體液的液化能增加液體從玻璃體腔中交換的速度。液體交換速度的增加有助于消除其存在會(huì)導(dǎo)致眼睛和視網(wǎng)膜損傷的物質(zhì)和狀況。
本發(fā)明提供了誘導(dǎo)玻璃體液液化以預(yù)防哺乳動(dòng)物眼科疾病的方法，其中包括將一定量的能有效液化玻璃體液的透明質(zhì)酸酶與哺乳動(dòng)物眼睛玻璃體液接觸的步驟，由此來預(yù)防眼科疾病而并不對(duì)哺乳動(dòng)物眼睛造成毒性損傷。
此方法優(yōu)選是為了治療下述病癥而實(shí)施增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變，老年性黃斑部退行變性，弱視，色素性視網(wǎng)膜炎，黃斑裂孔，或黃斑滲出(macular exudate)。透明質(zhì)酸酶可以是液體溶液，酶與玻璃體液接觸的步驟包括，將所述液體溶液注射到玻璃體液中。透明質(zhì)酸酶與玻璃體液在沒有硫柳汞存在下進(jìn)行接觸。
在一個(gè)實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸酶以5-200個(gè)國際單位的劑量與玻璃體液接觸。在另一實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸酶以1個(gè)國際單位的劑量與玻璃體液接觸。透明質(zhì)酸酶能以多次劑量的形式給藥，單次眼內(nèi)注射的注射體積可小于100∶1。
在另一實(shí)施方案中，分子量大于約100000(通過10％SDS PAGE電泳測(cè)定的)的透明質(zhì)酸酶沒有透明質(zhì)酸分解活性。分子量大約為60000-100000(通過10％SDS PAGE電泳測(cè)定的)的透明質(zhì)酸酶沒有明膠分解活性。此外，分子量大于約45000(通過10％SDS PAGE電泳測(cè)定的)的透明質(zhì)酸酶沒有酪蛋白分解活性。而且，分子量大于約100000(通過4-20％SDS PAGE電泳測(cè)定的)的透明質(zhì)酸酶沒有透明質(zhì)酸酶活性。此外，分子量大約為50000-60000(通過4-20％SDS PAGE電泳測(cè)定的)的透明質(zhì)酸酶沒有透明質(zhì)酸酶活性。此外，分子量大約20000以下(通過4-20％SDS PAGE電泳測(cè)定的)的透明質(zhì)酸酶沒有透明質(zhì)酸酶活性。
在另一實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸酶被制成不含硫柳汞的注射液，此制劑中含有高達(dá)8000 IU的透明質(zhì)酸酶、5.0-130.0mg乳糖、以及0.01-100.0mmol磷酸鹽。在另一實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸酶被制成不含硫柳汞的注射液，此制劑中含有6500 IU的透明質(zhì)酸酶、5.0mg乳糖、以及0.02mmol磷酸鹽。在另一實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸酶被制成不含硫柳汞的注射液，此制劑中含有500-1000 IU的透明質(zhì)酸酶、5.0-10.0mg乳糖、以及0.01-10.0mmol磷酸鹽。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，提供了治療哺乳動(dòng)物眼科疾病的方法，包括將一定量的能有效治療所述眼科疾病而不對(duì)所述哺乳動(dòng)物眼睛造成毒害的透明質(zhì)酸酶與所述哺乳動(dòng)物眼睛的玻璃體液進(jìn)行接觸的步驟。其中治療后，玻璃體液中沒有出血后積血，可以對(duì)所述哺乳動(dòng)物眼睛的視網(wǎng)膜進(jìn)行觀察。此外，該接觸步驟在沒有進(jìn)行玻璃體切除術(shù)的情況下進(jìn)行。
附圖的簡(jiǎn)要說明附

圖1表示具有泳道1-6的凝膠電泳，所述泳道表示1)31000-200000的分子量標(biāo)準(zhǔn)，2)羊透明質(zhì)酸酶ACS，3)VI-S型牛透明質(zhì)酸酶，4)V型羊透明質(zhì)酸酶，5)IV-S型牛透明質(zhì)酸酶，和6)I-S型牛透明質(zhì)酸酶。
附圖2是總結(jié)下述內(nèi)容的表格，與VI-S、IV-S和I-S型牛透明質(zhì)酸酶以及V型羊透明質(zhì)酸酶相比，由酶譜法測(cè)定的本發(fā)明透明質(zhì)酸酶ACS的透明質(zhì)酸、明膠分解和酪蛋白分解活性。
附圖3是總結(jié)下述內(nèi)容的表格，依據(jù)下面的實(shí)施例1，給兔子單次量玻璃體內(nèi)注射BSS、BSS+硫柳汞、透明質(zhì)酸酶ACS以及透明質(zhì)酸酶Wydase的毒性作用。
附圖4是總結(jié)下述內(nèi)容的表格，依據(jù)下面的實(shí)施例2，單次量的玻璃體內(nèi)透明質(zhì)酸酶ACS在兔子中的效力。
附圖5是總結(jié)下述內(nèi)容的表格，依據(jù)下面的實(shí)施例2，多次量的玻璃體內(nèi)透明質(zhì)酸酶ACS在兔子中的安全性和效力。
附圖6是總結(jié)下述內(nèi)容的表格，依據(jù)下面的實(shí)施例9，單次量的透明質(zhì)酸酶ACS在患有糖尿病性視網(wǎng)膜病變的病人中清除出血的效力。
發(fā)明詳述提供下面的詳細(xì)描述和實(shí)施例僅是為了描述和解釋本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案，而不以任何方式對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定。
促進(jìn)出血后的積血從眼睛玻璃體中清除的酶方法依據(jù)本發(fā)明，申請(qǐng)人已確定，當(dāng)一定類型的酶在玻璃體發(fā)生出血后與玻璃體液接觸，能增加出血后積血從玻璃體液中清除的速度。
在這方面，本申請(qǐng)人已發(fā)明了用于促進(jìn)出血后積血從眼睛玻璃體清除的方法，所述方法通常包括將透明質(zhì)酸酶以足以能促進(jìn)出血后積血從玻璃體中清除，同時(shí)又不損害視網(wǎng)膜或眼睛其它組織的劑量與玻璃體液接觸的步驟。優(yōu)先選擇具有下述分子量分布的透明質(zhì)酸酶，即分子量分布能容許透明質(zhì)酸酶在沒有硫柳汞存在下以1 IU以上、優(yōu)選15 IU以上、更優(yōu)選75 IU以上的劑量玻璃體內(nèi)給藥，而同時(shí)對(duì)視網(wǎng)膜或眼睛其它組織不引起毒性損害。本發(fā)明的出血清除方法可以在不進(jìn)行任何玻璃體切除術(shù)或其它手術(shù)操作或除去玻璃體液的情況下進(jìn)行，因此就防止了進(jìn)行這種玻璃體切除術(shù)所帶來的潛在危險(xiǎn)和并發(fā)癥。
出血清除酶優(yōu)選的給藥途徑是直接對(duì)玻璃體眼內(nèi)注射?；蛘?，本發(fā)明的出血清除酶可以任何能使酶在玻璃體內(nèi)有足夠分布以產(chǎn)生所期望出血清除效果的合適給藥途徑(例如局部給藥)給藥。
優(yōu)選的注射液可含有具有下述分子量分布的透明質(zhì)酸酶和使注射液基本等滲以及具有適于對(duì)眼睛給藥的pH的非活性成分，即分子量分布能容許透明質(zhì)酸酶以1 IU以上、優(yōu)選15 IU以上、更優(yōu)選75 IU以上的劑量玻璃體內(nèi)給藥，同時(shí)對(duì)眼睛不引起毒性損害。優(yōu)選的透明質(zhì)酸酶制劑優(yōu)選不含有硫柳汞。注射液可先冷凍干燥成干燥狀態(tài)，然后使用前再重新溶解。
優(yōu)選的眼用透明質(zhì)酸酶制劑對(duì)于本發(fā)明可注射且不含硫柳汞的透明質(zhì)酸酶制劑，其一般制劑如下述表1所示表1一般制劑

首先將這些制劑組分溶于無菌水中，無菌過濾，隨后冷凍干燥成干燥組合物。包裝冷凍干燥的組合物，使用前，將其重新溶解在合適的溶劑如無菌等滲鹽水或平衡鹽溶液中。所述平衡鹽溶液一般含有0.64％的氯化鈉，0.075％的氯化鉀，0.048％的去水氯化鈣，0.03％的氯化鎂六水合物，0.39％的乙酸鈉三水合物，0.17％的檸檬酸鈉二水合物，氫化鈉/透明質(zhì)酸以調(diào)節(jié)PH，以及使溶液達(dá)到用于注射的最終體積所需的水(適量)。
本說明書所用術(shù)語“透明質(zhì)酸酶ACS”指用于玻璃體內(nèi)注射、不含有硫柳汞、并且不含有分子量在100000以上、50000-60000之間以及20000以下的透明質(zhì)酸酶的一種優(yōu)選的透明質(zhì)酸酶溶液。其中一種這類透明質(zhì)酸酶可購自Calbiochem Biochemical，P.0.Box 12087，La Jolla，CA 92039-2087(由Biozyme生產(chǎn)，San Diego，CA)。本申請(qǐng)人已經(jīng)確定，透明質(zhì)酸酶ACS這種特別的分子量分布使其比其它透明質(zhì)酸酶制劑的眼毒性要低，同時(shí)在大量眼科應(yīng)用中顯示出理想療效。
附圖1顯示了凝膠電泳(4-20％梯度SDS-PAGE)，此凝膠電泳表明了與從SIGMA化學(xué)公司，P.O.Box 14508，St.Louis，Missouri63178獲得的VI-S、IV-S和I-S型牛透明質(zhì)酸酶以及V型羊透明質(zhì)酸酶的分子量分布相比，優(yōu)選的透明質(zhì)酸酶ACS的分子量分布。附圖1所示凝膠電泳的每一條泳道(泳道2-6)負(fù)載有標(biāo)準(zhǔn)量(即透明質(zhì)酸酶活性的當(dāng)量單位)的每一種酶。附圖1所示凝膠電泳的泳道1含有分別在200000、116000、97400、66000、45000和31000處的分子量標(biāo)記。附圖1所示凝膠電泳的泳道2-6含有下述各個(gè)測(cè)試透明質(zhì)酸酶制劑泳道 泳道中的樣本2 透明質(zhì)酸酶ACS3 VI-S型牛透明質(zhì)酸酶4 V型羊透明質(zhì)酸酶5 IV-S型牛透明質(zhì)酸酶6 I-S型牛透明質(zhì)酸酶泳道2表示包括分子量為97400、50000(大約)和45000(大約)的透明質(zhì)酸酶的透明質(zhì)酸酶ACS的分子量分布，但清楚地顯示了不含有分子量為100000以上、50000-60000之間以及20000以下的透明質(zhì)酸酶。
附圖1所示凝膠電泳的泳道3、4、5和6表明，VI-S、IV-S和I-S型牛睪丸透明質(zhì)酸酶以及V型羊睪丸透明質(zhì)酸酶都不同于本發(fā)明透明質(zhì)酸酶ACS，這是因?yàn)樗鼈兒蟹肿恿吭?0000-60000之間以及20000以下的透明質(zhì)酸酶。此外，4種測(cè)試的睪丸透明質(zhì)酸酶中有3種(即VI-S、IV-S和I-S型)含有分子量在100000以上的透明質(zhì)酸酶。
此外，也用酶譜法比較了標(biāo)準(zhǔn)量(即透明質(zhì)酸酶活性的當(dāng)量單位)的上述透明質(zhì)酸酶ACS和VI-S、V、IV-S和I-S型透明質(zhì)酸酶對(duì)透明質(zhì)酸、明膠和酪蛋白的分解活性。對(duì)于附圖2，每一酶譜所用的具體方法如下明膠分解活性的酶譜明膠1mg/ml明膠；10％的聚丙烯酰胺；過夜緩沖液＝50mM Tris鹽酸，5mM CaCl2，0.05％Triton X-100 pH 7.5；染色，用考馬斯藍(lán)；脫色，用10％的乙酸/50％的甲醇。
酪蛋白分解活性的酶譜酪蛋白4mg/ml；15％的聚丙烯酰胺；過夜緩沖液＝50mM Tris鹽酸，5mM CaCl2，0.05％Triton X-100 pH 7.5；染色，用考馬斯藍(lán)；脫色，用10％乙酸/50％的甲醇。
透明質(zhì)酸分解活性的酶譜透明質(zhì)酸2mg/ml；10％的聚丙烯酰胺；過夜緩沖液＝磷酸鹽緩沖鹽水，pH 7.4；染色，用3％乙酸中的0.5％的愛爾新藍(lán)；脫色，用10％的乙酸/50％的甲醇。
附圖2的表中總結(jié)了這些透明質(zhì)酸、明膠和酪蛋白酶譜的結(jié)果。很明顯，當(dāng)通過10％SDS PAGE電泳測(cè)定時(shí)，本發(fā)明優(yōu)選的透明質(zhì)酸酶ACS不含有分子量在約100000以上的能分解透明質(zhì)酸的透明質(zhì)酸酶，而每一種測(cè)試的睪丸透明質(zhì)酸酶(即VI-S、V、IV-S和I-S型)都含有分子量在100000以上的能分解透明質(zhì)酸的透明質(zhì)酸酶。
相類似地，當(dāng)通過10％SDS PAGE電泳測(cè)定時(shí)，本發(fā)明透明質(zhì)酸酶ACS不含有分子量在約60000-100000之間的能分解明膠的透明質(zhì)酸酶，而每一種測(cè)試的睪丸透明質(zhì)酸酶都含有分子量在約60000-100000之間的能分解明膠的透明質(zhì)酸酶。
此外，當(dāng)通過10％SDS PAGE電泳測(cè)定時(shí)，本發(fā)明優(yōu)選的透明質(zhì)酸酶ACS不含有分子量在約45000以上的能分解酪蛋白的透明質(zhì)酸酶，而每一種測(cè)試的睪丸透明質(zhì)酸酶(即VI-S、V、IV-S和I-S型)都含有分子量在約45000以上的能分解酪蛋白的透明質(zhì)酸酶。
由于本發(fā)明優(yōu)選的透明質(zhì)酸酶ACS的特異分子量分布和特異的酶活性，和/或在其制劑中不含有硫柳汞，使得本發(fā)明提供了這樣的透明質(zhì)酸酶制劑，當(dāng)其以其它透明質(zhì)酸酶制劑會(huì)引起毒性作用的劑量水平對(duì)眼睛給藥時(shí)，對(duì)眼睛沒有毒性。
當(dāng)用于下述實(shí)施例中時(shí)，按照下述以及表1所示方法和一般公式將優(yōu)選的透明質(zhì)酸酶ACS制成不含硫柳汞的制劑。更具體地說，用在下述實(shí)施例中的透明質(zhì)酸酶ACS是按照下表2所示的具體制劑制得的
表2具體制劑A

或者，另一可用于以單位劑量給藥的具體制劑如下表3所示表3具體制劑B

在另一具體制劑中，透明質(zhì)酸酶ACS以冷凍干燥形式提供，其組分如下表4所示表4具體制劑C

上表所列的稀釋量和注射體積是對(duì)于75 IU劑量而言的?？梢愿淖兿♂屃恳赃m應(yīng)劑量變化。
在另一具體制劑中，透明質(zhì)酸酶ACS是以液體形式提供的，其組分如下表5所示
表5具體制劑C

所有組分可按比例減少，以獲得具有相同注射體積的較低劑量。而且，乳糖的量可減少二分之一或四分之一。
表6具體制劑D

如下面的實(shí)施例所述，表2(上面)中透明質(zhì)酸酶ACS的具體制劑A可按照能帶來療效但不對(duì)眼睛或相關(guān)解剖學(xué)結(jié)構(gòu)引起毒性的劑量直接注射到眼睛后房中，其中所述療效包括但無需限于本發(fā)明的清除玻璃體出血的作用?；蛘?，透明質(zhì)酸酶ACS的具體制劑B或C也可以這樣注射。還提供了表6中透明質(zhì)酸酶ACS的具體制劑D在本發(fā)明方法中的應(yīng)用。硫柳汞、透明質(zhì)酸酶ACS和透明質(zhì)酸酶(Wvdase)對(duì)兔子的眼毒性實(shí)施例1將體重為1.5-2.5kg的52只健康的新酰雜交種New ZealandCross Variety兔子(26只雄兔，26只雌兔)分別標(biāo)以識(shí)別記號(hào)，并分別關(guān)在懸掛的籠子中。給兔子提供每日基礎(chǔ)量的市售兔飼料團(tuán)和任意量的自來水。
將兔子分成13組，每組4只(2只雄性，2只雌性)。每一組中選擇2只兔子(1只雄性，1只雌性)進(jìn)行眼底照相和熒光素血管造影預(yù)處理。
眼底照相是這樣進(jìn)行的將兔子固定，用裝有Kodak Gold 200 ASA膠卷的KOWARC-3眼底照相機(jī)給視神經(jīng)，視網(wǎng)膜弓照相。
熒光素血管造影包括，經(jīng)耳緣靜脈注射1.5ml 2％的無菌熒光素溶液。注射約30秒后，熒光素在視神經(jīng)、視網(wǎng)膜血管和眼底顯影。
第二天，靜脈注射34mg/kg的鹽酸氯胺酮和5mg/kg賽拉嗪將每只兔子麻醉。用開瞼器卷眼瞼，用碘伏(iodine-providone)洗液將眼睛消毒。
通過用裝有0.5英寸長(zhǎng)的30號(hào)針頭的1cc結(jié)核菌素注射器將平衡鹽溶液(BSS)、BBS+硫柳汞、透明質(zhì)酸酶(Wydase)或透明質(zhì)酸酶ACS注射給藥，來進(jìn)行所述制劑的試驗(yàn)處理。本實(shí)施例所用透明質(zhì)酸酶ACS溶液不含硫柳汞，而是由上面表2所示的透明質(zhì)酸酶ACS具體制劑構(gòu)成。
對(duì)每一動(dòng)物試驗(yàn)組進(jìn)行的試驗(yàn)處理如下組#治療1BSS2BSS+0.0075mg硫柳汞3BSS+0.025mg硫柳汞4透明質(zhì)酸酶(Wydase)1 IU5透明質(zhì)酸酶(Wydase)15 IU6透明質(zhì)酸酶(Wydase)30 IU7透明質(zhì)酸酶(Wydase)50 IU8透明質(zhì)酸酶(Wydase)150 IU9透明質(zhì)酸酶ACS 1 IU10 透明質(zhì)酸酶ACS 15 IU11 透明質(zhì)酸酶ACS 30 IU12 透明質(zhì)酸酶ACS 50 IU13 透明質(zhì)酸酶ACS 150 IU注射后第一天，用與給藥前檢查相同的方法觀察這26只進(jìn)行眼底照相和熒光素血管造影的兔子。
注射后第二天，將13只已經(jīng)在給藥前和第一天進(jìn)行過眼底照相和熒光素血管造影雄兔和13只未被選來進(jìn)行照相和造影術(shù)的雌兔，用以戊巴比妥鈉為主藥的藥物進(jìn)行安樂死。然后手術(shù)取出眼球，置于pH為7.37、含有0.1M磷酸鹽緩沖鹽水的2.5％戊二醛固定液中。
或者，將一只隨機(jī)選擇的兔子注射戊巴比妥使其安樂死，然后將戊二醛溶液注左心室(心內(nèi)注射)進(jìn)行固定，以測(cè)定固定操作對(duì)摘出的眼睛內(nèi)的組織學(xué)結(jié)果的作用。
在第7天，將13只已經(jīng)進(jìn)行過照相和造影術(shù)的雌兔按照前述方法進(jìn)行觀察。
給藥7天后，按照上述方法將剩余的26只兔子安樂死。按照與第二天固定眼睛相同的方式將眼睛固定。也將一只隨機(jī)選擇的兔子進(jìn)行與前面隨機(jī)選擇的兔子所進(jìn)行的相同的心內(nèi)戊二醛固定操作。
對(duì)在本實(shí)施例中處理的眼睛進(jìn)行肉眼和顯微鏡下觀測(cè)以發(fā)現(xiàn)與處理有關(guān)的毒性作用證據(jù)。附圖3給出了總結(jié)每一處理組的毒性或非毒性作用的組織學(xué)證據(jù)的表格。
簡(jiǎn)言之，用BSS處理的對(duì)照組眼睛在給藥后第2天和第7天未出現(xiàn)毒性。
用BSS+硫柳汞(0.0075mg)處理的第2組兔子的眼睛在給藥后第2天沒有毒性，但是在第7天表現(xiàn)出血-視網(wǎng)膜屏障破裂的證據(jù)。
用BSS+硫柳汞(0.025mg)處理的第3組兔子的眼睛在給藥后第2天和第7天都表現(xiàn)出嚴(yán)重的與治療有關(guān)的毒性作用。
用1 IU劑量Wydase處理的第4組兔子的眼睛在給藥后第2天和第7天沒有毒性，但是，用15 IU-150 IU劑量Wydase處理的第5-8組兔子的眼睛在給藥后第2天和第7天一般都表現(xiàn)出劑量-相關(guān)的毒性作用。
用透明質(zhì)酸酶ACS以1 IU-150 IU劑量處理的第9-13組兔子的眼睛在給藥后第2天和第7天一般都沒有表現(xiàn)出毒性作用。然而，在用150 IU劑量處理的動(dòng)物中觀察到了有些熒光素漏出。
因此，推論出硫柳汞和含有硫柳汞的Wydase制劑在測(cè)試劑量下確實(shí)在兔子的眼睛中產(chǎn)生了毒性作用，然而，透明質(zhì)酸酶ACS在測(cè)試劑量下在這些兔子中不產(chǎn)生毒性作用。
附圖3總結(jié)了在第7天檢測(cè)到的結(jié)果。如附圖3所示，于第7天，在用BSS+硫柳汞(0.0075mg)、以及1 IU-150 IU之間所有劑量下的透明質(zhì)酸酶(Wydase)處理的兔子的眼睛中，觀察到了嚴(yán)重的毒性作用。與之相反，在用1-150 IU劑量的透明質(zhì)酸酶ACS處理的兔子眼睛中，沒有觀察到任何毒性作用。
玻璃體內(nèi)注射的透明質(zhì)酸酶ACS在兔子眼睛中的安全性和效力實(shí)施例2在本實(shí)施例中，將12只健康的新酰雜交種兔子分別標(biāo)以識(shí)別記號(hào)，并分別關(guān)在懸掛的籠子中。給兔子提供每日基礎(chǔ)量的市售兔飼料團(tuán)和任意量的自來水。
將兔子隨機(jī)分成4個(gè)處理組，每組3只兔子。
首先，用1-2滴10％的托吡卡胺將每一只兔子的眼睛擴(kuò)瞳，然后肉眼檢查，用20屈光度的透鏡進(jìn)行間接的檢眼鏡檢查，對(duì)眼睛的前房進(jìn)行裂隙燈檢查。
對(duì)兔子的眼睛進(jìn)行初始檢查后，將100∶1或10∶1的血液注射到每只兔子的每只眼睛的玻璃體內(nèi)。
在第2天，依據(jù)下述處理方案，將BSS或透明質(zhì)酸酶ACS注射到每一處理組兔子右眼的玻璃體內(nèi)，其中每只兔子接受一次注射組#處理左眼右眼A未處理BSS(30∶1)×1B未處理25 IU透明質(zhì)酸酶ACS 30∶1×1C未處理50 IU透明質(zhì)酸酶ACS 30∶1×1D未處理75 IU透明質(zhì)酸酶ACS 30∶1×1本項(xiàng)試驗(yàn)中所用的透明質(zhì)酸酶ACS制劑是上述實(shí)施例2所示制劑。
在第3、5、7、14和21天，用裂隙燈再次檢查每只兔子的眼睛，以評(píng)價(jià)角膜前房、前房和虹膜。另外，用10％的托吡卡胺溶液將每一只兔子的眼睛擴(kuò)瞳，用20屈光度的透鏡通過間接檢眼鏡檢查視網(wǎng)膜。
附圖4總結(jié)了所觀察的透明質(zhì)酸酶ACS的出血清除效力。一般情況下，由于已注射了一定量的血液，所以每一處理組中每只兔子的左眼(未處理)含有渾濁的玻璃體和一些血塊。組A中用BSS處理(對(duì)照)的兔子的右眼也含有渾濁的玻璃體和一些血塊，然而處理組B-D中所有用透明質(zhì)酸酶處理的兔子的右眼都含有澄清的玻璃體，并且能進(jìn)行透過玻璃體的視網(wǎng)膜觀察。此外，處理組B-D中所有兔子右眼的視網(wǎng)膜看上去都很正常并沒有與處理有關(guān)的毒性。
試驗(yàn)結(jié)果表明，以25、50、和75 IU單次劑量玻璃體內(nèi)給藥后，透明質(zhì)酸酶ACS能有效地增加血液從被處理兔子的眼睛中清除的速度，并且在此項(xiàng)試驗(yàn)中，以所述單次劑量給藥時(shí)，透明質(zhì)酸酶ACS在被處理兔子的眼睛中不產(chǎn)生明顯的毒性作用。
在一試驗(yàn)變例中，除了透明質(zhì)酸酶以2周的間隔4次連續(xù)劑量給藥來代替單次劑量給藥外，用與上述試驗(yàn)相同的方式進(jìn)行本實(shí)施例。每次給藥后所進(jìn)行的檢查是一致的，檢查結(jié)果總結(jié)在附圖5中?？偟膩碚f，由于已注射了一定量的血液，所以每一處理組中每只兔子的左眼(未處理)含有渾濁的玻璃體和一些血塊。組A中用BSS處理(對(duì)照)的兔子的右眼也含有渾濁的玻璃體和一些血塊，然而處理組B-D中所有兔子(即用透明質(zhì)酸酶ACS處理的兔子)的右眼均含有澄清的玻璃體，并且能進(jìn)行透過玻璃體的視網(wǎng)膜觀察。此外，甚至透明質(zhì)酸酶多次給藥后，處理組B-D中所有兔子右眼的視網(wǎng)膜看上去都很正常并且沒有與處理有關(guān)的毒性。
試驗(yàn)結(jié)果表明，以25、50、和75 IU×4的劑量玻璃體內(nèi)給藥后，透明質(zhì)酸酶ACS能有效地增加血液從兔子眼睛中清除的速度，并且甚至在2周的時(shí)間間隔內(nèi)以4次連續(xù)劑量給藥后，透明質(zhì)酸酶ACS在被處理兔子的眼睛中不產(chǎn)生明顯的毒性作用。
玻璃體內(nèi)注射的透明質(zhì)酸酶ACS在人眼睛中的安全性和效力實(shí)施例3本項(xiàng)研究的主要目標(biāo)是，確定含有高純度的從牛睪丸組織中提取的透明質(zhì)酸酶的平衡鹽溶液能否注射到視覺損傷的眼睛的玻璃體內(nèi)而又不引起任何嚴(yán)重的眼睛副作用。試驗(yàn)材料和方法使用平衡鹽溶液(BSS)作為無效對(duì)照劑，平衡鹽溶液得自Allergan Pharmaceutical(Irvine，CA)。BSS含有0.64％氯化鈉、0.075％氯化鉀、0.048％氯化鈣二水合物、0.03％氯化鎂六水合物、0.39％乙酸鈉三水合物、足以將pH調(diào)至7.1-7.2的氫氧化鈉/鹽酸、以及注射用水(適量100％)。將30微升等份試樣的BSS或透明質(zhì)酸酶具體制劑D(表6)裝在安裝有長(zhǎng)0.5英寸的29號(hào)注射針的300μl微量注射器中。然后用裝有注射樣本的微量注射器把樣本注射到病人眼睛的玻璃體內(nèi)。
最初，隨機(jī)指定至少有一只眼睛視覺受損的8個(gè)受試者接受50μ1含50 IU透明質(zhì)酸酶ACS的BSS或單獨(dú)的BSS(3∶1的比例)的玻璃體內(nèi)注射給藥。跟蹤觀察一個(gè)月以確信能很好耐受后，第二組6個(gè)視覺受損的受試者參與本項(xiàng)試驗(yàn)，并以2∶1的比例隨機(jī)指定加入更高劑量的透明質(zhì)酸酶ACS組(100 IU)或BSS對(duì)照組。
用于評(píng)價(jià)測(cè)試制劑安全性的操作在本項(xiàng)試驗(yàn)過程中的不同時(shí)間間隔完成，并且包括間接檢眼鏡檢查，眼底照相，熒光素血管造影，視網(wǎng)膜電流描記，外部眼檢查，裂隙燈活組織顯微鏡檢查，扁平張力測(cè)量，厚度測(cè)量，和自身屈光檢查。
本項(xiàng)試驗(yàn)包括了同時(shí)進(jìn)行的安慰劑對(duì)照組，這樣可將只與透明質(zhì)酸酶ACS有關(guān)的副作用和載體(BSS)/注射操作所帶來的副作用區(qū)別開。此外，僅對(duì)視覺受損的眼睛進(jìn)行治療，這是因?yàn)闇y(cè)試制劑被注射到鄰近視網(wǎng)膜的部位，并且任何嚴(yán)重的不利反應(yīng)對(duì)視力都可能有危險(xiǎn)。用計(jì)算機(jī)生成的隨機(jī)方案指定病人進(jìn)行治療，對(duì)于試驗(yàn)的第一階段，從601開始編號(hào)，對(duì)于第二階段，從701開始編號(hào)。病人和研究人員都不知道正在進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射的樣本是BSS載體還是透明質(zhì)酸酶ACS/BSS溶液。
建立每一病人的基準(zhǔn)后，給受試者注射酶或?qū)φ瞻参縿?。讓病人坐在舒適的椅子上。將1滴或2滴局部麻醉劑局部滴注到欲治療的眼睛中，然后讓病人向下看，并將蘸有鹽酸丙美卡因眼用溶液的無菌棉簽擦在角膜上面約4-5mm處的鞏膜區(qū)域(上位/1200子午線)敷10秒種。然后將測(cè)試制劑用裝有29號(hào)注射針的200μl微量注射器注射到玻璃體中，其中注射針頭的全部長(zhǎng)度插入施用第二種麻醉劑的部位。結(jié)果雖然僅有很少幾次達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)有效性，但是裂隙燈活組織顯微鏡檢查表明，相對(duì)于僅用BSS治療的病人，用透明質(zhì)酸酶ACS/BSS制劑治療的病人表現(xiàn)出前段病理變化(最突出特征是在前房中存在細(xì)胞和閃光)的比例要高。然而，第6次觀測(cè)(治療后一個(gè)月)后發(fā)現(xiàn)，對(duì)于任一用裂隙燈評(píng)價(jià)的變量，沒有觀測(cè)到任何組間差異。
在一個(gè)用BSS治療的病人和兩個(gè)用50 IU透明質(zhì)酸酶ACS/BSS治療的病人中，通過視網(wǎng)膜電流描記法/視覺激發(fā)性電位測(cè)定的視網(wǎng)膜/皮層反應(yīng)隨時(shí)間變得惡化。然而，視網(wǎng)膜電流描記模型的交替總是雙向的，并且在高劑量(100 IU)透明質(zhì)酸酶ACS/BSS組病人的治療或未治療眼睛中都沒有發(fā)生這種交替現(xiàn)象，而且，在任一無論是治療還是未治療的眼睛中，熒光素血管造影測(cè)試結(jié)果也沒有表明存在視網(wǎng)膜局部缺血。
間接眼檢鏡檢查顯示，在受試者的眼睛中有液化和玻璃體后部脫離(PVD)現(xiàn)象。這些玻璃體的特征是，注射測(cè)試制劑之后很快表現(xiàn)出高度運(yùn)動(dòng)性和/或液化作用，對(duì)于含有透明質(zhì)酸酶ACS的制劑而言，這是所希望的結(jié)果。一些注射BSS的測(cè)試眼睛也出現(xiàn)了液化和PVD現(xiàn)象，這可能是在治療前就已存在了，因?yàn)锽SS不具有任何酶活性，并且注射的體積很小(30μl)。
關(guān)于PVD，在第一組病人中，通過裂隙燈活組織顯微鏡檢查，發(fā)現(xiàn)接受透明質(zhì)酸酶ACS治療的6個(gè)病人中有4個(gè)病人表現(xiàn)出PVD缺乏(即601，602，604和606)(參見下表6)。治療后，這些受試者中每一個(gè)都表現(xiàn)出存在PVD。從第二組病人得到的結(jié)果較不清楚，這是由于難以用裂隙燈顯微鏡法給玻璃體成像所致。
表6用50∶1和100∶1透明質(zhì)酸酶ACS進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射的人安全性試驗(yàn)


從實(shí)施例2的結(jié)果可知，在較早的臨床前試驗(yàn)中，透明質(zhì)酸酶ACS以高達(dá)150 IU的不同劑量注射到兔子眼睛的玻璃體內(nèi)不引起任何顯著的組織病理學(xué)變化，因此預(yù)計(jì)在人中低于150 IU的劑量將會(huì)很好地耐受。與此預(yù)計(jì)相一致的是，在現(xiàn)在的試驗(yàn)中將透明質(zhì)酸酶ACS/BSS注射到視覺受損眼睛的玻璃體內(nèi)產(chǎn)生了少數(shù)癥狀，由于它們?cè)诿恳辉囼?yàn)組中以可比較的頻率發(fā)生，因此相信這些少數(shù)癥狀都是由于注射操作本身所產(chǎn)生的，并且與治療有關(guān)的不利后果相當(dāng)輕且持續(xù)時(shí)間很短。
此外，觀察到在用透明質(zhì)酸酶ACS治療的人眼睛中，玻璃體后部脫離的發(fā)生率增加，在用透明質(zhì)酸酶ACS進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射的病人中所觀察到的PVD的增加表明，本發(fā)明的方法能有效地誘導(dǎo)玻璃體液的液化和脫離。因此，本項(xiàng)試驗(yàn)表明，透明質(zhì)酸酶ACS能注射到人玻璃體內(nèi)而不引起嚴(yán)重或長(zhǎng)期的眼并發(fā)癥。透明質(zhì)酸酶在促進(jìn)出血后的積血從眼睛玻璃體中清除方面的應(yīng)用下述實(shí)施例4描述了透明質(zhì)酸酶ACS用于促進(jìn)出血后的積血從眼睛玻璃體中清除的實(shí)例。在實(shí)施例4中，所用的透明質(zhì)酸酶是表2所示不含硫柳汞的透明質(zhì)酸酶ACS制劑。
實(shí)施例4透明質(zhì)酸酶玻璃體內(nèi)給藥后對(duì)出血清除的促進(jìn)在本項(xiàng)試驗(yàn)中，用透明質(zhì)酸酶ACS以50-200 IU的劑量單次玻璃體內(nèi)注射，來治療6個(gè)呈現(xiàn)玻璃體出血的病人(5個(gè)男性病人，1個(gè)女性病人)。
在本試驗(yàn)中給予的透明質(zhì)酸酶ACS是按照上面表2中所示制劑制得的。
本試驗(yàn)中所有受試病人都有糖尿病性視網(wǎng)膜病史，并被發(fā)現(xiàn)具有持續(xù)了不同時(shí)間的玻璃體出血。在每一病人中，玻璃體內(nèi)存在的血液量都足以妨礙通過標(biāo)準(zhǔn)眼底鏡檢查手段對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行的觀察。
每一病人接受單次的透明質(zhì)酸酶ACS玻璃體內(nèi)注射。4個(gè)病人的注射劑量是50 IU，1個(gè)病人的注射劑量是70 IU，1個(gè)病人的注射劑量是200 IU。
本項(xiàng)試驗(yàn)的觀測(cè)結(jié)果總結(jié)在附圖6中。
在本實(shí)施例接受治療的6個(gè)病人中，單次玻璃體內(nèi)注射透明質(zhì)酸酶ACS后6-16天內(nèi)，出血的玻璃體變得足夠清晰，能進(jìn)行透過玻璃體的視網(wǎng)膜觀測(cè)。玻璃體這種人為的變清比所預(yù)計(jì)的在這些病人中不進(jìn)行透明質(zhì)酸酶治療而自然變清的過程快很多。
需要指出，不象在用高劑量的透明質(zhì)酸酶ACS處理下的兔子中所觀察的熒光素泄漏，在本項(xiàng)以人為基礎(chǔ)的試驗(yàn)中沒有觀察到任何毒性作用。
透明質(zhì)酸酶在治療其它眼科疾病中的應(yīng)用本申請(qǐng)人還觀測(cè)了透明質(zhì)酸酶ACS以試驗(yàn)劑量進(jìn)行玻璃體內(nèi)單次給藥在治療一些眼科疾病中的效力。用透明質(zhì)酸酶ACS治療后，患有以前診斷的眼疾病包括增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變，老年性黃斑變性，弱視，色素性視網(wǎng)膜炎，黃斑裂孔，黃斑滲出(macular exudate)和囊樣黃斑水腫的病人，其這些眼疾病的臨床癥狀表現(xiàn)出改善。
本申請(qǐng)人還已確定，本發(fā)明的透明質(zhì)酸酶ACS制劑能以1 IU以上的劑量玻璃體內(nèi)給藥，而不對(duì)眼睛造成毒性損害，并能使玻璃體迅速液化，同時(shí)使玻璃體與視網(wǎng)膜和其它組織(例如epiretinal膜，黃斑)分開或脫離。玻璃體液化和脫離的結(jié)果是，玻璃體對(duì)視網(wǎng)膜和其它組織的物理拉力被減到最小，玻璃體內(nèi)液體的自然交換速度加快。因此，本申請(qǐng)的透明質(zhì)酸酶ACS制劑特別適于治療許多能受益于玻璃體液化/脫離和/或毒素或其它有害物質(zhì)(例如血管生成因子，水腫液等)從眼睛后房和/或從附著在后房的組織(例如視網(wǎng)膜或黃斑)中加速清除的疾病(例如增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變，與老年性黃斑變性，弱視，色素性視網(wǎng)膜炎，黃斑裂孔，黃斑滲出(macular exudate)和囊樣黃斑水腫)。此外，據(jù)信玻璃體的液化也能移除以聚合玻璃體液形式存在、支持新血管形成所必需的基質(zhì)。因此，本發(fā)明能用于防止或減輕視網(wǎng)膜新血管形成的發(fā)生。
此外，許多眼科疾病的病因是血液-視網(wǎng)膜薄膜的去穩(wěn)定作用。這種去穩(wěn)定作用使脈絡(luò)膜血管層的各種組分(例如血清組分、脂質(zhì)、蛋白)能進(jìn)入玻璃體腔并損害視網(wǎng)膜表面。這種去穩(wěn)定作用也是造成稱為新血管形成的玻璃體腔血管浸潤的初始原因。
因此，本發(fā)明的實(shí)施方案也涉及預(yù)防和治療由視網(wǎng)膜血管化的損傷或病變導(dǎo)致或?qū)ρ?視網(wǎng)膜屏障造成損傷的哺乳動(dòng)物眼睛的各種障礙。這類疾病的實(shí)例包括但不限于增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變，與老年性黃斑變性，弱視，色素性視網(wǎng)膜炎，黃斑裂孔，黃斑滲出(macularexudate)和囊樣黃斑水腫，以及其它其臨床癥狀因本發(fā)明的透明質(zhì)酸酶ACS治療而好轉(zhuǎn)的疾病。
下面是使用上述透明質(zhì)酸酶ACS制劑、使所述眼科疾病改善的應(yīng)用實(shí)施例。此外，本發(fā)明還涉及除透明質(zhì)酸酶ACS之外的酶在誘導(dǎo)玻璃體液化方面的應(yīng)用。其它可用于本發(fā)明的酶的實(shí)例包括其它葡萄糖胺聚糖酶，例如其它透明質(zhì)酸酶制劑，軟骨素酶ABC，軟骨素酶AC，軟骨素酶B，軟骨素4-硫酸酯酶，軟骨素6-硫酸酯酶，和β-葡糖苷酸酶。膠原酶也屬于本發(fā)明所考慮的范圍。此外，蛋白酶也是本申請(qǐng)所考慮的酶。
希望使用除透明質(zhì)酸酶ACS之外的酶來實(shí)施本發(fā)明方法的本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)使用本發(fā)明的指導(dǎo)來選擇合適的酶及其劑量。具體地說，當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，討論酶-底物特異性和非毒性試驗(yàn)的實(shí)施例將用其它酶實(shí)施以確定其有效性。因此，本發(fā)明包含的指導(dǎo)適用于確定能促進(jìn)玻璃體液化而同時(shí)不對(duì)視網(wǎng)膜或眼睛其它組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損害的基本上沒有毒性的酶。
增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病(PDR)的透明質(zhì)酸酶治療在工作年齡的美國人中，糖尿病性視網(wǎng)膜病變是導(dǎo)致失明的首要原因。視網(wǎng)膜病變的發(fā)生率隨患糖尿病的時(shí)間而增加，在患糖尿病7年的糖尿患者中，約50％的患者表現(xiàn)出視網(wǎng)膜病變，而對(duì)于患糖尿病20年以上的糖尿病患者，此比例則增加到約90％。據(jù)估計(jì)約有700000美國人患有PDR。
糖尿病的視網(wǎng)膜血管后果基本上部分由微血管滲漏和由于慢性高血糖的毛細(xì)血管不能灌輸構(gòu)成。微血管滲漏可依次導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫、脂質(zhì)滲出和視網(wǎng)膜內(nèi)出血。毛細(xì)血管不能灌輸導(dǎo)致形成視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常(IRMA)。這些異常是形成的動(dòng)靜脈分支，以灌輸由糖尿病介導(dǎo)的小動(dòng)脈退化導(dǎo)致的喪失血管形成能力的視網(wǎng)膜區(qū)域。
血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在毛細(xì)管不能灌輸區(qū)域從缺氧視網(wǎng)膜中的表達(dá)被認(rèn)為是導(dǎo)致視網(wǎng)膜外新血管形成發(fā)展的原因。這種新血管形成和其有關(guān)的纖維組分可自發(fā)消失或并發(fā)有玻璃體出血或牽引視網(wǎng)膜脫離。在熒光素血管造影術(shù)中，通過從這些新血管中滲漏的大量染料(因?yàn)檫@些新血管沒有和視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)形成緊密的內(nèi)皮連接)可容易地看到新血管形成。在視網(wǎng)膜缺氧區(qū)域的受損軸漿流導(dǎo)致形成棉絮狀滲出點(diǎn)。
由于在早期PDR具有很強(qiáng)的無癥狀特性，因此對(duì)于增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變(PDR)需要仔細(xì)地甄別糖尿病以便盡早確定診和治療。增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變可分成3個(gè)亞型(1)非增生性視網(wǎng)膜病變；(2)前增生性視網(wǎng)膜病變；(3)增生性視網(wǎng)膜病變。每一類都有一些形態(tài)學(xué)特征。非增生性視網(wǎng)膜病變的特征包括毛細(xì)血管微血管病(微血管閉塞和滲透性改變，毛細(xì)血管不能灌輸，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管微動(dòng)脈瘤，基膜增厚，和視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常(IRMA))；視網(wǎng)膜內(nèi)出血；滲出物；和黃斑改變。前增生性視網(wǎng)膜病變具有上述描述非增生性視網(wǎng)膜病變的部分或所有變化以及下述特征嚴(yán)重的靜脈珠化，棉絮狀滲出物，廣泛的IRMA以及廣泛的視網(wǎng)膜局部缺血。增生性視網(wǎng)膜病變的特征是視網(wǎng)膜外新血管形成和纖維組織增生，玻璃體改變和出血，黃斑病，和視網(wǎng)膜脫離。
纖維血管組織的產(chǎn)生是PDR特別重要的并發(fā)癥，因?yàn)槠浣?jīng)常會(huì)導(dǎo)致玻璃體介導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷。纖維血管組織可形成會(huì)與玻璃體后膜形成致密粘著物的視網(wǎng)膜前的膜。這些粘著物將玻璃體牽拉力傳遞給視網(wǎng)膜，從而可導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離。
玻璃體基質(zhì)通常牢固地附著在相鄰的視網(wǎng)膜和稱為Martegiani環(huán)的視神經(jīng)頭的外周緣上。在Martegiani環(huán)和玻璃體基質(zhì)之間所有其它位點(diǎn)上的玻璃體與視網(wǎng)膜的粘著很不牢固。從視網(wǎng)膜中的新血管形成導(dǎo)致形成從神經(jīng)頭或眼底其它部位延伸到玻璃體中的血管束。這些血管束的收縮可導(dǎo)致視網(wǎng)膜部分或全部脫離。
在黃斑處的視網(wǎng)膜脫離是PDR的主要并發(fā)癥。大多數(shù)由PDR導(dǎo)致的視網(wǎng)膜脫離開始時(shí)是沒有裂孔的牽引式脫離，但是在此疾病的后期，視網(wǎng)膜脫離可通過形成視網(wǎng)膜裂孔而變得破裂。牽引式脫離是由異常的玻璃體視網(wǎng)膜粘著或隨后會(huì)導(dǎo)致纖維束皺縮以及視網(wǎng)膜隆凸的玻璃體牽引所致。
本發(fā)明涉及用透明質(zhì)酸酶ACS通過玻璃體內(nèi)注射來治療處于前增生期和增生期的PDR。不限定于特別的機(jī)理，據(jù)信玻璃體內(nèi)注射透明質(zhì)酸酶ACS的作用是促進(jìn)玻璃體液相的清除。通過注射透明質(zhì)酸酶ACS而使得玻璃體內(nèi)透明質(zhì)酸解聚后，玻璃體內(nèi)注射的研制水從玻璃體中轉(zhuǎn)移到脈絡(luò)膜的速度明顯增加。本發(fā)明利用此觀察結(jié)果來液化玻璃體，例如為了促進(jìn)各種生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子和其它由于患有PDR而滲漏到玻璃體內(nèi)的血清產(chǎn)物的清除。本發(fā)明的透明質(zhì)酸酶ACS治療可單獨(dú)進(jìn)行，或與其它PDR治療聯(lián)合進(jìn)行。
實(shí)施例5前增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變的治療在實(shí)施例5中，通過玻璃體內(nèi)注射透明質(zhì)酸酶ACS來治療表現(xiàn)出前增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者的此糖尿病并發(fā)癥。治療的目的是減輕或阻止表征為視網(wǎng)膜外新血管形成和纖維組織增生、玻璃體改變和出血、黃斑病、和視網(wǎng)膜脫離的增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。
一旦病人被診斷出患有糖尿病，就要進(jìn)行增加的眼科監(jiān)視，因?yàn)樵诨加刑悄虿〉幕颊咧?，以后?huì)發(fā)展成增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變(PDR)的比例很高。此增加的眼科監(jiān)視應(yīng)包括周期性視網(wǎng)膜檢查和熒光血管造影術(shù)以監(jiān)視靜脈珠化、IRMA、和視網(wǎng)膜局部缺血的程度。
當(dāng)前增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變開始達(dá)到增生性階段時(shí)，即開始透明質(zhì)酸酶ACS治療。此階段定義為，在2個(gè)或2個(gè)以上象限中存在靜脈珠化現(xiàn)象、在1個(gè)或1個(gè)以上象限中存在IRMA、和/或微動(dòng)脈瘤以及在所有象限中有出血圓點(diǎn)。一旦存在這些標(biāo)記，就開始進(jìn)行本發(fā)明的透明質(zhì)酸酶ACS療法。
給患者進(jìn)行全面的眼科檢查以確定眼健康狀況的基礎(chǔ)。眼科檢查包括間接檢眼鏡檢查，裂隙燈活組織顯微鏡檢查，視網(wǎng)膜周圍檢查，眼內(nèi)壓測(cè)量，視敏度(肉眼及最佳校正)癥狀學(xué)檢查，眼底照相，熒光素血管造影，視網(wǎng)膜電流描記和A-掃描檢測(cè)。
初步檢查之后，將透明質(zhì)酸酶ACS注射到病人患病眼睛的玻璃體內(nèi)。如果兩只眼睛都患有PDR，將它們單獨(dú)治療。將50∶1的50 IU上述透明質(zhì)酸酶ACS眼用溶液注射到欲治療眼睛的玻璃體內(nèi)，以促進(jìn)玻璃體中透明質(zhì)酸的解聚，使玻璃體液化。
治療后，在第1、2、7、15、30和60天檢查患者的眼睛。每次檢查都檢查病人的玻璃體液化情況。此外，用帶有鞏膜凹的檢眼鏡間接檢查病人玻璃體后脫離。最后，通過定期視網(wǎng)膜檢查和熒光素血管造影術(shù)連續(xù)監(jiān)視患者PDR的程度，以檢查靜脈珠化、IRMA和視網(wǎng)膜局部缺血的程度。
實(shí)施例6增生性視網(wǎng)膜病變的治療在本實(shí)施例中，通過玻璃體內(nèi)注射透明質(zhì)酸酶ACS來治療表現(xiàn)出增生性視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者。治療的目的是減輕增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變的程度，預(yù)防除去視網(wǎng)膜外新血管化組織后疾病的復(fù)發(fā)，以及減少視網(wǎng)膜脫離的可能性。
呈現(xiàn)增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變的患者接受本發(fā)明的透明質(zhì)酸酶ACS治療和除去新血管化組織手術(shù)的聯(lián)合治療。增生通常從形成具有很少纖維組織成分的新血管開始。增生是由分化到血管內(nèi)皮細(xì)胞中的原間質(zhì)成分產(chǎn)生的。然后此新形成的血管發(fā)生纖維化生，即成血管細(xì)胞芽轉(zhuǎn)化為纖維組織。
新血管會(huì)滲漏熒光素，因此在血管造影期間，增生部分特別顯著。新血管和纖維組織穿過內(nèi)界膜，并在內(nèi)界膜和玻璃體后膜之間的界面上形成樹枝狀分枝。纖維血管組織可形成能與玻璃體后膜形成緊密粘著物的視網(wǎng)膜前的膜。這些粘著物非常重要，因?yàn)樵诓Ａw皺縮后期，它們將玻璃體牽拉力傳遞給視網(wǎng)膜。
PDR的增生性階段定義為呈現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上下述特征新血管，在視神經(jīng)一個(gè)圓盤直徑上或內(nèi)出現(xiàn)新血管，很多新血管(定義為在視神經(jīng)上有三分之一圓盤面積新血管化或視神經(jīng)上有二分之一圓盤面積新血管化或在別處有二分之一圓盤面積新血管化)，和視網(wǎng)膜前出血或玻璃體出血。
一旦確診進(jìn)入了增生階段，給患者進(jìn)行全面的眼科檢查以確定眼健康的基準(zhǔn)。眼科檢查包括間接檢眼鏡檢查，裂隙燈活組織顯微鏡檢查，視網(wǎng)膜周圍檢查，眼內(nèi)壓測(cè)量，視敏度(肉眼及最佳校正)癥狀學(xué)檢查，眼底照相，熒光素血管造影，視網(wǎng)膜電流描記和A-掃描檢測(cè)。
初步檢查之后，將透明質(zhì)酸酶ACS注射到病人患病眼睛的玻璃體內(nèi)。如果兩只眼睛都患有PDR，將它們單獨(dú)治療。將50∶1的50 IU上述透明質(zhì)酸酶ACS眼用溶液注射到欲治療眼睛的玻璃體內(nèi)，以促進(jìn)玻璃體中透明質(zhì)酸的解聚，使玻璃體液化。除了使玻璃體解聚外，也用全視網(wǎng)膜光凝固法直接治療新血管化組織以將對(duì)視網(wǎng)膜的損害作用減至最小。
全視網(wǎng)膜光凝固法(PRP)可與本發(fā)明透明質(zhì)酸酶ACS治療聯(lián)合使用來治療患有PDR的患者。全視網(wǎng)膜光致凝固法是一種激光光凝固法。激光例如氬綠激光(614nm)、氬藍(lán)綠激光(488和514nm)、氪紅激光(647nm)、可調(diào)染料激光、二極管激光和氙弧激光通常被用于視網(wǎng)膜手術(shù)。激光能量主要被含有對(duì)相鄰結(jié)構(gòu)產(chǎn)生熱效應(yīng)的色素(黑色素、葉黃素、或血色素)的組織吸收。氪紅激光是優(yōu)選的療法，因?yàn)榕c氬激光相比，氪紅激光能更好地穿透中心鞏膜內(nèi)障和玻璃體出血，而對(duì)于氬激光，若要達(dá)到與氪紅激光相同水平的穿透，就需要更多能量。
激光視網(wǎng)膜手術(shù)中所用的參數(shù)可根據(jù)光凝固法的目標(biāo)進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)在較低功率設(shè)置，治療持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，并且產(chǎn)生較大光點(diǎn)時(shí)，激光對(duì)小血管具有凝結(jié)作用。聚焦激光光凝固法用在糖尿病患者中以阻止微動(dòng)脈瘤滲漏。激光光點(diǎn)直接照在微動(dòng)脈瘤上，以使動(dòng)脈瘤輕微變白和關(guān)閉。當(dāng)以柵格形式照在視網(wǎng)膜水腫區(qū)域時(shí)，激光可減輕微動(dòng)脈瘤滲漏。在較高能量水平時(shí)，組織的激光切除是可能的。全視網(wǎng)膜光凝固法被認(rèn)為是通過破壞視網(wǎng)膜組織、減少眼睛局部缺血組織的數(shù)量來有效地發(fā)揮作用的。匯合的激光光點(diǎn)可用在新血管膜上來除去異常血管。
需要知道，本發(fā)明不需要特定的治療順序。在一個(gè)實(shí)施方案中，患者先用透明質(zhì)酸酶ACS治療，然后進(jìn)行激光治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，患者先進(jìn)行激光治療，然后進(jìn)行本發(fā)明的透明質(zhì)酸酶ACS治療。
治療后，在第1、2、7、15、30和60天檢測(cè)患者的眼睛。每一次檢測(cè)都檢查病人的玻璃體液化情況。另外，還用帶有鞏膜凹的間接檢眼鏡檢查病人玻璃體后脫離。最后，通過定期視網(wǎng)膜檢查和熒光素血管造影術(shù)連續(xù)監(jiān)視患者PDR的程度，以檢查靜脈珠化、IRMA、視網(wǎng)膜局部缺血、新血管化、以及玻璃體出血的程度。如果發(fā)現(xiàn)玻璃體出現(xiàn)新的聚合或解聚不完全，則允許重復(fù)進(jìn)行上述治療。
老年性黃斑退行變性的透明質(zhì)酸酶治療本發(fā)明還涉及透明質(zhì)酸酶ACS在與老年性黃斑退行變性(AMD)的治療中的應(yīng)用。老年性黃斑退行變性是逐漸的、并且經(jīng)常是兩側(cè)的視覺下降。它是導(dǎo)致成人正常失明的最常見原因。它可能是由于脈絡(luò)膜血管層或視網(wǎng)膜傳入血管老化和血管病所致。AMD基本上有兩種形態(tài)類型“干”型和“濕”型。
AMD的病因性異常是，在布魯赫膜和視網(wǎng)膜色素上皮水平(RPE)發(fā)生退化性變化。這種變化的標(biāo)志性損害是脈絡(luò)膜小疣。脈絡(luò)膜小疣在臨床上表現(xiàn)為RPE水平小的、黃白色沉著物。脈絡(luò)膜小疣可分為硬、軟或基底層狀的脈絡(luò)膜小疣。
本發(fā)明涉及濕型和干燥型AMD的治療和預(yù)防。在濕型AMD中，認(rèn)為病變累及脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層。脈絡(luò)膜血管層是脈絡(luò)膜的組成部分，其作用是使眼球血管化。脈絡(luò)膜血管層由給色素上皮提供大多數(shù)營養(yǎng)的豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)和視網(wǎng)膜外層構(gòu)成。脈絡(luò)膜血管層的損傷會(huì)最終導(dǎo)致新血管并發(fā)癥，這是黃斑變性的原因。
在干燥型AMD中，非盤狀黃斑變性是由于下面的脈絡(luò)膜血管層部分或完全閉塞所致。通過檢眼鏡可觀察到視網(wǎng)膜色素上皮層變性和形成裂孔。也可以觀察到色素上皮層下面的沉著物例如鈣螯合物或protinaesous等。在干燥型ADM中，通常會(huì)逐漸發(fā)生繼發(fā)性視網(wǎng)膜變化，導(dǎo)致視敏度逐漸下降。此外，在一部分患者中，會(huì)導(dǎo)致視覺的嚴(yán)重?fù)p失。
本發(fā)明涉及通過液化玻璃體來治療干燥型ADM和防止黃斑變性。據(jù)考慮，玻璃體的液化會(huì)增加將以后會(huì)導(dǎo)致黃斑變性的沉著物從視網(wǎng)膜中清除出去的速度。
濕型ADM主要是由于隨后會(huì)導(dǎo)致色素上皮層下新血管化的脈絡(luò)膜血管層不足造成的。新血管化也被認(rèn)為是為適應(yīng)由于囊狀損傷而致氧合作用不充分而產(chǎn)生視網(wǎng)膜血管化的結(jié)果。新血管化也會(huì)導(dǎo)致幾種其它疾病，例如色素上皮層和視網(wǎng)膜感覺區(qū)的脫離。這種疾病一般在60歲以后發(fā)生，男女的發(fā)病率相等，并且通常患者的兩側(cè)都表現(xiàn)出這種疾病。
大概老年性黃斑退行變性最重要的并發(fā)癥是眼球的布魯赫氏膜缺陷，新血管是由此層而生長(zhǎng)的。上皮層新血管化可導(dǎo)致在視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜下產(chǎn)生滲透性沉積物。新血管化也可導(dǎo)致出血進(jìn)入玻璃體，這可導(dǎo)致視網(wǎng)膜桿和圓錐變性，以及囊樣黃斑水腫(下面將要討論)?；蛐纬蓵?huì)導(dǎo)致不可逆視覺損失的黃斑裂孔。
雖然在患有AMD的患者中，發(fā)生AMD的新血管并發(fā)癥的比例僅有10％，但是AMD的新血管并發(fā)癥是導(dǎo)致視覺嚴(yán)重?fù)p失的最主要原因。危險(xiǎn)因素包括年齡增長(zhǎng)，軟脈絡(luò)膜小疣，非區(qū)域性萎縮，家族病史，遠(yuǎn)視，和視網(wǎng)膜色素上皮層脫離。AMD的脈絡(luò)膜新血管化的癥狀包括視物變形癥，旁中央盲點(diǎn)或中央視覺減弱。檢眼鏡發(fā)現(xiàn)包括視網(wǎng)膜下液體，血液，滲出物，RPE脫離，視網(wǎng)膜囊狀變化，或存在淺灰綠色視網(wǎng)膜下新血管膜。熒光素血管造影術(shù)通常是有效的診斷方法。在此診斷過程中，看上去是損傷邊緣模糊的視網(wǎng)膜下染料的進(jìn)行性淤積，或染料從未確定來源的滲漏是此疾病的標(biāo)志。通過熒光素血管造影術(shù)所顯示的脈絡(luò)膜新血管膜的其它部分包括，高阻塞的熒光素，弱堵塞的熒光素，血液，和盤狀瘢痕。
目前對(duì)新血管AMD的理解使我們知道，典型的脈絡(luò)膜新血管化是與視覺迅速衰退最有關(guān)的損傷。因此，AMD的治療必須覆蓋損傷部分的所有新血管和纖維血管。目前，只有當(dāng)?shù)湫偷男卵芑哂忻黠@的分界邊緣時(shí)，才進(jìn)行治療，并且光凝固法已顯示出很好的治療效果。
在脈絡(luò)膜中央凹外發(fā)生新血管化(距離中夾凹＞＝200微米)的眼睛中，氬激光光凝固法能使5年內(nèi)嚴(yán)重視覺損失的發(fā)生率由64％減至46％($6條線)。在治療后的第一年，用激光治療過的眼睛通常有一半會(huì)復(fù)發(fā)新血管化。復(fù)發(fā)的新血管化始終與嚴(yán)重視覺損失的發(fā)生有關(guān)。
在脈絡(luò)膜近中央凹處發(fā)生新血管化(距離中夾凹1-199微米)的眼睛中，氬激光光凝固法能使1年內(nèi)嚴(yán)重視覺損失的發(fā)生率由45％減至31％，雖然在5年內(nèi)，未治療組和治療組的差異并不明顯。
激光治療仍然是治療AMD的基本療法，然而，本發(fā)明可通過降低新血管化的復(fù)發(fā)率來增強(qiáng)此方法的效力。
實(shí)施例7與老年性黃斑退行變性的治療在本實(shí)施例中，通過玻璃體內(nèi)注射透明質(zhì)酸酶ACS來治療患有與老年性黃斑退行變性的患者。此治療的目的是減輕或阻止新血管化、黃斑病、和視網(wǎng)膜損傷的發(fā)生。
一旦患者達(dá)到60歲，就進(jìn)行加強(qiáng)的眼科檢查，以檢測(cè)是否發(fā)生ADM。加強(qiáng)的眼科檢查包括周期性視網(wǎng)膜檢查和熒光素血管造影術(shù)以檢測(cè)是否存在視網(wǎng)膜下液體、血液、滲出物、RPE脫離、囊狀視網(wǎng)膜變化，或是否存在淺灰綠色視網(wǎng)膜下新血管膜。
當(dāng)診斷出ADM時(shí)，就進(jìn)行與或不與其它治療如光凝固法聯(lián)合進(jìn)行的透明質(zhì)酸酶ACS治療。在治療的第一階段，給患者進(jìn)行全面的眼科檢查以確定眼健康狀況的基基礎(chǔ)。眼科檢查包括間接檢眼鏡檢查，裂隙燈活組織顯微鏡檢查，視網(wǎng)膜周圍檢查，眼內(nèi)壓測(cè)量，視敏度(未校正及最佳校正)癥狀檢查，眼底照相，熒光素血管造影，視網(wǎng)膜電流描記和A-掃描檢測(cè)。
預(yù)檢查之后，將透明質(zhì)酸酶ACS注射到病人患有ADM的眼睛的玻璃體內(nèi)。如果兩只眼睛都患有ADM，它們可以分別治療。將50∶1的50IU透明質(zhì)酸酶ACS眼用溶液(上述)注射到患ADM眼睛的玻璃體內(nèi)，以促進(jìn)玻璃體內(nèi)透明質(zhì)酸的解聚，從而使玻璃體液化。
注射過透明質(zhì)酸酶ACS的眼睛可能也需要激光光凝固法治療。在實(shí)施例5和6中描述的此激光治療方案應(yīng)當(dāng)在用透明質(zhì)酸酶治療AMD之后進(jìn)行。在另一實(shí)施方案中，光凝固法治療在進(jìn)行本發(fā)明的酶治療之前進(jìn)行。
治療后，在第1、2、7、15、30和60天檢查患者的眼睛。因?yàn)橛袕?fù)發(fā)的可能性，所以此后病人每1個(gè)月要回來進(jìn)行一次定期檢查。每一次檢查都檢測(cè)玻璃體的液化情況。此外，用帶有鞏膜凹的檢眼鏡間接檢查病人玻璃體后脫離。最后，通過定期視網(wǎng)膜檢查和熒光血管造影連繼續(xù)監(jiān)測(cè)患者視網(wǎng)膜下液體、血液、滲出物、RPE脫離、囊狀視網(wǎng)膜變化，或淺灰綠色視網(wǎng)膜下新血管膜的存在情況。如果有證據(jù)表明或發(fā)現(xiàn)新血管化復(fù)發(fā)，可能還需要再進(jìn)行透明質(zhì)酸酶ACS和/或激光治療。
下述實(shí)施例證實(shí)了甚至不用光凝固法，本發(fā)明的效力。
實(shí)施例8玻璃體內(nèi)注射透明質(zhì)酸酶后黃斑變性癥狀的改善一個(gè)具有老年性黃斑退行變性病史的年齡在79歲以上的男性患者，其右眼未校正視力是20∶400。將100 IU劑量的透明質(zhì)酸酶ACS一次注射到患者右眼玻璃體內(nèi)。左眼不進(jìn)行治療。
給藥后反復(fù)檢查患者的視力，其左眼(未治療)的視力保持不變，而觀察到右眼(治療)的視力有如下改善

*cf表示“指算”在此項(xiàng)試驗(yàn)中未觀察到透明質(zhì)酸酶ACS的任何副作用。
弱視的透明質(zhì)酸酶治療術(shù)語弱視衍生自希臘語，其表示視覺遲鈍(amblys＝遲鈍，ops＝眼睛)。弱視是由于腦的視覺區(qū)域發(fā)育異常所致，而腦的視覺區(qū)域發(fā)育異常又是由于在早期的視覺發(fā)育期間，異常的視覺刺激所致。與弱視有關(guān)的病理并不特定地限于眼睛，而且，其位于包括外側(cè)膝狀核和紋狀體皮層在內(nèi)的腦的視覺區(qū)域。此發(fā)育異常是由3個(gè)機(jī)制導(dǎo)致的(1)稱為圖像失真的模糊的視網(wǎng)膜視像；(2)皮層抑制；或(3)皮層抑制加圖像失真。本發(fā)明主要涉及由介質(zhì)渾濁引起的圖像失真。更具體地說，本發(fā)明是針對(duì)玻璃體渾濁的組織。
弱視通常定義為至少有兩條不同的視敏度斯內(nèi)倫氏線。早期檢查和早期治療對(duì)于弱視的治療很關(guān)鍵。對(duì)于治療由玻璃體渾濁引起的弱視，策略是通過改變玻璃體的渾濁來提供清晰的視網(wǎng)膜視像，這樣就產(chǎn)生了清晰的視覺。
在本實(shí)施例中，通過玻璃體內(nèi)注射透明質(zhì)酸酶ACS來治療由玻璃體渾濁導(dǎo)致弱視的患者。治療的目的是通過加快玻璃體內(nèi)液體的交換速度來減輕玻璃體渾濁。
實(shí)施例9透明質(zhì)酸酶ACS的玻璃體內(nèi)給藥治療后弱視癥狀的改善一個(gè)具有弱視病史、年齡為40歲的女性患者，其右眼的未校正視力為20∶400，左眼的未校正視力為20∶200。將100 IU劑量的透明質(zhì)酸酶ACS一次注射到患者右眼玻璃體內(nèi)。左眼不進(jìn)行治療。
給藥后反復(fù)檢查患者的視力，其左眼(未治療)的視力保持不變，而觀察到右眼(治療)的視力有如下改善

在此患者中未觀察到透明質(zhì)酸酶ACS的任何副作用。
色素性視網(wǎng)膜炎的透明質(zhì)酸酶治療色素性視網(wǎng)膜炎(RP)是指一些可遺傳的進(jìn)行性視網(wǎng)膜變性，其特征是雙側(cè)夜盲縮小的視野和視網(wǎng)膜電流圖異常。早期癥狀包括暗適應(yīng)困難以及視網(wǎng)膜赤道部視野缺損。隨著疾病進(jìn)展，視野缺損加重，一般只剩下一小塊視野，直到最終甚至累及中央視野。在此疾病早期，由于囊樣黃斑水腫，黃斑萎縮，或發(fā)生后囊下白內(nèi)障，中央視敏度可能也會(huì)受到影響。RP代表其致病機(jī)理通常是在對(duì)光傳導(dǎo)起關(guān)鍵作用的光受體外側(cè)部分生成至少一種異常蛋白的多種疾病。
RP的臨床后果之一是中央凹外周毛細(xì)血管和視神經(jīng)頭的血-視網(wǎng)膜屏障不穩(wěn)定。通過血管造影術(shù)，可觀察到這種不穩(wěn)定會(huì)導(dǎo)致熒光素染料滲漏。除了滲漏以外，也可能發(fā)生并可觀察到液體如微囊在叢狀層外的積聚。這些充滿液體的微囊可最終破裂，導(dǎo)致視網(wǎng)膜層受損傷。本發(fā)明涉及，通過促進(jìn)積聚在微囊中的組織液的清除來治療與視網(wǎng)膜損傷有關(guān)的RP。
實(shí)施例10透明質(zhì)酸酶玻璃體內(nèi)給藥后色素性視網(wǎng)膜炎癥狀的改善具有色素性視網(wǎng)膜炎病史、年齡為59歲的男性患者，其左眼的未校正視力為20∶400，并且校正后的視力也為20∶400。將100 IU劑量的透明質(zhì)酸酶ACS一次注射到患者左眼玻璃體內(nèi)。右眼不進(jìn)行治療。
透明質(zhì)酸酶ACS給藥后反復(fù)檢查患者的視力，其右眼(未治療)的視力保持不變，而觀察到左眼(治療)的視力有如下改善

+HM表示“手運(yùn)動(dòng)”≠cf表示“指算”試驗(yàn)結(jié)果表明，無論對(duì)于未校正視敏度(從20∶400改善到20∶80)，還是對(duì)于最佳校正視敏度(從20∶400改善到20∶40)，受試者的視力都有顯著改善。而且，雖然在治療期間觀察到眼內(nèi)壓發(fā)生改變，但是注射約2星期后，眼內(nèi)壓看上去恢復(fù)到基準(zhǔn)水平。雖然這是從一個(gè)患者中獲得的結(jié)果，但是這些結(jié)果看上去能足以保證進(jìn)一步研究。
黃斑裂孔的透明質(zhì)酸酶治療黃斑的破裂或爆裂性打開稱為黃斑裂孔。有趣的是，這種適應(yīng)癥通常在60歲-80歲的女性中發(fā)生，或在創(chuàng)傷如照亮損傷、日光損傷、鞏膜拱起后發(fā)生，或在患有葡萄腫的眼睛中發(fā)生。癥狀包括視物變形和視敏度下降。
據(jù)認(rèn)為，黃斑裂孔形成是由于玻璃體后皮層發(fā)生玻璃體后脫水收縮腔內(nèi)液體流動(dòng)誘使的穿過視網(wǎng)膜表面的正切牽引所致。在絕大多數(shù)黃斑裂孔患者中存在玻璃體后脫水收縮腔。據(jù)認(rèn)為，當(dāng)玻璃體后凝膠從視網(wǎng)膜表面回縮時(shí)，在兩個(gè)表面間形成的間隙會(huì)產(chǎn)生其中玻璃體液的運(yùn)動(dòng)可與視網(wǎng)膜表面進(jìn)行負(fù)性相互作用的區(qū)域。玻璃體液在玻璃體后脫水收縮腔內(nèi)的正切運(yùn)動(dòng)被認(rèn)為會(huì)促使視網(wǎng)膜破裂，導(dǎo)致產(chǎn)生黃斑裂孔。
本發(fā)明涉及用透明質(zhì)酸酶ACS解聚玻璃體以消除導(dǎo)致黃斑裂孔形成的病理狀態(tài)。通過解聚玻璃體，透明質(zhì)酸酶ACS介導(dǎo)的玻璃體再生的結(jié)果是，玻璃體后脫水收縮腔被消除。玻璃體后脫水收縮腔的消除使得視網(wǎng)膜和玻璃體之間的液體能自由流動(dòng)到玻璃體腔中，分散掉否則就已經(jīng)直接作用到視網(wǎng)膜表面上的任何有害壓力。
下述實(shí)施例討論表現(xiàn)出黃斑孔形成早期癥狀的患者的治療。
實(shí)施例11黃斑裂孔的治療通過玻璃體內(nèi)注射透明質(zhì)酸酶ACS治療表現(xiàn)出黃斑裂孔形成早期癥狀的患者。接受治療的患者表現(xiàn)出黃斑孔形成的各種癥狀。癥狀包括與黃色中央點(diǎn)或環(huán)有關(guān)的中央凹缺損。在黃斑裂孔形成區(qū)域，凹已經(jīng)開始變薄，并且損傷區(qū)域表現(xiàn)出微紅外形。在此階段的熒光素血管造影術(shù)可顯得正常，或呈現(xiàn)微弱的熒光素過度。出現(xiàn)偏心全層開裂表明此疾病正處于早期階段。觀察到這些癥狀時(shí)，開始透明質(zhì)酸酶ACS治療。
當(dāng)確診黃斑裂孔形成時(shí)，開始進(jìn)行本發(fā)明的透明質(zhì)酸酶ACS治療。對(duì)患者進(jìn)行全面的眼科檢查，以確定眼睛健康狀況的基準(zhǔn)。眼科檢查包括間接檢眼鏡檢查，裂隙燈活組織顯微鏡檢查，視網(wǎng)膜周圍檢查，眼內(nèi)壓測(cè)量，視敏度(未校正及最佳校正)癥狀檢查，眼底照相，熒光素血管造影，視網(wǎng)膜電流描記和A-掃描檢測(cè)。
預(yù)檢查之后，將透明質(zhì)酸酶ACS注射到病人患病眼睛的玻璃體內(nèi)。如果兩只眼睛都患有黃斑裂孔，它們可以分別治療。將50∶1的50 IU透明質(zhì)酸酶ACS眼用溶液(上述)注射到欲治療眼睛的玻璃體內(nèi)，以促進(jìn)玻璃體內(nèi)透明質(zhì)酸的解聚，從而使玻璃體液化。
治療后，在第1、2、7、15、30和60天檢查患者的眼睛。每一次檢查都檢測(cè)玻璃體的液化情況。也進(jìn)行對(duì)于監(jiān)視治療過程特別有效的熒光血管造影術(shù)。此外，用帶有鞏膜凹的檢眼鏡間接檢查病人玻璃體后脫離。
黃斑滲出的透明質(zhì)酸酶治療黃斑滲出物是能穿透血-視網(wǎng)膜屏障并且透過黃斑滲入玻璃體腔的物質(zhì)。有兩種滲出物，即軟滲出物和硬滲出物。軟滲出物實(shí)際上不是滲出物，而是在神經(jīng)纖維層內(nèi)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突簇，它們已經(jīng)在局部缺血性損傷或梗塞位點(diǎn)上發(fā)生了球狀擴(kuò)張。硬滲出物通常是基底視網(wǎng)膜病微血管變化所致的滲出物。硬滲出物呈黃色和蠟狀，并且經(jīng)常以環(huán)狀形式沉積在黃斑周圍。硬滲出物由衍生自血管滲漏的血清組分滲出物或衍生自視網(wǎng)膜內(nèi)變性神經(jīng)成份的脂質(zhì)產(chǎn)物的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)類物質(zhì)構(gòu)成。硬滲出物的吸附作用主要由巨噬細(xì)胞吸收作用介導(dǎo)，然而，由于滲出經(jīng)常發(fā)生在視網(wǎng)膜元血管區(qū)域的外叢狀層，所以這一吸附過程可能很慢。本發(fā)明尤其能用于減輕由于視網(wǎng)膜不穩(wěn)定導(dǎo)致的滲出性積聚的程度，因?yàn)橥该髻|(zhì)酸酶ACS能解聚玻璃體，從而使玻璃體水組分的交換速度增加。
實(shí)施例12黃斑滲出的治療用本發(fā)明的透明質(zhì)酸酶ACS注射法治療表現(xiàn)出黃斑滲出的患者。對(duì)患者進(jìn)行全面的眼科檢查，以確定眼睛健康狀況的基準(zhǔn)。眼科檢查包括間接檢眼鏡檢查，裂隙燈活組織顯微鏡檢查，視網(wǎng)膜周圍檢查，眼內(nèi)壓測(cè)量，視敏度(未校正及最佳校正)癥狀檢查，眼底照相，熒光血管造影，視網(wǎng)膜電流描記和A-掃描檢測(cè)。
預(yù)檢查之后，將透明質(zhì)酸酶ACS注射到病人患病眼睛的玻璃體內(nèi)。如果兩只眼睛都患有黃斑滲出，它們可以分別治療。將50∶1的50 IU透明質(zhì)酸酶ACS眼用溶液(上述)注射到預(yù)治療的眼睛的玻璃體內(nèi)，以促進(jìn)玻璃體內(nèi)透明質(zhì)酸的解聚，從而使玻璃體液化。
治療后，在第1、2、7、15、30和60天檢查患者的眼睛。每一次檢查都檢測(cè)玻璃體的液化情況。也進(jìn)行對(duì)于監(jiān)視治療過程特別有效的熒光素血管造影術(shù)。此外，用帶有鞏膜凹的檢眼鏡間接檢查病人玻璃體后脫離。
囊狀黃斑水腫的治療囊狀黃斑水腫是由不同病因?qū)е碌某Ｒ姷难劬Ξ惓！＿@種病理狀態(tài)主要是由于中央凹外周毛細(xì)血管和視神經(jīng)頭的血-視網(wǎng)膜屏障發(fā)生障礙，使液體滲漏，積聚在外叢狀層的微囊中所致。該區(qū)域相對(duì)較薄并位于視網(wǎng)膜血管化區(qū)域下面。當(dāng)進(jìn)行熒光素血管造影術(shù)檢查時(shí)，囊狀黃斑水腫在臨床上產(chǎn)生蜂窩式外形。水腫惡化時(shí)，外叢狀層可能會(huì)破裂，產(chǎn)生層狀裂孔。形成的裂孔可延伸到視網(wǎng)膜內(nèi)層，或最終可形成完全的黃斑裂孔。
本發(fā)明涉及通過透明質(zhì)酸酶ACS介導(dǎo)玻璃體解聚，來治療囊狀黃斑水腫以及防止黃斑裂孔形成。
實(shí)施例13囊狀黃斑水腫的治療按照實(shí)施例11和12的方法，通過玻璃體內(nèi)注射透明質(zhì)酸酶ACS來治療表現(xiàn)出囊狀黃斑水腫癥狀的患者。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，上面只是用一些優(yōu)選的實(shí)施方案和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，并沒有對(duì)本發(fā)明可采取或被實(shí)施的所有實(shí)施方案進(jìn)行詳盡的描述。實(shí)際上，在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前體下，可對(duì)上述具體的實(shí)施方案和實(shí)施例作各種變化。因此，對(duì)上述實(shí)施方案和實(shí)施例所作的所有合理修改都應(yīng)當(dāng)包括在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.誘使玻璃體液液化以治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物眼睛疾病的方法，包括如下步驟將一定量的能有效地液化所述玻璃體液，從而使所述疾病被治療或預(yù)防，而同時(shí)不對(duì)所述哺乳動(dòng)物眼睛產(chǎn)生毒性損害的透明質(zhì)酸酶與所述哺乳動(dòng)物眼睛的所述玻璃體液進(jìn)行接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法是為了治療增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病變而實(shí)施的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法是為了治療老年性黃斑退行變性而實(shí)施的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法是為了治療弱視而實(shí)施的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法是為了治療色素性視網(wǎng)膜炎而實(shí)施的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法是為了治療黃斑裂孔而實(shí)施的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法是為了治療黃斑滲出而實(shí)施的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法是為了治療囊狀黃斑水腫而實(shí)施的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述透明質(zhì)酸酶是水溶液，并且所述酶與玻璃體液接觸的步驟包括將所述液體溶液注射到玻璃體液內(nèi)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述透明質(zhì)酸酶在不存在硫柳汞的情況下與玻璃體液接觸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述透明質(zhì)酸酶以5-200國際單位的劑量與玻璃體液接觸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述透明質(zhì)酸酶以1國際單位的劑量與玻璃體液接觸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述透明質(zhì)酸酶是以多次劑量的形式給藥。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中單次玻璃體內(nèi)注射的注射體積低于100∶1。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過10％SDS PAGE電泳測(cè)定時(shí)分子量在約100000以上的所述透明質(zhì)酸酶不具有透明質(zhì)酸分解活性。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過10％SDS PAGE電泳測(cè)定時(shí)分子量在約60000-100000之間的所述透明質(zhì)酸酶不具有明膠分解活性。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過10％SDS PAGE電泳測(cè)定時(shí)分子量在約45000以上的所述透明質(zhì)酸酶不具有酪蛋白分解活性。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述透明質(zhì)酸酶不包含通過4-20％SDS PAGE電泳測(cè)定時(shí)分子量在約100000以上的透明質(zhì)酸酶。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述透明質(zhì)酸酶不包含通過4-20％SDS PAGE電泳測(cè)定時(shí)分子量在約50000-60000之間的透明質(zhì)酸酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述透明質(zhì)酸酶不包含通過4-20％SDS PAGE電泳測(cè)定時(shí)分子量在約20000以下的透明質(zhì)酸酶。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述透明質(zhì)酸酶被制備成不含有硫柳汞的注射液，注射液具有如下配方高達(dá)8000 IU的所述透明質(zhì)酸酶；5.0-130.0mg的乳糖；和0.01-100.0mmol的磷酸鹽。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述透明質(zhì)酸酶被制備成不含有硫柳汞的注射液，注射液含有如下配方6500 IU的所述透明質(zhì)酸酶；5.0mg的乳糖；和0.02mmol的磷酸鹽。
23.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述透明質(zhì)酸酶被制備成不含有硫柳汞的注射液，注射液具有如下配方500-1000 IU的所述透明質(zhì)酸酶；5.0-10.0mg的乳糖；和0.01-10.0mmol的磷酸鹽。
24.治療哺乳動(dòng)物眼睛疾病的方法，包括如下步驟將一定量的能有效治療所述疾病并不對(duì)所述哺乳動(dòng)物眼睛眼睛造成毒性損害的透明質(zhì)酸酶與所述哺乳動(dòng)物眼睛的玻璃體液接觸。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述玻璃體液沒有出血性積血從而能容許觀察所述哺乳動(dòng)物眼睛的視網(wǎng)膜。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述接觸步驟是在不進(jìn)行玻璃體切除術(shù)的情況下進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療哺乳動(dòng)物眼睛疾病的酶方法。通過將一定量的能有效液化被治療眼睛的玻璃體體液并不對(duì)所述哺乳動(dòng)物眼睛造成毒性損害的透明質(zhì)酸酶給藥,能防止新血管化和提高將對(duì)視網(wǎng)膜有毒性的物質(zhì)從玻璃體中清除出去的速度。玻璃體液的液化提高了液體從玻璃體腔中交換的速度。交換速度的增加使得會(huì)引起眼睛和視網(wǎng)膜損傷的物質(zhì)和病理狀態(tài)被清除。
文檔編號(hào)A61K9/08GK1257430SQ98805342
公開日2000年6月21日 申請(qǐng)日期1998年5月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月22日
發(fā)明者H·L·卡拉格奧茲安, V·H·卡拉格奧茲安, M·C·肯尼, J·L·G·弗洛雷斯, G·A·C·阿拉貢, A·B·內(nèi)斯布恩 申請(qǐng)人:先進(jìn)角膜系統(tǒng)公司