專利名稱：Ob受體及診斷和治療體重疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼Ob受體(ObR)-一種參與哺乳動(dòng)物體重調(diào)節(jié)的受體蛋白-的核苷酸的發(fā)現(xiàn)、識(shí)別和鑒定。本發(fā)明包括obR核苷酸，宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，ObR蛋白，融合蛋白，多肽和肽，所述受體的抗體，能表達(dá)obR轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或不能表達(dá)ObR的重組失效動(dòng)物，所述受體的拮抗劑和激動(dòng)劑，以及能調(diào)節(jié)obR基因表達(dá)或ObR活性的其它化合物，可將上述化合物用于體重疾病的診斷、藥物篩選、臨床試驗(yàn)監(jiān)測(cè)和/或治療，所述體重疾病包括，但不限于肥胖、惡病質(zhì)和厭食。
肥胖是最為流行的體重疾病，而且是西方世界最重要的營(yíng)養(yǎng)疾病，據(jù)估計(jì)，中年人群中的發(fā)病率為30-50％。諸如神經(jīng)性厭食和神經(jīng)性食欲過(guò)盛的其它體重疾病使西方世界的女性群體的大約0.2％受到困擾，這種病同樣對(duì)健康造成嚴(yán)重威脅。另外，諸如厭食和惡病質(zhì)(消瘦)的疾病還是諸如癌、囊性纖維化和AIDS的其它疾病的突出特征。
被定義為相對(duì)瘦體重而言的體脂肪過(guò)剩的肥胖還可引起其它疾病。例如，這種疾病決定著諸如冠狀動(dòng)脈病、中風(fēng)和糖尿病的疾病的高發(fā)病率(例如，參見(jiàn)Nishina,P.M.等，1994,Metab.43:554-558)。肥胖不僅是一種行為問(wèn)題，即隨意多食的結(jié)果。而且，觀察到的肥胖與正常被試者的身體組成差異是由于代謝和神經(jīng)/代謝相互作用的差異造成的。這些差異似乎在一定程度上歸因于基因表達(dá)、和/或基因產(chǎn)物量或活性的不同(Friedman,J.M.等，1991,Mammalian Gene 1:130-144)。
肥胖的流行病學(xué)有力地證實(shí)了這種疾病具有遺傳特征(Stunkard,1990,N.Eng.J.Med.322:1483)。Moll等報(bào)導(dǎo)，在很多群體中，肥胖似乎只受少數(shù)基因位點(diǎn)的控制(Moll等，1991,Am.J.Hum.Gen.49:1243)。此外，人類雙生子研究可靠地提供了有關(guān)體重控制的豐富的遺傳基礎(chǔ)，估計(jì)的遺傳力為80-90％(Simopoulos,A.P和Childs B.，著，1989，見(jiàn)“肥胖的遺傳變異和營(yíng)養(yǎng)”(“Genetic Variation and Nutrition in Obesity”)，營(yíng)養(yǎng)和糖尿病綜述(WorldReview of Nutrition and Diabetes)63,S.Karger,Basel,Switzerland；Borjeson,M.,1976,Acta.Paediatr.Scand.65:279-287)。
對(duì)通過(guò)有意地系統(tǒng)性多吃而試圖增重的非肥胖人體所做的研究發(fā)現(xiàn)，這種人更難于以這種方式增加體重，而且僅能通過(guò)極高的熱量攝入維持升高的體重。相反，自發(fā)性肥胖個(gè)體以正?；蛑械绕叩?zé)崃繑z入即可保持其肥胖狀態(tài)。另外，動(dòng)物飼養(yǎng)中的普通經(jīng)驗(yàn)是，不同品系的豬、牛等具有不同的肥胖誘因。對(duì)人類肥胖和動(dòng)物肥胖模型的遺傳學(xué)研究表明，肥胖是由于食物攝入、食物誘發(fā)的能量消耗和脂質(zhì)與瘦體合成代謝之間的平衡的復(fù)雜的缺陷型調(diào)節(jié)而造成的。
人類和其它物種的很多以肥胖為特征的遺傳病，其較突出的癥狀通常還包括畸形特征和智力遲鈍。例如，大約在20,000個(gè)活產(chǎn)兒中就有一個(gè)受到Praderwilli綜合癥(PWS)的困擾，并且會(huì)出現(xiàn)新生兒肌肉健康狀況較差，面部和生殖畸形，和總體上的肥胖。
除了PWS以外，還鑒定了包括肥胖癥狀在內(nèi)的很多其它的多效性綜合癥。這些綜合癥在遺傳學(xué)上更為直接，并且似乎涉及常染色體隱性等位基因。這些疾病尤其包括Ahlstroem、Carpenter、Bardet-Biedl、Cohen和Morgagni-Stewart-Monel綜合癥。
現(xiàn)有很多供研究肥胖用的模型(例如，參見(jiàn)Bray,GA.,1992，腦研究進(jìn)展(Prog.Brain.Res.)93:333-341,和Bray,G.A.,1989，美國(guó)臨床營(yíng)養(yǎng)雜志(Amer.J.Clin.Nutr.)5:891-902)。例如，業(yè)已鑒定了具有能導(dǎo)致包括肥胖癥狀在內(nèi)的綜合癥的突變的動(dòng)物，并且嘗試過(guò)將這種動(dòng)物用作肥胖研究的模型。迄今為止，用于遺傳性肥胖研究的做過(guò)最深入的研究的動(dòng)物模型是小鼠模型。例如，為了回顧其發(fā)展，可參閱Friedman,J.M.等，1991，哺乳動(dòng)物遺傳(Mamm.Gen.)1:130-144；Friedman,J.M.和Liebel,R.L,1992，細(xì)胞(Cell)69:217-220)。
用小鼠所做研究已經(jīng)證實(shí)，肥胖是一種具有很高遺傳力的極為復(fù)雜的性狀。業(yè)已鑒定了發(fā)生在多個(gè)基因座的能導(dǎo)致肥胖表型的突變。其中包括常染色體隱性突變肥胖(ob)、糖尿病(db)、多脂肪(fat)和矮胖(tub)。另外，已證實(shí)發(fā)生于agouti(野鼠色)和脂肪(Adipose)(Ad)基因座上的常染色體顯性突變Yellow(黃色)會(huì)產(chǎn)生肥胖表型。
ob和db突變分別發(fā)生在6號(hào)和4號(hào)染色體上，但都能產(chǎn)生一種復(fù)雜的、臨床上類似的肥胖表型，其癥狀大約始于1月齡時(shí)，其癥狀包括多食、葡萄糖和胰島素代謝的極度異常、極差的體溫調(diào)節(jié)能力和非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱，極度遲鈍和瘦肉體重的發(fā)育不全。這種復(fù)雜的表型使得人們難于確定其主要缺陷歸因于哪一種突變(Bray GA.，等，1989美國(guó)臨床營(yíng)養(yǎng)雜志(Amer.J.Clin.Nutr.)5:891-902)。
使用分子遺傳標(biāo)記和經(jīng)典遺傳標(biāo)記已將db基因定位于4號(hào)中等染色體上(Friedman等，1991,Mamm.Gen.1:130-144)。小鼠基因組的一個(gè)片段的突變圖譜與人的一致表明，如果存在db基因的人類同系物的話，它很可能位于人類染色體色體1p上。
所述ob基因及其人類同系物最近已被克隆(Zhang,Y等，1994,Nature372:425-432)。該基因似乎能產(chǎn)生4.5kb的脂肪組織信使RNA，它含有一個(gè)167個(gè)氨基酸的開(kāi)放讀框。該ob基因的推定氨基酸序列表明，它是一種分泌蛋白，并因此作為來(lái)自脂肪組織的信號(hào)途徑的一部分起作用，用于調(diào)節(jié)體脂肪沉積的某些方面。另外，最近的研究已證實(shí)，當(dāng)外源服用重組ob蛋白(又被稱作萊普亭(leptin))時(shí)，至少能夠部分糾正ob小鼠所表現(xiàn)出的與肥胖相關(guān)的表型(Pelleymounter,M.A.等，1995,Science 269:540-543；Halalas,J.L.等，1995,Science269:543-546；Campfield,L.A.等，1995,Science 269:546-549)。最新的研究已揭示，肥胖人和肥胖嚙齒類動(dòng)物(ob/ob小鼠除外)其產(chǎn)生ob mRNA或蛋白的能力并無(wú)缺陷，而且其生產(chǎn)量通常會(huì)高于瘦型個(gè)體(Maffei等，1995，自然醫(yī)學(xué)分冊(cè)(Nature Med.)1(11):1155-116l；Considine等，1995，臨床研究雜志(J.Clin invest.)95(6):2986-2988；Lohnqvist等，1995,Nature Med.1:950-953；Hamilton等，1995,Nature Med.1:953-956)。以上資料表明，對(duì)于人類肥胖來(lái)說(shuō)，對(duì)正常或較高含量Ob的耐受性可能比Ob產(chǎn)生不足更為重要。不過(guò)，被認(rèn)為是在下丘腦中表達(dá)的ob基因產(chǎn)物的受體仍難于捉摸。
由發(fā)生于fat或tub基因座的純合突變所導(dǎo)致的肥胖，其發(fā)展比發(fā)生在ob和db小鼠上的肥胖的發(fā)展緩慢(Coleman,D.L,和Eicher,E.M.,1990，遺傳學(xué)雜志(J.Heredity)81:424-427),tub肥胖的發(fā)展較fat動(dòng)物的肥胖的發(fā)展緩慢。tub肥胖表型的這種特征使得tub肥胖表型的發(fā)展與人類肥胖的發(fā)展方式最為接近。不過(guò)，即使這樣這些動(dòng)物的肥胖表型仍可以超重為特征，其中，這些動(dòng)物的體重最終可接近正常小鼠體重的兩倍。
業(yè)已將fat突變定位于小鼠8號(hào)染色體上，而tub突變被定位于小鼠7號(hào)染色體上。據(jù)Naggert等報(bào)導(dǎo)，fat突變最近已得到鑒定(Naggert,J.K.,等，1995，自然遺傳學(xué)分冊(cè)(Nature Genetics)10:135-141)。具體地講，fat突變好象是發(fā)生在編碼羧肽酶(Cpe)E蛋白的Cpe基因座上的一種突變。Cpe是一種參與包括胰島素原在內(nèi)的激素原加工的外肽酶。
agouti基因座上的顯性Yellow突變，可導(dǎo)致一種多效性綜合癥，它會(huì)引起中度成體發(fā)胖，黃色皮毛顏色，腫瘤生成的高發(fā)病率(Herberg,L.和Coleman,D.L.,1977，新陳代謝(Metabolism)26:59)，和體脂肪的異常解剖分布(Coleman,D.L.,1978,Diabetologia 14:141-148)。這種突變是可導(dǎo)致體重增加而不是下降的多效性突變的唯一已知例子。這種突變會(huì)導(dǎo)致一種在正常情況下僅能在新生兒皮膚中出現(xiàn)的蛋白被廣泛表達(dá)(Michaud,E.J.等，1994，發(fā)育遺傳學(xué)(Genes,Devel.)8:1463-1472)。
其它動(dòng)物模型包括fa/fa(fatty)大鼠，它們與上文所述的ob/ob和db/db小鼠有許多相似之處。有一點(diǎn)不同的是，盡管fa/fa大鼠對(duì)寒冷極為敏感，但其非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱的能力是正常的。遲鈍在保持fa/fa大鼠的肥胖方面所起的作用似乎要大于其在相應(yīng)的小鼠突變體上的作用。另外，諸如NZO小鼠和日本KK小鼠的小鼠近交系是中度肥胖的。某些雜交小鼠，如Wellesley小鼠會(huì)自發(fā)地發(fā)胖。另外，某些沙漠嚙齒類動(dòng)物，如刺毛小鼠在其天然生存環(huán)境下不會(huì)發(fā)胖，但在用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)飼料飼養(yǎng)時(shí)會(huì)發(fā)胖。
通過(guò)物理或藥理學(xué)方法已建立了被用作肥胖模型的動(dòng)物。例如，大鼠腹側(cè)正中下丘腦(VMH)和腹外側(cè)下丘腦(VLH)的雙側(cè)病變分別與多食癥和過(guò)度肥胖以及吞咽不能、惡病質(zhì)和厭食相關(guān)。另外，業(yè)已證實(shí)給新生小鼠喂食谷氨酸-單鈉(MSG)或硫代葡萄糖金也會(huì)導(dǎo)致肥胖綜合癥。
上述每一種嚙齒類模型都伴有糖類代謝的改變，類似于人類的Ⅱ型糖尿病。例如，同類系的C57BL/KS ob和db小鼠均可能出現(xiàn)嚴(yán)重糖尿病，最終使β細(xì)胞壞死和發(fā)生胰島萎縮，造成相對(duì)的胰島素缺乏，而同類系的C57BL/6J ob和db小鼠會(huì)發(fā)生瞬時(shí)型耐胰島素糖尿病，但最終會(huì)被β細(xì)胞胞肥大所補(bǔ)償，與人類的Ⅱ型糖尿病相似。
就ob和db小鼠而言，這些小鼠的表型與人類肥胖的相似之處在于，與瘦型對(duì)照相比，突變型小鼠吃的更多，所消耗的能量更少(與胖人相似)，而不在于糖尿病的發(fā)展。這種表型與具有腹側(cè)正中下丘腦病變的動(dòng)物的表型也十分相似，這表明兩種突變均會(huì)干擾在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)營(yíng)養(yǎng)信息作出正確綜合或反應(yīng)的能力。上述假設(shè)得到了異種共生實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持(Colemom,D.L.1973，糖尿病學(xué)(Diabetologica)9:294-298)，該實(shí)驗(yàn)證明，ob小鼠缺乏循環(huán)飽因子，而db小鼠能耐受ob因子的作用。由上述實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論是，所述突變型小鼠的肥胖是由控制機(jī)體組成的假設(shè)的反饋機(jī)制的傳入環(huán)和/或整合中心的不同缺陷而造成的。
因此，總而言之，構(gòu)成世界范圍內(nèi)的問(wèn)題的肥胖，是一種復(fù)雜的、遺傳力很高的性狀。由于這種病的嚴(yán)重性、流行性及潛在的異質(zhì)性，導(dǎo)致迫切需要鑒定參與體重控制的基因和基因產(chǎn)物。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供體重調(diào)節(jié)劑、提供診斷體重疾病的方法、提供治療這種疾病的方法和提供用于篩選可用于控制體重的物質(zhì)的測(cè)試系統(tǒng)。
本發(fā)明涉及編碼Ob受體(ObR)-一種參與哺乳動(dòng)物體重控制的受體蛋白-的核苷酸的發(fā)現(xiàn)、鑒別和鑒定。在本文中首次披露的ObR是一種跨膜蛋白，它一次跨越細(xì)胞膜，并參與通過(guò)其天然配體Ob結(jié)合而觸發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述Ob又被稱為萊普亭。ObR具有發(fā)現(xiàn)于Ⅰ型細(xì)胞因子受體家族的氨基酸序列基序，并且與IL-6受體、G-CSF受體和LIF受體的gp130信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分最為相關(guān)。在本發(fā)明的工作實(shí)例中得到的結(jié)果表明，長(zhǎng)形的ObR(主要在下丘腦中表達(dá))通過(guò)一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活人蛋白(STAT)介導(dǎo)的途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，它通常為IL-6型細(xì)胞因子受體，而存在于肥胖db/db小鼠中的主要為天然存在的截短形式的或突變形式的ObR則不然。長(zhǎng)形ObR可以介導(dǎo)STAT蛋白的激活，并通過(guò)IL-6效應(yīng)基因因子刺激轉(zhuǎn)錄。重組實(shí)驗(yàn)證明，盡管ObR能以類似于IL-6型細(xì)胞因子受體的特異性介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)，但其信號(hào)似乎獨(dú)立于IL-6型細(xì)胞因子受體的gp130信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分。
長(zhǎng)度大約為5kb的ObR mRNA轉(zhuǎn)錄物是在脈絡(luò)叢、下丘腦和包括肺和肝在內(nèi)的其它組織中表達(dá)的。本文所披露的鼠類短形編碼894(圖1)和893個(gè)氨基酸的受體蛋白；而本文所披露的鼠類長(zhǎng)形obR cDNA和人類obR cDNA分別編碼1162個(gè)氨基酸和1165個(gè)氨基酸的受體蛋白(分別見(jiàn)圖6和圖3)。所述ObR有一個(gè)典型的疏水前導(dǎo)序列(兩種形式的鼠類ObR中的長(zhǎng)度均約為22個(gè)氨基酸，而在人類ObR中的長(zhǎng)度大約為20個(gè)氨基酸)；一個(gè)胞外域(在兩種形式的鼠類ObR中的長(zhǎng)度均約為815個(gè)氨基酸，而在人類ObR中的長(zhǎng)度約為819個(gè)氨基酸)；一個(gè)短的跨膜區(qū)(在兩種形式的鼠類ObR和人類ObR中的長(zhǎng)度均大約為23個(gè)氨基酸)；以及一個(gè)胞質(zhì)域。編碼鼠類ObR短形(圖1)和長(zhǎng)形(圖6)的轉(zhuǎn)錄物，在短形終止密碼子5＇末端的第15個(gè)密碼子之前是相同的，然后完全趨異，這暗示可能存在可變剪接。正如本文所披露的，由894個(gè)氨基酸的鼠類短形obR cDNA編碼的胞質(zhì)域?yàn)?4個(gè)氨基酸，而由鼠類長(zhǎng)形obR cDNA(302個(gè)氨基酸)編碼的胞質(zhì)域大約和由人類obR cDNA(303個(gè)氨基酸)編碼的胞質(zhì)域的長(zhǎng)度相同。由鼠類長(zhǎng)形ObR和人類ObR推測(cè)出的氨基酸序列在編碼區(qū)范圍內(nèi)是同源的，并具有75％的同一性(圖7)。
db小鼠的肥胖表型是由obR基因上的G→T顛換而造成的。這種顛換可產(chǎn)生一個(gè)剪接供體位點(diǎn)，該位點(diǎn)又會(huì)導(dǎo)致db突變型中obR長(zhǎng)型mRNA的異常加工。在db突變型中，由這種異常加工所產(chǎn)生的長(zhǎng)型mRNA，其編碼截短形式的并且與894個(gè)氨基酸的短形ObR相同的ObR蛋白。與短形ObR類似，該突變型長(zhǎng)形ObR缺乏大部分胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，而且不能通過(guò)STAT介導(dǎo)的途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。在db/db小鼠體內(nèi)所缺乏的信號(hào)感受態(tài)的長(zhǎng)形ObR是保持體重所必須的。
本發(fā)明涉及以下核苷酸，表達(dá)這些核苷酸的宿主細(xì)胞，和這些核苷酸的表達(dá)產(chǎn)物(a)編碼哺乳動(dòng)物ObR的核苷酸，包括人ObR及該obR基因產(chǎn)物；(b)編碼ObR的各個(gè)部分的核苷酸，這些部分相應(yīng)于其各個(gè)功能域，以及由這些核苷酸序列所確定的多肽產(chǎn)物，包括，但不限于胞外域(ECD)、跨膜域(TM)、和胞質(zhì)域(CD)；(c)編碼ObR突變型的核苷酸，在該ObR突變型中，所述功能域之一的全部或一部分缺失或改變了，以及由這些核苷酸序列所編碼的多肽，包括，但不限于其TM全部或部分缺失的可溶性受體，和其CD全部或部分缺失的非功能性受體；(d)編碼含有與另一種多肽融合的所述ObR或其一個(gè)功能域(例如，胞外域)的融合蛋白的核苷酸。
本發(fā)明還涉及ObR的激動(dòng)劑和拮抗劑，其中包括能與天然Ob競(jìng)爭(zhēng)的小分子、大分子、突變型Ob蛋白，以及抗體，和可用于抑制obR基因表達(dá)的核苷酸序列(例如，反義和核酶分子，以及基因或調(diào)控序列置換結(jié)構(gòu))或用于加強(qiáng)ObR基因表達(dá)的核苷酸序列(例如，能使ObR基因受一種強(qiáng)啟動(dòng)子系統(tǒng)控制的表達(dá)結(jié)構(gòu))，和能表達(dá)obR轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或不能表達(dá)ObR的“失效”動(dòng)物。
另外，本發(fā)明涉及用于包括肥胖和惡病質(zhì)的體重疾病的診斷評(píng)估、分型和預(yù)測(cè)以及用于鑒定具有這種病的誘因的患者的方法和組合物。舉例來(lái)說(shuō)，可將本發(fā)明的obR核苷酸分子用作診斷性雜交探針或診斷性PCR分析的引物，用于鑒定obR基因上的obR基因突變、等位變異和調(diào)控缺陷。本發(fā)明還提供了用于實(shí)施上述方法的診斷試劑盒。
另外，本發(fā)明還涉及將所述obR基因和/或obR基因產(chǎn)物用于鑒定能調(diào)節(jié)obR基因表達(dá)和/或obR基因活性，即作為其激動(dòng)劑或拮抗劑的化合物的方法。這種化合物可被用作體重控制劑，特別是用作治療劑，治療包括肥胖、惡病質(zhì)和厭食在內(nèi)的體重和體重疾病。
再者，本發(fā)明涉及用于治療包括肥胖、惡病質(zhì)和厭食在食的體重疾病的方法和組合物。所述方法和組合物可以調(diào)節(jié)obR基因的表達(dá)水平和/或obR基因產(chǎn)物的活性水平。
本發(fā)明部分地基于在對(duì)很多細(xì)胞系和組織、對(duì)腦脈絡(luò)叢中的對(duì)Ob有高度親和力的受體進(jìn)行廣泛研究之后得到的驚人發(fā)現(xiàn)，源于由脈絡(luò)叢mRNA制備的文庫(kù)的obR cDNA的鑒定和克隆，其新型序列的鑒定，以與db基因圖譜相同的遺傳間距將該obR基因作圖于小鼠基因組上，和作為Ⅰ型細(xì)胞因子受體家族的跨膜受體的ObR的鑒定。在包括下丘腦在內(nèi)的其它組織中檢測(cè)到過(guò)obR mRNA。
主要在下丘腦中表達(dá)的全長(zhǎng)ObR通過(guò)激活STAT蛋白并通過(guò)IL-6效應(yīng)基因因子刺激的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。全長(zhǎng)的長(zhǎng)形ObR轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的能力與存在于db/db小鼠中的天然存在的截短形式或突變形式的不同，后者不能介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明還包括缺少一個(gè)或另一個(gè)對(duì)于信號(hào)轉(zhuǎn)輸和誘導(dǎo)基因表達(dá)有重要作用的胞內(nèi)域的ObR類型。
A..定義本文中，以下的術(shù)語(yǔ)無(wú)論是單數(shù)形式還是復(fù)數(shù)形式，均具有以下含義Ob是指由Zhang等(1994,Nature 372:425-432)所披露的Ob蛋白，它又被稱作萊普亭(Leptin)，該文獻(xiàn)被全文收作本文的參考資料。Ob包括與Ob同源或與ObR結(jié)合的分子。具有N-末端堿性磷酸酶功能域的Ob融合蛋白在本文中被稱為AP-Ob融合蛋白，而具有C-末端堿性堿酸酶功能域的Ob融合蛋白在本文中被稱為Ob-AP融合蛋白。
obR核苷酸或編碼序列是指編碼ObR蛋白、ObR蛋白的多肽或肽片段、或ObR融合蛋白的核苷酸序列，obR核苷酸序列所涉及的DNA包括基因組DNA(例如，obR基因)或cDNA或RNA。
ObR是指Ob受體蛋白。ObR蛋白的多肽或肽片段被稱為ObR多肽或ObR肽。與一種不相關(guān)的蛋白融合的ObR、或ObR多肽或肽片段在本文中被稱為ObR融合蛋白。功能性O(shè)bR是指在體內(nèi)或體外能以高親合力結(jié)合Ob的蛋白。
ECD是指“胞外域”。
TM是指“跨膜域”。
CD是指“胞質(zhì)域”。
Ⅳ..


圖1．編碼鼠類短型ObR蛋白(894個(gè)氨基酸)的鼠obR(短型)cDNA的核苷酸序列(序列1)和推定的氨基酸序列(序列2)。短型鼠ObR的功能域有信號(hào)序列(氨基酸殘基1至22左右)，胞外域(大約為氨基酸殘基23-837)，穿膜域(大約為氨基酸殘基838-860)，和胞質(zhì)域(大約為氨基酸殘基861-894)。胞外域中潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)通過(guò)N-X-S和N-X-T基序第一個(gè)氨基酸上方的星號(hào)標(biāo)出。字下劃線表示Ⅰ型細(xì)胞因子受體家族的保守基序。
圖2A-2B.AP-Ob融合蛋白的結(jié)合研究。
圖2A．用ObR cDNA轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞，用1nM(稀釋于DMEM+10％FBS)的各種AP或AP-Ob融合蛋白處理。柱體表示2次結(jié)合測(cè)定的平均值，而誤差柱表示兩次測(cè)定之間的差異。1)未融合的AP,2)AP-Ob(小鼠)，3)AP-Ob(小鼠)+100nM小鼠Ob,4)AP-Ob(小鼠)+100nM人Ob,5)AP-Ob(人),6)Ob-AP(小鼠),7)AP-Ob(小鼠)，與模擬轉(zhuǎn)染的(載體-無(wú)插入片段)COS-7細(xì)胞一起培養(yǎng)過(guò)。
圖2B.AP-Ob與ObR相互作用的結(jié)合等溫線和Scatchard分析。用各種濃度的AP-Ob(小鼠)融合蛋白培養(yǎng)由obR cDNA轉(zhuǎn)染過(guò)的COS-7細(xì)胞。用插圖表示Scatchard轉(zhuǎn)化作用。
圖3．編碼人ObR蛋白的人obR cDNA的核苷酸序列(序列3)和推定的氨基酸序列(序列4)。人ObR的功能域有信號(hào)序列(從氨基酸殘基1至20左右)，胞外域(大約為氨基酸殘基21-839)，跨膜域(大約為氨基酸殘基840-862)，和胞質(zhì)域(大約為氨基酸殘基863-1165)。還示出了5′-非翻譯核苷酸序列。胞外域中潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)用N-X-S和N-X-T基序的第一個(gè)氨基酸上方面的星號(hào)表示。字下劃線表示Ⅰ型細(xì)胞因子受體家族的保守基序。
圖4．鼠ObR和人gp130胞外域的比較。通過(guò)在相應(yīng)的氨基酸周圍描影表示相同的殘基(黑體)和保守置換(灰體)。所示保守置換的定義同F(xiàn)ASTA定義。
圖5．鼠ObR(圖1所示的短型)與人ObR的比較。兩種序列之間相同的氨基酸用星號(hào)表示。
圖6．編碼鼠長(zhǎng)型ObR蛋白的鼠長(zhǎng)型obR cDNA的核苷酸序列和推定的氨基酸序列。長(zhǎng)型鼠ObR的功能域有信號(hào)序列(從氨基酸殘基1至22左右)，胞外域(大約為氨基酸殘基23-837)，跨膜域(大約為氨基酸殘基838-860)，和胞質(zhì)域(大約為氨基酸殘基861-1162)。
圖7．長(zhǎng)型人與鼠ObR的比較。相同的殘基和保守置換分別用2個(gè)星號(hào)和1個(gè)星號(hào)表示。所示保守置換的定義同F(xiàn)ASTA定義。縮略語(yǔ)mobr-1，鼠ObR長(zhǎng)形；hobr，人類同系物。
圖8．編碼ObR的基因在小鼠4號(hào)染色體上的定位。
圖9．db/db長(zhǎng)型轉(zhuǎn)錄物上的106bp插入片段的核苷酸序列。示出了其在推定的氨基酸序列中接近插入?yún)^(qū)的精確插入位置。
圖10．表示ObR-Ig對(duì)OB蛋白的中和作用的柱形圖。用ObR cDNA對(duì)COS細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，并測(cè)定其結(jié)合0.5nM AP-OB的能力。柱1示在無(wú)ObR-IgG融合蛋白時(shí)出現(xiàn)的高水平的特異性結(jié)合。柱2、3和4表示用3種不同柱級(jí)分的純化ObR IgG所產(chǎn)生的對(duì)結(jié)合作用的近乎完全的抑制作用。
圖11A．示意性地表示ObR蛋白的各種C-末端缺失突變型。在每種蛋白的上方標(biāo)出了其名稱和預(yù)測(cè)長(zhǎng)度(aa)。胞外域用斜線表示，跨膜域用黑體表示，胞質(zhì)域用白框表示。胞質(zhì)域中酪氨酸殘基的位置用水平線條表示(Y986、Y1079和Y1141在人ObR與鼠ObR之間是保守的)。胞質(zhì)域的長(zhǎng)度(aa)在每種蛋白的下面標(biāo)出。
圖11B．表示用IL-6RE-CAT表達(dá)結(jié)構(gòu)(上圖)或HRRE-CAT表達(dá)結(jié)構(gòu)(下圖)和圖11A的ObR缺失突變型進(jìn)行CAT測(cè)試的結(jié)果的柱形圖。用編碼所述ObR突變型和IL-6RE-CAT或HRRE-CAT的cDNA轉(zhuǎn)染H-35細(xì)胞。用無(wú)血清的培養(yǎng)基本身(-)或含有鼠萊普亭的無(wú)血清培養(yǎng)基(+)處理細(xì)胞的傳代培養(yǎng)物24小時(shí)。測(cè)定CAT活性，并以用未處理過(guò)的對(duì)照培養(yǎng)物得到的值的相對(duì)值形式表示。
圖12．表示AP-Ob融合蛋白結(jié)合測(cè)試的結(jié)果的柱形圖。用編碼所示ObR蛋白的cDNA轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。48小時(shí)后，用1mM AP-Ob融合蛋白培養(yǎng)細(xì)胞。柱體表示兩次結(jié)合測(cè)試的平均值。誤差柱表示兩次測(cè)試的差異。
圖13A．各種突變型ObR蛋白的示意圖。示出了酪氨酸殘基986和1079的位置。還標(biāo)出了“框1”序列的位置。
圖13B．表示HRRE-CAT誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果的柱形圖。用HRRE-CAT和OB-RY986F,OB-RY1079F或OB-R(框(box)1mt)的表達(dá)結(jié)構(gòu)對(duì)H-35細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。用含有人萊普亭的無(wú)血清培養(yǎng)基處理細(xì)胞的傳代培養(yǎng)物24小時(shí)。測(cè)定CAT活性，并用未處理過(guò)的對(duì)照培養(yǎng)物得到的值的相對(duì)值形式表示。
圖14A．各種受體嵌合體的示意圖。其中，陰影部分為源于G-CSFR的部分；而非陰影部分源于ObR。標(biāo)出了預(yù)測(cè)的框1、框2和框3基序的位置。
圖14B．表示IL-6RE-CAT(左圖)和HRRE-CAT誘導(dǎo)測(cè)定結(jié)果的柱形圖。用所示受體(ObR,G-CSFR或嵌合體)的表達(dá)質(zhì)粒和IL-6-RE-CAT或HREE-CAT表達(dá)結(jié)構(gòu)對(duì)H-35進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。用適當(dāng)配體刺激細(xì)胞，并按圖11B所示實(shí)驗(yàn)的方法測(cè)定CAT活性。所有的值均以非處理對(duì)照培養(yǎng)物的相對(duì)值形式表示(3-4次實(shí)驗(yàn)的平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤)。
圖15A．表示HRRE-CAT誘導(dǎo)測(cè)定結(jié)果的柱形圖。用HRRE-CAT和所示量的ObR和OB-RΔ868-1165對(duì)H-35細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。用萊普亭刺激細(xì)胞，并按照?qǐng)D11所示實(shí)驗(yàn)的方法測(cè)定CAT活性。所有的值均以非處理培養(yǎng)物的相對(duì)值形式表示。
圖15B．表示IL-6RE-CAT誘導(dǎo)測(cè)定結(jié)果的柱形圖。用IL-6RE-CAT和標(biāo)明量的ObR/G-CSFR和OB-RΔ868-1165對(duì)H-35細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。用萊普亭刺激細(xì)胞，并按照?qǐng)D11所示實(shí)驗(yàn)的方法測(cè)定CAT活性。所有的值均以非處理培養(yǎng)物的相對(duì)值形式表示。
圖15C．表示IL-6RE-CAT誘導(dǎo)測(cè)定結(jié)果的柱形圖。用IL-6RE-CAT和標(biāo)示量的G-CSFR和G-CSFR(Δcyto)對(duì)H-35細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。用G-CSF刺激細(xì)胞，用按照?qǐng)D11所示實(shí)驗(yàn)的方法測(cè)定CAT活性。所有的值均以非處理培養(yǎng)物的相對(duì)值形式表示。
圖15D．表示IL-6RE-CAT誘導(dǎo)測(cè)定結(jié)果的柱形圖。用IL-6RE-CAT和標(biāo)示量的G-CSFR/ObR和G-CSFR(Δcyto)對(duì)H-35細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。用G-CSF刺激細(xì)胞，并按照?qǐng)D11所示實(shí)驗(yàn)的方法測(cè)定CAT活性。所有的值均以非處理培養(yǎng)物的相對(duì)值形式表示。
圖15E．表示IL-6RE-CAT誘導(dǎo)測(cè)定結(jié)果的柱形圖。用IL-6RE-CAT和標(biāo)示量的ObR和OB-RY1141F對(duì)H-35細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。用萊普亭處理細(xì)胞，并按照?qǐng)D11所示實(shí)驗(yàn)的方法測(cè)定CAT活性。所有的值均以非處理培養(yǎng)物的相對(duì)值形式表示。
Ⅴ．發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明在本文中首次披露的ObR，是一種參與體重調(diào)節(jié)的新型受體蛋白。ObR是一種跨膜蛋白，它從膜中跨越一次，并屬于細(xì)胞因子受體的Ⅰ型家族，而且，與IL-6受體、G-CSF受體和LIF受體的gp130信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分的關(guān)系最為密切。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是由Ob與其受體的結(jié)合觸發(fā)的。中和Ob、清除Ob或干擾它與ObR的結(jié)合可導(dǎo)致體重增加。在脈絡(luò)叢和包括下丘腦在內(nèi)的其它組織中檢測(cè)到過(guò)ObRmRNA。
本發(fā)明涉及下列物質(zhì)在體重疾病的診斷和治療中的用途obR核苷酸，ObR蛋白和肽，以及ObR的抗體(例如，它可以作為ObR激動(dòng)劑或拮抗劑)，能抑制受體活性或表達(dá)的拮抗劑，或能激發(fā)受體活性或加強(qiáng)其表達(dá)的興奮劑，所述疾病包括，但不限于包括人在內(nèi)的動(dòng)物的肥胖、惡病質(zhì)和厭食。患者體內(nèi)ObR異?；騉bR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常的診斷，有助于設(shè)計(jì)出合適的處理或治療方案。另外，可將obR核苷酸和ObR蛋白用于鑒定能有效治療受ObR調(diào)節(jié)的體重疾病的化合物。
具體地講，在以下的各小節(jié)中所披露的本發(fā)明涉及ObR，相應(yīng)于該ObR的各功能域(例如，ECD、TM或CD)的多肽或肽，突變的、截短的或缺失的ObR(例如，缺失了一個(gè)或幾個(gè)功能域或其部分的ObR，如ΔTM和/或ΔCD)，ObR融合蛋白(例如，ObR或ObR的一個(gè)諸如ECD的功能域與不相關(guān)的蛋白或諸如免疫球蛋白恒定區(qū)的肽(即IgFc)融合)，編碼上述產(chǎn)物的核苷酸序列，以及能產(chǎn)生上述ObR產(chǎn)物的宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明的特征還在于具有與一種特定氨基酸序列大致相同的氨基酸序列的Ob受體。
“大致相同”是指一種多肽或核酸的序列與參考氨基酸或核酸的序列的相同性至少為85％，優(yōu)選地為90％，更優(yōu)選地為95％或更高。對(duì)多肽而言，參考多肽序列的長(zhǎng)度通常至少為16個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少為20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少為25個(gè)氨基酸，最好為35個(gè)氨基酸，對(duì)核酸而言，參考核酸序列的長(zhǎng)度通常至少為50個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少為60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少為75個(gè)核苷酸，最好為110個(gè)核苷酸。
可以用序列分析軟件測(cè)定序列同一性(例如，Wisconsin大學(xué)遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組的序列分析軟件包，生物技術(shù)中心，1710 University Avenue,Madison,WI 53705)。
當(dāng)多肽序列與參考序列的相同性不到100％時(shí)，不相同的位點(diǎn)優(yōu)選是，但不一定是參考序列的保守置換。保守置換通常包括下列各組的內(nèi)部置換甘氨酸和丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。
在說(shuō)一種特定的多肽與特定長(zhǎng)度的參考多肽有特定百分比的同一性時(shí)，該百分相同性是相對(duì)該參考肽而言的。因此，與長(zhǎng)度為100個(gè)氨基酸的參考多肽的相同性為50％的一種肽，可以是一種50個(gè)氨基酸的多肽，它與參考多肽的一個(gè)50個(gè)氨基酸長(zhǎng)的部分完全相同。也可以是長(zhǎng)度為100個(gè)氨基酸的多肽，它與參考多肽整個(gè)長(zhǎng)度的相同性為50％。當(dāng)然，有很多其它多肽都滿足同一標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明還涉及ObR的抗體和抗特應(yīng)抗體(包括Fab片段)、拮抗劑和激動(dòng)劑，以及能抑制ObR基因表達(dá)的化合物或核苷酸結(jié)構(gòu)(轉(zhuǎn)錄因子抑制劑，反義和核酶分子，或基因或調(diào)控序列置換結(jié)構(gòu))或能促進(jìn)ObR表達(dá)的化合物或核苷酸結(jié)構(gòu)(例如，其obR編碼序列可操縱地與諸如啟動(dòng)子、啟動(dòng)子/增強(qiáng)子之類的表達(dá)控制因子結(jié)合的表達(dá)結(jié)構(gòu))。本發(fā)明還涉及遺傳工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞和動(dòng)物，使其能表達(dá)人ObR(或其突變型)或抑制或“剔除”該動(dòng)物內(nèi)源ObR的表達(dá)。
可將ObR蛋白或肽、ObR融合蛋白、obR核苷酸序列、抗體、拮抗劑和激動(dòng)劑用于檢測(cè)突變型ObR或表達(dá)不正確的ObR，以便診斷諸如肥胖、厭食或惡病質(zhì)的體重疾病?？蓪bR蛋白或肽、ObR融合蛋白、obR核苷酸序列、宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、抗體、拮抗劑、激動(dòng)劑和遺傳工程產(chǎn)生的細(xì)胞和動(dòng)物用于篩選能有效治療上述體重疾病的藥物。使用遺傳工程宿主細(xì)胞和/或動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)是，該系統(tǒng)不僅可以鑒定能與ObR的ECD結(jié)合的化合物，而且還能鑒定可影響由活化ObR而轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)的化合物。
最后，可將ObR蛋白產(chǎn)物(尤其是可溶性衍生物，如相應(yīng)于ObR ECD的肽或缺少TM域的截短了的多肽)和融合蛋白產(chǎn)物(尤其是ObR-Ig融合蛋白，即ObR或ObR的一個(gè)諸如ECD、ΔTM的功能域與IgFc的融合體)，抗體和抗特應(yīng)抗體(包括Fab片段)、拮抗劑或激動(dòng)劑(包括能調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物，它可以作用于ObR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游目標(biāo))用于治療上述疾病。例如，服用有效量的可溶性O(shè)bR ECD，能模擬ObR ECD的ΔTM ObR或ECD-IgFc融合蛋白或抗特應(yīng)抗體(或其Fab)，可以“清除”或“中和”內(nèi)源Ob，并抑制或減弱其結(jié)合和受體激活，導(dǎo)致體重增加。可將編碼上述ObR產(chǎn)物的核苷酸結(jié)構(gòu)用于通過(guò)遺傳工程方法產(chǎn)生宿主細(xì)胞，以便在體內(nèi)表達(dá)這種ObR產(chǎn)物；這種遺傳工程細(xì)胞在體內(nèi)像“生物反應(yīng)器”一樣起作用，源源不斷地提供能“清除”或中和Ob的ObR、ObR肽、可溶性ECD或ΔTM或ObR融合蛋白。可將編碼功能性O(shè)bR、突變型ObR的核苷酸結(jié)構(gòu)，以及反義和核酶分子用于“基因治療”方法中，用于在治療體重疾病時(shí)調(diào)節(jié)ObR表達(dá)和/或活性。因此，本發(fā)明還涉及治療體重疾病的藥物制劑和方法。
本發(fā)明在某種程度上基于以下驚人發(fā)現(xiàn)Ob的高親和力受體能以很高濃度在脈絡(luò)叢中表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)使得用一種新型堿性磷酸酶/Ob(AP-Ob)融合蛋白對(duì)細(xì)胞和組織進(jìn)行原位染色成為可能。用未標(biāo)記的Ob所做的競(jìng)爭(zhēng)研究證實(shí)，所觀察到的原位結(jié)合是對(duì)Ob特異的。用AP-Ob融合蛋白對(duì)鼠obR cDNA進(jìn)行鑒定，以篩選由鼠脈絡(luò)叢mRNA合成并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物COS細(xì)胞中的cDNA表達(dá)文庫(kù)。鑒定了一個(gè)能表達(dá)Ob的短形高親和力受體的克隆，famj 5312，并進(jìn)行了測(cè)序。序列分析顯示，所述obR cDNA和預(yù)測(cè)的氨基酸序列是含有表明該ObR是受體蛋白Ⅰ型家族一員的氨基酸片段的新型序列。本文所披露的作圖研究表明，所述obR基因位于db位點(diǎn)。本文所提供的資料還進(jìn)一步表明，該db基因是一種突變型obR基因，它可以表達(dá)一種編碼與短型鼠ObR相同的蛋白的異常剪接的obR長(zhǎng)型信息。將famj5312序列用于篩選人胎腦cDNA文庫(kù)，結(jié)果鑒定了本文所披露的人obRcDNA克隆fahj5312d。本文中還披露了將根據(jù)人cDNA序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物用于克隆人基因組DNA克隆h-ObR-p87。采用根據(jù)人ObR胞質(zhì)域設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物由鼠下丘腦克隆了編碼鼠長(zhǎng)型ObR的mRNA。
在以下各小節(jié)中將對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)地說(shuō)明。
A..ObR基因在圖1和6中分別示出了鼠短型(長(zhǎng)度為894個(gè)氨基酸)和鼠長(zhǎng)型ObR的cDNA序列(序列1)和推定的氨基酸序列(序列2)。鼠短型和長(zhǎng)型ObR的信號(hào)序列在圖1和6中分別從氨基酸殘基1延伸到22左右；兩種型式的鼠ObR的胞外域在圖1和6中大約從氨基酸殘基23延伸至837；兩種型式的鼠ObR的跨膜域在圖1和6中大約從氨基酸殘基838延伸至860；鼠短型ObR的胞質(zhì)域在圖1中大約從氨基酸殘基861延伸至894，而長(zhǎng)形ObR的胞質(zhì)域在圖6中從氨基酸殘基861延伸至1162。至少已鑒定到一種另類短型鼠ObR，它比圖1所示序列少一個(gè)氨基酸(即893個(gè)氨基酸)。其C-末端序列與圖1所示序列的差別在于，沒(méi)有殘基890-893(RTDTL)；而第二種短形ObR的殘基890-893的序列為IMWI。
人ObR的cDNA序列(序列3)和推定的氨基酸序列(序列4)如圖3所示。人ObR信號(hào)序列在圖3中從氨基酸殘基1延伸至20左右；人ObR的胞外域在圖3中大約從氨基酸殘基21延伸至839；人ObR的跨膜域在圖3中大約為氨基酸殘基840-862；而人ObR的胞質(zhì)域在圖3中大約從氨基酸殘基863延伸至1165。將源于人cDNA克隆的序列用于設(shè)計(jì)引物，在下文所述的實(shí)施例中用這些引物克隆人基因組obR,h-obR-p87。
在下文的實(shí)施例中所提供的資料表明，obR基因位于db位點(diǎn)，而db基因是一種突變型obR基因，它能以異常剪接的轉(zhuǎn)錄物形式在db小鼠體內(nèi)表達(dá)，所產(chǎn)生的mRNA種在其編碼ObR的胞質(zhì)域的部分具有一個(gè)大約為106個(gè)核苷酸(nt)的插入片段。該插入片段能產(chǎn)生一種突變，由此所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物編碼一種超前截短了的長(zhǎng)型，其與鼠短型ObR相同。
本發(fā)明的obR核苷酸序列包括(a)如圖1、3或6所示的DNA序列，或含于由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保存的大腸桿菌531284F3菌株中的cDNA克隆famj5312上的或含于由ATCC保存的大腸桿菌h-obRD菌株中的cDNA克隆fahj5312d上的或含于由ATCC保存的人基因組克隆h-obR-p87上的核苷酸序列；(b)編碼圖1、3或6所示氨基酸序列的或由ATCC保存的cDNA克隆famj5312或由ATCC保存的cDNA克隆fahj5312d編碼的或含于由ATCC保存的人基因組克隆h-obR-p87中的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)能在高度嚴(yán)格的條件下與圖1、3或6所示DNA序列或含于由ATCC保存的cDNA克隆famj5312中的或含于由ATCC保存的cDNA克隆fahj5312d中的或含于由ATCC保存的人基因組克隆h-obR-p87中的DNA序列的補(bǔ)體(complement)雜交，并編碼一種功能上等同的基因產(chǎn)物的一切核苷酸序列，例如，在65℃下，在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)中與濾膜結(jié)合的DNA雜交，并在68℃下在0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌(Ausubel F.M.等著，1989,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.I,Green Rublishing Asso-ciaties,Inc.,and John Wiley & Sons Inc.,New York,見(jiàn)P.2.10.3)；和(d)能在不太嚴(yán)格的條件下，例如，在諸如42℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌的中等嚴(yán)格的條件下(Ausubel等，1989，同上)，與編碼圖1、3或6所示的氨基酸序列的DNA序列或含于由ATCC保存的cDNA克隆famj5312中的或含于由ATCC保存的cDNA克隆fahj5312d中的或含于由ATCC保存的人基因組克隆h-ObR-p87中的DNA序列的補(bǔ)體雜交，并且還能編碼一種功能上等同的ObR基因產(chǎn)物的一切核苷酸序列。ObR的功能性等同物包括存在于其它物種的天然生成的ObR，和天然生成的或遺傳工程合成的突變型ObR。本發(fā)明還包括序列(a)至(d)的簡(jiǎn)并變體。
本發(fā)明還包括優(yōu)選為DNA分子的核酸分子，它能與前一段落中的核苷酸序列(a)至(d)雜交，因此，也是所述核苷酸序列的補(bǔ)體。如上文所述，該雜交條件可以是高度嚴(yán)格的或不太嚴(yán)格的。在所述核酸分子是脫氧寡核苷酸(“寡聚體”)的場(chǎng)合下，高度嚴(yán)格的條件是指諸如在6×SSC/0.05％焦磷酸鈉中在37℃(適用于14個(gè)堿基的寡聚體)、48℃(適用于17個(gè)堿基的寡聚體)、55℃(適用于20個(gè)堿基的寡聚體)和60℃(適用于23個(gè)?；墓丫垠w)的溫度下洗滌。上述核酸分子可以編碼obR后義分子或起到該分子的作用，例如，用于obR基因調(diào)節(jié)(在obR基因核酸序列的擴(kuò)增反應(yīng)中編碼和/或作為反義引物)。就obR基因調(diào)節(jié)而言，上述方法可用于調(diào)節(jié)諸如惡病質(zhì)和/或厭食的疾病。而且，可將上述序列用作核酶和/或三螺旋序列的部分，還可用于obR基因調(diào)節(jié)。另外，可以把上述分子用作診斷方法的要素，以便能檢測(cè)出決定導(dǎo)致諸如肥胖的體重疾病的特定obR等位基因的存在。
除了上述obR核苷酸序列之外，用本領(lǐng)域眾所周知的分子生物學(xué)方法，無(wú)須過(guò)多的實(shí)驗(yàn)即可鑒定并順利分離到存在于同一物種中的全長(zhǎng)obR cDNA或其因序列和/或存在于其它物種中的所述obR基因的同系物。在相關(guān)物種中鑒定的ObR同系物可用于開(kāi)發(fā)與人類關(guān)系更密切的動(dòng)物模型系統(tǒng)，用于藥物的發(fā)現(xiàn)。例如，由源于感興趣的生物的脈絡(luò)叢mRNA合成的cDNA表達(dá)文庫(kù)，可以用源于同一物種的標(biāo)記Ob，如AP-Ob融合蛋白進(jìn)行篩選。另外，可以用本文所披露的核苷酸作為雜交或擴(kuò)增探針，通過(guò)雜交篩選源于所述感興趣的生物的這種cDNA文庫(kù)或基因組DNA文庫(kù)。而且，還可以通過(guò)類似方法鑒定編碼與所述ObR基因產(chǎn)物的一個(gè)或幾個(gè)功能域有高度同源性的蛋白的位于所述基因組中的其它遺傳基因座上的基因。就cDNA文庫(kù)而言，上述篩選方法可以鑒定源于相同或不同物種的可變剪接的轉(zhuǎn)錄物的克隆。
篩選可以用雙重濾膜通過(guò)濾膜雜交進(jìn)行。標(biāo)記過(guò)的探針可至少含有圖1、3或6所示obR核苷酸序列的至少15-30個(gè)堿基對(duì)。當(dāng)cDNA文庫(kù)源于不同于產(chǎn)生標(biāo)記序列的生物的生物類型時(shí)，所采用的雜交洗滌條件應(yīng)當(dāng)是低嚴(yán)格性的。對(duì)于人obR同系物的克隆來(lái)說(shuō)，采用諸如鼠obR探針的探針時(shí)，雜交可以在諸如65℃的溫度、在Church′s緩沖液(7％SDS,250mMNaHPO4,2 μMEDTA,1％BSA)中的條件下進(jìn)行。洗滌可以這樣進(jìn)行在65℃下在2×SSC,0.1％SDS中洗滌，然后在65℃下在0.1×SSC,0.1％SDS中洗滌。
低嚴(yán)格條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并可根據(jù)產(chǎn)生所述文庫(kù)和標(biāo)記序列的具體生物可預(yù)見(jiàn)地加以改變。例如，有關(guān)這些條件的指南可以參閱以下書(shū)目Sambrook等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港出版社(MolecularCloning,A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Press,N.Y)；和Ausubel等，1989，分子生物學(xué)通用方法(Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y)。
另外，同樣可以用適度嚴(yán)格的條件，將標(biāo)記的obR核苷酸探針用于篩選源于感興趣的生物的基因組文庫(kù)。人基因組克隆的識(shí)別和鑒定有助于設(shè)計(jì)出治療人類患者的體重疾病的診斷性試驗(yàn)和臨床方案。例如，可將源于人基因的內(nèi)含子/外顯子邊界附近部位的序列用來(lái)設(shè)計(jì)引物，將該引物用于擴(kuò)增試驗(yàn)中，檢測(cè)外顯子、內(nèi)含子、剪接位點(diǎn)(例如，剪接受體和/或供體位點(diǎn))等中可用于診斷的突變。
另外，通過(guò)使用根據(jù)本文所披露的obR基因產(chǎn)物中的氨基酸序列所設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并寡核苷酸引物庫(kù)進(jìn)行的PCR，可以從感興趣的生物的核酸中分離obR基因同系物。反應(yīng)模板可以是通過(guò)mRNA的逆轉(zhuǎn)錄而獲得的cDNA，例如，所述mRNA可以從已知的或猜測(cè)的能表達(dá)obR基因的等位基因的人或非人細(xì)胞系或諸如脈絡(luò)叢的組織中制備。
可以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆并測(cè)序，以確保所擴(kuò)增的序列是obR基因的序列。然后可將該P(yáng)CR片段用于通過(guò)各種方法分離全長(zhǎng)cDNA克隆。例如，可以標(biāo)記所擴(kuò)增的片段，并將其用于篩選cDNA文庫(kù)，如，噬菌體cDNA文庫(kù)。另外，可通過(guò)篩選基因組文庫(kù)的方式將標(biāo)記的片段用于分離基因組克隆。
還可以利用PCR技術(shù)分離全長(zhǎng)cDNA序列。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)方法從合適的細(xì)胞或組織來(lái)源(即已知的或猜測(cè)的能表達(dá)obR基因的來(lái)源，例如脈絡(luò)叢或腦組織)中分離RNA。對(duì)該RNA實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用對(duì)所述擴(kuò)增片段的大多數(shù)(most)5′-末端特異的寡核苷酸引物引發(fā)第一股鏈的合成。然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)用鳥(niǎo)嘌呤對(duì)所產(chǎn)生的RNA/DNA雜合體加尾，可以用RNAase H消化該雜合體，再通過(guò)聚胞苷酸(poly-C)引物引發(fā)第二股鏈的合成。因此，很容易分離擴(kuò)增片段上游的cDNA序列。為了回顧可以采用的克隆方法，可以參閱諸如Sambrook等的著述(1989，同上)。
另外，可將obR基因序列用于分離突變型obR基因的等位基因?？梢詮囊阎幕驊岩善渚哂性斐芍T如肥胖、惡病質(zhì)或厭食的體重疾病基因型的個(gè)體中分離上述突變型等位基因。然后可將突變型等位基因和突變型等位基因產(chǎn)物用在下文所述的治療和診斷系統(tǒng)中。另外，可將這種ObR基因序列用于檢測(cè)可能會(huì)影響體重的obR基因調(diào)節(jié)(例如，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)缺陷。
例如，可以用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的PCR方法分離一種突變型obR基因的cDNA。在這種場(chǎng)合下，可以用如下方法合成第一條cDNA鏈讓Oligo-dT(寡聚脫氧胸苷酸)寡核苷酸與自推測(cè)其攜帶突變型obR等位基因的個(gè)體的已知的或懷疑能表達(dá)該基因的組織中分離的mRNA雜交，并用逆轉(zhuǎn)錄酶延長(zhǎng)這條新鏈。接著用能特異性地與正?；虻?＇末端雜交的寡核苷酸合成第二條cDNA鏈。然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，采用上述兩種引物通過(guò)PCR擴(kuò)增所述產(chǎn)物，克隆到適當(dāng)載體上，并進(jìn)行DNA序列分析。通過(guò)比較突變型obR等位基因和正常obR等位基因的DNA序列，可以查明決定突變型obR基因產(chǎn)物的功能喪失或改變的突變。
另外，可以用獲自被懷疑或已知其帶有突變型obR等位基因的個(gè)體的DNA構(gòu)建基因組文庫(kù)，或用獲自已知的或懷疑能表達(dá)該突變型obR等位基因的組織的RNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)。然后可以對(duì)正常的obR基因或其任何適當(dāng)?shù)钠芜M(jìn)行標(biāo)記，并用作探針，在上述文庫(kù)中鑒定相關(guān)的突變型ObR等位基因。然后可以純化含有該突變型ObR基因序列的克隆，并用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法進(jìn)行序列分析。
另外，可以用cDNA構(gòu)建表達(dá)文庫(kù)，該cDNA是用諸如從被懷疑或已知其攜帶突變型ObR等位基因的個(gè)體的已知的或被懷疑能表達(dá)這種突變型等位基因的組織中分離的RNA合成的。如下文的5.3.節(jié)所述，由所述推測(cè)的突變型組織以所述方法制備的基因產(chǎn)物，可以表達(dá)并用標(biāo)準(zhǔn)的抗體篩選技術(shù)結(jié)合抗正常obR基因的抗體進(jìn)行篩選(例如，篩選技術(shù)可以參閱Harlow,E.和Lane著，1988，“抗體實(shí)施手冊(cè)”，冷泉港出版社(“Antibodies:ALaboratory Manual”,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor))。另外，可以用諸如AP-Ob或Ob-AP融合蛋白的標(biāo)記的Ob融合蛋白進(jìn)行篩選以實(shí)現(xiàn)所述篩選。對(duì)于能導(dǎo)致表達(dá)的基因產(chǎn)物具有改變了的功能的obR突變來(lái)說(shuō)(例如，由錯(cuò)義突變或移碼突變所導(dǎo)致的改變)，有一類ObR的多克隆抗體可以與突變型ObR基因產(chǎn)物發(fā)生交叉反應(yīng)?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法純化通過(guò)其與上述標(biāo)記抗體的反應(yīng)檢測(cè)的基因文庫(kù)克隆并進(jìn)行序列分析。
本發(fā)明還涉及編碼突變型ObR、ObR的肽片段、截短的ObR和ObR融合蛋白的核苷酸序列。其中，包括，但不限于編碼以下產(chǎn)物的核苷酸序列在下文的5.2節(jié)中所披露的突變型ObR；相應(yīng)于ObR的ECD、TM和/或CD域或這些功能域的部分的多肽或肽；其中缺失了所述功能域中的一個(gè)或兩個(gè)的截短了的ObR，例如，缺少TM或同時(shí)缺少TM和CD區(qū)的可溶性O(shè)bR，或缺少全部或一部分CD區(qū)的截短了的、無(wú)功能的ObR。編碼融合蛋白的核苷酸可以包括，但不限于編碼以下產(chǎn)物的核苷酸全長(zhǎng)ObR，截短的ObR或與不相關(guān)的蛋白或肽融合的ObR肽片段，例如，將ObR ECD固定在細(xì)胞膜上的跨膜序列；能提高血液中所產(chǎn)生的融合蛋白(如ObR-Ig)的穩(wěn)定性和半衰期的IgFc；或可以用作標(biāo)記的酶，熒光蛋白，發(fā)光蛋白。
本發(fā)明還涉及(a)含有上述ObR編碼序列和/或其補(bǔ)體(即反義鏈)中任一個(gè)的DNA載體；(b)含有上述ObR編碼序列中任一個(gè)的DNA表達(dá)載體，所述ObR編碼序列可操縱地與能指導(dǎo)該序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件連接；和(c)通過(guò)遺傳工程方法產(chǎn)生的含有上述ObR編碼序列中任一個(gè)的宿主細(xì)胞，該編碼序列可操縱地與能指導(dǎo)其在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)元件連接。在本文中，調(diào)節(jié)元件包括，但不限于誘導(dǎo)型和非誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱子以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的能啟動(dòng)或調(diào)節(jié)表達(dá)的其它元件。所述調(diào)節(jié)因子包括，但不限于巨細(xì)胞病毒hCMV立即早期基因，SV40腺病毒的早期或晚期啟動(dòng)子，lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，TAC系統(tǒng)，TRC系統(tǒng)，噬菌體A的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)，fd外殼蛋白的操縱區(qū)，3-磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子，酸性磷酸酶的啟動(dòng)子，以及酵母α-交配因子的啟動(dòng)子。
B..ObR蛋白和多肽可以制備ObR蛋白，ObR的多肽和肽片段，ObR的突變、截短或缺失的型式和/或ObR融合蛋白，將其用于各種目的，包括，但不限于制備抗體，作為診斷試驗(yàn)中的試劑，鑒定參與體重調(diào)節(jié)的其它細(xì)胞基因產(chǎn)物，用作篩選能用于治療體重疾病的化合物的試驗(yàn)的試劑，并用作可用于治療與ObR相關(guān)的體重疾病的藥用制劑。
圖1和6分別表示鼠短型和長(zhǎng)型ObR蛋白。在上述兩型式的ObR中，信號(hào)序列從氨基酸1延伸到氨基酸22左右；ECD大約從氨基酸23延伸至837；而TM大約從氨基酸838延伸至860。在短型鼠ObR上，CD大約從氨基酸861延伸至894(或在第二種短型中延伸至893)；而在其長(zhǎng)型上大約從氨基酸861延伸至1162。圖3表示人ObR的氨基酸序列。其信號(hào)序列從氨基酸殘基1延伸至20左右；ECD大約從氨基酸殘基21延伸至839；TM大約從氨基酸殘基840延伸862；而CD大約從氨基酸殘基863延伸至1165。
ObR序列始于一個(gè)甲硫氨酸，它在DNA序列中的位置與一個(gè)翻譯起始位點(diǎn)一致，其后是一個(gè)典型的肽分泌的疏水信號(hào)序列。以上兩種型式的鼠ObR的預(yù)測(cè)的成熟胞外域是一樣的，并且長(zhǎng)度均為815個(gè)氨基酸，而預(yù)測(cè)的人ObR的ECD長(zhǎng)度為819個(gè)氨基酸。ObR胞外域具有很多Ⅰ型細(xì)胞因子受體家族的特征(其綜述見(jiàn)Heldin,1995，細(xì)胞(Cell)80:213-223)，并且與IL-6受體(Taga等，1989,Cell 58:573-581)、G-CSF受體(Fukunaga等，1990,Cell 61:341-350)和LIF受體(Gearing等，1991,科學(xué)(Science)255:1434-1437)的gp130信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的關(guān)系最為密切。事實(shí)上，本文所提供的資料表明，長(zhǎng)型ObR通過(guò)激活STAT蛋白-由IL-6型細(xì)胞因子受體家族介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的標(biāo)志-轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。
在圖4中對(duì)鼠ObR和gp130之間的胞外域進(jìn)行了比較。盡管這兩種分子之間總體上的氨基酸序列同一性較低(24％)，但所保留的有特色的半胱氨酸殘基、Trp-Ser-X-Trp-Ser基序(圖1所示鼠序列的氨基酸殘基317-321和620-624；圖3所示人序列的氨基酸殘基319-323和622-626)、和這一類蛋白中其它殘基的保守(其綜述見(jiàn)Kishi-moto等，1994,Cell 76:253-262)都是顯而易見(jiàn)的。鼠短型ObR和人ObR的氨基酸序列在鼠短型ObR的長(zhǎng)度范圍內(nèi)是高度同源的(圖5)。事實(shí)上，鼠短型和人克隆的推定氨基酸序列之間的同一性(78％)等于或大于在對(duì)鼠和人的gp130型式(Saito等，1992，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)148:4066-4071)、LIF受體(Gough等，1988，美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)85:2623-2627)和G-CSF受體(Fukanaga等，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.87:8702-8706)進(jìn)行比較時(shí)所觀察到的同一性。類似地，由鼠和人長(zhǎng)型ObR推定的氨基酸序列在其編碼區(qū)長(zhǎng)度范圍內(nèi)是同源的，并具有75％的相同性(圖7)。
在鼠和人ObR的ECD中均存在潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)(即氨基酸序列基序N-X-S或N-X-T)。在圖1和6所示的鼠ECD序列中，至少可以確認(rèn)20個(gè)潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)(參見(jiàn)始于下列氨基酸殘基的三肽基序23、41、56、73、81、98、187、206、276、347、397、433、516、624、659、670、688、697、728、和750)；而在圖3所示的人ObR ECD序列中至少可確認(rèn)16個(gè)潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)(參見(jiàn)始于下列氨基酸殘基的三肽基序41、56、73、98、187、275、345、431、514、622、657、668、686、695、698和726)。在鼠和人ObR胞外域后面的是23個(gè)氨基酸的預(yù)測(cè)跨膜域。
圖1所示的鼠cDNA編碼一種短的胞質(zhì)域(34個(gè)氨基酸)。鼠ObR胞質(zhì)域的氨基酸5-24(即圖1中的氨基酸殘基865-884)與LIF受體的胞內(nèi)域的近膜序列有47％的同一性，并含有一個(gè)box1 Jak相互作用序列(Navazaki等，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.91:2285-2289)。有趣的是，由所述cDNA編碼的一種蛋白具有長(zhǎng)于鼠短型ObR胞內(nèi)域的胞內(nèi)域。雖然所述鼠短型和人胞內(nèi)域在直到鼠短型ObR的最后5個(gè)殘基的范圍內(nèi)都是高度保守的，但人的胞內(nèi)域一直延續(xù)到類似于gp130的長(zhǎng)度。所述鼠短型克隆和人克隆的核苷酸序列在鼠短型ObR的整個(gè)編碼區(qū)范圍內(nèi)也是極其相似的，但隨后在接近鼠短型ObR終止密碼子處完全趨異。
本文所披露的鼠短型cDNA的短胞質(zhì)域具有幾種Ⅰ型細(xì)胞因子受體多肽的特征(其綜述見(jiàn)Kishimoto等，1994,Cell 76:253-262)。不過(guò)，本文所報(bào)導(dǎo)的結(jié)果表明，短型ObR不能通過(guò)STAT途徑啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，該途徑是由長(zhǎng)型ObR介導(dǎo)的。事實(shí)上，所述與ObR具有很高同源性的3個(gè)受體均具有在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中有重要作用的長(zhǎng)的胞質(zhì)域。這加大了所分離的鼠短形ObR克隆是嵌合體或編碼一種罕見(jiàn)的、不代表脈絡(luò)叢中的主要表達(dá)型式的異常剪接型式的可能性。為了解決這一問(wèn)題，選擇8個(gè)在文庫(kù)篩選中分別鑒定的鼠克隆，并用制備到終止密碼子的序列3＇的引物通過(guò)PCR擴(kuò)增每一個(gè)克隆(各自為有150個(gè)克隆的亞集合體)。結(jié)果表明，所有8個(gè)克隆均含有相同的3′非翻譯序列。另外，對(duì)5個(gè)分別分離到的克隆的C-末端測(cè)序，均表現(xiàn)出有相同的終止密碼子。最后，用從不同于產(chǎn)生所述cDNA的小鼠品系(C57B1/KsJ)的脈絡(luò)叢中提取的全RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，產(chǎn)生了在同一位點(diǎn)上含有終止密碼子的相同的PCR產(chǎn)物。上述結(jié)果表明，所分離到的鼠短型克隆既非嵌合型式，亦非罕見(jiàn)的異常剪接型式，而很可能是該受體在鼠脈絡(luò)叢中的主要型式。本文所提供的資料表明，小鼠ObR的可變剪接的型式具有較長(zhǎng)的胞內(nèi)域(長(zhǎng)型)；即野生型obR基因以兩種型式表達(dá)一種mRNA轉(zhuǎn)錄物具有一個(gè)大約為100個(gè)核苷酸的插入片段，它編碼具有一種短的胞質(zhì)域的ObR；另一種mRNA轉(zhuǎn)錄物編碼具有一種長(zhǎng)的胞質(zhì)域的ObR，該胞質(zhì)域與人的CD同源。
圖6所示的鼠cDNA克隆編碼長(zhǎng)型ObR。如上文所述，編碼鼠長(zhǎng)型ObR的ECD和TM的氨基酸與編碼鼠短型的氨基酸相同。不過(guò)，由鼠長(zhǎng)型cDNA編碼的胞質(zhì)域(302個(gè)氨基酸)的長(zhǎng)度大致與由人ObR cDNA編碼的胞質(zhì)域相同。與obR短型不同的是，由鼠長(zhǎng)型的核苷酸序列編碼的obR直到整個(gè)胞質(zhì)域的范圍內(nèi)都是與人ObR相似的。
本文所提供的資料還表明，db是長(zhǎng)型鼠obR基因的一種突變型。db突變型能表達(dá)一種異常剪接的轉(zhuǎn)錄物，在該轉(zhuǎn)錄物的編碼CD的mRNA部分含有一個(gè)大約為106個(gè)核苷酸的插入片段。雖然該轉(zhuǎn)錄物是長(zhǎng)的，但由插入序列形成的突變所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物編碼一種截短的ObR蛋白，該蛋白與所述短型ObR相同，因此，它缺少大部分CD。本文所提供的資料表明，與長(zhǎng)型ObR不同，短型ObR，即與db/db小鼠的肥胖表型相關(guān)的受體型式不能轉(zhuǎn)導(dǎo)由STAT途徑介導(dǎo)的信號(hào)。因此，好像是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)感受態(tài)的長(zhǎng)型ObR積極參與了體重的調(diào)節(jié)和保持。
總之，已鑒定了幾種主要ObR型式的信使RNA。存在于大部分組織中的優(yōu)勢(shì)ObR mRNA能編碼一種具有一個(gè)由34個(gè)氨基酸殘基組成的短的胞質(zhì)域的跨膜蛋白，它被稱為短型。在下丘腦中存在一種obRmRNA，它所編碼的蛋白具有與短型相同的胞外域，但有一個(gè)302個(gè)殘基長(zhǎng)的胞質(zhì)域，它被稱為長(zhǎng)型。所述db突變能導(dǎo)致長(zhǎng)型轉(zhuǎn)錄物的異常剪接產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而形成一種具有截短了的胞質(zhì)域的蛋白。有趣的是，在db/db小鼠中長(zhǎng)型ObR的mRNA，能編碼一種結(jié)構(gòu)與天然存在的短型相同的蛋白。其C-端區(qū)的喪失被認(rèn)為使ObR失去了活性，并推測(cè)能導(dǎo)致db/db小鼠的肥胖表型。
序列資料表明，ObR可能產(chǎn)生類似于G-CSFR、LIFR和gp130的信號(hào)轉(zhuǎn)錄作用(Stahl和Yancopoulos,1993，細(xì)胞(Cell)74:587-590；Kishimoto等，1995，血液(Blood)86:1243-1254)。由上述受體進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，尤其能實(shí)現(xiàn)Janus激酶家族的受體相關(guān)激酶的激活，由此導(dǎo)致磷酸化作用，并激發(fā)STAT1、STAT3和STAT5的DNA結(jié)合活性(Ihle,1995,Nature 377:591-594；Kishimoto等，1995,Blood 86:1243-1254)。這一過(guò)程反過(guò)來(lái)又與誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)(所述基因具有STAT蛋白的結(jié)合位點(diǎn))，如編碼急相血漿蛋白的肝基因(Lai等，1995，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)270:23254-23257)。為了驗(yàn)證所克隆的ObR同種型是否確系信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體分子，將ObR導(dǎo)入已建立的組織培養(yǎng)細(xì)胞系中，并將細(xì)胞對(duì)OB處理的反應(yīng)與由結(jié)構(gòu)上相關(guān)的IL-6-型細(xì)胞因子受體介導(dǎo)的反應(yīng)加以比較。在下文的實(shí)施例中所提供的結(jié)果表明，該長(zhǎng)型ObR是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。具體地講，所述結(jié)果證實(shí)了該長(zhǎng)型ObR具有IL-6-型細(xì)胞因子受體的功能特異性。所述結(jié)果還證實(shí)，短型ObR不能通過(guò)由所述ObR長(zhǎng)型轉(zhuǎn)導(dǎo)的STAT途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。因此，好像是長(zhǎng)型ObR，而不是短型ObR與體重的保持相關(guān)。
本發(fā)明的ObR氨基酸序列包括圖1(序列2)、圖3(序列4)或圖6所示的氨基酸序列，或由保存于ATCC的cDNA克隆famj5312或保存于ATCC的cDNA克隆fahj5312d或保存在ATCC的人基因組克隆h-obR-p87編碼的氨基酸序列。而且，本發(fā)明還包括其它物種的ObR。事實(shí)上，由上面的5.1節(jié)中所披露的obR核苷酸所編碼的一切ObR蛋白均屬于本發(fā)明的范疇。
本發(fā)明還涉及作為由5.1節(jié)中所披露的核苷酸序列編碼的ObR的功能性等同物的蛋白，這種功能性等同物可以用眾多標(biāo)準(zhǔn)中的任一種判斷，所述標(biāo)準(zhǔn)包括，但不限于結(jié)合Ob的能力，對(duì)Ob的結(jié)合力，Ob結(jié)合所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，例如，當(dāng)ObR等同物存在于適當(dāng)細(xì)胞型中時(shí)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞代謝的變化(例如，離子流動(dòng)、酪氨酸磷酸化)或表型的變化(如減輕、抑制或延緩肥胖表型，即db或ob表型)、或體重減少。所述功能性等同的ObR蛋白包括，但不限于在由上文的5.1節(jié)中所披露的obR核苷酸序列編碼的氨基酸序列中的氨基酸殘基的添加或置換，但這種變化導(dǎo)致的是沉默改變，由此產(chǎn)生一種功能上相同的基因產(chǎn)物。氨基酸置換，可基于有關(guān)殘基在極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性和/或兩親性方面的相似性完成。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、笨丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；而帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
盡管可以對(duì)obR DNA進(jìn)行隨機(jī)突變(采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的隨機(jī)誘變技術(shù))并檢測(cè)所得到的突變型ObR的活性，但也可以通過(guò)工程方法使obR編碼序列發(fā)生定點(diǎn)突變(采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的定點(diǎn)誘變技術(shù))產(chǎn)生突變型ObR，該突變型ObRs具有增加的功能，例如，對(duì)Ob的較高結(jié)合力和/或較大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力；或具有降低的功能，例如，對(duì)Ob的較低的結(jié)合力和/或較弱的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。
例如，小鼠短型ObR(圖1)和人ObR同系物(圖3)的比較示于圖5中，其中，相同的氨基酸殘基用星號(hào)標(biāo)出。可以對(duì)突變型ObR進(jìn)行工程操作，以使相同的區(qū)域(在圖5中用星號(hào)標(biāo)出)得以保存，而可變殘基(圖5中未加星號(hào)的殘基)被改變，例如，通過(guò)缺失或插入一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基或置換一個(gè)或幾個(gè)不同的氨基酸殘基。可以對(duì)可變位置上的保守性變性進(jìn)行工程操作，以產(chǎn)生仍保留有功能的突變型ObR；例如，保留了Ob結(jié)合力或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力或同時(shí)保留了這兩種能力?？梢栽谶@些可變位置上用工程操作方法產(chǎn)生非保守性變化，以改變其功能，例如，Ob結(jié)合力或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力或這兩種能力。另外，如果需要改變功能，可以用工程操作方法使所述保守區(qū)域(即圖5中用星號(hào)標(biāo)示的相同的氨基酸)發(fā)生缺失或非保守性變化。例如，可以通過(guò)工程操作使CD發(fā)生缺失或非保守性變化(置換或插入)，例如，鼠ObR的氨基酸殘基861-894(圖1)，或人ObR的氨基酸殘基863-1165(圖3)，或CD的各個(gè)部分，例如，鼠ObR的氨基酸殘基861-884(圖1)，或人ObR(box 1 Jak相互作用域)的氨基酸殘基863-886，以產(chǎn)生一種突變型ObR，該突變型ObR能結(jié)合Ob，但不能轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)?？梢詫?duì)圖5所示ECD中的標(biāo)有星號(hào)的殘基進(jìn)行工程操作，以使其發(fā)生非保守性變化，從而產(chǎn)生具有改變了的Ob結(jié)合力的突變型ObR。根據(jù)圖7中對(duì)鼠長(zhǎng)型ObR和人ObR同系物的比較，可以將相同的突變方法用于設(shè)計(jì)突變型ObR，在圖7中，相同的氨基酸殘基用雙星號(hào)表示。
圖4中示出了鼠ObR的ECD與人gp130的比較，其中，相同的殘基用黑體表示，而保守性變化用灰體表示。據(jù)推測(cè)，在保持ECD的三級(jí)結(jié)構(gòu)方面相同區(qū)域和保守區(qū)域有著重要作用，而可變區(qū)可產(chǎn)生每一種受體對(duì)其配體的特異性。因此，通過(guò)改變圖4所示的可變區(qū)，可以通過(guò)工程方法產(chǎn)生具有改變了的Ob結(jié)合力的ObR突變型?？梢詫?duì)所述ObR突變型進(jìn)行設(shè)計(jì)，以保留在圖4中被框出(包括黑框和灰框)的ObR氨基酸序列，或含有一個(gè)或幾個(gè)由圖4的灰框所示gp130序列所產(chǎn)生的保守性置換。
可以使obR編碼序列發(fā)生其它突變，以產(chǎn)生更適于在所選定的宿主細(xì)胞中表達(dá)、放大等的ObR。例如，為了消除二硫鍵，可以缺失或用另一種氨基酸置換半胱氨酸殘基；可以改變或消除N-連接的糖基化位點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)諸如均相產(chǎn)物表達(dá)的目的，這種產(chǎn)物更容易從酵母宿主中回收和純化，已知上述位點(diǎn)為高糖基化N-連連接位點(diǎn)。為此，發(fā)生在ECD上的一個(gè)或幾個(gè)糖基化識(shí)別序列(N-X-S或N-X-T)中任一個(gè)的第一或第三氨基酸位置上的各種氨基酸置換和/或發(fā)生在ECD上的一個(gè)或幾個(gè)所述識(shí)別序列中任一個(gè)的第二位置上的一個(gè)氨基酸的缺失，可以抑制ObR在修飾過(guò)的三肽序列上的糖基化作用(例如，參見(jiàn)Miyajima等，1986，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志(EMBO J.)5(6):1193-1197)。
相當(dāng)于ObR的一個(gè)或幾個(gè)功能堿(如ECD、TM或CD)的肽、截短了的或缺失的ObR(例如，缺失了其中的TM和/或CD的ObR)、以及由全長(zhǎng)ObR、ObR肽或截短的ObR與一種不相關(guān)的蛋白融合而成的融合蛋白也屬于本發(fā)明范疇，并可以根據(jù)在本節(jié)和上文的5.1節(jié)中所披露的obR核苷酸序列和ObR氨基酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。所述融合蛋白包括，但不限于IgFc融合蛋白，它能穩(wěn)定ObR蛋白或肽，并延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期；或與能使融合蛋白固定在細(xì)胞膜上的一切氨基酸序列融合，以使其ECD被呈現(xiàn)在細(xì)胞表面上；或是與具有標(biāo)記功能的酶、熒光蛋白或發(fā)光蛋白融合。
雖然可用化學(xué)方法合成ObR多肽和肽(例如，參見(jiàn)Creighton,1983，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原理(Proteins:Structures and Molecular Principles)，W.H.Freeman & Co.,N.Y)，但源于ObR的大型多肽和全長(zhǎng)ObR本身最好用本領(lǐng)域廣為人知的技術(shù)通過(guò)重組DNA方法產(chǎn)生，以表達(dá)含有ObR基因序列和/或編碼序列的核酸?？蓪⑦@種方法用于構(gòu)建含有5.1節(jié)中披露的obR核苷酸序列合適的轉(zhuǎn)錄及翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。例如，所述方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組技術(shù)。例如，參見(jiàn)披露于Sambrook等(1989，同上)和Ausubel等(1989，同上)的著述中的技術(shù)?；蛘撸梢杂弥T如合成儀的裝置化學(xué)合成能編碼obR核苷酸序列的RNA。例如，參見(jiàn)披露于寡核苷酸合成(“Oligonucleotide Synthesis”)(1984,Gait,M.J.著，IRLPress,Oxford)中的技術(shù)，該文獻(xiàn)的全文被收作本文參考。
可以用各種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明的obR核苷酸序列。如果該ObR肽或多肽是可溶性衍生物(例如，相當(dāng)于ECD的ObR肽；截短的或缺失的ObR，其中的TM和/或CD已缺失)的話，在ObR肽或多肽不是分泌性的時(shí)可從培養(yǎng)物，即宿主細(xì)胞中回收該肽或多肽，而在ObR肽或多肽是由宿主細(xì)胞分泌的時(shí)可從培養(yǎng)基中回收。不過(guò)，該表達(dá)系統(tǒng)還包括遺傳工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞可原位表達(dá)ObR或其功能性等同物，即固定在細(xì)胞膜上?？梢杂眠m當(dāng)?shù)南礈靹┖椭F(tuán)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法實(shí)現(xiàn)從這種表達(dá)系統(tǒng)中純化或富集ObR。不過(guò)，可將這種用工程方法產(chǎn)生的宿主細(xì)胞本身用于以下場(chǎng)合它不僅對(duì)于保持ObR的結(jié)構(gòu)和功能特征起著重要作用，而且對(duì)評(píng)估其生物學(xué)活性有重要意義，例如，用于藥物篩選試驗(yàn)中。
可用于本發(fā)明目的的表達(dá)系統(tǒng)包括，但不限于諸如用含有obR核苷酸序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌(例如，大腸桿菌、枯草芽胞桿菌)的微生物；用含有obR核苷酸序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化過(guò)的酵母(例如，酵母屬、畢赤酵母屬)；用含有obR核苷酸序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染過(guò)的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；用含有obR核苷酸序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒TMV)感染過(guò)的或用含有obR核苷酸序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化過(guò)的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或獲得了重組表達(dá)結(jié)構(gòu)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如，COS、CHD、BHK、293、3T3)，所述表達(dá)結(jié)構(gòu)含有源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子(例如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或源于哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(例如，腺病毒晚期啟動(dòng)子；痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子)。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)被表達(dá)的obR基因產(chǎn)物的預(yù)期用途對(duì)若干表達(dá)載體進(jìn)行適當(dāng)選擇。例如，當(dāng)需要產(chǎn)生大量的此類蛋白以制備ObR蛋白的藥用組合物或制備該ObR蛋白的抗體時(shí)，需要用諸如能指導(dǎo)便于純化的融合蛋白產(chǎn)物的高水平表達(dá)的載體。這種載體包括，但不限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Pruther等，1983,EMBO J.2:1791)，其中，obR編碼序列可以與lacZ編碼區(qū)單獨(dú)在讀框中的連接到該載體，以產(chǎn)生所述融合蛋白；pIN載體(Inouye和Inouye,1985，核酸研究(Nucleic Acids Res.)13:3101-3109；Van Heeke和Schuster,1989，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)264:5503-5509)；以及類似載體。還可將pGEX載體用于表達(dá)外源多肽，該多肽是一種與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。一般，這種融合蛋白是可溶性的，而且便于從裂解的細(xì)胞中純化，其做法是將其吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖珠上，然后在有游離的谷胱甘肽的條件下洗脫。將PGEX載體設(shè)計(jì)成包括凝血酶或因子X(jué)a蛋白酶裂解位點(diǎn)，以便能從GST部分分離出克隆的目標(biāo)基因產(chǎn)物。
在昆蟲(chóng)系統(tǒng)中，用苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcNPN)作為載體表達(dá)外源基因。該病毒生長(zhǎng)于草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)細(xì)胞中。可將obR基因編碼區(qū)單獨(dú)克隆到該病毒的非必需區(qū)(例如，多角體蛋白基因)上，并置于AcNPV啟動(dòng)子(例如，多角體蛋白啟動(dòng)子)的控制之下。ObR基因編碼序列的成功插入，可導(dǎo)致多角體蛋白基因的失活和無(wú)包被重組病毒(即缺少由多角體蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)外被的病毒)的產(chǎn)生。然后再用這種重組病毒感染草地貪夜蛾細(xì)胞，其中，所插入的基因得以表達(dá)(例如，參見(jiàn)Smith等，1983，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)46:584；Smith，美國(guó)專利US 4,215,051)。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以使用多種病毒基表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)腺病毒被用作表達(dá)載體時(shí)，可將感興趣的obR核苷酸序列連接在腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合體上，例如，晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列。然后通過(guò)體外或體內(nèi)重組將該嵌合基因插入腺病毒基因組中。如果插入點(diǎn)是在病毒基因組的非必需區(qū)上(例如，E1或E3區(qū))，將會(huì)產(chǎn)生一種有活力的并能在感染的宿主中表達(dá)obR基因產(chǎn)物的重組病毒(例如，參見(jiàn)Logan和ShenR,1984，美國(guó)科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 81:3655-3659)。插入的obR核苷酸序列的有效翻譯可能還需要特殊的起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子及相鄰的序列。在完整的obR基因或cDNA(包括其自身的起始密碼子及相鄰序列)被插入合適的表達(dá)載體的情況下，無(wú)須額外的翻譯控制信號(hào)。不過(guò)，當(dāng)插入的僅僅是一部分obR編碼序列時(shí)，必須提供外源翻譯控制信號(hào)，可能包括ATG起始密碼子。而且，該起始密碼子必須與所需的編碼序列的讀框同相，以確保整個(gè)插入片段的翻譯。所述外源翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可有多種來(lái)源，它可以是天然的和合成的。通過(guò)包含合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件、轉(zhuǎn)錄終止子等可以提高表達(dá)的效率(參見(jiàn)Bittner等，1987，酶學(xué)方法(Methods inEnzymol.)153:516-544)。
另外，可以選擇宿主細(xì)胞品系，該品系能調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)，或以所需的特定方式修飾并加工其基因產(chǎn)物。蛋白產(chǎn)物的這種修飾(如糖基化)和加工(如裂解)可能對(duì)該蛋白的功能至關(guān)重要。不同的宿主細(xì)胞具有進(jìn)行蛋白和基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾的特征性的、特殊機(jī)制?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保所表達(dá)的外源蛋白的正確修飾和加工。為達(dá)此目的，可以使用具有用于正確加工初級(jí)轉(zhuǎn)錄物、基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細(xì)胞器的真核宿主細(xì)胞。這種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括，但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38，尤其是脈絡(luò)叢細(xì)胞系。
為了長(zhǎng)期、高得率地生產(chǎn)重組蛋白，穩(wěn)定的表達(dá)是優(yōu)選的。例如，可以制備出可穩(wěn)定表達(dá)上述obR序列的細(xì)胞系?？梢杂糜蛇m當(dāng)?shù)谋硎隹刂圃?例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點(diǎn)等)控制并有一種選擇標(biāo)記的DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，而不是用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。在導(dǎo)入外源DNA之后，可以讓制備出的細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后將其轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上。重組質(zhì)粒上的選擇標(biāo)記可以產(chǎn)生選擇抗性，并使得該細(xì)胞能將所述質(zhì)粒穩(wěn)定地整合到其染色體中，生長(zhǎng)型成轉(zhuǎn)化灶，隨后可以對(duì)該轉(zhuǎn)化灶進(jìn)行克隆并擴(kuò)增成細(xì)胞系?？蓪⒃摲椒ㄟm當(dāng)用于制備能表達(dá)obR基因產(chǎn)物的細(xì)胞系。由此制備的細(xì)胞系特別適用于篩選和評(píng)價(jià)能影響obR基因產(chǎn)物的內(nèi)在活性的化合物。
有多種選擇系統(tǒng)可供使用，包括，但不限于可分別用于tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞的單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977,Cell 11:223)、次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(Szybalska和Szybalski,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:2026)、和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(Louy等，1980,Cell 22:817)。另外，可以將抗代謝物抗性用作以下基因的選擇基礎(chǔ)dhfr，它能產(chǎn)生對(duì)氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，1980,Natl.Acad.Sci.USA 77:3567；O′Hare等，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78:1527)；gpt，它可以產(chǎn)生對(duì)霉酚酸的抗性(Mulligan & Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072)；neo，它能產(chǎn)生對(duì)氨基糖苷G-418的抗性(Colbeme-Garapin等，1981,J.Mol.Biol.150:1)；以及hvgro，它能產(chǎn)生對(duì)潮霉素的抗性(Santere等，1984,Gene30:147)。
另外，可以用對(duì)被表達(dá)的融合蛋白特異的抗體方便地純化一切融合蛋白。例如，由Janknecht等所披露的一種系統(tǒng)可用于方便地純化在宿主細(xì)胞系中表達(dá)的非變性融合蛋白(Jamknecht等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8972-8976)。在該系統(tǒng)中，將感興趣的基因亞克隆到痘苗重組質(zhì)粒上，以使該基因的開(kāi)放讀框被翻譯融合到由6個(gè)組氨酸殘基構(gòu)成的氨基末端尾上。將獲自由重組痘苗病毒感染的細(xì)胞的提取物加樣到Ni2+次氮基乙酸-瓊脂糖柱上，并用含有咪唑的緩沖液選擇性地洗脫由組氨酸標(biāo)記的蛋白。
還可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)obR基因產(chǎn)物。任何物種的動(dòng)物均可用于生產(chǎn)obR轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中包括，但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、豬、微型豬(micro-pigs)、山羊和非人靈長(zhǎng)類，如狒狒、猿、和黑猩猩。
本領(lǐng)域已知的任何方法均可用于將obR轉(zhuǎn)基因?qū)雱?dòng)物中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的起始系。這些方法包括，但不限于原核顯微注射法(Hoppe,PC.和Wagner,-33T.E.,1989，美國(guó)專利US 4,873,191)；由逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因向種系中的轉(zhuǎn)入(Van der Putten等，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:6148-6152)；胚胎干細(xì)胞中的基因定向(Thompson等，1989,Cell 56:313-321)；胚胎的電穿孔法(Lo,1983，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol Cell.Biol.)3:1803-1814)；以及精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano等，1989,Cell 57:717-723)等。為了回顧這此方法，可參閱Gordon,1989，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(TransgenicAnimals),Intl.Rev.Cytol.115:171-229，該資料被全文收作本文參考。
本發(fā)明提供了在其所有細(xì)胞中均攜帶有obR轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以及在其某些，而不是所有細(xì)胞中都攜帶有該轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物，即嵌合型動(dòng)物。所整合的轉(zhuǎn)基因可以是一個(gè)轉(zhuǎn)基因，或是多聯(lián)體，例如，頭-頭連接或頭-尾連接的多聯(lián)體。還可以將該轉(zhuǎn)基因選擇性地導(dǎo)入特定的細(xì)胞類型并將其激活，例如，按照Lasko等披露的方法進(jìn)行(Lasko,M.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6236)。這種細(xì)胞型特異激活所需的調(diào)控序列，取決于感興趣的具體細(xì)胞類型，而且，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。當(dāng)希望把obR基因的轉(zhuǎn)基因整合到內(nèi)源obR基因的染色體位點(diǎn)上時(shí)，優(yōu)選基因定向法。簡(jiǎn)單地講，當(dāng)使用這樣一種方法時(shí)，出于整合的需要設(shè)計(jì)含有某些與內(nèi)源obR基因同源的核苷酸序列的載體，通過(guò)與染色體序列的同源重組進(jìn)入內(nèi)源obR基因的核苷酸序列，并破壞其作用。還可以將轉(zhuǎn)基因選擇性地導(dǎo)入特定的細(xì)胞類型，并由此僅僅失活該細(xì)胞類型中的內(nèi)源obR基因，例如，通過(guò)Gu等披露的方法進(jìn)行(Gvu等，1994,Science 265:103-106)。這種細(xì)胞型特異失活所需的調(diào)控序列取決于感興趣的特定細(xì)胞類型，而且，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
一旦制備出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，即可用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定重組obR基因的表達(dá)。初步篩選可以通過(guò)Southern印跡分析或PCR技術(shù)而實(shí)現(xiàn)，對(duì)動(dòng)物組織進(jìn)行分析，以驗(yàn)證是否也發(fā)生了轉(zhuǎn)基因的整合。還可以用如下方法測(cè)定轉(zhuǎn)基因在組織中的表達(dá)水平，這些方法包括，但不限于對(duì)獲自動(dòng)物的組織樣品進(jìn)行Northern印跡分析、原位雜交分析和RT-PCR。還可以用對(duì)obR轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物特異的抗體通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)ObR基因表達(dá)組織樣進(jìn)行評(píng)價(jià)。
C..ObR蛋白抗體本發(fā)明還涉及能特異識(shí)別ObR的一個(gè)或幾個(gè)表位，或ObR的保守變體或ObR的肽片段的表位的抗體。所述抗體包括，但不限于多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab＇)2片段、由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(anti-Id)抗體、以及上述任何抗體的表位結(jié)合片段。
例如，可將本發(fā)明的抗體用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的ObR，并因此可被用作診斷或預(yù)測(cè)方法的一部分，以檢測(cè)出有異常ObR含量的患者。例如，還可將這些抗體用于在下文的3.5節(jié)中所述的化合物篩選方法中，以評(píng)價(jià)試驗(yàn)化合物對(duì)obR基因產(chǎn)物表達(dá)和/或活性的影響。另外，還可將這些抗體用于在下文的5.6節(jié)中所述的基因治療方法中，例如，用于在把正常和/或制備出的ObR-表達(dá)細(xì)胞導(dǎo)入患者體內(nèi)之前對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。還可將這種抗體用作抑制異常ObR活性的方法。因而可將所述抗體用作體重疾病治療方法的組成部分。
為了制備抗體，可以通過(guò)注射ObR、ObR肽(例如，相當(dāng)于所述受體的一個(gè)功能域，如ECD、TM或CD的肽)、截短的ObR多肽(其中的一個(gè)或幾個(gè)功能域，如TM或CD已缺失的ObR)、ObR的功能性等同物或ObR突變體的方法使各種宿主動(dòng)物免疫。所述宿主動(dòng)物可以包括，但不限于兔、小鼠、和大鼠，僅列舉以上幾種。為了加強(qiáng)免疫反應(yīng)，可根據(jù)宿主的物種使用各種佐劑，包括，但不限于Freund＇s(完全和不完全)佐劑、諸如氫氧化鋁的礦物凝膠，諸如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油乳、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚的表面活性物質(zhì)，以及諸如BCG(卡介苗)和小棒桿菌的潛在可用的人的佐劑。多克隆抗體是源于免疫動(dòng)物血清的抗體分子的異質(zhì)群體。
單克隆抗體是特定抗原的抗體的均質(zhì)群體，這種抗體可以用任何方法獲得，這些方法以在培養(yǎng)物中延續(xù)細(xì)胞系的方式產(chǎn)生抗體分子。所述方法包括，但不限于Kohler和Milstein的雜交瘤技術(shù)(1975,Nature 256:495-497；和US 4,376,110)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，1983，當(dāng)代免疫學(xué)(Immunology Today)4:72；Cole等，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:2026-2030),和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，單抗和癌癥治療(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy),Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。所述抗體可以是任何類型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其所有亞型?？梢栽隗w外或體內(nèi)培養(yǎng)能產(chǎn)生本發(fā)明mAb的雜交瘤。在體內(nèi)生產(chǎn)高效價(jià)的mAbs是現(xiàn)有的優(yōu)選生產(chǎn)方法。
此外，還可以使用為了制備“嵌合型抗體”而發(fā)展起來(lái)的技術(shù)(Morrison等，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855；Neubergor等，1984,Nature,312；604-608；Takeda等，1985,Nature,314:452-454)，該方法是通過(guò)剪接源于具有適當(dāng)抗原特異性的抗體分子的基因和源于具有適當(dāng)生物學(xué)活性的人抗體分子的基因而實(shí)現(xiàn)。嵌合型抗體是一種其不同的部分源于不同的動(dòng)物種的分子，如具有源于鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子。
另外，可以改進(jìn)已知的用于制備單鏈抗體的方法(US專利4,946,778；Bird,1988,Science 242:423-426；Huston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；和Ward等，1989,Nature 334:544-546)以制備抗obR基因產(chǎn)物的單鏈抗體。單鏈抗體是通過(guò)由一個(gè)氨基酸橋?qū)v區(qū)的重鏈和輕鏈片段連接而形成的一種單鏈多肽。
可以用已知方法制備能識(shí)別特異表位的抗體片段。例如，這些片段包括，但不限于可用胃蛋白酶消化抗體分子而產(chǎn)生的F(ab＇)2片段，以及可通過(guò)還原F(ab＇)2片段的二硫鍵而產(chǎn)生的Fab片段。另外，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)(Huse等，1989,Sciece,246:1275-1281)，以便能快速、方便的鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段。
反過(guò)來(lái)，又可以將ObR的抗體用于通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)制備“模擬”O(jiān)bR的抗獨(dú)特型抗體(例如，參見(jiàn)Greenspam和Bona,1993，美國(guó)聯(lián)邦實(shí)驗(yàn)生物學(xué)會(huì)雜志(FASEB J)7(5):437-444；和Nissinoff,1991,J.Immunol.147(8):2429-2438)。例如，可將能與ObR ECD結(jié)合并競(jìng)爭(zhēng)性抑制Ob與ObR結(jié)合的抗體用于制備“模擬”ECD的抗獨(dú)特型，因此，該抗獨(dú)特型又能結(jié)合并中和Ob?？蓪⑸鲜鲋泻托钥躬?dú)特型或該抗獨(dú)特異的Fab片段用于治療方法中，用于中和Ob并促進(jìn)體重增加。
D..體重疾病異常性的診斷可將多種方法用于診斷和預(yù)測(cè)性評(píng)估體重疾病，所述疾病包肥胖、惡病質(zhì)和厭食，并用于確認(rèn)具有這種疾病誘因的對(duì)象。
例如，所述方法可以使用諸如在5.1節(jié)中所披露的obR核苷酸序列和在5.3節(jié)中所披露的ObR抗體的制劑。具體地講，可將上述制劑用于諸如(1)檢測(cè)obR基因的存在，或檢測(cè)ObR mRNA相對(duì)無(wú)體重疾病狀態(tài)而言是過(guò)表達(dá)還是表達(dá)不足；(2)檢測(cè)相對(duì)無(wú)體重疾病狀態(tài)而言obR基因產(chǎn)物過(guò)量還是不足；和(3)檢測(cè)由ObR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的干擾或異常性的場(chǎng)合。
例如，本文所披露的方法可以用預(yù)先包裝好的診斷試劑盒實(shí)現(xiàn)，該試劑盒至少含有一種本文所披露的特殊obR-核苷酸序列或ObR抗體制劑，該試劑盒可方便地用于諸如臨床試驗(yàn)的場(chǎng)合，以診斷具有體重疾病異?，F(xiàn)象的患者。
為了檢測(cè)obR突變，可將任何具核細(xì)胞用作基因組核酸的來(lái)源。為了檢測(cè)ObR基因表達(dá)或ObR基因產(chǎn)物，可以使用表達(dá)過(guò)ObR基因的任何細(xì)胞型或組織，如脈絡(luò)叢細(xì)胞。
在下文的5.4.1節(jié)中披露了以核酸為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)。在5.4.2節(jié)中披露了肽檢測(cè)技術(shù)。
1..檢測(cè)obR基因及轉(zhuǎn)錄物可以用多種方法檢測(cè)出發(fā)生在obR基因上的突變?？蓪?lái)自任何具核細(xì)胞的核酸用作這種測(cè)定方法的起點(diǎn)，并可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的核酸制備方法提取核酸。
可將DNA用于生物學(xué)樣品的雜交或擴(kuò)增測(cè)試中，以檢測(cè)與obR基因結(jié)構(gòu)相關(guān)的異常性，包括點(diǎn)突變、插入、缺失和染色體重排。所述測(cè)試包括，但不限于Southern分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)和PCR分析。
例如，所述用于檢測(cè)obR基因特異突變的診斷方法可能包括接觸并培養(yǎng)荻自諸如源于患者的樣品或其它適當(dāng)細(xì)胞來(lái)源的含有重組DNA分子、克隆的基因或其簡(jiǎn)并變體的核酸，和在5.1節(jié)中所披露的一種或幾種包括重組DNA分子、克隆的基因或其簡(jiǎn)并變體的標(biāo)記核酸制劑，培養(yǎng)是在有利于所述制劑與其在obR基因中的互補(bǔ)序列特異退火的條件下進(jìn)行的。優(yōu)選的是，所述核酸制劑的長(zhǎng)度至少為15-30個(gè)核苷酸。在培養(yǎng)之后，將所有未退火的核酸從核酸obR分子雜合體上除去。然后檢測(cè)雜交過(guò)的核酸分子的存在，如果存在這種分子的話。例如，用這種檢測(cè)方法可將來(lái)自感興趣的細(xì)胞類型或組織的核酸固定在諸如薄膜的固相支持物上，或固定在塑料表面上，如微滴定板或聚苯乙烯珠的表面上。在這種情況下，在培養(yǎng)之后，未退火的、在5.1節(jié)中所述類型的標(biāo)記核酸制劑容易被清除。對(duì)保留的、退火的、標(biāo)記的ObR核酸制劑的檢測(cè)可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法完成?？蓪⑴c所述核酸制劑退火的ObR基因序列與根據(jù)正常ObR基因序列預(yù)測(cè)的退火模式加以比較，以確認(rèn)是否存在ObR基因突變。
用于檢測(cè)患者樣品或其它合適細(xì)胞來(lái)源中的ObR基因特異性核酸分子的其它診斷方法可能包括對(duì)該分子進(jìn)行擴(kuò)增，例如，通過(guò)PCR(由Mullis,K.B.,1987，在US 4,683,202中提出的實(shí)驗(yàn)方案)方法擴(kuò)增，然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法檢測(cè)擴(kuò)增的分子。可將所得到的擴(kuò)增序列與根據(jù)當(dāng)擴(kuò)增的核酸中僅含有正?？截惖膐bR基因時(shí)所預(yù)期的序列加以比較，以確定是否存在obR基因突變。
另外，可以用眾所周知的基因型分類方法鑒定帶有obR基因突變的個(gè)體。例如，這類方法包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)的使用，其中涉及所使用的特定限制酶的識(shí)別位點(diǎn)之一的序列變化。
另外，所披露的可用于鑒定obR基因突變的分析DNA多態(tài)性的改進(jìn)方法，利用的是限制酶位點(diǎn)之間可變數(shù)量的短的、串聯(lián)重復(fù)的DNA序列的存在。例如，Weber(US 5,075,217，其全文被收作本文參考)披露了一種DNA標(biāo)記，該標(biāo)記是基于(dC-dA)n-(dG-dT)n短串聯(lián)重復(fù)模序的長(zhǎng)度多態(tài)性。估計(jì)(dC-dT)n-(dG-dT)n模序的平均長(zhǎng)度為30,000-60,000bp。排列如此緊密的標(biāo)記具有高頻率的共遺傳性，而且在諸如obR基因的突變的遺傳突變的鑒定和與obR突變相關(guān)的疾病和異常的診斷方面極為有用。
另外，Caskey等(US 5,364,759，其全文被收作本文參考)披露了一種用于檢測(cè)短的3核苷酸和4核苷酸重復(fù)序列的DNA分布測(cè)定。該方法包括提取諸如obR基因的感興趣的DNA，擴(kuò)增所提取的DNA，以及標(biāo)記重復(fù)的序列，從而作出有關(guān)個(gè)體的DNA的基因型圖。
還可以通過(guò)檢測(cè)并測(cè)定obR轉(zhuǎn)錄測(cè)定obR基因的表達(dá)水平。例如，可以分離已知的或被懷疑能表達(dá)obR基因的細(xì)胞類型組織，如腦、尤其是脈絡(luò)叢細(xì)胞的RNA，并用上文所披露的雜交和PCR方法進(jìn)行測(cè)定。所分離的細(xì)胞可以源于細(xì)胞培養(yǎng)物或患者體內(nèi)。對(duì)取自培養(yǎng)物的細(xì)胞進(jìn)行分析可能是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定的必要步驟，該細(xì)胞被用作基于細(xì)胞的基因治療方法的一部分，或被用于檢測(cè)化合物對(duì)ObR基因表達(dá)的影響。上述分析可以揭示obR基因表達(dá)方式的定量及定性特征，包括obR基因表達(dá)的激活或失活。
在所述檢測(cè)方法的一種實(shí)施方案中，cDNA是由感興趣的RNA合成的(例如，將RNA分子逆轉(zhuǎn)錄成cDNA)。然后將該cDNA上的一段序列用作核酸擴(kuò)增反應(yīng)，如PCR擴(kuò)增反應(yīng)等的模板。在該方法的逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增步驟中被用作合成起始試劑(如引物)的核酸試劑是從披露于5.1節(jié)的obR核酸試劑中選擇的。這種核酸試劑的長(zhǎng)度優(yōu)選為9-30個(gè)核苷酸。為了檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，可以用放射性標(biāo)記的或非放射性標(biāo)記的核苷酸。另外，要制備足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物，以便能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的溴化乙錠染色或通過(guò)其它合適的核酸染色方法顯現(xiàn)該產(chǎn)物。
另外，還可以“在原位”進(jìn)行obR基因表達(dá)的測(cè)定，即直接測(cè)定在活體解剖或切除術(shù)中獲得的患者組織的組織切片(固定的和/或冷凍的)。可將披露于5.1節(jié)中的核酸試劑用作這種原位方法的探針和/或引物(例如，參見(jiàn)Nuovo,G.J.,1992，“原位雜交PCR方法和應(yīng)用(PCR In Situ Hybridization:Protocols And Applications)”Raven Press,NY)。
另外，如果能得到足夠數(shù)量的適當(dāng)細(xì)胞，則可以實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)Northern分析，以測(cè)定obR基因的mRNA表達(dá)水平。
2..檢測(cè)obR基因產(chǎn)物在上文的5.3節(jié)中所披露的抗野生型obR基因產(chǎn)物或其保守性變體或肽片段的抗體還可用于本節(jié)所述的體重疾病診斷和預(yù)測(cè)方法中?？蓪⑦@種診斷方法用于檢測(cè)ObR基因表達(dá)水平上的異常性，或ObR在結(jié)構(gòu)和/或時(shí)序、組織、細(xì)胞或亞細(xì)胞定位方面的異常性，并可以在體內(nèi)或體外，如在活體解剖組織上實(shí)施該方法。
例如，可將抗ObR ECD表位的抗體用于體內(nèi)檢測(cè)ObR在體內(nèi)的表達(dá)型式和表達(dá)水平?？梢杂弥T如不透射線的或其它合適的化合物標(biāo)記所述抗體，并將其注射到受治對(duì)象體內(nèi)，以便用諸如X-射線、CAT-掃描或MRI的方法顯現(xiàn)其與體內(nèi)表達(dá)的ObR的結(jié)合。標(biāo)記過(guò)的抗體片段，例如，含有抗原結(jié)合區(qū)的最小部分的Fab或單鏈抗體可優(yōu)選用于促進(jìn)血腦屏障交聯(lián)的目的，并能夠標(biāo)記在脈絡(luò)叢中表達(dá)的ObR。
另外，任何能檢測(cè)到其存在的ObR融合蛋白或ObR綴合蛋白均可以服用。例如，可以服用由不透射線的或其它合適化合物標(biāo)記的ObR融合或綴合蛋白，并進(jìn)行體內(nèi)顯現(xiàn)，如上文結(jié)合標(biāo)記的抗體所做說(shuō)明?？蓪⒅T如AP-Ob或Ob-AP融合蛋白的其它融合蛋白用于體外診斷方法中。
另外，還可將上述免疫測(cè)定或融合蛋白的檢測(cè)測(cè)定用于活體解剖和尸體解剖樣品的體外測(cè)定，以評(píng)價(jià)ObR的表達(dá)型式。所述測(cè)定并不局限于使用限定ObR ECD的抗體，而且還可包括使用針對(duì)ObR的任何功能域，如ECD、TM和/或CD的表位的抗體。所述每一種或所有標(biāo)記抗體的使用，可提供有關(guān)ObR翻譯和朝向細(xì)胞表面的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的有用信息，并可以鑒定其在加工方面的缺陷。
接受分析的組織或細(xì)胞類型通常包括已知的或被懷疑能表達(dá)ObR基因的組織或細(xì)胞，例如，脈絡(luò)叢細(xì)胞。例如，本文所使用的蛋白提取方法，可以是諸如由Harlow和Lane所披露的方法(Harlow,E.和Lane,D.,1988,“Antibodies:ALaboratory Manual”,Cold Spring Harber Laboratory Pross,Cold Spring Harbor,New York)，該書(shū)被全文收作本文參考。所分離的細(xì)胞可源于細(xì)胞培養(yǎng)物或源于患者。對(duì)來(lái)自培養(yǎng)物的細(xì)胞進(jìn)行分析是評(píng)價(jià)細(xì)胞的一個(gè)必要步驟，該細(xì)胞可被用作基于細(xì)胞的基因治療方法的一部分，或用于檢驗(yàn)化合物對(duì)obR基因表達(dá)的影響。
例如，可以在本發(fā)明中使用的諸如在上文的5.3節(jié)中披露的抗體，或抗體片段可被用于定量或定性檢測(cè)obR基因產(chǎn)物或其保守性變體或肽片段的存在。例如，這一目的可以這樣實(shí)現(xiàn)通過(guò)采用熒光標(biāo)記的抗體(參見(jiàn)本節(jié)以下的內(nèi)容)的免疫熒光技術(shù)，同時(shí)結(jié)合光學(xué)顯微檢測(cè)、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)或熒光測(cè)定。當(dāng)obR基因產(chǎn)物被表達(dá)于細(xì)胞表面上時(shí)，上述方法尤其適用。
可用于本發(fā)明的抗體(或其片段)或Ob融合蛋白或綴合蛋白，還可用于組織學(xué)測(cè)定，如免疫熒光、電子顯微或非免疫測(cè)定，用于原位檢測(cè)obR基因產(chǎn)物或其保守性變體或肽片段，或用于Ob結(jié)合(針對(duì)標(biāo)記過(guò)的Ob融合蛋白)。
原位檢測(cè)可以這樣實(shí)現(xiàn)從患者體內(nèi)取出組織學(xué)樣品，并將本發(fā)明的標(biāo)記抗體或融合蛋白涂在樣品上。最好通過(guò)將標(biāo)記過(guò)的抗體(或片段)涂在生物學(xué)樣品樣上的方式使用所述抗體(或片段)或融合蛋白。采用上述方法不僅可以測(cè)定obR基因產(chǎn)物或保守性變體或肽片段的存在，或Ob結(jié)合的存在，而且可以測(cè)定其在檢查的組織中的存在。通過(guò)使用本發(fā)明，本發(fā)明普通技術(shù)人員將很容易領(lǐng)會(huì)到，可以對(duì)多種組織學(xué)方法(如染色方法)中的任一種加以改進(jìn)，以便實(shí)現(xiàn)所述原位檢測(cè)。
對(duì)ObR基因產(chǎn)物或其保守性變體或肽片段的免疫測(cè)定和非免疫測(cè)定，通常包括在有能確認(rèn)obR基因產(chǎn)物或其保守性變體或肽片段的可檢測(cè)的標(biāo)記抗體存在的條件下培養(yǎng)諸如生理液體、組織提取物、新采集的細(xì)胞或在細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞的裂解液的樣品，和通過(guò)多種本領(lǐng)域公知技術(shù)中的任一種檢測(cè)結(jié)合抗體。
可以使所述生物學(xué)樣品接觸并固定在諸如硝酸纖維素膜的固相支持物或載體上，或固定在其它能固定細(xì)胞、細(xì)胞顆?；蚩扇苄缘鞍椎墓滔嘀С治锷?。然后可以用合適的緩沖液洗滌所述支持物，然后再用可檢測(cè)地標(biāo)記過(guò)的ObR抗體或Ob融合蛋白進(jìn)行處理。接著，用所述緩沖液再次洗滌所述固相支持物，以除去未結(jié)合的抗體或融合蛋白。然后，可以用常規(guī)方法測(cè)定固體支持物上的結(jié)合標(biāo)記物的量。
“固相支持物或載體”是指能夠結(jié)合抗原或抗體的任何支持物。眾所周知的支持物包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和改性纖維素、聚丙烯酰胺、輝長(zhǎng)巖和磁鐵礦。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，所述載體的性質(zhì)或者有一定程度的可溶性或是不溶性的。實(shí)際上，所述支持材料可以為任何可能的結(jié)構(gòu)構(gòu)型，只要所連接的分子能夠與抗原或抗體結(jié)合即可。因此，所述支持物構(gòu)型可以是球形的，如呈球狀，或?yàn)橥矤睿缭谠嚬艿膬?nèi)表面或棒的外表面。另外，其表面可以是平的，如板、試條等。優(yōu)選的支持物包括聚苯乙烯球。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法可以確定很多其它適于結(jié)合抗體或抗原的載體。
可以用公知方法測(cè)定特定的多種ObR抗體或Ob融合蛋的白結(jié)合活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法確定每一種測(cè)定的可操作的和最佳測(cè)試條件。
就抗體而言，對(duì)ObR抗體進(jìn)行可檢測(cè)地標(biāo)記的方法之一是將其同一種酶連接，并將其用于酶免疫測(cè)定(EIA)中(Voller,A.，“酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(TheEnzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA))”,1978,Diagnostic Horizons2:1-7,Microbiological Associates Quarterly Publication,Walkersvslle,MD；Voller,A.等，1978，臨床病理學(xué)(J.Clin.Pathol.)31:507-520；Butler,J.E,1981,Meth.Enzyme.73:482-523；Maggio,E.(著)，1980，酶免疫檢測(cè)(Enzyme lmmuno-assay),CRC Press,Boca Raton,FL；Ishikawa,E.等，(著)，1981,Enzyme,Immunoassay,Kgakushoin,Tokyo)。所述與抗體結(jié)合的酶可以和適當(dāng)?shù)牡孜?，?yōu)選為顯色底物反應(yīng)，以生成能通過(guò)諸如分光光度裝置、熒光測(cè)定裝置或目測(cè)裝置檢測(cè)到的化學(xué)成分。可用于可檢測(cè)地標(biāo)記抗體的酶包括，但不限于蘋(píng)果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母醇脫氫酶、α-磷酸甘油鹽，脫氫酶、磷酸三糖異構(gòu)酶、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。檢測(cè)過(guò)程可以通過(guò)比色法實(shí)現(xiàn)，該方法使用特定酶的一種顯色底物。檢測(cè)過(guò)程還可以通過(guò)目測(cè)比較某種底物的酶促反應(yīng)程度和以類似方法制備的標(biāo)準(zhǔn)物的反應(yīng)程度而實(shí)現(xiàn)。
檢測(cè)還可以用多種其它免疫測(cè)定方法中的任一種而實(shí)現(xiàn)。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)放射性方法標(biāo)記抗體或抗體片段，可以用放射免疫測(cè)定(RIA)方法檢測(cè)ObR(例如，參見(jiàn)Weintraub,B.，放免原理，放射配體格測(cè)技術(shù)的第七次培訓(xùn)教程(Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques),The Endocrine Society,1986年3月，該資料被收作本文參考)。可通過(guò)諸如使用γ-計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器的方法或放射性自顯影法檢測(cè)放射性同位素。
還可以用熒光化合物標(biāo)記所述抗體。當(dāng)用熒光標(biāo)記過(guò)的抗體遇到波長(zhǎng)合適的光照時(shí)，就可通過(guò)熒光檢測(cè)到它的存在。最常用的熒光標(biāo)記化合物有熒光素異硫氰酸鹽、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺。
還可用諸如152Eμ或鑭系其它成員的熒光發(fā)光金屬對(duì)抗體進(jìn)行可檢測(cè)地標(biāo)記。可以用諸如二乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金屬螯合基團(tuán)將所述金屬連接在抗體上。
還可以通過(guò)連接化學(xué)發(fā)光化合物的方法對(duì)所述抗體進(jìn)行可檢測(cè)地標(biāo)記。然后通過(guò)檢測(cè)發(fā)光現(xiàn)象確定化學(xué)發(fā)光標(biāo)記抗體的存在，所述發(fā)光現(xiàn)象是在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生的。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的例子有魯米諾、異魯米諾、theromatic acridinium ester、咪唑、吖啶鹽和草酸酯。
類似地，還可將生物發(fā)光化合物用于標(biāo)記本發(fā)明的抗體。生物發(fā)光是存在于生物系統(tǒng)中的一種化學(xué)發(fā)光，其中，一種催化性蛋白可提高化學(xué)發(fā)光的效率。通過(guò)測(cè)定發(fā)光現(xiàn)象測(cè)定生物發(fā)光蛋白的存在。可用于標(biāo)記目的的重要生物發(fā)光化合物有熒光素、熒光素酶和水母素。
E..能調(diào)節(jié)ObR表達(dá)或活性的篩選測(cè)定設(shè)計(jì)以下測(cè)定是為了鑒定如下化合物能與ObR(包括，但不限于ObR的ECD或CD)相互作用(如與之結(jié)合)的化合物，能與可以和ObR(包括，但不限于ObR的TM或CD)相互作用的胞內(nèi)蛋白相互作用(如與之結(jié)合)的化合物，能干擾ObR與參與ObR-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的跨膜蛋白或胞內(nèi)蛋白的相互作用的化合物，以及能調(diào)節(jié)obR基因活性(即調(diào)節(jié)ObR基因表達(dá)水平)或調(diào)節(jié)ObR水平的化合物。還可以使用鑒定能與ObR基因調(diào)控序列(如啟動(dòng)子序列)結(jié)合的化合物和能調(diào)節(jié)ObR基因表達(dá)的化合物的測(cè)定方法。例如，參見(jiàn)Platt,K.A.,1994,J.Biol.Chem.269:28558-28562，該資料被全文收作本文參考。
可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行篩選的化合物包括，但不限于肽，抗體及其片段，以及其它能與ObR的ECD結(jié)合并模擬由天然配體(即激動(dòng)劑)觸發(fā)的活性或抑制由天然配體(即拮抗劑)觸發(fā)的活性的有機(jī)化合物(例如，肽模擬物)；以及肽，抗體或其片段，和其它能模擬ObR的ECD(或其一部分)并能結(jié)合和“中和”天然配體的有機(jī)化合物。
所述化合物可以包括，但不限于諸如可溶性肽的肽，包括，但不限于隨機(jī)肽文庫(kù)的成員(例如，參見(jiàn)Lam,K.S.等，1991,Nature 354:82-84；Houghten,R.等，1991,Nature 354:84-86)；由D型和/或L型構(gòu)型的氨基酸組成的組合型化學(xué)衍生的分子文庫(kù)；磷酸肽(包括，但不限于隨機(jī)的或部分簡(jiǎn)并的定向磷酸肽文庫(kù)；例如，參見(jiàn)Songyang,Z.等，1993,Cell 72:767-778)；抗體(包括，但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、抗獨(dú)特性抗體、嵌合型或單鏈抗體、和FAb、F(ab＇)2和FAb表達(dá)文庫(kù)片段，及其表位結(jié)合片段)，以及小型有機(jī)或無(wú)機(jī)分子。
可以用本發(fā)明方法篩選的其它化合物包括，但不限于能夠通過(guò)血腦屏障進(jìn)入適當(dāng)細(xì)胞(例如，脈絡(luò)叢或下丘腦細(xì)胞)、并影響obR基因或與ObR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)的某些其它基因的表達(dá)(例如，通過(guò)與參與基因表達(dá)的調(diào)控區(qū)或轉(zhuǎn)錄因子相互作用)的小型有機(jī)分子；或能影響ObR活性(例如，通過(guò)抑制或加強(qiáng)CD的酶促活性)或與ObR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的某些其它胞內(nèi)因子，如gp130的活性的化合物。
計(jì)算機(jī)模擬和檢索技術(shù)可用于化合物鑒定，或改進(jìn)已鑒定的能調(diào)節(jié)ObR表達(dá)或活性的化合物。已鑒定到這樣的化合物或組合物，其活性位點(diǎn)或區(qū)域已被鑒定。所述活性位點(diǎn)通常是配體結(jié)合位點(diǎn)，Ob與ObR本身的相互作用域。所述活性位點(diǎn)可以用本領(lǐng)域已知方法鑒定，例如，包括基于肽的氨基酸序列、核酸的核苷酸序列或?qū)ο嚓P(guān)化合物或組合物與其天然配體的復(fù)合體所做的研究進(jìn)行鑒定。在后一種情況下，可以用化學(xué)或X-射線晶體學(xué)方法發(fā)現(xiàn)活性位點(diǎn)，其是通過(guò)尋找因子上復(fù)合的配體的存在位置而進(jìn)行。
然后，測(cè)定活性位點(diǎn)的三維幾何結(jié)構(gòu)。這一目的可通過(guò)包括X-射線晶體學(xué)在內(nèi)的已知方法而實(shí)現(xiàn)，該方法可以測(cè)定完整的分子結(jié)構(gòu)。另一方面，可以用固相或液相NMR方法測(cè)定某些分子內(nèi)距離?？梢允褂萌魏谓Y(jié)構(gòu)測(cè)定的其它實(shí)驗(yàn)方法來(lái)測(cè)定部分或整個(gè)幾何結(jié)構(gòu)。在測(cè)定幾何結(jié)構(gòu)時(shí)，可以使用天然或人工的復(fù)合配體，該配體可以提高活性位點(diǎn)測(cè)定的精度。
如果測(cè)得一種不完全的或不夠精確的結(jié)構(gòu)，可以用基于計(jì)算機(jī)的數(shù)字模擬方法來(lái)完善其結(jié)構(gòu)或提高其精度?？梢允褂靡磺凶R(shí)別模擬方法，包括專用于特定生物聚合物，如蛋白或核酸的參數(shù)模擬，基于計(jì)算分子運(yùn)動(dòng)的分子動(dòng)態(tài)模擬，基于熱集團(tuán)的統(tǒng)計(jì)力學(xué)模擬或復(fù)合模擬，對(duì)于大部分類型的模型來(lái)說(shuō)，標(biāo)準(zhǔn)分子力場(chǎng)表示組成性原子和基團(tuán)之間所必需的力，并可以從物理化學(xué)中已知的力場(chǎng)中力加以選擇。不完全的或不夠精確的實(shí)施結(jié)構(gòu)可被用作由上述模擬方法計(jì)算出來(lái)的完整的、更精確的結(jié)構(gòu)的限制。
最后，在通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法、模擬方法或其綜合方法測(cè)定了活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)之后，通過(guò)檢索包括化合物及其分子結(jié)構(gòu)信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以確定能候選的調(diào)節(jié)化合物。上述檢索所找到的化合物的結(jié)構(gòu)與測(cè)定的活性活點(diǎn)結(jié)構(gòu)相吻合，并能與構(gòu)成該活性位點(diǎn)的基團(tuán)相互作用。上述檢索可以人工完成，但最好由計(jì)算機(jī)輔助完成。通過(guò)檢索所發(fā)現(xiàn)的化合物為潛在的ObR調(diào)節(jié)化合物。
另外，還可將上述方法用于從已知的調(diào)節(jié)化合物或配體中鑒定改進(jìn)的調(diào)節(jié)化合物。可以改變已知化合物的組成，并可以用上述實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模擬方法對(duì)新的組成進(jìn)行分析，以測(cè)定這種改變的結(jié)構(gòu)效應(yīng)。然后將改變了的結(jié)構(gòu)與該化合物的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)加以比較，以確定是否取得了改進(jìn)的適用性或相互作用效果。用這種方法可以快速評(píng)估組成的系統(tǒng)性變化，例如側(cè)基的改變，以獲得具有提高了的特異性或活性的改進(jìn)的調(diào)節(jié)化合物或配體。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可用于根據(jù)Ob、ObR和相關(guān)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子的活性位點(diǎn)鑒定的其它實(shí)施和計(jì)算機(jī)模擬方法是顯而易見(jiàn)的。
分子模擬系統(tǒng)的例子有CHARMm和QUANTA程序(PolygenCorporation,Waltham,MA)。CHARMm執(zhí)行能量最低化和分子動(dòng)力學(xué)功能。QUANTA執(zhí)行分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)建、作圖模擬和分析功能。QUANTA可以完成對(duì)各分子之間相互作用的構(gòu)建、修飾、顯現(xiàn)和行為分析。
有很多文章對(duì)藥物與特異蛋白的相互作用的計(jì)算機(jī)模擬進(jìn)行了綜述，例如，Rotivinen等，1988,Acta Pharmaceutical Fenmica 97:159-166；Ripka，新科學(xué)家(New Scientist)54-57(June 16,1988)；Mckinaly和Rossmanm,1989，藥學(xué)，毒理學(xué)年度綜述(Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.)29:111-122；Pemy和Davies，藥物設(shè)計(jì)中的結(jié)構(gòu)-活性定量關(guān)系(OSAR:Quantrtative Structure-Activity Relationships in Drug Design)pp.189-193(Alan R.Liss,Inc.1989)；Lewis和Dean,1989Proc.R.Soc.Lond.236:125-140和141-162；有關(guān)核酸成分的模型受體，可參考Askew等，1989,J.Am.Chem.Soc.111:1082-1090?？捎糜诤Y選并圖解說(shuō)明化合物的其它計(jì)算機(jī)程序可由諸如BioDesign,Inc.(Pasadena,CA)、Allelix,Inc.(Mississauge,Omario Canada)和Hypercube,Inc.(Cambridge,Ontario)的公司提供。雖然這些程序的設(shè)計(jì)主要是用于對(duì)特定蛋白特異的藥物的，但也可將其修改成針對(duì)DNA或RNA的區(qū)域特異的藥物，一旦所述區(qū)域得以鑒定的話。
盡管以上說(shuō)明是就設(shè)計(jì)并制備可以改變結(jié)合的化合物而言，但也可用于篩選已知化合物文庫(kù)，其中包括天然產(chǎn)物或合成化合物，以及包括蛋白在內(nèi)的生物活性材料，以尋找到可作為抑制劑或激活劑的化合物。
通過(guò)諸如本文所披露的測(cè)定方法所鑒定的化合物可用于諸如闡明obR基因產(chǎn)物的生物學(xué)功能和用于緩解體重疾病的目的。在下文的5.5.4節(jié)中將討論用于檢測(cè)由諸如5.5.1至5.5.3節(jié)所述方法鑒定的化合物的作用的測(cè)定方法。
1..能與ObR結(jié)合的化合物的體外篩選測(cè)定為了鑒定能與ObR(包括，但不限于ObR的ECD、或CD)相互作用(例如，與之結(jié)合)的化合物，可以設(shè)計(jì)體外系統(tǒng)。例如，所鑒定的化合物可用于調(diào)節(jié)野生型和/或突變型obR基因產(chǎn)物的活性；可用于闡明ObR的生物學(xué)功能；可用于篩選能破壞正常的ObR相互作用的鑒定化合物；或由其本身破壞這種相互作用。
用于鑒定能與ObR結(jié)合的化合物的測(cè)定方法的原理包括制備ObR與試驗(yàn)化合物的反應(yīng)混合物，在足于使以上兩個(gè)部分相互作用并結(jié)合的條件下和反應(yīng)時(shí)間里反應(yīng)，以形成可以從該反應(yīng)混合物中清除和/或檢測(cè)到的復(fù)合物。所用的ObR類型可根據(jù)篩選測(cè)定的目的而有所變化。例如，在尋找天然配體的激動(dòng)劑時(shí)，可以使用全長(zhǎng)ObR或可溶性截短O(píng)bR，如，其分子中缺失了TM和/或CD的ObR，相當(dāng)于ECD的肽或含有與有利于該測(cè)定系統(tǒng)(例如，所得到的復(fù)合物的標(biāo)記、分離等)的蛋白或多肽融合的ObR ECD的融合蛋白。一旦鑒定所尋找的能與所述胞質(zhì)域相互作用的化合物，就可以使用相當(dāng)于ObR CD的肽和含有ObR CD的融合蛋白。
可以多種方式實(shí)施所述篩選測(cè)定。例如，實(shí)施上述測(cè)定的一種方法包括將ObR蛋白、多肽、肽或融合蛋白或試驗(yàn)化合物固定在一種固相上，并在反應(yīng)結(jié)束時(shí)測(cè)定固定在所述固相上的ObR/試驗(yàn)化合物復(fù)合物。在所述方法的一種實(shí)施方案中，可將ObR反應(yīng)劑固定在一種固體表面上，而未被固定的試驗(yàn)化合物可進(jìn)行直接或間接固定。
在實(shí)踐中，微量滴定板可被方便地用作所述固相。被固定的組分可以是通過(guò)非共價(jià)或共價(jià)結(jié)合而固定的。非共價(jià)結(jié)合可以通過(guò)將蛋白溶液簡(jiǎn)單地涂在固體表面上并干燥而實(shí)現(xiàn)。另外，可以用對(duì)待固定的蛋白特異的固定化抗體，優(yōu)選為單克隆抗體，把所述蛋白固定在固體表面上。可事先制備好所述固體表面待用。
為了實(shí)施所述測(cè)定，將非固定化的組分加到含有該固定組分的涂層表面上。在反應(yīng)結(jié)束之后，除去未反應(yīng)的組分(例如，用洗滌方法)，其作業(yè)條件為使所有形成的復(fù)合物仍固定在固體表面上?？梢杂枚喾N方法完成對(duì)固定在固體表面上的復(fù)合物的檢測(cè)。如果對(duì)事先未固定的組分進(jìn)行預(yù)標(biāo)記的話，檢測(cè)到固定在固體表面上的標(biāo)記即表明形成了復(fù)合物。如果不對(duì)事先未固定的組分進(jìn)行預(yù)標(biāo)記的話，則可以用一種間接標(biāo)記來(lái)檢測(cè)固定在固體表面上的復(fù)合物，例如，用對(duì)所述事先未固定的組分特異的標(biāo)記抗體(該抗體可以是用標(biāo)記過(guò)的抗-Ig抗體直抗或間接標(biāo)地標(biāo)記的)。
另外，可以在液相中進(jìn)行反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物和未反應(yīng)的組分分離，并檢測(cè)復(fù)合物；例如，用對(duì)ObR蛋白、多肽、肽或融合蛋白或試驗(yàn)化合物特異的固定化抗體固定生成于溶液中的一切復(fù)合物，并用對(duì)有可能生成的復(fù)合物的其它組分特異的標(biāo)記抗體檢測(cè)被固定的復(fù)合物。
另外，可以用基于細(xì)胞的測(cè)定鑒定能與ObR相互作用的化合物。為此，可以使用能表達(dá)ObR的細(xì)胞系或通過(guò)遺傳工程方法產(chǎn)生的(例如，通過(guò)ObRDNA轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo))能表達(dá)ObR的細(xì)胞系(例如，COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)?？梢酝ㄟ^(guò)與天然Ob比較或競(jìng)爭(zhēng)的方式測(cè)定試驗(yàn)化合物與諸如由宿主細(xì)胞表達(dá)的obR ECD的相互作用。
2..測(cè)定能與ObR相互作用的胞內(nèi)蛋白任何適用于測(cè)定蛋白與蛋間相互作用的方法均可用于鑒定能與ObR相互作用的跨膜蛋白或胞內(nèi)蛋白?？梢允褂玫某Ｒ?guī)方法有共免疫沉淀、交聯(lián)，以及通過(guò)梯度柱或?qū)游鲋鶎?duì)細(xì)胞裂解液或獲自細(xì)胞裂解液的蛋白和ObR進(jìn)行共純化，以鑒定所述裂解液中能與ObR相互作用的蛋白。為了進(jìn)行上述測(cè)定，所使用的ObR組分可以是全長(zhǎng)ObR、缺乏膜固著區(qū)(membrane-anchoringregion)的可溶性衍生物(例如，一種截短的ObR，其中的TM已缺失，所產(chǎn)生的截短分子含有與CD融合的ECD)、相當(dāng)于CD的肽或含有ObR的CD的融合蛋白。一旦分離到這種胞內(nèi)蛋白，即可對(duì)其進(jìn)行鑒定，然后再將其用于標(biāo)準(zhǔn)方法中鑒定能與它相互作用的蛋白。例如，用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，例如，通過(guò)Edman降解技術(shù)(例如，參見(jiàn)Creighton,1983，“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原理(Proteins:Structures and Molecular Principles)”,W.H.Freeman & Co.,N.Y,pp.34-49)至少能測(cè)定與ObR相互作用的胞內(nèi)蛋白的部分氨基酸序列。所得到的氨基酸序列可用于指導(dǎo)能被用于篩選編碼所述胞內(nèi)蛋白的基因序列的寡核苷酸混合物的制備。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)雜交或PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)篩選。用于制備寡核苷酸混合物和篩選的技術(shù)是眾所周知的(例如，參見(jiàn)Ausubel的著述，同上，和PCR方法方法和應(yīng)用指南(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications),1990 Innis,M.等著，Academic Press,Inc.,New York)。
另外，可以采用能同時(shí)鑒定編碼能與ObR相互作用的跨膜蛋白或胞內(nèi)蛋白的基因的方法。例如，所述方法包括以與公知的入gtl1文庫(kù)抗體檢測(cè)技術(shù)類似的方法，用標(biāo)記的ObR蛋白、或ObR多肽、肽或融合蛋白，例如，與一種標(biāo)記(如酶、熒光劑、發(fā)光蛋白或染料)融合的ObR多肽或ObR功能域、或Ig-Fc功能域檢測(cè)表達(dá)、文庫(kù)。
詳細(xì)披露了一種用于體內(nèi)檢測(cè)蛋白相互作用的方法雙雜交系統(tǒng)，但其用意僅在于說(shuō)明，而不是限定。該系統(tǒng)的一種型式業(yè)已披露(Chien等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9578-9582)并可通過(guò)商業(yè)途徑從Clontech(Palo Alto,CA)獲得。
簡(jiǎn)單地講，用上述系統(tǒng)構(gòu)建編碼兩種雜合蛋白的質(zhì)粒一種質(zhì)粒由編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白的DNA結(jié)合域的核苷酸和與之融合的編碼ObR、ObR多肽、肽或融合蛋白的核苷酸序列組成，而另一種質(zhì)粒由編碼所述轉(zhuǎn)錄激活蛋白的激活域的核苷酸和與之融合的編碼一種未知蛋白的、作為cDNA文庫(kù)的一部分重組進(jìn)入該質(zhì)粒的cDNA組成。將所述DNA-結(jié)合域融合質(zhì)粒和cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)入一種釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)菌株，該菌株具有一個(gè)報(bào)道基因(例如，HBS或lacZ)，其調(diào)控區(qū)含有轉(zhuǎn)錄激活物結(jié)合位點(diǎn)。僅有任一種雜合蛋白都不能激活該報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄DNA-結(jié)合域的雜交不能實(shí)現(xiàn)，因?yàn)樗荒墚a(chǎn)生激活功能，激活域的雜交也不能實(shí)現(xiàn)，因?yàn)樗荒芏ㄎ挥诩せ钗锝Y(jié)合位點(diǎn)。兩種雜合蛋白的相互作用可以重建功能性激活蛋白，并導(dǎo)致所述報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)，通過(guò)測(cè)定報(bào)導(dǎo)基因產(chǎn)物可以檢測(cè)出該基因的表達(dá)。
可將上述雙雜交系統(tǒng)或相關(guān)方法用于篩選能與“誘鉺”基因產(chǎn)物相互作用的蛋白的激活域文庫(kù)。舉例來(lái)說(shuō)，而不是要進(jìn)行限定，可將ObR用作誘鉺基因產(chǎn)物。將全基因組或cDNA序列同編碼激活域的DNA融合。將該文庫(kù)和編碼與所述DNA結(jié)合域融合的雜合誘餌obR基因產(chǎn)物共轉(zhuǎn)化到酵母報(bào)導(dǎo)菌株中，并篩選所得到的能表達(dá)該報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)化體。例如(其用意不是限定)，可以將諸如在圖1、圖3或圖6中示出的obR(或obR的一個(gè)功能域)的開(kāi)放讀框的誘餌obR基因序列克隆到一種載體上，以使其可翻譯地融合于編碼GAL 4蛋白的DNA-結(jié)合域的DNA上。純化所述克隆，并提取決定報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)的文庫(kù)質(zhì)粒。然后用DNA測(cè)序方法鑒定由該文庫(kù)質(zhì)粒編碼的蛋白。
然后，可以用本領(lǐng)域經(jīng)常采用的方法構(gòu)建所述細(xì)胞系的cDNA文庫(kù)，可用該文庫(kù)檢測(cè)能與誘餌基因產(chǎn)物相互作用的蛋白。例如，按照本文所披露的特定系統(tǒng)，可將所述cDNA片段插入一種載體，以使其可翻譯地與GAL 4的轉(zhuǎn)錄激活域GAL 4融合?？蓪⒃撐膸?kù)隨誘餌ObR基因-GAL 4融合質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)化到含有l(wèi)acZ基因的酵母菌株中，該基因由含有GAL 4激活序列的啟動(dòng)子啟動(dòng)。將一種由cDNA編碼的蛋白與能與誘餌ObR基因產(chǎn)物相互作用的GAL 4翻譯激活域融合，可以重建一種活性GAL 4蛋白，并因此啟動(dòng)HIS3基因的表達(dá)。通過(guò)其在含有缺少組氨酸的半固體瓊脂基培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上的生長(zhǎng)，可以測(cè)定能表達(dá)HIS3的克隆。然后從這些菌株中純化cDNA，并將其用于通過(guò)本領(lǐng)域常用的方法制備并分離所述誘鉺obR基因相互作用蛋白。
3.測(cè)定能干擾ObR/胞內(nèi)或ObR/跨膜大分子的化合物相互作用所述能與ObR相互作用的大分子在本文中是指“結(jié)合配偶體”。所述結(jié)合體配偶體很可能與ObR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)，并因此參與ObR對(duì)體重的調(diào)節(jié)。因此，希望鑒定能干擾或破壞上述結(jié)合配偶體與Ob的相互作用的化合物，可將該化合物用于調(diào)節(jié)ObR活性并控制與ObR活性相關(guān)的體重疾病。
用于鑒定能干擾ObR與其配偶體之間的相互作用的測(cè)定系統(tǒng)的基本原理包括制備一種反應(yīng)混合物，該混合物含有在上文的5.5.1節(jié)和5.5.2節(jié)中所披露的ObR蛋白、多肽、肽或融合蛋白，以及所述結(jié)合配偶體，反應(yīng)是在使以上兩種組分相互作用并結(jié)合成復(fù)合物的條件下進(jìn)行，并反應(yīng)足夠的時(shí)間。為了試驗(yàn)一種化合物的抑制活性，在有和沒(méi)有該試驗(yàn)化合物的條件下制備反應(yīng)混合物。試驗(yàn)化合物可在一開(kāi)始即包含于反應(yīng)混合物中，或在加入ObR組分及其配偶體一段時(shí)間之后再加入。對(duì)照反應(yīng)混合物是在沒(méi)有試驗(yàn)化合物的條件下培養(yǎng)或與空白對(duì)照劑一起培養(yǎng)。然后檢測(cè)由ObR組分和結(jié)合配偶體所生成的任何復(fù)合物。在對(duì)照反應(yīng)中可生成復(fù)合物，但在含有試驗(yàn)化合物的反應(yīng)混合物中不能，這表明所述試驗(yàn)化合物能干擾ObR與其互作型結(jié)合配偶體的相互作用。另外，可將在含有試驗(yàn)化合物和正常ObR蛋白的反應(yīng)混合物中的復(fù)合物生成與在含有試驗(yàn)化合物和突變型ObR的反應(yīng)混合物中的復(fù)合物生成加以比較。在希望鑒定能破壞突變型ObR，而不是正常ObR的相互作用的條件下，這種比較可能很重要。
能干擾ObR及其結(jié)合配偶體的相互作用的測(cè)定可以異相或均相型式進(jìn)行。異相測(cè)定包括將ObR組分的產(chǎn)物或其結(jié)合配偶體固定在一種固相上，并在反應(yīng)結(jié)束時(shí)檢測(cè)固定在該固相上的復(fù)合物。在均相測(cè)定中，整個(gè)反應(yīng)是在液相中進(jìn)行的。在每一種方法中，反應(yīng)物的加入順序可以改變，以獲得有關(guān)被試驗(yàn)化合物的不同資料。例如，通過(guò)在有試驗(yàn)物質(zhì)的條件下進(jìn)行反應(yīng)可以鑒定能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用干擾其相互作用的試驗(yàn)化合物；即在加入ObR組分和可相互作用的結(jié)合配偶體之前或同時(shí)加入試驗(yàn)物質(zhì)。另外，通過(guò)在復(fù)合物生成之后將試驗(yàn)化合物加入反應(yīng)混合物中的方法可以檢驗(yàn)?zāi)芷茐念A(yù)先生成的復(fù)合物的試驗(yàn)化合物，例如，有高結(jié)合常數(shù)的化合物，它能將復(fù)合物中的一種成分排斥出去。下面將對(duì)各種方法作扼要說(shuō)明。
在異相測(cè)定系統(tǒng)中，將ObR組分或可相互作用的結(jié)合配偶體固定在固體表面上，而對(duì)未固定的一類組分進(jìn)行直接或間接標(biāo)記。在實(shí)踐中，經(jīng)常使用微量滴定板。被固定的組分可以是通過(guò)非共價(jià)鍵或共價(jià)鍵結(jié)合固定化的。非共價(jià)結(jié)合可以通過(guò)簡(jiǎn)單地將obR基因產(chǎn)物或結(jié)合配偶體的溶液涂在固體表面上并干燥而實(shí)現(xiàn)。另外，可以用對(duì)待固定的組分特異的固定化抗體將該組分固定在固體表面上。該表面可事先制備并貯存待用。
為了進(jìn)行所述測(cè)定，讓固定組分的配偶體在有或沒(méi)有試驗(yàn)化合物的條件下接觸涂過(guò)的表面。在反應(yīng)結(jié)束后，將未反應(yīng)的組分除去(例如，通過(guò)洗滌)，所生成的一切復(fù)合物將仍然固定在所述固體表面上。可以用多種方法實(shí)施對(duì)固定在固體表面上的復(fù)合物的檢測(cè)。在對(duì)非固定的組分作過(guò)預(yù)先標(biāo)記的情況下，通過(guò)檢測(cè)固定在所述表面上的標(biāo)記物可以表明復(fù)合物的生成。在未對(duì)非固定的組分進(jìn)行預(yù)先標(biāo)記的情況下，可以用一種直接標(biāo)記物檢測(cè)固定在所述表面上的復(fù)合物；例如，使用一種對(duì)開(kāi)始時(shí)非固定的組分特異的標(biāo)記抗體(該抗體是用標(biāo)記過(guò)的抗-Ig抗體直接或間接標(biāo)記過(guò)的)。根據(jù)反應(yīng)組分的加入順序，可以檢測(cè)出能抑制復(fù)合物生成或破壞預(yù)先生成的復(fù)合物的試驗(yàn)化合物。
另外，可以在液相中，在有或沒(méi)有試驗(yàn)化合物的條件下進(jìn)行反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物和非反應(yīng)的組分分離，并檢測(cè)復(fù)合物；例如，用對(duì)結(jié)合組分之一特異的固定化抗體固定溶液中所生成的任何復(fù)合物，并用一種對(duì)另一個(gè)配偶體特異的標(biāo)記抗體檢測(cè)固定的配偶體。同樣，根據(jù)向液相中加入反應(yīng)物的順序，可以鑒定能抑制復(fù)合物或能破壞預(yù)先生成的復(fù)合物的化合物。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，可以采用均相測(cè)定。在該方法中，制備一種由ObR組分和可相互作用的結(jié)合配偶體組成的預(yù)先生成復(fù)合物，其中的ObR或其結(jié)合配偶體是預(yù)先標(biāo)記過(guò)的，但由標(biāo)記物所產(chǎn)生的信號(hào)因復(fù)合物的生成而被猝滅(例如，參見(jiàn)Rubenstein的美國(guó)專利US 4,109,496，該專利使用這種方法進(jìn)行免疫測(cè)定)。加入能競(jìng)爭(zhēng)并排斥預(yù)先生成的復(fù)合物中的一種組分的試驗(yàn)物質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)高于背景的信號(hào)。通過(guò)這種方法可以鑒定能破壞ObR/胞內(nèi)結(jié)合配偶體相互作用的試驗(yàn)物質(zhì)。
在一種具體實(shí)施方案中，可制備一種用于固定的ObR融合體。例如，可以用諸如pGEX-5X-1的融合載體將ObR或諸如與CD相當(dāng)?shù)碾钠稳诤嫌诠入赘孰?S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因上，用這種方法保留其在所產(chǎn)生的融合蛋白中的結(jié)合活性?？梢杂迷谏衔牡?.3節(jié)中所述的本領(lǐng)域中常用的方法純化可相互作用的結(jié)合配偶體，并制備單克隆抗體。例如，可以用本領(lǐng)域中常用的方法用放射性同位素125I標(biāo)記所述單克隆抗體。例如，在異相測(cè)定中，可將GST-ObR融合蛋白固定在谷胱甘肽-瓊脂糖顆粒上。然后在有或沒(méi)有試驗(yàn)化合物的條件下，以使得相互作用和結(jié)合能夠發(fā)生的方式加入可相互作用的結(jié)合配偶體。在反應(yīng)時(shí)間結(jié)束后，可將未結(jié)合的材料洗去，并可將標(biāo)記過(guò)的單克隆抗體加入該系統(tǒng)中，使其與復(fù)合的組分結(jié)合。通過(guò)測(cè)定仍然與谷胱甘肽-瓊脂糖球結(jié)合的放射性活性量，可以測(cè)定obR基因產(chǎn)物與可相互作用的結(jié)合配偶體之間的相互作用。試驗(yàn)化合物對(duì)上述相互作用的成功抑制可導(dǎo)致所測(cè)得放射性活性的下降。
另外，可以在沒(méi)有固體谷胱甘肽-瓊脂糖顆粒的條件下在液體中混合GST-ObR融合蛋白和可相互作用的結(jié)合配偶體。可以在以上組分相互作用期間或之后加入試驗(yàn)化合物。然后將該混合物加入谷胱甘肽-瓊脂糖顆粒中，并洗去未結(jié)合的材料。同樣，可通過(guò)加入標(biāo)記過(guò)的抗體并測(cè)定與所述顆粒相關(guān)的放射性活性的方法檢測(cè)對(duì)ObR/結(jié)合配偶體相互作用的抑制程度。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，可以用相當(dāng)于ObR和/或可相互作用或結(jié)合的配偶體(此時(shí)該結(jié)合配偶體是蛋白)的結(jié)合域的肽片段取代一種或兩種全長(zhǎng)蛋白，實(shí)施相同的技術(shù)。可以用本領(lǐng)域中常用方法的任一種鑒定并分離結(jié)合位點(diǎn)。所述方法包括，但不限于誘變編碼所述蛋白之一的基因，并通過(guò)共免疫沉淀測(cè)定對(duì)結(jié)合的破壞作用。然后可以選擇編碼復(fù)合物中第二種組分的基因的補(bǔ)償突變。對(duì)編碼相應(yīng)蛋白的基因所作的序列分析將揭示出相應(yīng)于參與相互作用結(jié)合的蛋白區(qū)域的突變。另外，可以用上述方法將一種蛋白固定在一種固體表面上，并使其相互作用于并結(jié)合于其標(biāo)記過(guò)的結(jié)合配偶體上，該結(jié)合配偶體曾用諸如胰蛋白酶的蛋白酶處理過(guò)。在洗滌之后，一種短的、含有所述結(jié)合域的標(biāo)記過(guò)的肽仍保持與固相材料結(jié)合，可以分離并通過(guò)氨基酸測(cè)序鑒定該肽。而且，一旦得到編碼胞內(nèi)結(jié)合配偶體的基因，即可制備出能表達(dá)所述蛋白的肽片段的短的基因片段，然后可測(cè)試其結(jié)合活性并進(jìn)行純化或合成。
例如(不是出于限定目的)，可以通過(guò)制備GST-ObR融合蛋白并使其結(jié)合于谷胱甘肽瓊脂糖顆粒上而將obR基因產(chǎn)物固定在一種如上所述的固體材料上?？梢杂弥T如35S的放射性同位素標(biāo)記可相互作用的結(jié)合配偶體，并用諸如胰蛋白酶的蛋白酶進(jìn)行裂解。然后將裂解產(chǎn)物加入固定的GST-ObR融合蛋白中，并使其結(jié)合。在洗去未結(jié)合的肽之后，可以用眾所周知的方法洗脫代表胞內(nèi)結(jié)合配偶體結(jié)合域的標(biāo)記過(guò)的結(jié)合材料，純化、并分析其氨基酸序列?？梢酝ㄟ^(guò)合成方法生產(chǎn)所鑒定的肽，或用重組DNA技術(shù)將其融合在合適的易化蛋白。
4..鑒定能緩解體重疾病的化合物的測(cè)定方法可以檢測(cè)包括，但不限于通過(guò)諸如在上文的5.5.1至5.5.3節(jié)中所披露的測(cè)定方法鑒定的化合物在緩解包括肥胖在內(nèi)的體重疾病綜合癥方面的能力。上述測(cè)定方法可以鑒定影響ObR活性的化合物(例如，能與ObR結(jié)合、抑制天然配體結(jié)合，和激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(激動(dòng)劑)或封阻激活作用(拮抗劑)的化合物，和能與ObR的天然配體結(jié)合并中和配體活性的化合物)；或能影響obR基因活性的化合物(通過(guò)影響obR基因的表面，包括分子，例如，能影響或干擾剪接過(guò)程的蛋白或小的有機(jī)分子，以便調(diào)節(jié)全長(zhǎng)或截短型式的ObR的表達(dá))。不過(guò)，應(yīng)當(dāng)指出的是，所披露的測(cè)定方法還可用于鑒定能調(diào)節(jié)ObR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物(例如，能影響下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的化合物，如酪氨酸激酶或磷酸酶活性的抑制劑或增強(qiáng)劑，所述酶參與由Ob與ObR結(jié)合而激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))。能影響ObR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的另一步驟的化合物的鑒定和使用也屬于本發(fā)明范疇，其中，obR基因和/或obR基因產(chǎn)物參與了這一途徑，并可以通過(guò)影響這一途徑來(lái)調(diào)節(jié)ObR對(duì)體重疾病發(fā)展的影響。所述化合物可被用作治療體重疾病方法的一部分。
本發(fā)明涉及基于細(xì)胞和基于動(dòng)物模型的、用于鑒定具有減輕體重疾病綜合癥能力的化合物的測(cè)定方法。所述基于細(xì)胞的測(cè)定系統(tǒng)還可被用作測(cè)定天然配體Ob，包括重組或合成產(chǎn)生的Ob和Ob突變體的純度和效力的“金標(biāo)準(zhǔn)(gold standard)”。
可將基于細(xì)胞的系統(tǒng)用于鑒定能起到緩解體重疾病綜合癥作用的化合物。例如，所述細(xì)胞系統(tǒng)可以包括重組或非重組細(xì)胞，如能表達(dá)obR基因的細(xì)胞系。例如，可以使用脈絡(luò)叢細(xì)胞、下丘腦細(xì)胞或源于脈絡(luò)叢或下丘腦的細(xì)胞系。另外，可將通過(guò)遺傳工程方法產(chǎn)生的能表達(dá)功能性O(shè)bR可效應(yīng)于通過(guò)天然Ob配體的激活作用的表達(dá)宿主細(xì)胞(例如，COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成纖維細(xì)胞)用作測(cè)定的終止，例如，通過(guò)化學(xué)或表型變化、另一個(gè)宿主細(xì)胞基因誘導(dǎo)、離子流動(dòng)的變化(例如，Ca+)+、宿主細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸化等的測(cè)定而實(shí)現(xiàn)。
在使用所述細(xì)胞系統(tǒng)時(shí)，用被懷疑具有緩解體重疾病綜合癥的能力的化合物處理細(xì)胞，化合物的濃度高到、而且處理時(shí)間長(zhǎng)到足于誘發(fā)被處理的細(xì)胞產(chǎn)生這種體重疾病的緩解作用。處理之后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，以測(cè)定obR基因表達(dá)的變化，例如，測(cè)定細(xì)胞裂解液中的obR mRNA轉(zhuǎn)錄物(例如，通過(guò)Northern分析法)或測(cè)定細(xì)胞中ObR蛋白的表達(dá)；能調(diào)控或調(diào)節(jié)obR基因表達(dá)的化合物是治療劑的優(yōu)良候選對(duì)象。另外，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢查，以確定是否有一種或幾種體重疾病樣細(xì)胞表型已變得接近更正?；蚋吧谋硇?、非體重疾病表型或一種更傾向于產(chǎn)生低發(fā)病率或嚴(yán)重度的疾病綜合癥的表型。另外，可以測(cè)定ObR作為其一個(gè)部分的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的組分的表達(dá)和/或活性，或ObR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑本身的活性。
例如，在照射之后，通過(guò)與源于未照射過(guò)的對(duì)照細(xì)胞的裂解液進(jìn)行比較測(cè)定處理細(xì)胞裂解液中宿主細(xì)胞蛋白的酪氨酸磷酸化的存在。在上述測(cè)定系統(tǒng)中，試驗(yàn)化合物抑制宿主細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸化的能力表明，該試驗(yàn)化合物能抑制由ObR激活作用起動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)?？捎肳estern印跡法對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行方便地測(cè)定；即通過(guò)凝膠電泳分離宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)移并用一種抗-磷酸酪氨酸檢測(cè)抗體(例如，用諸如放射性標(biāo)記物、熒光劑、酶等的信號(hào)發(fā)生化合物標(biāo)記過(guò)的抗-磷酸酪氨酸抗體)檢測(cè)(例如，參見(jiàn)Glenney等，1988，免疫方法雜志(J.Immunol.Methods)109:277-285；Fradkelton等，1983,Mol.Cell.Biol.3:1343-1352)。另外，可以采用ELISA方法，其中，用一種對(duì)目標(biāo)宿主細(xì)胞蛋白特異的固定抗體固定參與ObR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一種特定宿主細(xì)胞蛋白，并用標(biāo)記過(guò)的抗磷酸酪氨酸抗體檢測(cè)固定化宿主細(xì)胞蛋白上磷酸酪氨酸的有或無(wú)(參見(jiàn)king等，1993，生命科學(xué)(Life Sciences)53:1465-1472)。在另一種方案中，作為ObR刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的終止，可以測(cè)定離子流動(dòng)，如鈣離子流動(dòng)。
另外，可以測(cè)定STAT蛋白的激活作用和由IL-6效應(yīng)基因元件介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄刺激作用。例如，可以制備一種重組表達(dá)載體，使其含有克隆在接近一個(gè)報(bào)導(dǎo)基因處的IL6效應(yīng)元件序列，并可通過(guò)測(cè)定報(bào)導(dǎo)基因活性測(cè)定ObR活性的調(diào)節(jié)?？梢允褂玫膱?bào)導(dǎo)基因包括，但不限于編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、螢火蟲(chóng)熒光素酶或人生長(zhǎng)激素的基因。
另外，可將包括諸如ob、db和ob/db小鼠的基于動(dòng)物的體重疾病系統(tǒng)用于鑒定能緩解體重疾病樣綜合癥的化合物。可將所述動(dòng)物模型用作鑒定能有效治療上述疾病的藥物、藥劑、療法和處置方法的被作用物。例如，可以用被懷疑具有緩解體重疾病綜合癥的化合物處理動(dòng)物模型，該化合物的濃度高到、而且處理時(shí)間長(zhǎng)到足于引起被處理動(dòng)物發(fā)生體重疾病的緩解作用?？梢酝ㄟ^(guò)評(píng)價(jià)與諸如肥胖的體重疾病相關(guān)的疾病的恢復(fù)監(jiān)測(cè)動(dòng)物對(duì)上述處理的反應(yīng)。就處置方法而言，任何能恢復(fù)體重疾病樣綜合癥的任何方面的治療均被視為用于人類體重疾病治療處置的可選方案。如將在下面的5.7.1節(jié)中討論的，可通過(guò)繪制劑量效應(yīng)曲線的方法測(cè)定試驗(yàn)劑的劑量。
F..包括體重疾病在內(nèi)的體重治療本發(fā)明涉及用于改變體重并治療體重疾病的方法和組合物，所述疾病包括，但不限于肥胖、惡病質(zhì)和厭食。由于正常obR基因產(chǎn)物功能的喪失會(huì)導(dǎo)致肥胖表型的發(fā)展，提高obR基因產(chǎn)物活性或激活ObR途徑(例如，下游激活)有利于使表現(xiàn)出缺陷型obR基因表達(dá)水平和/或obR活性水平的肥胖個(gè)體逐漸趨于接近正常狀態(tài)。
另外，通過(guò)降低obR基因表達(dá)水平和/或obR基因活性和/或下調(diào)ObR途徑的活性(例如，通過(guò)定向下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程)，可以緩解某些體重疾病的綜合癥，例如，涉及低于正常體重表型的惡病質(zhì)。下面探討不同的方法
1..制ObR表達(dá)或ObR活性，促進(jìn)體重增加任何能中和Ob或抑制obR基因表達(dá)(抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯)的方法均可用于實(shí)現(xiàn)體重增加。所述方法可被用于治療諸如厭食或惡病質(zhì)的疾病。還可將所述方法用于農(nóng)業(yè)目的；即提高家畜動(dòng)物的體重。
例如，可通過(guò)服用能結(jié)合并“中和”循環(huán)Ob的可溶性肽、蛋白、融合蛋白或抗體(包括抗獨(dú)特型抗體)，和ObR的天然配體實(shí)現(xiàn)體重增加。為此，可以使用相當(dāng)于ObR的ECD的肽、ObR的可溶性缺失突變型(例如，ΔTMObR突變型)或ObR功能域中的任一個(gè)或融合于另一種多肽(例如，IgFc多肽)的突變型。另外，可以使用能模擬ObR ECD并中和Ob的抗獨(dú)特型抗體或抗獨(dú)特型抗體的片段(參見(jiàn)5.3節(jié)，同上)。給受治對(duì)象服用的上述ObR肽、蛋白、融合蛋白、抗獨(dú)特型抗體或Fab的量足于中和Ob并實(shí)現(xiàn)體重增力。
可使用相當(dāng)于ECD具有圖1或6中所示的氨基酸序列，大約從23-837號(hào)氨基酸殘基，或具有圖3所示的氨基酸序列，從約從21-839號(hào)氨基酸殘基的ObR肽。還可以使用ObRΔTM突變體中23個(gè)氨基酸的疏水錨定序列(例如，大約為圖1或6中的838-860號(hào)氨基酸殘基，或大約為圖3中840-862號(hào)氨基酸殘基)。ObR、ObR ECD或ΔTM ObR與IgFc多肽的融合不僅可以提高該制劑的穩(wěn)定性，而且可以延長(zhǎng)ObR-Ig融合蛋白在體內(nèi)的半衰期和提高其活性?？蓪?duì)該融合蛋白的Ig部分的Fc片段作進(jìn)一步的修飾，以降低免疫球蛋白的效應(yīng)子功能。參見(jiàn)下文的第10節(jié)。
在本文所披露的一種特定實(shí)施方案中，將小鼠或人ObR的胞外域同IgG恒定區(qū)融合。如圖10所示，純化的ObR-IgG能夠有效地抑制或中和AP-OB融合蛋白與細(xì)胞表面ObR的結(jié)合(參見(jiàn)10.4.節(jié))。
在中和循環(huán)Ob的另一種實(shí)施方案中，可以給患者服用經(jīng)過(guò)遺傳工程操作的、能表達(dá)所述可溶型式或分泌型式ObR的細(xì)胞，使其能在體內(nèi)起到“生物反應(yīng)器的作用，以便能連續(xù)供應(yīng)Ob中和蛋白。所述細(xì)胞可以獲自所述患者或一個(gè)MHC相容性供體，并可以包括，但不限于成纖維細(xì)胞、血細(xì)胞(例如，淋巴細(xì)胞)、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等?？梢杂弥亟MDNA技術(shù)對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行體外遺傳工程操作，以便將ObR ECD、ΔTM ObR或ObR-Ig融合蛋白(例如，ObR-、ECD-或ΔTM ObR-IgFc融合蛋白)的編碼序列導(dǎo)入該細(xì)胞中，例如，通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)(使用病毒載體，優(yōu)選使用能將轉(zhuǎn)基因整合到細(xì)胞基因組中的載體)或轉(zhuǎn)染方法，包括，但不限于使用質(zhì)粒、粘粒、YAC、電穿孔、脂質(zhì)體等?？蓪bR編碼序列置于一個(gè)強(qiáng)組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的控制之下，以實(shí)現(xiàn)所述ObR肽或融合蛋白的表達(dá)和分泌?？蓪⑺苽涞哪鼙磉_(dá)并分泌所需ObR產(chǎn)物的細(xì)胞系統(tǒng)地導(dǎo)入患者體內(nèi)，例如，通過(guò)腹膜內(nèi)注射方法導(dǎo)入循環(huán)系統(tǒng)，位于脈絡(luò)叢或下丘腦。另外，可將所述細(xì)胞摻入一種基質(zhì)，并植入體內(nèi)，例如，可將通過(guò)遺傳工程方法產(chǎn)生的成纖維細(xì)胞作為皮膚移植物的一部分植入；而通過(guò)遺傳工程方法產(chǎn)生的內(nèi)皮細(xì)胞可以作為血管移植物的一部分植入(例如，參見(jiàn)Anderson等，US5,399,349；和Mulligan & Wilson,US 5,460,959，它們分別被作為整體收作本文參考)。
如果待服用的細(xì)胞是非自體細(xì)胞，則可以用眾所周知的方法服用這種細(xì)胞，只要該方法可以預(yù)防針對(duì)導(dǎo)入細(xì)胞的宿主免疫反應(yīng)的發(fā)生。例如，可以膠囊化型式導(dǎo)入所述細(xì)胞，雖然可以與緊鄰的胞外環(huán)境進(jìn)行組分交換，但所導(dǎo)入的細(xì)胞不會(huì)被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別。
在另一種實(shí)施方案中，可以設(shè)計(jì)體重增加療法，以降低內(nèi)源ObR基因表達(dá)的水平，例如，用反義或核糖酶方法抑制或阻止obR mRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯；用三重螺旋方法抑制obR基因的轉(zhuǎn)錄；或通過(guò)定向同源重組使obR基因或其內(nèi)源啟動(dòng)子失活或“失效”。由于obR基因是在大腦中，包括脈絡(luò)叢和下丘腦中表達(dá)，給藥技術(shù)最好被設(shè)計(jì)成能通過(guò)血腦屏障(參見(jiàn)PCTWO89/10134，該專利被作為一個(gè)整體收作本文參考)。另外，可將本文所披露的反義、核糖酶或DNA結(jié)構(gòu)直接給藥至含有目標(biāo)細(xì)胞的部位；例如，脈絡(luò)叢和/或下丘腦。
反義方法包括設(shè)計(jì)能與ObR mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸(DNA或RNA)。反義寡核苷酸能與互補(bǔ)的ObR mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，并抑制其翻譯。絕對(duì)互補(bǔ)性盡管是優(yōu)選的，但是沒(méi)有必要。在本文中，“互補(bǔ)”于一部分RNA的序列是指具有足于與該RNA雜交，形成穩(wěn)定的雙鏈體的序列；對(duì)于雙鏈反義核酸來(lái)說(shuō)，可以對(duì)該雙鏈DNA的一條鏈進(jìn)行檢測(cè)，或測(cè)定三鏈體的形成。雜交能力同時(shí)取決于其互補(bǔ)程度和反義核酸的長(zhǎng)度。一般，雜交的核酸越長(zhǎng)，它所包含的與RNA錯(cuò)配的堿基越多，并仍然可形成穩(wěn)定的雙鏈體(或三鏈體，如果條件許可的話)。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定雜交復(fù)合體的熔點(diǎn)可以確定錯(cuò)配的允許度。
互補(bǔ)于所述信息(message)5＇末端，例如，5＇非翻譯序列直至并包括AUG起始密碼子在內(nèi)的序列的寡核苷酸，能最有效地抑制翻譯作用。不過(guò)，最近已證實(shí)互補(bǔ)于mRNA3＇非翻譯序列的序列也能有效抑制mRNA的翻譯。大致參閱Wagner,R.,1994,Nature 372:333-335。因此，在反義方法中，可以用互補(bǔ)于圖1(鼠短型)、圖6(鼠長(zhǎng)型)或圖3(人長(zhǎng)型)所示obR的5′-或3＇-非翻譯、非編碼區(qū)的寡核苷酸抑制內(nèi)源obR mRNA的翻譯?；パa(bǔ)于該mRNA的5＇非翻譯區(qū)的寡核苷酸應(yīng)當(dāng)包括AUG起始密碼子?；パa(bǔ)于mRNA編碼區(qū)的反義寡核苷酸是翻譯的不十分有效的抑制劑，但可用于本發(fā)明中。反義核酸無(wú)論被設(shè)計(jì)成能與ObR mRNA的5＇、3′-或編碼區(qū)雜交，其長(zhǎng)度均至少應(yīng)為6個(gè)核苷酸，而且，優(yōu)選為長(zhǎng)度為6至大約50個(gè)核苷酸的寡核苷酸。在特定場(chǎng)合下，該寡核苷酸至少為10個(gè)核苷酸，至少17個(gè)核苷酸、至少25個(gè)核苷酸或至少50個(gè)核苷酸。
無(wú)論靶序列的選擇如何，最好首先進(jìn)行體外研究，以便對(duì)該反義寡核苷酸抑制基因表達(dá)的能力進(jìn)行定量。這些研究?jī)?yōu)選使用能區(qū)分反義基因抑制和寡核苷酸的非特異生物學(xué)效應(yīng)的對(duì)照。同樣理想的是，該研究能比較目標(biāo)RNA或蛋白的含量和內(nèi)在對(duì)照RNA或蛋白的含量。另外，預(yù)計(jì)將用所述反義寡核苷酸獲得的結(jié)果與用對(duì)照寡核苷酸獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。理想的是，對(duì)照寡核苷酸的長(zhǎng)度大致與試驗(yàn)寡核苷酸的長(zhǎng)度相同，而且，該寡核苷酸的核苷酸序列與反義序列的差異不超過(guò)抑制與靶序列進(jìn)行特異雜交所必須的程度。
所述寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈的DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修飾型式。舉例來(lái)說(shuō)，可以對(duì)該寡核苷酸的堿基部分、糖部分或磷酸骨架進(jìn)行修飾，以提高該分子的穩(wěn)定性、雜交能力等。該寡核苷酸可以包括其它附屬基團(tuán)，如肽(例如，用于在體內(nèi)尋靶宿主細(xì)胞受體的肽)，或能促進(jìn)跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)(例如，參見(jiàn)Letsinger等，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6553-6556；Lemaitre等，1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:648-652；PCT公開(kāi)號(hào)WO 88/09810，出版日1988年12月15日)或通過(guò)血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)(例如，參見(jiàn)PCT公開(kāi)號(hào)WO 89/10134，出版日1988年4月25日)的制劑，雜交觸發(fā)的裂解劑(例如，參見(jiàn)Krol等，1988，生物技術(shù)(BioTechniques)6:958-976)或嵌入劑(例如，參見(jiàn)Zon,1988，藥學(xué)研究(Pharm.Res.)5:539-549)。為此，可將所述寡核苷酸綴合于另一種分子上，例如，肽、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)劑、雜交觸發(fā)的裂解劑上。
所述反義寡核苷酸可以包括至少一個(gè)修飾的堿基部分，該堿基部分選自包括，但不限于由下列化合物組成的一組5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖queosine、肌苷、N6-異戊基腺嘌呤、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖queosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧代乙酸(Ⅴ)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧代乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧代乙酸(Ⅴ)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)W、和2,6-二氨基嘌呤。
所述反義寡核苷酸還可以包括至少一個(gè)修飾過(guò)的糖部分，該部分選自包括，但不限于下列化合物組成的一組阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
在另一種實(shí)施方案中，該反義寡核苷酸包括至少一個(gè)修飾過(guò)的磷酸骨架，該骨架選自由下列化合物組成的一組硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯和formacetal或其類似物。
在另一種實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸是一種α-端基異構(gòu)寡核苷酸。α-端基異構(gòu)寡核苷酸能與互補(bǔ)RNA形成特殊的雙鏈雜合體，其中，與常見(jiàn)的β-單元不同，所述鏈?zhǔn)潜舜似叫械厝∠虻?Gautier等，1987,Nucl.Acids.Res.15:6625-6641)。所述寡核苷酸是2＇-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987,Nucl.Acids Res.15:6131-6148)、或嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等，1987,FEBS Lett.215:327-330)。
本發(fā)明的寡核苷酸還可以用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成，例如，使用一臺(tái)自動(dòng)化DNA合成儀(如由Biosearch,Applied Biosystems等出售的合成儀)。舉例來(lái)說(shuō)，可以用Stein等的方法(1988,Nucl.Acids Res.16:3209)合成硫代磷酸酯寡核苷酸，甲基磷酸酯寡核苷酸可用可控孔度玻璃聚合物支持體(Sarin等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:7448-7451)等進(jìn)行制備。
雖然可以使用互補(bǔ)于obR編碼區(qū)序列的反義寡核苷酸，但互補(bǔ)于轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)的寡核苷酸最佳。例如，可將具有如下序列的反義寡核核苷酸用于本發(fā)明中a)5＇-CATCTTACTTCAGAGAA-3＇，它互補(bǔ)于圖3中的核苷酸-14至+3。
b)5＇-CATCTTACTTCAGAGAAGTACAC-3＇，它互補(bǔ)于圖3中的核苷酸-20至+3。
c)5＇-CATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAA-3＇，它互補(bǔ)于圖3中的核苷酸-26至+3。
d)5＇-CATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCCTCT-3＇，它互補(bǔ)于圖3中的寡核苷酸-32至+3。
e)5＇-AATCATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3，它互補(bǔ)于圖3中的核苷酸-29至+6。
f)5′-CTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3，它互補(bǔ)于圖3中的核苷酸-29至-1。
g)5′-TCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3，它互補(bǔ)于圖3中的核苷酸-29至-7。
h) 5＇-AAGTACACCCATAATCC-3，它互補(bǔ)于圖3中的核苷酸-29至-13。
所述反義分子應(yīng)當(dāng)被輸入能在體內(nèi)表達(dá)ObR的細(xì)胞中，例如，脈絡(luò)叢和/或下丘腦。已建立起多種用于將反義DNA或RNA送入細(xì)胞的方法；例如，可將反義分子直接注射到組織位點(diǎn)，或全身性給藥針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞而設(shè)計(jì)的修飾過(guò)的反義分子(例如，與能特異結(jié)合表達(dá)于靶細(xì)胞表面的受體或抗原的肽或抗體的反義分子)。
不過(guò)，要使該反義分子達(dá)到足以抑制內(nèi)源mRNA表達(dá)的胞內(nèi)濃度通常是很困難的。因此，優(yōu)選的方法是使用一種重組DNA結(jié)構(gòu)，其中，該反義寡核苷酸被置于強(qiáng)polⅢ或polⅡ啟動(dòng)子的操縱之下。用這種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染患者體內(nèi)的靶細(xì)胞，可導(dǎo)致足夠量的單鏈RNA轉(zhuǎn)錄，這些單鏈RNA能與內(nèi)源obR轉(zhuǎn)錄物形成互補(bǔ)的堿基對(duì)，從而阻止obR mRNA的翻譯。例如，可以體內(nèi)導(dǎo)入一種載體，以便該載體能被細(xì)胞攝入，并指導(dǎo)反義RNA的轉(zhuǎn)錄。所述載體可以保持其附加體型式或進(jìn)行染色體整合，只要它能夠轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生所需的反義RNA即可。所述載體可以用本領(lǐng)域規(guī)范化的重組DNA技術(shù)制備。載體可以是用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)的質(zhì)粒、病毒或本領(lǐng)域公知的其它載體。編碼反義RNA的序列的表達(dá)可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物中實(shí)施，優(yōu)選在人細(xì)胞中實(shí)施。所述啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型的或組成型的。所述啟動(dòng)子包括，但不限于SV40早期啟動(dòng)子片段(Bernoist和Chambon,1981,Nature 290:304-310)、包含于Rous肉瘤病毒的3＇長(zhǎng)的末端重復(fù)中的啟動(dòng)子(Yamamoto等，1980,Cell 22:787-797)、皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagner等，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)控序列(Brinster等，1982,Nature 296:39-42)等。任何類型的質(zhì)粒、粘粒、YAC或病毒載體均可用于制備能被直接導(dǎo)入諸如脈絡(luò)叢或下丘腦的組織位點(diǎn)的重組DNA結(jié)構(gòu)。另外，可將病毒載體用于選擇性地感染目標(biāo)組織(例如，可將皰疹病毒用于感染腦組織)，在每一種情況下均可通過(guò)其它途徑(例如，全身給藥)實(shí)現(xiàn)給藥。
被設(shè)計(jì)用于催化裂解obR mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酶分子也可被用于抑制obR mRNA的翻譯和ObR的表達(dá)(例如，參見(jiàn)PCT國(guó)際公開(kāi)WO 90/11364，
公開(kāi)日1990年10月4日；Sarver等，1990,Science 247:1222-1225)。雖然可以用能在特異的識(shí)別序列上裂解mRNA的核酶來(lái)破壞obR mRNA,但優(yōu)選使用錘頭狀核酶。錘頭狀核酶能在由旁側(cè)區(qū)限定的部位裂解mRNA，該旁側(cè)區(qū)與靶mRNA形成互補(bǔ)堿基對(duì)。唯一的要求是，所述靶mRNA具有如下的2個(gè)堿基的序列5＇UG-3′。錘頭狀核酶的構(gòu)建和制備為本領(lǐng)域所熟知，并由Haseloff和Gerlan作過(guò)更全面的描述(1988,Nature,334:585-591)。在人ObR cDNA的核苷酸序列上(圖3)有數(shù)百個(gè)潛在的錘頭狀核酶裂解位點(diǎn)。理想的是，所述核酶通過(guò)遺傳工程方法生產(chǎn)的，以使其裂解識(shí)別位點(diǎn)位于接近ObR mRNA的5＇末端處；即提高效率，同時(shí)減少非功能性mRNA轉(zhuǎn)錄物的胞內(nèi)積累。
例如，可將具有如下序列的錘頭狀核酶用于本發(fā)明中a)5＇-ACAGAAUUUUUGACAAAUCAAAGCAGANNNNUCUGAGNAGUCCUUACUUCAGAGAA-3＇，它可以裂解圖3所示人obR mRNA的核苷酸-1至1。
b)5＇-GGCCCGGGCAGCCUGCCCAAAGCCGGNNNNCCGGAGNAGUCGCCAGACCGGCUCGUG-3＇，它可以裂解圖3所示核苷酸-175至-176。
c)5＇-UGGCAUGCAAGACAAAGCAGGNNNNCCUGAGNAGUCCUUAAAUCUCCAAGGAGUAA-3＇，它可以裂解圖3所示核苷酸102至103。
d)5＇-UAUAUGACAAAGCUGUNNNNACAGAGNAGUCCUUGUGUGGUAAAGACACG-3′，它可裂解圖3所示核苷酸994至995。
e)5＇-AGCACCAAUUGAAUUGAUGGCCAAAGCGGGNNNNCCCGAGNAGUCAACCGUAACAGUAUGU-3＇，它可裂解圖3所示核苷酸2142至2143。
f)5＇-UGAAAUUGUUUCAGGCUCCAAAGCCGGNNNNCCGGAGNAGUCAAGAAGAGGACCACAUGUCACUGAUGC-3＇，它可裂解圖3所示核苷酸2736至2737。
g)5＇-GGUUUCUUCAGUGAAAUUACACAAAGCAGCNNNNGCUGAGNAGUCAGUUAGGUCACACAUC-3＇，它可裂解圖3所示核苷酸3492至3493。
h)5＇-ACCCAUUAUAACACAAAGCUGANNNNUCAGAGNAGUCAUCUGAAGGUUUCUUC-3′，它可裂解圖3所示核苷酸3521至3522。
本發(fā)明的核酶還包括RNA內(nèi)切核糖核酸酶(以下稱“Cech型核酶”)，如天然存在于嗜熱四膜蟲(chóng)(Tetrahymena Thermophila)中的一種酶(被稱為IVS或L-19 IVS RNA),Thomas Cech及其合作者對(duì)此做過(guò)詳盡說(shuō)明(Zaug等，1984,Science,224:574-578；Iang和Cech,1986,Science,23:470-475；Zang等,1986,Nature,324:429-433；國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 88/04300，由University PatentInc.公開(kāi)；Been和Cech,1986,Cell,47:207-216)。Cech型核酶具有一個(gè)有8個(gè)堿基對(duì)的活性位點(diǎn)，它能與靶RNA序列雜交，然后裂解該靶RNA。本發(fā)明涉及能尋靶ObR上的8個(gè)堿基對(duì)的活性位點(diǎn)序列的Cech型核酶。
在反義方法中，所述核酶可以由修飾的寡核苷酸(例如，為了提高其穩(wěn)定性、定向性等)組成，并應(yīng)當(dāng)送入能在體內(nèi)表達(dá)ObR的細(xì)胞中，例如，下丘腦和/或脈絡(luò)叢。一種優(yōu)選的輸送方法包括受一個(gè)強(qiáng)的組成型palⅢ或polⅡ啟動(dòng)子控制的“編碼”所述核酶的DNA結(jié)構(gòu)，以便轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能產(chǎn)生足夠數(shù)量的核酶，以破壞內(nèi)源obR信息，并抑制翻譯。由于核酶不同于反義分子，它是催化性的，較低的胞內(nèi)濃度即可有效。
通過(guò)使用定向的同源重組方法使obR基因或其啟動(dòng)子失活或“失效”，也可以降低內(nèi)源ObR基因的表達(dá)(例如，參見(jiàn)Smithies等，1985,Nature317:230-234；Thomas & Capecchi,1987,Cell 51:503-512；Thompson等，1989 Cell 5:313-321；以上文獻(xiàn)分別被以全文型式收作本文參考)。例如，可以用有或沒(méi)有選擇標(biāo)記和/或負(fù)選擇標(biāo)記的、其旁側(cè)為與內(nèi)源obR基因(該ObR基因的編碼區(qū)或調(diào)控區(qū))同源的DNA的突變型非功能性O(shè)bR(或一種完全無(wú)關(guān)的DNA序列)轉(zhuǎn)染能在體內(nèi)表達(dá)ObR的細(xì)胞。通過(guò)定向同源重組插入該DNA結(jié)構(gòu)，可導(dǎo)致obR基因失活。這種方法特別適用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，其中，對(duì)ES(胚胎于)細(xì)胞的修飾可用于產(chǎn)生具有失活ObR的動(dòng)物子代(例如，參見(jiàn)Thomas和Capecchi1987和Thompson1989，同上)。不過(guò)，也可以對(duì)該方法加以改進(jìn)，以適用于人，用合適的病毒載體將所述重組DNA結(jié)構(gòu)直接給藥或?qū)б了璧捏w內(nèi)部位，例如，用皰疹病毒載體向諸如下丘腦和/或脈絡(luò)叢的腦組織輸送。
另外，通過(guò)定向互補(bǔ)于obR基因調(diào)控區(qū)(即obR啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)脫氧核糖核苷酸序列)形成三重螺旋結(jié)構(gòu)，抑制obR基因在體內(nèi)的靶細(xì)胞中表達(dá)，可以減弱內(nèi)源obR基因表達(dá)(大致參見(jiàn)Helene,C.1991,Anticancer DrugDes.6(6):569-84；Helene,C.等，1992,Ann,N.YAccad.Sci.660:27-36；和Maher,L.J.,1992,Bioassays 14(12):807-15)。
在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，用“顯性失活”方法降低ObR活性，以實(shí)現(xiàn)體重增加。為此，可將編碼缺陷型ObR的結(jié)構(gòu)用于基因治療方法中，以減弱適當(dāng)靶細(xì)胞中的ObR活性。例如，如將能指導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)ObRs的核苷酸序列導(dǎo)入脈絡(luò)叢或下丘腦的細(xì)胞中(通過(guò)上述體內(nèi)或來(lái)自體內(nèi)的基因療法)，所表達(dá)的ObRs的CD(例如，圖1中861-894號(hào)氨基酸殘基；圖6中861-1162號(hào)氨基酸殘基；或圖3中863-1165號(hào)氨基酸殘基)或CD的一部分(例如，框1Jak相互作用序列；圖1和6的氨基酸殘基861-884；或圖3的氨基酸殘基863-886)是缺失的或突變的。另外，可以用定向同源重組的方法將這種缺失或突變導(dǎo)入受治對(duì)象下丘腦或脈絡(luò)叢的內(nèi)源ObR基因中。這種用工程方法所得到的細(xì)胞可以表達(dá)非功能性受體(即一種能結(jié)合其天然配體，但不能進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的固著受體)。存在于脈絡(luò)叢或下丘腦中的上述工程細(xì)胞對(duì)內(nèi)源Ob配體應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)出較弱反應(yīng)，從而導(dǎo)致體重增加。
2..恢復(fù)或加強(qiáng)ObR表達(dá)或活性，促進(jìn)體重下降就提高正常obR基因表達(dá)和/或obR基因產(chǎn)物活性而言，可將obR核酸序列用于治療包括肥胖在內(nèi)的體重疾病。當(dāng)肥胖的原因是缺陷型ObR時(shí)，可以諸如基因替代療法型式施治。具體地講，可以用載體將一個(gè)或幾個(gè)拷貝的正常obR基因或能指導(dǎo)具有正常功能的obR基因產(chǎn)物產(chǎn)生的obR基因的一部分插入患者或動(dòng)物受治對(duì)象體內(nèi)的合適細(xì)胞中，所述載體包括，但不限于腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒載體，此外，還有能將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的其它顆粒子，如脂質(zhì)體。
由于obR基因是在包括脈絡(luò)叢和下丘腦的腦組織中表達(dá)的，所述基因替代療法技術(shù)應(yīng)當(dāng)能夠?qū)bR基因送至患者體內(nèi)的上述類型細(xì)胞中。因此，應(yīng)將輸送ObR基因的方法設(shè)計(jì)成能順利通過(guò)血-腦屏障，這種方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(例如，參見(jiàn)PCT申請(qǐng)，公開(kāi)號(hào)WO 98/10134，該專利被以全文型式收作本文參考)，或者，該方法應(yīng)包括將所述obR基因序列直接給藥至待表達(dá)該obR基因序列的細(xì)胞部位。另外，可以用定向同源重組的方法糾正諸如脈絡(luò)叢和/或下丘腦的適當(dāng)組織中的缺陷型內(nèi)源ObR基因。在動(dòng)物中，可將定向同源重組用于糾正ES細(xì)胞中的缺陷，以產(chǎn)生具有糾正了的性狀的子代。
可用于提高obR基因表達(dá)的總體水平和/或ObR活性的其它方法包括，將適當(dāng)?shù)腛bR表達(dá)細(xì)胞，優(yōu)選為自體細(xì)胞導(dǎo)入患者體內(nèi)，導(dǎo)入的部位和數(shù)量足于緩解包括肥胖在內(nèi)的體重疾病綜合癥。所述細(xì)胞可以是重組型的或非重組型的?？杀挥糜谔岣呋颊唧w內(nèi)obR基因表達(dá)的總體水平的細(xì)胞包括正常細(xì)胞，尤其是能表達(dá)obR基因的下丘腦細(xì)胞。可將所述細(xì)胞用于大腦的解剖部位，或作為組織移植物放置在身體的不同部位。這種基于細(xì)胞的基因治療技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，例如，參見(jiàn)Anderson等的美國(guó)專利US5,399,349；Mulligan和Wilson的美國(guó)專利US 5,460,959。
最后，可將在上述測(cè)定中鑒定的能激發(fā)或加強(qiáng)由ObR激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如，通過(guò)激活ObR級(jí)聯(lián)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，并由此避開(kāi)缺陷型ObR的化合物用于實(shí)現(xiàn)體重的減少。有關(guān)制劑及服用方式取決于該化合物的物理化學(xué)特性。所述服用方式包括可通過(guò)血腦屏障的已知技術(shù)。
G..藥用制劑和給藥方法可以給患者服用治療有效劑量的被確認(rèn)能影響obR基因表達(dá)或ObR活性的化合物，以治療或緩解包括肥胖、惡病質(zhì)和厭食在內(nèi)的體重疾病。治療有效劑量是指足于導(dǎo)致體重疾病癥狀減輕的所述化合物用量。
1..有效劑量可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)方法，用細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物測(cè)定所述化合物的毒性和療效，例如，測(cè)定其LD50(使群體的50％致死的劑量)和ED50(對(duì)群體的50％有治療效果的劑量)。毒性作用和治療作用的劑量比為治療指數(shù)，并可以LD50/ED50之比型式表示。優(yōu)選具有較大治療指數(shù)的化合物。盡管可以使用具有毒副作用的化合物，但要采取防范措施，以設(shè)計(jì)出能將所述化合物定向給藥至受治組織的給藥系統(tǒng)，以減少對(duì)無(wú)關(guān)細(xì)胞的潛在危害，從而減輕其副作用。
可將在細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動(dòng)物研究中取得的資料用于制備供人體使用的各種劑量。所述化合物的劑量?jī)?yōu)選處于這樣的循環(huán)濃度范圍內(nèi)其中包括ED50，少有或沒(méi)有毒性。根據(jù)所用的劑型和給藥途徑，其劑量可以在該范圍內(nèi)變動(dòng)。對(duì)于用于本發(fā)明方法的任何化合物來(lái)說(shuō)，都可以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)初步計(jì)算出其治療有效劑量。在動(dòng)物模型中，可以制備能達(dá)到包括IC50(即能實(shí)現(xiàn)對(duì)癥狀的半數(shù)最大抑制的試驗(yàn)化合物濃度)在內(nèi)的循環(huán)血漿濃度范圍的劑量，這一劑量是在細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)定的。上述資料可被用于更精確地確定適用于人體的劑量。例如，通過(guò)高效液相層析可以測(cè)定在血漿中的濃度。
2..制劑及用途可以通過(guò)常規(guī)方法，用一個(gè)或幾種生理學(xué)上可以接受的載體或賦形劑制備適用于本發(fā)明的藥用組合物。
因此，可將所述化合物及其生理學(xué)上可以接受的鹽和溶劑化物制成適于通過(guò)吸入或吹入(經(jīng)口或鼻)或口服、頰服(buccal)、腸胃外或直腸使用方法給藥的型式。
對(duì)于口服而言，該藥用組合物可以采用諸如通過(guò)常規(guī)方法，用諸如粘結(jié)劑(例如，預(yù)凝膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)的可以藥用的賦形劑、填料(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)、潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石或硅石)、崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或淀粉乙醇酸鈉)、或濕潤(rùn)劑(例如，十二烷基硫酸鈉)制備成的片劑或膠囊型式?？梢杂帽绢I(lǐng)域眾所周知的方法對(duì)片劑進(jìn)行包衣。用于口服的液體制劑可以采用諸如溶液、糖漿或懸液的型式，或以干制品型式提供，在使用之前用水或其它合適載體制成液體。上述液體制劑可以通過(guò)常規(guī)方法用諸如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)、乳化劑(例如，卵磷脂和阿拉伯膠)；非水媒介物(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分餾植物油)和防腐劑(例如，對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)的可以藥用的添加劑制備。如有必要，該制劑還可以含有合適的緩沖鹽、矯味劑、著色劑和增甜劑。
用于口服的制劑適于被制成能可控制地釋放活性化合物的型式。
對(duì)于頰服來(lái)說(shuō)，所述組合物可以采用以常規(guī)方法制備的片劑或錠劑型式。
對(duì)于吸入服用來(lái)說(shuō)，用于本發(fā)明的化合物通常是以氣溶膠噴霧型式給藥，該噴霧劑由加壓裝置或噴霧器用諸如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、CO2或其它合適氣體的合適的推進(jìn)劑提供。就加壓氣溶膠而言，其劑量單位可以通過(guò)設(shè)置一個(gè)閥以輸送定量氣溶膠的型式確定?？蓪⒂糜谖鼩馄骰虼禋馄鞯闹T如明膠的膠囊和藥筒制成含有由所述化合物和諸如乳糖或淀粉的合適粉狀基質(zhì)組成的粉狀混合物的型式。
可將上述化合物制成適于通過(guò)注射的腸胃外給藥型式，例如，通過(guò)塊(bolus)注射或連續(xù)輸注型式服用。適于注射的制劑可以單位劑量型式提供，例如，裝于安瓿瓶或多劑量容器中，并添加有防腐劑。該組合物可以采用諸如含于油性或水性媒介物中的懸液、溶液或乳液型式，并可以含有諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑/或分散劑的配制劑。另外，該活性成分可以是適于與適當(dāng)媒介物組配的粉狀型式，例如，在使用之前用滅菌的無(wú)熱原水組配。
還可將上述化合物制成諸如栓劑或保留灌腸劑型式的直腸組合物，例如，含有諸如可可油或其它甘油酯的常見(jiàn)栓劑基質(zhì)。
除了上述制劑以外，還可將上述化合物制備成緩釋制劑。這用長(zhǎng)效制劑可以通過(guò)植入方法(例如，皮下或肌內(nèi)植入)或肌內(nèi)注射方法使用。因此，舉例來(lái)說(shuō)，所述化合物可以用合適的聚合材料或疏水材料(例如，溶于可以接受的油中的乳劑)或離子交換樹(shù)脂制備，或制成微溶性衍生物，例如，微溶性鹽。
如果必要，所述化合物可以包裝或分配裝置型式提供，其中可以容納含有活性成分的一個(gè)或幾個(gè)單位劑量型式。例如，所述包裝可以包括金屬或塑料泊，如發(fā)泡包裝。在所述包裝或分配裝置上還可帶有使用說(shuō)明。
Ⅵ..實(shí)施例ObR的原位定位在本文所提供的實(shí)施例中，通過(guò)用Ob(萊普亭(leptin))-堿性磷酸酶(AP)融合蛋白所做的結(jié)合研究證實(shí)，在哺乳動(dòng)物脈絡(luò)叢組織中存在高親和性O(shè)b受體。還發(fā)現(xiàn)，所觀察到的融合蛋白結(jié)合是Ob-特異性的，而不是由非特異性堿性磷酸酶產(chǎn)生的假象。
A..材料和方法Ob-堿性磷酸酶融合蛋白的構(gòu)建和表達(dá)。
制備兩種類型的融合蛋白。具體地講，制備Ob-AP融合蛋白，其中，AP部分位于該融合蛋白的羧基末端；制備AP-Ob融合蛋白，其中，AP部分位于該融合蛋白的氨基末端。
為了制備小鼠和人Ob-Ap和Ap-Ob融合結(jié)構(gòu)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增cDNA序列。對(duì)于小鼠和人Ob-AP融合蛋白而言，分別由相應(yīng)的cDNA擴(kuò)增編碼小鼠和人Ob的整個(gè)開(kāi)放讀框的核苷酸序列。用HindⅢ和BamHⅠ裂解位于擴(kuò)增引物末端的限制位點(diǎn)(小鼠)，并將其插入APtag-2的HindⅢ-BglⅡ多接頭位點(diǎn)；或用BamHⅠ和BglⅡ裂解(人)，并將其插入APtag-2的BglⅡ位點(diǎn)。對(duì)于小鼠和人AP-Ob融合結(jié)構(gòu)而言，首先制備能表達(dá)一種具有其自身信號(hào)肽的新型AP融合蛋白(APtag-3)，做法是用分泌性胎盤(pán)堿性磷酸酶(包括信號(hào)序列)的PCR擴(kuò)增序列置換Aptag-2上位于HindⅢ和XhoⅠ位點(diǎn)之間的序列。設(shè)置一個(gè)BglⅡ位置，以便導(dǎo)入該位點(diǎn)的融合蛋白符合AP蛋白的讀框。然后由相應(yīng)的cDNA通過(guò)PCR擴(kuò)增預(yù)測(cè)的成熟型式的小鼠和人Ob的序列。用BamHⅠ和BglⅡ裂解位于擴(kuò)增引物末端的限制位點(diǎn)，并將其插入APtag-3的BglⅡ位點(diǎn)。
將各個(gè)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞中(11.25μg/150mm板)。讓細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿，再用條件培養(yǎng)基(media-conditioned)3天。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心，0.45μm過(guò)濾，并用20mMHepes(pH7.0)和0.05％疊氮鈉保存于4℃溫度下。按照Flanagam和Leder(Flanagan,J.G.和Leder,P.,1980,Cell 63:185-194)披露的方法在96孔平板讀數(shù)器上測(cè)定條件培養(yǎng)基，并定量AP活性，所不同的是，在所有測(cè)定中均省去了高精氨酸。
原位融合蛋白結(jié)合。
在12孔平板中用HBHA(含有0.5mg/ml BSA、0.1％NaN3、20mMHEPES[pH7.0])的Hank＇s平衡鹽溶液漂洗四分小鼠腦、分離的脈絡(luò)叢、細(xì)胞和細(xì)胞系一次。然后，在室溫下將組織和含有AP-Ob融合體、Ob-AP融合體的組織培養(yǎng)上清液或?qū)φ丈锨逡?即僅含有未融合的AP的上清液、含有AP-OB或OB-AP融合蛋白+80倍摩爾過(guò)量大腸桿菌產(chǎn)生的重組OB的上清液或獲自模擬轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的上清液)一起培養(yǎng)75分鐘，同時(shí)伴以緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)。隨后按前文所述方法處理樣品(Cheng,H.J.和Flangan,J.G.,1994,Cell 79:157-168)。
B..結(jié)果為了找到Ob受體,構(gòu)建O-b堿性磷酸酶融合蛋白，其可通過(guò)比色法檢測(cè)其Ob結(jié)果。具體地講，將編碼小鼠和人Ob蛋白的cDNA分子插入上文6.1節(jié)中所述的表達(dá)載體APtag-2和APtag-3上。插入表達(dá)載體Aptag-2后所產(chǎn)生的融合蛋白，其Ob位于該融合蛋白的N-末端，而胎盤(pán)堿性磷酸酶(AP)位于該融合蛋白的C-末端。所得到的融合蛋白被稱為Ob-AP。插入載體APtag-3之后所產(chǎn)生的融合蛋白，其AP位于N-末端，它與位于C-末端的預(yù)測(cè)的成熟型式的Ob蛋白融合。所得到的融合蛋白被稱為AP-Ob。兩種型式的鼠融合蛋白均為分泌性的，并且均以大致為81KDa的預(yù)測(cè)分子量型式生成。
為了鑒定能表達(dá)Ob受體的細(xì)胞或組織，采用了幾種方法。用本文所述方法試驗(yàn)的每一種細(xì)胞、細(xì)胞系和組織都至少可能參與體重調(diào)節(jié)。所采用的第一種方法試圖指導(dǎo)Ob-AP和AP-Ob融合蛋白結(jié)合試驗(yàn)。用該方法檢測(cè)過(guò)的細(xì)胞系包括胎盤(pán)細(xì)胞系Be WO(ATCC No.CCL98)和JAR(ATCC No.HTB144)；肌細(xì)胞系L6(ATCC No.CRL 1458)和BC3H(ATCC No.CRL 1443)；神經(jīng)細(xì)胞系PC12(ATCC No.CRL 1712)和NB41A3(ATCC No.CCL147)；前脂肪細(xì)胞系3T3-L1(ATCC No.CRL 173)；和肝細(xì)胞系Hepa1-6(ATCCNo.CRL 1830)。還用該方法試驗(yàn)了來(lái)自下丘腦的原代培養(yǎng)物和來(lái)自小腦的原代培養(yǎng)物。上述研究無(wú)一產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)合結(jié)果。
其次，還嘗試過(guò)通過(guò)檢測(cè)基因表達(dá)隨重組Ob蛋白的存在而發(fā)生的變化來(lái)鑒定能表達(dá)Ob受體的細(xì)胞系。其原理是，基因表達(dá)的變化，無(wú)論是obR基因的表達(dá)，還是Ob/ObR-相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑更下游處的基因的表達(dá)，可用于鑒定其中存在ObR的細(xì)胞。
上述分析是通過(guò)對(duì)源于Ob處理過(guò)的或未處理過(guò)的細(xì)胞的RNA進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)示差演示分析(參見(jiàn)Pardee等，US 5,262,311)完成的。簡(jiǎn)單地講，從用Ob處理過(guò)的或未經(jīng)處理的細(xì)胞中提取RNA，并以如下方式進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增可以對(duì)存在于源于Ob處理的細(xì)胞系和源于未經(jīng)Ob處理的細(xì)胞系的RNA中的單個(gè)轉(zhuǎn)錄物含量進(jìn)行直接的定量比較。用該方法試驗(yàn)過(guò)的Ob細(xì)胞系有INS-1、3T3-L1、Hepa1-6、L6、PC12、NB41A3和BC3H。另外，還試驗(yàn)了原代下丘腦培養(yǎng)物。在試驗(yàn)過(guò)的細(xì)胞中，無(wú)一表現(xiàn)出因該細(xì)胞是否用Ob處理過(guò)而產(chǎn)生的在表達(dá)型式方面的可檢測(cè)的定量差異。
第三，還嘗試過(guò)通過(guò)用重組Ob蛋白處理細(xì)胞，并測(cè)定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活的跡象的方法來(lái)鑒定能表達(dá)Ob受體的細(xì)胞。具體地講，通過(guò)3H的攝入監(jiān)測(cè)cAMP的變化，并通過(guò)由抗磷酸酪氨酸抗體處理過(guò)的Western印跡測(cè)定酪氨酸磷酸化的變化。用這種方法對(duì)20個(gè)以上的細(xì)胞系進(jìn)行了檢驗(yàn)。具體地講，這些細(xì)胞系包括小鼠細(xì)胞系Y1(腎上腺皮層；ATCC No.CCL79)、BC3H(平滑肌-腦瘤；ATCC No.CRL1443),P19(胚胎癌性細(xì)胞；ATCCNo.CRL 1825)、3T3L1(前脂肪細(xì)胞；ATCC No.CRL173)、Hepa1-6(肝癌；ATCC No.CRL1830)、C2C12(成肌細(xì)胞；ATCC No.CRL1772)、NMUMG(乳腺，正常上皮；ATCC No.CRL1636)、MM5MT(乳腺；ATCCNo.CRL 1637)、NB41A3(成神經(jīng)細(xì)胞瘤；ATCC No.CCL 147)、AtT20(腦垂體；ATCC No.CCL89)、N MU LI(肝；ATCC No.CRL 1638)、BNLCL2(肝；ATCC No.TIB 73)和NCTC-1469(肝；ATCC No.CCL 91)；大鼠細(xì)胞系，包括L6(成肌細(xì)胞；ATCC No.CRL 1458)、PC12(腎上腺嗜鉻細(xì)胞；ATCC No.CRL 1721)、和H-4-H-E(肝癌；ATCC No.CRL 1548)；和人細(xì)胞系，包括SW 872(脂肪肉瘤；ATCCNo.HTB 92)、HepaG2(肝；ATCCNo.HB8065)、和成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，包括SK-N-SH(ATCC No.HTB11)。在該試驗(yàn)中，同樣未能在試驗(yàn)過(guò)的任何細(xì)胞中觀察到取決于Ob的差異。
在對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和組織作過(guò)深入研究之后，將成年小鼠腦四分剖開(kāi)，用AP-Ob融合蛋白處理，洗滌，并用上文的6.1節(jié)所披露的組織學(xué)方法測(cè)定該融合蛋白的結(jié)合AP活性。在嚙齒類動(dòng)物的腦脈絡(luò)叢中(位于側(cè)向和第三腦室)觀察到了AP-Ob融合蛋白的再現(xiàn)性結(jié)合。不過(guò)，在脈絡(luò)叢周圍的腦組織中未發(fā)現(xiàn)AP-Ob染色。脈絡(luò)叢是主要決定腦脊液產(chǎn)生的組織。而且，脈絡(luò)叢被認(rèn)為是血腦屏障的“保護(hù)者”之一。
用由非融合的AP處理過(guò)的組織和由AP-Ob處理過(guò)的組織進(jìn)行對(duì)照AP染色，是在有加入的過(guò)量非結(jié)合Ob的條件下進(jìn)行，以便競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合所述融合蛋白。在這些對(duì)照的任一個(gè)中都未出現(xiàn)類似于Ab-Ob融合蛋白的染色現(xiàn)象，這表明所觀察到的AP-Ob結(jié)合是Ob特異的，而不是由AP導(dǎo)致的假象。
因此，總體來(lái)說(shuō)，只有在采用幾種方法之后才能定位一種結(jié)合Ob的細(xì)胞表面分子；而該細(xì)胞表面分子存在于大腦的特定部位-脈絡(luò)叢中。
Ⅶ..實(shí)施例克隆鼠ObR基因在下面的7.2.1節(jié)中，披露了由用鼠脈絡(luò)叢RNA構(gòu)建的表達(dá)文庫(kù)成功地克隆了一種短型Ob受體cDNA,famj5312。用上文第6節(jié)中所提供的實(shí)施例中披露的方法，用AP-Ob融合蛋白篩選表達(dá)文庫(kù)。在下文的7.2.2節(jié)披露了短型Ob受體編碼區(qū)的核苷酸序列，而且，還披露了Ob短型受體蛋白的氨基酸序列。在下文的7.2.3節(jié)中披露的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合研究表明，由提取的編碼一種受體的cDNA編碼的蛋白，表現(xiàn)出對(duì)小鼠和人Ob蛋白有高的親和結(jié)合力。7.2.4節(jié)所披露的研究證實(shí)了所分離的ObRcDNA克隆的真實(shí)性。
如下文所述，由ObR表現(xiàn)出的高親和力Ob結(jié)合和其與細(xì)胞因子受體Ⅰ型家族的同源性相關(guān)，這表明ObR是通過(guò)與Ob配體結(jié)合觸發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與哺乳動(dòng)物的體重控制。
A..材料和方法脈絡(luò)叢mRNA分離。
按照RSelden在分子生物學(xué)通用方法(Current Protocols for MolecularBiology)(4.2.3增補(bǔ)14)中披露的Chirgwin等的異硫氰酸胍/CsCl方法(1979，生物化學(xué)(Biochemistry)18:5294)每100只小鼠一批地從300只小鼠脈絡(luò)叢中分離總RNA。在進(jìn)行定量之后，用蒸餾過(guò)的去離子水將RNA稀釋至1mg/ml，并用等體積的DNase溶液(20mM MgCl2、2mM DTT、0.1單位DNase、0.6單位RNase抑制劑，溶于TE中)在37℃下培養(yǎng)30分鐘，以除去摻雜的DNA。用苯酚/三氯甲烷/異戊醇萃取所述RNA，并用乙醇沉淀。在260nm波長(zhǎng)下定量，然后對(duì)一個(gè)等分試樣進(jìn)行電泳，以檢測(cè)其完整性。一共純化了320μg總RNA。
用Qiagen(Chatsworth,CA)出售的Oligotex-dT試劑盒(產(chǎn)品目錄號(hào)70042)提取PolyA+RNA，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明操作。在進(jìn)行定量以后，用乙醇使mRNA沉淀，并以1mg/ml的濃度重新懸浮于蒸餾過(guò)的、去離子的、DEPC處理過(guò)的水中。一共純化了11μg Poly A+RNA。
文庫(kù)構(gòu)建。
按照Gubler和Hoffman的方法(Gene,1983,25:263)，用購(gòu)自LifeTechnologies(Gaithersburg,MD)的Superscript Plasmid cDNA合成試劑盒(產(chǎn)品目錄號(hào)Series 8248)合成cDNA。所得到的cDNA連接到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pMET7的NotⅠ/SalⅠ位點(diǎn)上，pMET7是pME18S的改進(jìn)型式，它使用上文所述的SRα啟動(dòng)子(Takebe,Y等，1988，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cel.Bio.)8:466)。之所以選擇該載體，是因?yàn)樗性贑OS7細(xì)胞中表達(dá)的強(qiáng)真核啟動(dòng)子，含有AMP抗性基因，而且長(zhǎng)度僅為3.0kb。該載體小的尺寸之所以重要，是因?yàn)樗茉黾涌寺〈笮蚦DNA的可能性。其它相當(dāng)?shù)妮d體為4.8kb，而且較大，因此增加了不完全復(fù)制的機(jī)率，并降低了克隆大型cDNA的可能性。用乙醇沉淀連接的cDNA，并以25mg/ml的濃度重新懸浮于蒸餾過(guò)的、去離子的、DEPC處理的水中。通過(guò)電穿孔法，在0.1cm的杯中用1μl DNA轉(zhuǎn)化40μl電感受態(tài)DH10B大腸桿菌。
進(jìn)行2次cDNA合成，并將其用于構(gòu)建兩個(gè)獨(dú)立的小鼠脈絡(luò)叢文庫(kù)mCP(小鼠脈絡(luò)叢)A和mCPD。
DNA制備。
根據(jù)cDNA轉(zhuǎn)化的效價(jià)用初級(jí)轉(zhuǎn)化體以150cfu/孔的濃度接種96深孔平板，接種1ml的LB-amp中。在使用等分試樣之前，僅讓初級(jí)轉(zhuǎn)化體在37℃下生長(zhǎng)1小時(shí)，以避免較小插入克隆的過(guò)分生長(zhǎng)，并因此使得在150cfu的庫(kù)(pool)中較大的克隆表現(xiàn)不足。在37℃下使培養(yǎng)物通氣生長(zhǎng)15-16小時(shí)。在制備之前，取出100μl細(xì)胞懸浮液，并加入100μl 50％的甘油中，混合，并于-80℃保存(甘油冷凍板)。
用WizardTMMiniprops DNA Purification System(Promega,Madison,WI；產(chǎn)品目錄號(hào)A7100)制備DNA，采用改進(jìn)的96孔方案。該方法如下1)在4℃下，以3200rpm的速度在96深孔板中離心培養(yǎng)物。除去上清液。
2)順序加入140μl每種細(xì)胞重懸液(50mM Tris-HCl,pH7.5,10mMEDTA,100μg/ml RNaseA)、細(xì)胞裂解液(0.2M氫氧化鈉，1.0％SDS)和中和液(1.32M乙酸鉀，pH4.8)，在加入每一種試劑后渦旋14秒鐘，以確?；旌狭己?。
3)將板在冰水中放置15分鐘。
4)在4℃下，以3200rpm的速度離心樣品10分鐘。
5)將上清液轉(zhuǎn)至96孔Polyfiltronic聚丙烯過(guò)濾板上(10μm,0.8ml)。
6)加入500μl WP樹(shù)脂，并在室溫下培養(yǎng)3-5分鐘；對(duì)所述板施加吸力。
7)用640μl的重懸液將樣品洗滌3遍。
8)在室溫下，以3200rpm的速度離心樣品5分鐘，以除去殘留緩沖液。
9)用40μl室溫下的水洗脫樣品2-5分鐘。
10)在室溫下，以3200rpm的速度使洗脫的DNA通過(guò)微孔板。
11)定量DNA。
收集方法。
設(shè)計(jì)收集方法，以得到大小最佳的1200cfu的庫(kù)，適于轉(zhuǎn)染和檢測(cè)，并可迅速降至150cfu的較小的庫(kù)。一旦鑒定到150的陽(yáng)性庫(kù)，為了提供該庫(kù)的表現(xiàn)度，需要400-800個(gè)獨(dú)立的克隆。開(kāi)始使用一個(gè)1200cfu的庫(kù)，意味著需要較少的DNA探針，但在最后的鑒定步驟中需要更多獨(dú)立的克隆(3200-6400)，因此，需要更多的時(shí)間來(lái)鑒定陽(yáng)性克隆。
從組成排的8個(gè)孔中等量收集共5μg DNA，共得到1200cfu。因此，每個(gè)96孔板可產(chǎn)生12份收集的DNA，用于轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞中。
在鑒定到陽(yáng)性庫(kù)之后，從構(gòu)成該庫(kù)的8個(gè)孔中的每一個(gè)中制備DNA，并再轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞中。在鑒定到一個(gè)陽(yáng)性孔之后，通過(guò)將該孔的一份甘油冷凍等分試樣鋪平板破壞該孔，以得到數(shù)以千計(jì)的獨(dú)立克隆。每一個(gè)陽(yáng)性克隆挑選400-800個(gè)克隆，并排列在96孔板中，用上述方法獲得DNA，并收集24個(gè)孔中的DNA用于轉(zhuǎn)染。從陽(yáng)性排中提取代表每一個(gè)克隆的DNA，并轉(zhuǎn)染，以作最終鑒定。
定量Ob細(xì)胞表面結(jié)合分析。
大致按以前就Kit-AP所述的方法(Flanagcm,J.G.和Leder,P.,1990,Cell 63:185-194)用AP-Ob融合蛋白進(jìn)行定量細(xì)胞表面結(jié)合試驗(yàn)。
Ob蛋白。
本文所使用的重組鼠Ob蛋白是以前披露的(Campfield等，1995,Science 269:546-549)。本文所用的重組人Ob蛋白，是用含有抗人Ob的單克隆抗體的單克隆抗體柱從桿狀病毒上清液中純化的。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)考馬斯藍(lán)染色判定，所純化的重組人Ob蛋白的純度大于95％。
DNA測(cè)序。
測(cè)序及序列組合是按以前披露的方法進(jìn)行的(International PolycysticKidney Consortium,1995,Cell 81:289-298)。
Northern分析通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(Chirgwin,J.M.等，1979,Biochemistry 18:5294-5299)，用由編碼鼠ObR胞外域的序列擴(kuò)增的標(biāo)記DNA對(duì)源于各種組織的PolyA+mRNA(Clontech)進(jìn)行Northern印跡分析檢測(cè)。
rt-PCR。
用標(biāo)準(zhǔn)方法(Zhang,Y.等，1994,Nature 372:425-432)對(duì)1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR(rt-PCR)反應(yīng)。具體地講，用隨機(jī)六聚體制備第一條cDNA鏈。然后用源于編碼ObR胞外域的序列的引物或G3PDH對(duì)照引物通過(guò)PCR擴(kuò)增所述第一條cDNA鏈。
B..結(jié)果1..克隆源于小鼠脈絡(luò)叢的Ob受體在上文的第6節(jié)中提供的實(shí)施例中所披露的AP-Ob融合蛋白與鼠脈絡(luò)叢的強(qiáng)Ob-特異結(jié)合表明，在該組織中可能有一種Ob受體高水平表達(dá)。因此，為了實(shí)現(xiàn)克隆編碼該Ob受體的cDNA，解剖獲自300只小鼠的脈絡(luò)叢，并從該組織中一共提取到11μg polyA+RNA用于按上文7.1節(jié)所披露的方法構(gòu)建cDNA文庫(kù)。
開(kāi)始，將3μg poly A+用于制備cDNA，再將該cDNA用于構(gòu)建小鼠脈絡(luò)叢cDNA文庫(kù)A。收集一切大小大于500bp的制備的cDNA(261ng)，并將其中的90ng連接在pMET7上。將這種連接的cDNA轉(zhuǎn)化到電感受態(tài)DH10B大腸桿菌中，得到一個(gè)大致為7.2×105cfu的文庫(kù)，其平均大小為1Kb。
鑒于cDNA文庫(kù)A沒(méi)有足夠數(shù)量的含有大到足于以統(tǒng)計(jì)學(xué)上合理的頻率編碼一種受體的插入片段，將另3μg poly A+RNA用于制備758ngcDNA。收集32ng代表cDNA最大的兩種級(jí)分的cDNA，并將其連接到pMET7上。用這種連接的cDNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)染，得到2.4×105cfu的小鼠脈絡(luò)叢文庫(kù)D，其平均插入片段大小為2kb。僅使用cDNA最大的兩種級(jí)分可保證該文庫(kù)傾向于大的cDNA。這一點(diǎn)通過(guò)鑒定10個(gè)克隆的插入片段大小得到了證實(shí)；其中7個(gè)克隆的插入片段的長(zhǎng)度大于2kb，未發(fā)現(xiàn)插入片段小于1kb的克隆。這與文庫(kù)A形成了對(duì)照，在文庫(kù)A中，20個(gè)克隆中的16個(gè)小于1kb。
從小鼠脈絡(luò)叢文庫(kù)A中制備并收集代表6×105cfu(40個(gè)板)的DNA。從小鼠脈絡(luò)叢文庫(kù)D中制備代表2.4×105cfu(16個(gè)板)的DNA。
為了進(jìn)行篩選，將所述文庫(kù)制備成有150個(gè)克隆的庫(kù)，并將8個(gè)庫(kù)的混合物用于每一次轉(zhuǎn)染(即1200克隆/轉(zhuǎn)染)。將收集的DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞中，并通過(guò)與含有鼠AP-Ob融合蛋白的上清液一起培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，洗滌，并染色以原位測(cè)定AP活性，一切操作盡如上文的6.1和6.2節(jié)所述。一旦鑒定到陽(yáng)性克隆，便對(duì)8個(gè)亞庫(kù)中的每一個(gè)分別進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)所得到的亞庫(kù)進(jìn)行一步細(xì)分，直到鑒定到單一的陽(yáng)性克隆。
一共由文庫(kù)A和D產(chǎn)生了632個(gè)DNA庫(kù)，共鑒定了10個(gè)獨(dú)立的陽(yáng)性庫(kù)。所有陽(yáng)性庫(kù)均被成功地分解為各有150個(gè)克隆的亞庫(kù)，并對(duì)陽(yáng)性亞庫(kù)進(jìn)一步細(xì)分，直到鑒定單個(gè)陽(yáng)性克隆。該克隆含有一個(gè)5.1kb的cDNA插入片段，被命名為famj5312。
2..Ob受體(ObR)及ObR基因用上文7.2.1節(jié)所述方法提取的famj5312鼠obRcDNA克隆含有一個(gè)大約為5.1kb的插入片段。由該克隆所得到的核苷酸序列示于圖1中(序列1)。該克隆的核苷酸序列表明，有一個(gè)開(kāi)放讀框，由該序列所產(chǎn)生的ObR的氨基酸序列也示于圖1中(序列2)。
該鼠ObR蛋白的推斷的894個(gè)氨基酸的序列始于一個(gè)甲硫氨酸，其密碼子位于與翻譯起始位點(diǎn)吻合的DNA序列內(nèi)。該ObR氨基酸序列始于一個(gè)從氨基酸殘基1-23的一個(gè)疏水信號(hào)序列，這種序列常見(jiàn)于膜結(jié)合性或分泌性蛋白。
所述鼠Ob受體蛋白含有一個(gè)從氨基酸殘基836-860的疏水性跨膜域，這表明該Ob受體跨過(guò)細(xì)胞膜一次。
該跨膜域的位置表明，成熟鼠ObR蛋白的胞外部分是從氨基酸殘基24至氨基酸殘基837。數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯示，ObR的胞外域含有同源片段，該片段使得ObR被歸入細(xì)胞因子受體的Ⅰ型家族(例如，為了回顧其發(fā)展，可參閱Heldin,C.-H,1995,Cell 80:213-223；和Kishimoto,T.和Tetsuya,T.,1994,Cell 76:253-252)。ObR似乎與IL-6受體、GSF受體和LIF受體的gp130信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分的關(guān)系最為密切。對(duì)ObR和gp130的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比研究揭示，盡管兩種蛋白之間總體上的序列相同性不高，但特征性的保守性的半胱氨酸殘基、Trp-Ser-X-Trp-Ser基序和Ⅰ型蛋白家族內(nèi)保守的其它氨基酸殘基卻顯而易見(jiàn)。
在該鼠Obr蛋白的單一跨膜域之后，有一個(gè)由34個(gè)氨基酸(即氨基酸殘基861-894)的短的胞質(zhì)域。同源性比較還表明，該ObR胞質(zhì)域的前23個(gè)氨基酸與LIF受體的近膜序列有30％的相同性。
對(duì)獲自總RNA的obR mRNA進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增證實(shí)了在脈絡(luò)叢中存在obR轉(zhuǎn)錄物(單鏈約為5kb)，而且還證實(shí)了其在下丘腦中的存在。另外，對(duì)源于幾種小鼠組織的poly A+RNA所做的Northern印跡分析表明，obR mRNA還存在于諸如肺和腎的其它組織中。
3..OB受體能有效結(jié)合OB蛋白對(duì)AP-Ob與由上文的7.2.2節(jié)所披露的obR cDNA編碼的ObR的結(jié)合進(jìn)行分析。該分析的結(jié)果示于圖2中，它證實(shí)了該ObR對(duì)小鼠和人Ob蛋白均有很強(qiáng)的Ob-特異性結(jié)合力。
在圖2中示出了對(duì)AP融合蛋白結(jié)合力的定量分析結(jié)果。在把所述ObR克隆瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中以后，檢查到1nM鼠AP-Ob的強(qiáng)力結(jié)合(相對(duì)模擬轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞或ObR轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞與非融合AP-一起培養(yǎng)而言)(圖2A)。這種結(jié)合幾乎能完全被100nM未標(biāo)記的重組小鼠或人萊普亭蛋白所抑制，這表明，該受體可以結(jié)合天然Ob。AP和人Ob的融合體還能以高親合力結(jié)合小鼠ObR，象一種在其N-末端為小鼠萊普亭，C-末端上為AP的融合蛋白(Ob-AP)一樣起作用。對(duì)小鼠AP-Ob的結(jié)合進(jìn)行Scatchard分析(圖2B)，所得到的解離常數(shù)值(KD)為0.7×10-9M。
4..famj5312克隆的真實(shí)性用幾種方法檢驗(yàn)所分離的ObR famj5312克隆的真實(shí)性。首先，用引物對(duì)8個(gè)分別分離的克隆(分別在150個(gè)克隆的亞庫(kù)中)PCR擴(kuò)增，制備至終止密碼子的obR序列3＇末端。序列分析證實(shí)，所有8個(gè)克隆均含有相同3＇非翻譯序列。另外，對(duì)分別分離的編碼ObRC-末端的5個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，并發(fā)現(xiàn)其分別利用相同的終止密碼子。最后，對(duì)獲自不同于產(chǎn)生所述cDNA文庫(kù)的品系的小鼠品系(C57/BLKsJ)的脈絡(luò)叢總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR(rt-PCR)，得到一種在相同的位點(diǎn)上含有終止密碼子的相同PCR產(chǎn)物。這些資料表明，所分離到的famj5312 cDNA克隆，既不是嵌合克隆，也不是罕見(jiàn)的異常剪接過(guò)程的結(jié)果，而是代表了一種編碼脈絡(luò)叢中主導(dǎo)型式的ObR受體的克隆。
5..克隆小鼠長(zhǎng)型ObR編碼核酸如本文所述，本發(fā)明人克隆了鼠ObR長(zhǎng)型。
為了找到人長(zhǎng)型ObR基因(圖3)的小鼠同系物，對(duì)自小鼠下丘腦、Ks、和脈絡(luò)叢、db和Ks中提取的第一條cDNA鏈進(jìn)行半嵌套PCR，所用的5′引物來(lái)自小鼠短型開(kāi)始與人長(zhǎng)型趨異的前面的片段，而3＇簡(jiǎn)并引物是由人ObR同系物胞內(nèi)區(qū)域設(shè)計(jì)的。通過(guò)3＇RACE對(duì)全轉(zhuǎn)錄物作進(jìn)一步鑒定。
從C57B1/KS(KS)和C57B1/KS-db(db)脈絡(luò)叢和下丘腦中制備全mRNA。用購(gòu)自GIBCO-BRL的Superscript Reverse Transcriptase的逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)六聚體或Oligo dT為引物，由1μg mRNA的cDNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。共制備了24μg cDNA。為了進(jìn)行PCR，以1∶200的比例稀釋cDNA，并將3μg稀釋的cDNA用于25μl反應(yīng)物中。
第一輪PCR反應(yīng)，使用編碼小鼠ObR蛋白序列PNPKNCSW的5＇引物，其核苷酸組成為5＇-CCAAAC CCC AAG AAT TGT TCC TGG-3＇；互補(bǔ)于編碼接近人長(zhǎng)型的羧基末端的KIMENKMCD的核苷酸序列的反向簡(jiǎn)并引物，其核苷酸組成為5＇-TC(GA)CA CAT(CT)TT(GA)TT(GATC)CC CATTAT CTT-3′。
在第二輪PCR反應(yīng)中，其3′引物相同，而5＇引物為第一輪反應(yīng)5＇引物的內(nèi)部，它編碼的蛋白序列為AQGLNFQK，其核苷酸組成為5＇-GCACAAGGACTGAATTTCCAAAAG-3＇。
按上述方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，所不同的是嵌套PCR的型式為94℃下3分鐘；94℃下30秒，57℃下30秒，72℃下40秒，反應(yīng)30輪；72℃下5分鐘，反應(yīng)1輪。
用Taq循環(huán)測(cè)序試劑盒，在自動(dòng)ABI 373A和377 DNA測(cè)序儀(AppliedBiosystems,Foster City,CA)上進(jìn)行DNA測(cè)序。用Sequencher進(jìn)行序列分析。
另外，用自下丘腦中提取的mRNA對(duì)編碼鼠長(zhǎng)型ObR胞內(nèi)域的核酸進(jìn)行半嵌套PCR，以得到足夠量的編碼小鼠長(zhǎng)型obR因的特定PCR產(chǎn)物。對(duì)該P(yáng)CR產(chǎn)物測(cè)序(圖6)證實(shí)，該DNA編碼長(zhǎng)型ObR的小鼠同系物。直到短型終止密碼子5＇端的第5個(gè)密碼子之前，短型和長(zhǎng)型的轉(zhuǎn)錄物是相同的，然后完全趨異，暗示發(fā)生了可變剪接。由小鼠長(zhǎng)型和人ObR推定的氨基酸序列在其編碼區(qū)長(zhǎng)度范圍內(nèi)是同源的，并具有75％的相同性(圖7)。
6..ObR mRNA的表達(dá)特性作為了解ObR組織分布的第一個(gè)步驟，在各種鼠組織中檢查其mRNA的表達(dá)。為此，用由編碼ObR胞外域的序列擴(kuò)增得到的標(biāo)記DNA對(duì)源于各種小鼠組織(心、腦、脾、肺、肝、骨骼肌、腎和睪丸；Clontech,Palo Alto,CA)的polyA+mRNA(2μg/泳道)的Northern印跡進(jìn)行檢測(cè)分析。雜交是按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，在65℃下在Rapid-hyb緩沖液中進(jìn)行的。
在大部分組織中，ObR mRNA以略大于5kb的單一條帶型式出現(xiàn)，表明這里所披露的5.1kb的cDNA克隆是全長(zhǎng)的。在分析過(guò)的組織中，在肺、腎和全腦中觀察到了表達(dá)。在睪丸中未檢測(cè)到表達(dá)。
對(duì)獲自總RNA的)bR mRNA進(jìn)行的RT-PCR擴(kuò)增，證實(shí)了該轉(zhuǎn)錄物在脈絡(luò)叢中的存在，還證實(shí)了其在下丘腦中的存在。用從小鼠脈絡(luò)叢或下丘腦中提取的1μg總RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。從db/db小鼠(C57B1/BLKsJ背景)或+/+同窩仔對(duì)照中分離組織。對(duì)用隨機(jī)六聚體制備的第一條cDNA鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物源于編碼ObR胞外域的序列或用G3PDH對(duì)照引物。在平行進(jìn)行的總RNA對(duì)照的模擬逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增中，未檢測(cè)到帶。
Ⅷ..實(shí)施例obR基因即db基因下文披露的實(shí)驗(yàn)和研究證實(shí)，obR基因位于db位點(diǎn)，而db小鼠中的obR基因是一種突變型obR，它可導(dǎo)致一種具有106個(gè)核苷酸的插入片段的異常剪接mRNA的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生一種截短的長(zhǎng)型鼠ObR蛋白，該蛋白與鼠短型ObR相同。
A..obR基因位于db遺傳間隙內(nèi)在此處所提供的實(shí)施例中，所披露的研究表明，obR基因位于小鼠4號(hào)染色體的4-5cM區(qū)，它相當(dāng)于db位點(diǎn)所處的同一區(qū)域。
1..材料和方法PCR擴(kuò)增。
將下列由famj5312衍生的引物用于擴(kuò)增小鼠基因組DNA正向引物5＇-GCTGCACTTAACCTGGC-3＇反向引物5＇-GGATAACTCAGGAACG-3＇。
PCR反應(yīng)混合物含有6μl模板DNA(10ng/μl)1.4μl 10×PerkinElmer(Novwalk,CT)PCR緩沖液，1.12μl dNTPs(2.5mM)、1.05μl正向引物(6.6μM)、1.05μl反向引物(6.6μM)、0.38μl H2O和3μl AmpliTaq HotstartTM聚合酶(Perkin Elmer；0.5u/μl)。
擴(kuò)增參數(shù)為94℃,2分鐘，此時(shí)加入ampli Taq，然后94℃,40秒，55℃,50秒和72℃,30秒一輪的反應(yīng)進(jìn)行共30輪次。
在相同反應(yīng)條件下使用第二組引物，所不同的是，55℃的輪次是在52℃下進(jìn)行正向引物5＇-CACTATTTGCCCTTCAG-3＇反向引物5＇-GCCTGAGATAGGGGTGC-3＇電泳。
在以下兩種條件下對(duì)樣品進(jìn)行電泳在室溫下，在非變性的8％丙烯酰胺凝膠上，以45W電泳3小時(shí)；在4℃下，在非變性的10％丙烯酰胺SSCP(單鏈構(gòu)象多形性)凝膠上，以20W電泳2.5小時(shí)。
用SYBR GreenⅠ對(duì)以上兩種類型的凝膠進(jìn)行染色，并在一臺(tái)MD熒光計(jì)上掃描，獲得了可以解釋的結(jié)果。
2..對(duì)famj5312 obR cDNA克隆進(jìn)行作圖按照8.1節(jié)中所披露的方法，由famj5312 cDNA的編碼序列設(shè)計(jì)PCR引物。這些引物擴(kuò)增了C57B1/6J基因組DNA的1921bp片段，它與obR cDNA上兩個(gè)引物之前的堿基對(duì)長(zhǎng)度吻合，和源于由野生型衍生的Mus Spretus品系SPRET/Ei。位于Mus Spretus等位基因上的3bp插入片段編碼一個(gè)位于45號(hào)和46號(hào)氨基酸之間的額外Asn。通過(guò)單鏈構(gòu)象多形性(SSCP)凝膠電泳和非變性凝膠電泳進(jìn)行的大小測(cè)定，在雜交(C57B1/6J×Mus Spretus)F1♀×C57B1/6J♂的182個(gè)回交子代中發(fā)現(xiàn)了ObR的Mus Spretus 195bp等位基因的遺傳分離。將Mus Spretus等位基因的分離型式與該回交實(shí)驗(yàn)組中已作圖的226個(gè)其它遺傳位點(diǎn)的分離型式加以比較。通過(guò)減少obR與其它標(biāo)記之間的復(fù)交換的次數(shù)證實(shí)，obR位于鼠4號(hào)染色體上，大致位于標(biāo)記D4Mit9遠(yuǎn)端2.2±1.6cM處，并位于標(biāo)記D4Mit46近端4.6±1.6cM處。通過(guò)對(duì)其它遺傳學(xué)標(biāo)記進(jìn)行作圖進(jìn)一步精細(xì)ObR的遺傳學(xué)圖距。參見(jiàn)圖8，該obR基因距離D4Mit255遠(yuǎn)端0.6±0.3CM，并距離D4Mitl55近端0.6±0.6CM。
由famj5312 cDNA 3＇序列設(shè)計(jì)的其它引物對(duì)(正向=CACTATTGCCCTTCAG；反向=GCCTGAGATAGGGGTGC)還證實(shí)了C57B1/6J基因組DNA與野生型衍生的Mus Spretus品系SPRET/Ei的基因組DNA之間在SSCP凝膠上的多態(tài)性。另外，這使得famj5312 cDNA的遺傳作圖可以用該克隆的另一個(gè)片段進(jìn)行。該多態(tài)性的作圖與上文披露的famj5312的作圖100％一致，同時(shí)證實(shí)了obR的作圖，并證實(shí)famj 5312 cDNA克隆不是嵌合型的。
3..鼠db遺傳區(qū)的確定小鼠db基因最初被作圖于小鼠4號(hào)染色體上(Hummel,K.-P.等，1966,Science 153:1127-1128)。對(duì)該遺傳定位已作過(guò)進(jìn)一步細(xì)化(Bahary,N.等，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8642-8646；Bahary,N.等，1993,Genomics 16:113-122)，以便將db定位于近鳥(niǎo)氨酸脫羧基酶4(Odc4)位點(diǎn)與無(wú)名遠(yuǎn)端標(biāo)記D4Rck22和D4Rck69之間的1.5cM的遺傳間距內(nèi)。Bahary等在1993年還報(bào)導(dǎo)D4Mit 205接近Odc4 1.1cM。因此，相對(duì)D4Mit205而言，db基因位于大約2.2cM的遠(yuǎn)端。
db等位基因最初出現(xiàn)于C57B1/BLKsJ近交系。隨后將所述db突變轉(zhuǎn)移到其它遺傳背景中，以形成同類品系。通過(guò)對(duì)同類品系C57B1/6J-m db動(dòng)物定型，可以確定db基因在小鼠4號(hào)染色體上必然存在的遺傳間距內(nèi)。通過(guò)上述分析，確定了必然含有db基因的遺傳間距，位于近端無(wú)名DNA標(biāo)記D4Mit255與遠(yuǎn)端標(biāo)記D4Mit 331和D4Mit 31之間，大致為4cM(在Mit圖上確定的遺傳距離；Dietvich,W.F.等，1994，自然，遺傳學(xué)分冊(cè)(NatureGenetics)7:220-245；Copeland,N.G.等，1993,Science 262:67；Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research，鼠遺傳圖譜，DatabaseRelease 10,April 28,1995)。應(yīng)當(dāng)指出的是，由Bahary等(1993，同上)確定的間距似乎比本文所確定的遺傳圖距小幾個(gè)厘摩(cM)。參見(jiàn)圖8，其中，D4Mit255和D4Mit31之間的距離大約為5.1cM。
通過(guò)比較上述famj5312的作圖數(shù)據(jù)和db的作圖數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，famj5312的圖位距D4Mit255遠(yuǎn)端0.6±0.6cM，距D4Mit155近端0.6±0.6cM，完全符合obR是db基因的設(shè)想。
B..db小鼠的obR突變可產(chǎn)生一種截短的長(zhǎng)型受體1..材料和方法由C57B1/KS(KS)和C57B1/KS-db(db)脈絡(luò)叢和下丘腦制備總mRNA。用購(gòu)自GIBCO-BRL的Superscript Reverse Transcviptase逆轉(zhuǎn)錄酶，用隨機(jī)六聚體或Oligo dT作引物，由1μg mRNA的cDNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA。共制備了24μg cDNA。為了進(jìn)行PCR，將cDNA稀釋1∶200倍，并將3μg稀釋過(guò)的cDNA用于25μl的反應(yīng)物中。
根據(jù)小鼠短型cDNA克隆、famj5312和長(zhǎng)型cDNA克隆(圖6)設(shè)計(jì)引物，使其覆蓋短型和長(zhǎng)型obR cDNA的編碼區(qū)。由每種樣品制備平均大小為600bp的重疊PCR片段。在0.8％的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。從凝膠上分離DNA并用瓊脂糖酶酶解。用兩種末端引物和內(nèi)部引物對(duì)瓊脂糖酶酶解的DNA片段測(cè)序。
PCR條件。25μl PCR反應(yīng)物中含有2mM MgCl2,0.5mM每種引物，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各200mM，和0.5單位的Taq聚合酶，溶于1×Taq聚合酶緩沖液(Perkin-Elmer)。所有PCR反應(yīng)均在GeneAmp PCRSystem 9600(Pekin-Elmer)上進(jìn)行。除非另作說(shuō)明，一般的PCR參數(shù)為94℃下3分鐘；94℃下10秒，57℃下10秒，72℃下40秒，35輪次，72℃下5分鐘1輪次。
DNA測(cè)序和序列分析。在自動(dòng)ABI 373A和377 DNA測(cè)序儀上，用Taq循環(huán)測(cè)序試劑盒(Applied Bio-systems,Fobter City,CA)進(jìn)行DNA測(cè)序。用測(cè)序儀(Sequencher)進(jìn)行序列分析。
2..結(jié)果用從KS和db小鼠的脈絡(luò)叢中提取的mRNA進(jìn)行半嵌套PCR。用dbcDNA作模板制備的PCR產(chǎn)物大約比用KsDNA作模板制備的產(chǎn)物長(zhǎng)100bp。對(duì)兩種PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序。在上述小鼠的脈絡(luò)叢中表達(dá)的短型mRNA的編碼序列內(nèi)，未檢測(cè)到序列差異。然而，在對(duì)由始于兩種型式共有的跨膜域并止于長(zhǎng)型所特有的胞內(nèi)域所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)db/db和對(duì)照之間在幾種組織中存在明顯差異。測(cè)序數(shù)據(jù)表明，推定的db長(zhǎng)型obR相比正常長(zhǎng)型轉(zhuǎn)錄物量有一個(gè)106bp的插入片段(圖9)。該106bp片段包括編碼最后5個(gè)氨基酸的序列、終止密碼子以及所述短型的88bp3′UTR區(qū)的序列。db長(zhǎng)型能產(chǎn)生一種與所述短型相同的截短的ObR蛋白，它缺少胞內(nèi)域。在所有db組織中均未檢測(cè)到所述正常長(zhǎng)型，在對(duì)照組織中也未檢測(cè)到db長(zhǎng)型。
為了了解這種明顯的剪接錯(cuò)誤的機(jī)制，我們比較了db/db小鼠和對(duì)照小鼠的obR基因組序列。在db/db小鼠的106bp插入位點(diǎn)之后緊鄰的2bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)G→T的核苷酸變化。這種變化所產(chǎn)生的剪接供體能將所述106bp的片段轉(zhuǎn)化成插入db長(zhǎng)型中的外顯子。由于上述插入作用，該db長(zhǎng)型僅能產(chǎn)生一種不具備胞內(nèi)信號(hào)域的截短蛋白。由于與ObR關(guān)系最密切的Ⅰ型細(xì)胞因子受體均具有長(zhǎng)的胞間域，所述長(zhǎng)型的長(zhǎng)的胞間域?qū)τ趩?dòng)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要。上述資料所述受體在體重調(diào)節(jié)方面的作用，而不能產(chǎn)生ObR長(zhǎng)型是db/db小鼠出現(xiàn)極度肥胖表型的原因。
Ⅸ..實(shí)施例克隆人ObR編碼核酸本節(jié)將披露編碼人ObR的cDNA和基因組DNA的克隆和鑒定。
A..克隆人Obr cDNA將所述famj 5312 cDNA插入片段用于檢測(cè)購(gòu)自Sratagene(La Jolla,CA)的建在Uni-Zap XR載體上的人胎腦cDNA文庫(kù)。之所以選擇源于人胎腦的cDNA文庫(kù)，是因?yàn)樵撐膸?kù)有可能含有存在于整個(gè)腦部的cDNA，包括脈絡(luò)叢、小鼠obRcDNA組織源，以及存在于下丘腦中的cDNA。
以大約50,000pfu/板的密度將所述cDNA文庫(kù)鋪平板于20塊平板上。用Amersham Hybond-N尼龍薄膜濾膜在每塊板上重復(fù)進(jìn)行濾膜吸附(lift)。按照標(biāo)準(zhǔn)方法將所述濾膜變性、中和和交聯(lián)。在有32P標(biāo)記的核苷酸的條件下，通過(guò)隨機(jī)引導(dǎo)對(duì)探針進(jìn)行放射性標(biāo)記。讓濾膜與探針在65℃下，在Church＇s緩沖液(7％SDS、250mM NaHPO4、2μM EDTA、1％BSA)雜交過(guò)夜。次日，在65℃下，在2×SSC/0.1％SDS中洗滌濾膜20分鐘，然后在0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌10分鐘。隨后在-80℃下用其對(duì)Kodak膠片曝光5小時(shí)。
在對(duì)照比較重復(fù)的濾膜之后，獲得了13個(gè)重復(fù)的信號(hào)。隨后進(jìn)行二次鋪平板，將每種初級(jí)塞的10μl 1∶1000的稀釋液鋪平板。使用與上文所述相同的探針、雜交和洗滌條件。在80℃下對(duì)膠片曝光2小時(shí)。13個(gè)原始陽(yáng)性信號(hào)中僅有一個(gè)在該膠片上產(chǎn)生重復(fù)信號(hào)。
對(duì)來(lái)自陽(yáng)性平板的4個(gè)獨(dú)立噬斑進(jìn)行處理，并按照Stratagene披露的方法，用ExAssist輔助噬菌體、XLl-Blue細(xì)胞和SOLR細(xì)胞剪切。然后將剪切產(chǎn)物鋪平板于LB/Amp平板上，并在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜。從每個(gè)平板上挑取一個(gè)白色菌落，并在37℃下，在液體LB/Amp中生長(zhǎng)過(guò)夜。次日，用Promega Witzard Mini-prep試劑盒進(jìn)行小量制備。用EcoRⅠ和XhoⅠ消化該小量制備產(chǎn)物，測(cè)定插入片段的大小。4個(gè)克隆之一(d)具有一個(gè)大約6kb的插入片段。
用Qiagen Plasmid Maxi試劑盒制備供測(cè)序用的DNA。
圖3表示人ObR cDNA的核苷酸序列(序列3)，它編碼信號(hào)序列(氨基酸殘基1至20左右)、胞外域(大約從氨基酸殘基21～839)、跨膜域(大約從氨基酸殘基840-862)和胞質(zhì)域(大約從氨基酸殘基863-1165)。
B..克隆人obR基因組DNA正如這里所披露的，本發(fā)明人克隆了人ObR基因組DNA。
將famj5312 cDNA插入片段用于檢測(cè)購(gòu)自Genome Systems Inc.的人高密度PAC濾膜(產(chǎn)品目錄號(hào)FPAC-3386)。用Prime-It試劑盒(Stratagene；產(chǎn)品目錄號(hào)300392)對(duì)探針進(jìn)行隨機(jī)引導(dǎo)的標(biāo)記。按照生產(chǎn)商推薦的方法，在Amersham Rapid-hyb緩沖液中進(jìn)行雜交。然后在65℃下，在2×SSC/1％SDS中洗滌濾膜，并在-80℃下對(duì)Kodak膠片進(jìn)行曝光。
鑒定到11個(gè)推定的陽(yáng)性PAC克隆。測(cè)定其方格位置，而所述克隆購(gòu)自Geneme Systems,Inc.。
本發(fā)明人將方格位置P298-K6上的克隆命名為hobr-p87，通過(guò)用來(lái)自O(shè)bR開(kāi)放讀框的5＇(obRF4和obR R4)和3＇(obRS和obRO)末端的引物對(duì)進(jìn)行的PCR測(cè)試進(jìn)一步證實(shí)其含有整個(gè)ObR編碼區(qū)。用于該驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中的引物如下obRF4:5＇-CTGCCTGAAGTGTTAGAAGA-3′obRR4:5＇-GCTGAACTGACATTAGAGGTG-3＇ohRS: 5＇-ACCTATGAGGACGAAAGCCAGAGAC-3′obRO: 5＇TGTGAGCAACTGTCCTCGAGAACT-3＇已于1995年12月28日將hobr-p87交由ATCC保存。
X..實(shí)施例構(gòu)建ObR-免疫球蛋白融合蛋白A..制備OBR-IG融合蛋白將人ObR的胞外部分制備成與免疫球蛋白恒定區(qū)結(jié)合的融合蛋白。免疫球蛋白的恒定區(qū)可以具有遺傳修飾，包括能減弱或消除免疫球蛋白結(jié)構(gòu)所固有的效應(yīng)活性的修飾(例如，參見(jiàn)PCT公開(kāi)號(hào)WO 88/07089，
公開(kāi)日1988年9月22日)。簡(jiǎn)單地講，進(jìn)行PCR重疊延伸，以便將編碼人ObR的胞外部分的DNA連接于編碼人IgG1的絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)的DNA。上述目的是按照在以下的小節(jié)中所披露的方法實(shí)現(xiàn)的。
B..制備基因融合體以100μl的最終體積制備PCR反應(yīng)物，該反應(yīng)物由Pfu聚合酶和含有引物(各1μM)、dNTPs(各200μM)、和1ng模板DNA的緩沖液(Stratagene)組成。
通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備相當(dāng)于結(jié)合Ob的編碼ObR ECD或其一部分的DNA序列的DNA片段，所使用的引物對(duì)是為了擴(kuò)增編碼整個(gè)人ObRECD的序列以及少量5′非編碼序列而設(shè)計(jì)的。例如，正向引物為5＇-GTCACGATGTCGACGTGTACTTCTCTGAAGTAAGATGATTTG-3＇相當(dāng)于圖3中的核苷酸-20至+8，在其5＇末端另有14個(gè)核苷酸(含有一個(gè)SalⅠ位點(diǎn))。反向引物為5′-GTCAGGTCAGAAAAGCTTATCACTCTGTGTTTTTCAATATCATCTTGAGTGAA-3′相當(dāng)于圖3中核苷酸+2482至+2517的補(bǔ)體，在其5＇末端另有18個(gè)核苷酸(含有一個(gè)HindⅢ位點(diǎn))。將一種編碼人ObR的cDNA用作擴(kuò)增胞外域的模板。用上述引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增能產(chǎn)生一種編碼ObR胞外域的DNA片段。
在另一個(gè)PCR反應(yīng)中，設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增IgG恒定區(qū)(即絞鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū))的第二組引物，以使反向引物有一個(gè)獨(dú)特的限制位點(diǎn)，而正向引物的5＇末端互補(bǔ)于在前面的ObR ECD擴(kuò)增中所用反向引物的5＇末端區(qū)(即5′-AAGCTTTTCTGACCTGACNNN-3＇)，這使得ObR編碼核苷酸序列上的開(kāi)放讀框延伸至待擴(kuò)增的IgG核苷酸序列的整個(gè)長(zhǎng)度。該反應(yīng)中所用的模板DNA是人IgG重鏈基因組DNA的2000個(gè)核苷酸的片段(Ellison等，1982,Nuc.Acids.Res 10:4071-4079)。
通過(guò)另一個(gè)PCR反應(yīng)制備完整的人ObR-IgG融合片段。混合上述兩個(gè)PCR反應(yīng)的純化產(chǎn)物，變性(95℃,1分鐘)，然后復(fù)性(54℃,30秒)，使兩種片段互補(bǔ)的末端退火。用dNTP和Taq聚合酶以及用第一個(gè)PCR反應(yīng)的正向PCR引物和第二個(gè)PCR反應(yīng)的反向PCR引物擴(kuò)增的整個(gè)片段補(bǔ)平所述鏈。為了便于克隆到表達(dá)載體上，隨后用能識(shí)別第一個(gè)PCR反應(yīng)的正向PCR引物和第二個(gè)PCR反應(yīng)的反向PCR引物上特別設(shè)計(jì)的位點(diǎn)的限制酶裂解所得到的片段。然后該消化過(guò)的片段克隆到同樣用所述限制酶處理過(guò)的表達(dá)載體上。
將序列分析用于證實(shí)其結(jié)構(gòu)，并將該結(jié)構(gòu)用于轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，以檢測(cè)瞬時(shí)表達(dá)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，有多種因素影響待將所述ObR-IgG融合片段克隆至其中的表達(dá)載體的選擇，如宿主生物的性質(zhì)、實(shí)現(xiàn)所需轉(zhuǎn)錄和翻譯控制的必需元件。例如，如果需要瞬時(shí)表達(dá)，可以上面制備的ObR-IgG融合片段克隆到表達(dá)載體pcDNA-1(Invitrogen)上。另外，通過(guò)將ObR-IgG融合片段克隆到表達(dá)載體pcDNA-3(Ivitrogen)上，可以實(shí)現(xiàn)融合蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。
另外，可以用諸如CD5-IgG1載體(由Amffo等披露，1990,Cell,61:1303-1313)的已含有IgG恒定區(qū)的表達(dá)載體制備小鼠和/或人ObR-IgG融合蛋白。按照上述方法，用一個(gè)PCR反應(yīng)制備編碼ObR胞外域的DNA片段，以使編碼ObR胞外域的開(kāi)放讀框是連續(xù)的，并符合編碼IgG恒定區(qū)的開(kāi)放讀框。
例如，用Extaq(PanVera Corp.)對(duì)小鼠和人ObR的胞外域(包括信號(hào))肽進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將以下引物用于在第一代表達(dá)結(jié)構(gòu)中擴(kuò)增小鼠和人ObR小鼠正向引物5′-CCCAATGTCGACATGATGTGTCAGAAATTCTAT-3＇反向引物5′-AAAAAGGATCCGGTCATTCTGCTGCTTGTCGAT-3＇人正向引物5′-CCCAATGTCGACATGGTGTACTTCTCTGAAGTA-3＇反向引物5′-TTTTTGGATCCCACCTGCATCACTCTGGTG-3＇上述每一個(gè)正向引物均含有一個(gè)SalⅠ限制位點(diǎn)，而上述每一個(gè)反向引物含有一個(gè)BamHⅠ限制位點(diǎn)。用所述小鼠和人obR cDNA作模板進(jìn)行擴(kuò)增，然后將所得到的PCR片段克隆到CD5-IgG載體(Aruffo等，1990,Cell)的XhoⅠ/BamHⅠ位點(diǎn)。將所得到的載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中，并制備條件培養(yǎng)基。用蛋白A對(duì)該條件培養(yǎng)基進(jìn)行免疫沉淀(IP)，并通過(guò)SDS PAGE分析證實(shí)，小鼠ObR IgG融合蛋白的表達(dá)水平高于人ObR-IgG的表達(dá)水平。為了提高人ObR-IgG融合體的表達(dá)，設(shè)計(jì)能擴(kuò)增人ObR胞外域(無(wú)信號(hào)肽)的引物，并將該片段和編碼小鼠ObR的信號(hào)肽共連接到CD5-IgG載體上。將以下引物用于擴(kuò)增與小鼠ObR信號(hào)肽融合的人ObRECD片段正向引物5′ -TTTAACTTGTCATATCCAATTACTCCTTGGAGATTTAAGTTGTCTTGC3＇反向引物5＇TTTTTGGATCCCACCTGCATCACTCTGGTG-3＇在擴(kuò)增，限制酶消化和亞克隆之后，讓所得到的結(jié)構(gòu)在COS細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。對(duì)所得到的條件培養(yǎng)基所作的IP和SDS-PAGE分析證實(shí)了170KD人ObRIgG融合蛋白的成功表達(dá)。加強(qiáng)免疫球蛋白融合蛋白表達(dá)的另一種方法，包括以這種方式將ObR胞外域(不包括信號(hào)肽)插入CD5-IgG1載體中使CD5信號(hào)肽融合于成熟的ObR胞外域上。已證實(shí)這樣一種信號(hào)肽的融合，可加強(qiáng)免疫球蛋白融合蛋白的表達(dá)。
C..制備修飾的CH2域可對(duì)按上述方法制備的ObR-IgG基因融合體的核苷酸序列進(jìn)行修飾，用絲氨酸殘基置換鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基，和/或置換CH2域內(nèi)被認(rèn)為是IgG結(jié)合Fc受體及補(bǔ)體活化所必需的氨基酸。
修飾CH2域，置換被認(rèn)為是與結(jié)合Fc受體相關(guān)的氨基酸的過(guò)程是按如下方法實(shí)現(xiàn)的。按上述方法制備質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，提供用于修飾ObR-IgCγl CH2域的模板。用上文第一個(gè)PCR反應(yīng)中所述的正向PCR引物和一種反向引物對(duì)該模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所述反向引物設(shè)計(jì)成與IgG1的CH2域的5′末端部分同源，所不同的是，所設(shè)計(jì)的改變氨基酸234、235和237的5個(gè)核苷酸置換(Canfield,S.M.和Morrison,S.L.(1991)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)173:1483-1491)分別為L(zhǎng)eu-Ala、Leu-Glu、和Gly-Ala。用該P(yáng)CR引物進(jìn)行擴(kuò)增，能產(chǎn)生一種由CH2域的修飾部分組成的DNA片段。在第二個(gè)PCR反應(yīng)中，用上文所述第二個(gè)PCR反應(yīng)中所用的反向引物和一種正向引物對(duì)該模板進(jìn)行擴(kuò)增，將所述正向引物設(shè)計(jì)成與該分子的Ig部分互補(bǔ)，并含有為CH2氨基酸置換所必須的5個(gè)互補(bǔ)核苷酸改變。用所述引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，能產(chǎn)生一種由CH2域的修飾部分、一個(gè)內(nèi)含子、CH3域和3＇端附加序列組成的片段。通過(guò)另一個(gè)PCR反應(yīng)制備由修飾的CH2域組成的完整obR-IgCγl片段?；旌仙鲜鰞蓚€(gè)PCR反應(yīng)的純化產(chǎn)物，變性(95℃,1分鐘)，然后復(fù)性(54℃,30秒)，使兩種片段的互補(bǔ)末端退火。用dNTP和Taq聚合酶以及用所述第一個(gè)PCR反應(yīng)的正向PCR引物和第二個(gè)PCR反應(yīng)的反向PCR引物擴(kuò)增的完整片段補(bǔ)平所述鏈。為了便于克隆到所述表達(dá)載體上，隨后用能識(shí)別所述第一個(gè)PCR反應(yīng)的正向PCR引物和第二個(gè)PCR反應(yīng)的反向PCR引物所特有的位點(diǎn)的限制酶裂解所得到的片段。然后將該消化過(guò)的片段克隆到同樣用上述限制酶處理過(guò)的表達(dá)載體上。
將序列分析用于證實(shí)其結(jié)構(gòu)，并將該結(jié)構(gòu)用于轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，以檢驗(yàn)其瞬時(shí)表達(dá)。將hIgG ELISA用于測(cè)定/證實(shí)瞬時(shí)表達(dá)水平，對(duì)于所述結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，其表達(dá)水平為100ng蛋白/ml細(xì)胞上清液。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞系，以便永久表達(dá)該融合蛋白。
D..OBR-lg中和Ob蛋白為了證實(shí)ObR-IgG融合蛋白是否能在體外和在小鼠體內(nèi)結(jié)合并中和OB蛋白(萊普亭)，用小鼠ObR-IgG融合蛋白對(duì)293個(gè)細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。在蛋白A柱上將ObR-IgG蛋白純化至接近均相。并分析其抑制堿性磷酸酶-OB融合蛋白(AP-OB)結(jié)合細(xì)胞表面ObR的能力。
用小鼠ObR cDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，并測(cè)試其結(jié)合0.5nM AP-OB的能力。如圖10所示，純化的ObR-IgG能有效抑制或中和AP-OB融合蛋白與細(xì)胞表面ObR的結(jié)合。
圖10中的第1欄表示在沒(méi)有ObR-IgG融合蛋白的條件下觀察到的高水平的特異結(jié)合。第2、3和4欄表示用3種不同的純化ObR-IgG柱級(jí)分所觀察到的對(duì)結(jié)合近乎完全的抑制。
Ⅺ..OBR長(zhǎng)型具有IL-6型細(xì)胞因子受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力為了驗(yàn)證克隆的ObR同種型是否具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，將ObR基因?qū)胨⒌慕M織培養(yǎng)細(xì)胞系，并將相應(yīng)于OB處理的細(xì)胞反應(yīng)與由結(jié)構(gòu)上相關(guān)的IL-6型細(xì)胞因子受體介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)加以比較。在該實(shí)例中所提供的結(jié)果證實(shí)了ObR長(zhǎng)型是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，并具有IL-6型細(xì)胞因子受體的功能特異性。
A..材料和方法1.細(xì)胞按已知方法培養(yǎng)COS-1、COS-7、H-35(Baumann等，1989,Ann.N.Y.Acad.Sci.557:280-297),HepG2和Hep3B(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257)細(xì)胞。在僅含有0.5％胎牛血清或添加了1μM地塞米松、0.1-1000ng/ml人OB、1000ng/ml小鼠OB、IL-6(Genetics Institute)或G-CSF(Immunex Corp.)的培養(yǎng)基中處理所述細(xì)胞。為了用gp130抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并用抗人gp130、B-R3的兩種泛抑制的(pan-blocking)單克隆抗體(Chevalier等，1995,N.Y.Acad.Sci.762:482-484)和144的混合物(20μg/ml)處理細(xì)胞。
2..表達(dá)載體及CAT報(bào)導(dǎo)基因構(gòu)建體上文披露了人ObR長(zhǎng)型和小鼠ObR短型的表達(dá)載體(7-9節(jié))。業(yè)已披露了截短的人G-CSFR(27)(Ziegler等，1993,Mol.Cell.Brol.,13:2384-2390)和大鼠STAT1、STAT3和STAT5B(Lai等，1995,J.Biol.Chem.,270:23254-23257；Ripperger等，1995,J.Biol.Chem.270:29998-30006)。通過(guò)重疊延伸PCR，用合成的編碼特定氨基酸置換的寡核苷酸(Higuchi等，1988,Nucleic Acids Res.12:5707-5717)制備具有突變的框3(box3)序列(Y1141F)的ObR。該Y1141F的1141位上的酪氨酸被苯丙氨酸所取代。通過(guò)將密碼子716和717轉(zhuǎn)換成兩個(gè)終止密碼子，制備了含有截去55個(gè)羧基末端殘基的大鼠STAT3的質(zhì)粒SV-SPORT1(Life Technologies,Inc.)。先前已披露了CAT報(bào)導(dǎo)基因構(gòu)建體，pHRRE_CAT和pIL-6RE-CAT(Lia等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257；Movella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310)。
3..細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分析通過(guò)DEAE-葡聚糖方法(Lopata等，1989,Nucleic Acids Res.12:5707-5717)用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染COS-1、H-35和Hep3B細(xì)胞，通過(guò)磷酸鈣方法(Graham等，1973，病毒學(xué)(Virology),52:456-461)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，并通過(guò)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺方法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。將COS細(xì)胞的繼代培養(yǎng)物在無(wú)血清培養(yǎng)基中保持16小時(shí)，然后通過(guò)用細(xì)胞因子處理15分鐘激活STAT蛋白。按照Sadowski等(1993,Science,26:1739-1744)所披露的方法，用全細(xì)胞提取物通過(guò)EMSA測(cè)定STAT蛋白對(duì)DNA的結(jié)合作用。將高親和性SIEm 67(Sadowski等，1993,Science,26:1739-1744)和TB-2(Ripperger等，1995,J.Biol.Chem.270:29998-30006)的雙鏈寡核苷酸用作EMSA底物。用細(xì)胞因子或OB處理CAT基因轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)物24小時(shí)。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞提取物系列稀釋液對(duì)CAT活性進(jìn)行定量，換算成共轉(zhuǎn)染標(biāo)記質(zhì)粒pIE-MUP(Morella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310)的表達(dá)，并以每一個(gè)實(shí)驗(yàn)系列的非處理對(duì)照培養(yǎng)物的值(定為=1.0)的相對(duì)值型式表示。大致按Cheng和Flangan所披露的方法(Cheng & Flanagan,1994,Cell,79:157-168)定量AP-OB融合蛋白的細(xì)胞表面結(jié)合力(6節(jié))。
B..結(jié)果和討論1..OBR活化STAT蛋白為了測(cè)定ObR是否具有恢復(fù)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)器的能力，用兩種代表性O(shè)bR型式-小鼠短型(也相當(dāng)于在db/db小鼠中檢測(cè)到的突變形)和人長(zhǎng)型-的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。轉(zhuǎn)染2天后，在1nM人或小鼠堿性磷酸酶-OB中培養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò)所表現(xiàn)出的堿性磷酸酶-OB(AP-OB)融合蛋白的特異結(jié)合測(cè)定ObR的細(xì)胞表面表達(dá)。短型ObR的轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致結(jié)合作用比長(zhǎng)型的結(jié)合作用大約高10倍。在多種AP-OB濃度下進(jìn)行的Scatchard轉(zhuǎn)化的結(jié)合數(shù)據(jù)表明，所觀察到的長(zhǎng)型的較低結(jié)合力主要為降低的細(xì)胞表面表達(dá)所致。小鼠短型結(jié)合鼠和人配體的親和力為0.7nM，而人長(zhǎng)型結(jié)合鼠和人配體的親和力為1.0nM。
用人或小鼠ObR的表達(dá)載體(2μg/ml)和各種STAT蛋白(3μg/ml)對(duì)COS-1細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。通過(guò)ObR表達(dá)載體和各種STAT同種型所進(jìn)行的共轉(zhuǎn)染，可以分析由配體誘導(dǎo)的特定STAT蛋白的激活作用。在沒(méi)有或有OB(100ng/ml)的條件下處理轉(zhuǎn)染的細(xì)胞15分鐘，并通過(guò)EMSA用診斷性寡核苷酸底物STE或TB-2鑒定對(duì)STAT蛋白結(jié)合DNA的激活作用。在上述實(shí)驗(yàn)中，僅有長(zhǎng)型ObR能激活內(nèi)源COS STAT蛋白或共表達(dá)的STAT1、STAT3或STAT5B。ObR對(duì)所有STAT同種型的激活作用都是配體依賴型的。相反，短型ObR不能激活任何內(nèi)源或共轉(zhuǎn)染的STAT蛋白，盡管其具有高的表面表達(dá)力。由于長(zhǎng)型ObR能激活所有同樣能由G-CSFR、LIFR和gp130激活的STAT蛋白(Kishimoto等，1995,Blood,86:1243-1245；Lia等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257)，推測(cè)該長(zhǎng)型ObR能以IL-6型細(xì)胞因子受體的特異性刺激轉(zhuǎn)錄作用。
2..OBR信號(hào)誘導(dǎo)基因表達(dá)先前已將嚙齒類和人肝癌細(xì)胞系用于確定異位表達(dá)的血細(xì)胞生成素受體的基因誘導(dǎo)作用(Baumann等，Mol.Cell.Biol.14:138-146)。隨后，將3種互補(bǔ)的肝癌細(xì)胞系用于鑒定ObR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。將長(zhǎng)型或短型ObR或人G-CSFR連同HRRE-CAT報(bào)導(dǎo)基因結(jié)構(gòu)一起導(dǎo)入大鼠H-35細(xì)胞，其在這些細(xì)胞中的表達(dá)通過(guò)許多血細(xì)胞生成素的信號(hào)而得以加強(qiáng)(Morrella等，1995,J.Biol.Chem.270:8289-8310)。僅用無(wú)血清培養(yǎng)基或含有細(xì)胞因子(mOB、LIF或IL-6)的有或沒(méi)有地基米松的培養(yǎng)基處理繼代培養(yǎng)物24小時(shí)。長(zhǎng)型ObR介導(dǎo)了CAT基因表達(dá)的配體依賴型誘導(dǎo)。其激發(fā)作用得到了地塞米松的協(xié)同加強(qiáng)作用。由ObR介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)十分類似于內(nèi)源IL-6R的作用，但特征性地不同于內(nèi)源LIFR的作用。相反，短型ObR未能誘導(dǎo)基因表達(dá)，這表明有34個(gè)殘基的胞質(zhì)域盡管有與框1相關(guān)的基序，但不能恢復(fù)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。具有被截短至27個(gè)殘基的胞質(zhì)域G-CSFR仍能在有配體的條件下誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄這一事實(shí)表明，所述細(xì)胞能對(duì)由一種血細(xì)胞生成素受體的短的、含有框1的胞質(zhì)域作出反應(yīng)。在G-CSFR-轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞中不能誘導(dǎo)CAT基因表達(dá)這一事實(shí)表明，在沒(méi)有轉(zhuǎn)染的ObR的條件下，H-35細(xì)胞對(duì)OB無(wú)反應(yīng)。
3..OBR獨(dú)立于gp130起作用上面所披露的結(jié)果支持這樣的模型長(zhǎng)型ObR能重建類似于IL-6R的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。接著，為了確定gp130是否是功能性O(shè)bR的一部分，將長(zhǎng)型ObR連同HRRE-CAT或IL-6RE-CAT一起導(dǎo)入HepG2細(xì)胞，并測(cè)定抗gp130抗體的抑制作用。
用小鼠或人OB處理轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞，能產(chǎn)生類似的、強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，其作用強(qiáng)度落在由IL-6所產(chǎn)生作用的范圍內(nèi)(30-40倍的激發(fā)作用)。劑量效應(yīng)分析表明，用100ng/ml OB可獲得最大的調(diào)節(jié)作用。在4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，1-5ng/ml OB可產(chǎn)生1/2最大激發(fā)作用，1000ng/ml的濃度所產(chǎn)生生的激發(fā)作用一致性地低于最大值。在有已知其能抑制所有IL-6型細(xì)胞因子受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗人gp130單克隆抗體(Chevalier等，1995,N.YAcad.Sci.762:482-484)的條件下，IL-6對(duì)基因表達(dá)的激發(fā)作用正如預(yù)料般地被破壞了，而OB的調(diào)節(jié)作用未受影響。上述結(jié)果表明，ObR是獨(dú)立于gp130起作用(對(duì)抗gp130不敏感)，而且，通過(guò)受體的同源寡聚化可以觸發(fā)信號(hào)啟動(dòng)。
4..OBR的框3序列和STAT3與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)由IL-6 RE誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄是IL-10R的血細(xì)胞生成素受體的特征，該受體的胞質(zhì)域內(nèi)至少有一個(gè)拷貝的框3基序(YXXQ)(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257)。已證實(shí)框3序列因其在受體相關(guān)激酶激活方面的作用而參與重建STAT3與受體的結(jié)合(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257；Stahl等，1995,Science 267:1349-1353)。長(zhǎng)型ObR(圖3)在氨基酸位置1141-1144上含有一個(gè)拷貝的框3基序，這可能是STAT3的激活作用和IL-6RE-CAT的轉(zhuǎn)錄激發(fā)作用的原因。為驗(yàn)證ObR的框3基序和STAT3是否與ObR的基因誘導(dǎo)作用相關(guān)，使用兩種互補(bǔ)的試劑一種框3突變型ObR和一種顯性失活STAT3。通過(guò)將氨基酸位置1141上的酪氨酸誘變成苯丙氨酸(Y1141F)測(cè)定框3序列在長(zhǎng)型ObR上所起作用。用野生型ObR或ObRY1141F的表達(dá)載體(2μg/ml)連同pHRRE-CAT或pIL-6RE-CAT一起轉(zhuǎn)染HepG2和H-35細(xì)胞。用人OB(100ng/ml)處理細(xì)胞，并測(cè)定CAT活性的相對(duì)變化。將突變型ObR轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中所產(chǎn)生的對(duì)HRRE-和IL-6RE-CAT報(bào)導(dǎo)基因結(jié)構(gòu)的激發(fā)作用低于野生型ObR的激發(fā)作用。例如，在HepG2細(xì)胞和H-35細(xì)胞中，HRRE-CAT表達(dá)的激發(fā)作用降低了40倍。IL-6RE-CAT的激發(fā)作用在HepG2細(xì)胞中降低了20倍，而在H-35細(xì)胞中降低了100倍。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，突變型ObR的減了的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性并非由于破壞了表面表達(dá)，正如由AP-OB結(jié)合所證實(shí)的。突變的相對(duì)作用在IL-6RE上的表現(xiàn)比在HRRE上的表現(xiàn)更為明顯。用H-35細(xì)胞所做的一個(gè)類似實(shí)驗(yàn)證實(shí)，框3突變與IL-6RE調(diào)節(jié)作用的喪失相關(guān)，而HRRE的調(diào)節(jié)作用僅受到很小的影響。這一結(jié)果與先前的觀察一致，即在某些細(xì)胞系中，STAT3的恢復(fù)在由IL-6RE介導(dǎo)的基因誘導(dǎo)方面的作用大于在由HRRE介導(dǎo)的基因誘導(dǎo)方面的作用(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257；Morella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310；Wang等，1995,Blood 86:1671-1679)。
Y1141F ObR突變型的降低的基因調(diào)控作用還與STAT蛋白較低的激活作用相關(guān)。當(dāng)像轉(zhuǎn)染野生型ObR般地將突變型ObR轉(zhuǎn)染到COS-1細(xì)胞中時(shí)，未檢測(cè)到內(nèi)源COS STAT蛋白的激活作用。另外，ObR Y1141F在激活超量表達(dá)的STAT1和STAT3方面的作用比野生型ObR低大約10倍。不過(guò)，STAT5B的激活作用不受該突變的影響。由ObR Y1141F對(duì)STAT的激活作用的上述特征，與在框3缺陷型gp130(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257)和G-CSFR(Movella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310)上所觀察到的結(jié)果相吻合，并能解釋在報(bào)導(dǎo)基因結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)方面的特殊變化。
STAT3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用是利用STAT3 55C的超量表達(dá)確定的，STAT355C是一種突變型STAT3，其羧基末端的55個(gè)殘基被截去了，在對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的作用方面，它起著STAT3的顯性失活抑制劑的作用。諸如上文11.2.1節(jié)中所披露的DNA結(jié)合試驗(yàn)證實(shí)，長(zhǎng)型ObR能有效激活STAT3 55C的DNA結(jié)合活性。STAT3 55C基本上能破壞由ObR介導(dǎo)的IL-6RE的誘導(dǎo)作用，并能將HRRE的作用減弱50％。上述資料表明，在肝細(xì)胞中，有ObR參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑同樣為IL-6-型細(xì)胞因子受體所利用，而且對(duì)STAT3 55C敏感。
5..OBR能利用STAT3和STAT5B基因誘導(dǎo)特定的報(bào)導(dǎo)基因結(jié)構(gòu)在HepG2或H-35細(xì)胞中的誘導(dǎo)作用最大，而且不會(huì)受到超量表達(dá)的野生型STAT蛋白的明顯加強(qiáng)。為了證實(shí)由ObR激活的STAT蛋白是否起著正調(diào)節(jié)物的作用，用人ObR連同pIL-6RE-CAT或pHRRE-CAT和STAT蛋白的表達(dá)載體一起轉(zhuǎn)染人Hep3B細(xì)胞。相對(duì)非處理的對(duì)照測(cè)定人OB(100ng/ml)對(duì)CAT活性的激發(fā)作用(平均值±S.D.；N=3-4)。所述肝癌細(xì)胞仍能表達(dá)功能性IL-6R，但缺乏針對(duì)其它IL-6-型細(xì)胞因子的受體(Baumam等，1994,Mol.Cell.Biol.14:138-146)。而且，所述細(xì)胞具有較低含量的STAT3和-5，因此，可通過(guò)STAT蛋白超量表達(dá)所獲得的功能測(cè)定ObR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。由上述實(shí)驗(yàn)所得出的結(jié)果表明，超量表達(dá)的STAT3可介導(dǎo)IL-6RE的誘導(dǎo)作用增加15倍。超量表達(dá)的STAT31和STAT5B可分別將由ObR介導(dǎo)的HRRE-CAT的誘導(dǎo)作用提高5倍和30倍。
C..結(jié)論上文所提供的結(jié)果表明，全長(zhǎng)ObR是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，其作用模式與IL-6-型細(xì)胞因子受體相關(guān)。這些數(shù)據(jù)還支持這樣的假設(shè)，即截短的ObR變體，如在很多組織中表達(dá)的或由db突變型轉(zhuǎn)錄物編碼的短型，要么是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不能的，要么產(chǎn)生一個(gè)減弱了的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的所有組成成分，弱到無(wú)法用本文所使用的工具檢測(cè)到。在肝細(xì)胞中在基因表達(dá)水平上實(shí)現(xiàn)的OB反應(yīng)的重建這一事實(shí)有說(shuō)服力的提示我們，同樣的過(guò)程也可能發(fā)生在下丘腦細(xì)胞中或其它能正常表達(dá)全長(zhǎng)ObR的細(xì)胞類型中。ObR是通過(guò)STAT蛋白與特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)聯(lián)，以及有關(guān)這些蛋白是通過(guò)可鑒別的DNA結(jié)合元件控制基因的特異性的知識(shí)，可能有助于確定ObR的直接作用，這與理解OB在體內(nèi)的作用相關(guān)。上文所提供的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)還可被用于研究有關(guān)天然存在的短型ObR在其長(zhǎng)型的功能調(diào)節(jié)方面的功能性作用(如果有這樣的作用的話)。
12..OBR的突變分析為了確定ObR胞質(zhì)區(qū)上對(duì)激活基因重要的區(qū)域，產(chǎn)生了一系列突變體，并進(jìn)行了分析。下面所披露的研究，確定了兩個(gè)對(duì)誘導(dǎo)基因表達(dá)至關(guān)重要的ObR胞質(zhì)域的獨(dú)特區(qū)域。
12.材料和方法12.1.1細(xì)胞用Baumann等所披露的方法(1989,Ann.N.Y.Acad.Sci.557:280-297)培養(yǎng)COS-1、COS-7和H-35細(xì)胞。在含有0.5％胎牛血清和1μM地塞米松的培養(yǎng)基中進(jìn)行模擬激發(fā)，或在添加了100ng/ml人萊普亭(Roche)、IL-6(Genetics Institute)或G-CSF(Immunex Corp)的同一種培養(yǎng)基中處理。
12.1.2表達(dá)載體和CAT報(bào)導(dǎo)基因結(jié)構(gòu)用于長(zhǎng)型人ObR的表達(dá)載體已在上文(第9節(jié))中披露，而大鼠STAT1、STAT3和STAT5B已在現(xiàn)有技術(shù)中披露(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257；Ripperger等，1995,J.Biol.Chem.270:29998-30006)。通過(guò)PCR制備pOB-RΔ1115-1165、pOB-RΔ1065-1165和pOB-RΔ965-1165，它們均編碼羧基末端截短的人ObR。簡(jiǎn)單地講，將跨人ObR的胞內(nèi)域的寡核苷酸用于制備特定氨基酸的框內(nèi)終止密碼子。用EcoRⅤ和XbaⅠ消化PCR片段，并將該片段亞克隆到用EcoRⅤ和XbaⅠ消化過(guò)的人ObR上。用類似方法制備pOB-RΔ868，但使用能產(chǎn)生一個(gè)MscⅠ-XbaⅠ片段的引物，由該片段取代內(nèi)源人ObR序列。按照在11.1.2節(jié)中披露的方法制備編碼具有突變的框3序列的人ObR的pOB-RY1141F。ObR突變體pOB-R(boxlmt)在其ObR框1基序中含有PNP→SNS的變化(aa876和878)；而突變型pOB-RY986F和pOB-RY1079F是通過(guò)重疊延伸PCR制備，制備時(shí)使用合成的寡核苷酸，該寡核苷酸編碼特定的Tyr→Phe的氨基酸置換(Higuchi等，1988,Nucleic Acids Res.16:7351-7367)。CAT報(bào)導(dǎo)基因結(jié)構(gòu)pHRRE-CAT和pIL-6-CAT已在現(xiàn)有技術(shù)中披露(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257；Movella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310)。
12.1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分析通過(guò)DEAE-葡聚糖方法(Lopata等，1984,Nucleic Acids Res.12:5707-5717)轉(zhuǎn)染COS-1和H-35細(xì)胞，并通過(guò)脂轉(zhuǎn)染胺方法(Tarstaglia等，1995,Cell 83:1263-1271)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。為了分析STAT的激活作用，將COS細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中保持16小時(shí)，接著用100ng/ml萊普亭或G-CSF處理細(xì)胞15小時(shí)。
為了進(jìn)行CAT分析，將轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)分，并用配體處理24小時(shí)。測(cè)定CAT報(bào)導(dǎo)基因活性，并以每個(gè)實(shí)驗(yàn)系列的非處理對(duì)照所得到的值的相對(duì)值型式表示。按照Sadowski等所披露的方法(1993,Science 26:1739-1744)，通過(guò)對(duì)全細(xì)胞提取物進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)分析STAT蛋白對(duì)DNA的結(jié)合。在EMSA中，用放射標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸SIEm67(用于STAT1和STAT3)和TB-2(用于STAT5B)作結(jié)合底物。按照Cheng和Flangan所披露的方法(1994,Cell 79:157-168)，通過(guò)定量AP-OB融合蛋白細(xì)胞表面結(jié)合力分析COS細(xì)胞中的受體表達(dá)。
12.1.4免疫印跡所有免疫印跡均按Baumann等所述方法(1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:XXX-XXX)進(jìn)行，并按照生產(chǎn)商(Amersham)的說(shuō)明，通過(guò)加強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)顯現(xiàn)免疫活性蛋白。對(duì)STAT5B特異的兔多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology。
12.2結(jié)果和討論如上所述，ObR是Ⅰ型細(xì)胞因子受體超家族的一員。這一類型的受體缺乏內(nèi)源性酪氨酸激酶活性，并且是由配體誘導(dǎo)的受體同源二聚化或異源二聚化激活的。在很多場(chǎng)合，活化作用需要激活Janus家族(JAKs)的受體相關(guān)激酶(Ihle等，1994，生物科學(xué)動(dòng)態(tài)(Trends.Biol.Sci.)19:222-227)。JAK與細(xì)胞因子受體的胞內(nèi)部分的近膜域相關(guān)，在由配體誘導(dǎo)的受體激活作用之后啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。JAK蛋白的下游目標(biāo)包括轉(zhuǎn)錄因子的STAT(SignalTransducers and Activators of Transcription)家族的成員(Ihle等，1994,Trends.Biol.Sci.19:222-227)。STAT是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，它含有Src-同源(SH2)域，它能通過(guò)磷酸化酪氨酸殘基與受體分子相互作用。STAT由酪氨酸的磷酸化作用激活，形成異源二聚體或同源二聚體，轉(zhuǎn)運(yùn)到胞核中，并調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。
12.2.1 OBR胞內(nèi)域至少包括2個(gè)對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有重要作用的區(qū)域?yàn)榱舜_定ObR胞質(zhì)域中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的區(qū)域，制造一系列的C-末端缺失突變體(圖11A)。將編碼這些突變體的cDNA連同IL-6RE-CAT或HRRE-CAT報(bào)導(dǎo)結(jié)構(gòu)一起瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染到H-35細(xì)胞中，并測(cè)定其激發(fā)轉(zhuǎn)錄的能力(圖11B)。除掉ObR的框3序列(aa 1141-1144)的C-末端截短作用，破壞了由IL-6-RE引起的轉(zhuǎn)錄激活作用(圖11B；上圖)。這一結(jié)果與單個(gè)框3基序中Y→F突變的事實(shí)或ObR在H-35細(xì)胞中通過(guò)IL-6RE徹底破壞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(11.2.4節(jié))的情況吻合。相反，除去極端C-末端序列對(duì)通過(guò)HRRE進(jìn)行的ObR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的減弱作用很小，直到除去位置868-965之間的大約97個(gè)氨基酸之后才能徹底破壞其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(圖11B)。
為了確保各種ObR突變體的表達(dá)載體能指導(dǎo)表面定位受體蛋白的合成，通過(guò)AP-OB結(jié)合研究測(cè)定用各種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的受體表達(dá)。由ObR C-末端截短所產(chǎn)生的蛋白，是在表面上表達(dá)，并與配體結(jié)合(圖12)。而且，ObR的表達(dá)水平隨胞內(nèi)域的漸進(jìn)性截短而提高。
如上文所述，通過(guò)IL-6RE進(jìn)行的ObR基因誘導(dǎo)與STAT1和STAT3的激活作用相關(guān)，而且，已證實(shí)通過(guò)HRRE完成的ObR基因誘導(dǎo)與STAT5B的激活作用相關(guān)。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)HRRE激發(fā)和STAT5B激活作用之間的關(guān)系，用STAT5B的表達(dá)質(zhì)粒和ObR缺失突變體共轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。用這些細(xì)胞制備提取物，對(duì)該提取物所做的免疫印跡表明STAT5B是以相對(duì)均等的量在每一種轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物中表達(dá)。用萊普亭處理細(xì)胞。做EMSA分析，并通過(guò)Western印跡定量STAT蛋白含量。ObR的漸進(jìn)性C-末端截短，可導(dǎo)致其激活STAT5B的能力減弱，而且，只有在除去近膜ObR片段之后(結(jié)構(gòu)pOBRΔ868-1165)才喪失可檢測(cè)的STAT5B激活作用。因此，ObR STAT5B激活作用的喪失和通過(guò)HRRE進(jìn)行的基因誘導(dǎo)之間似乎存在相關(guān)性。
為了確定保守性胞內(nèi)域酪氨酸殘基和近膜框1基序在由HRRE進(jìn)行的ObR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，制備了突變體OB-RY1141F、OB-RY986F、OB-RY1079F和OB-R(boxlmt)(圖13A)。當(dāng)在COS細(xì)胞中分析時(shí)，AP-OB結(jié)合研究證實(shí)，上述突變體大致表達(dá)在細(xì)胞表面，野生型ObR也是如此。在將OB-RY986F和OB-RY1079F轉(zhuǎn)染到H-35細(xì)胞中后，其調(diào)節(jié)HRRE的能力未變(圖13B)。相反，ObR框1基序的突變會(huì)使由該元件實(shí)現(xiàn)的對(duì)基因誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用完全喪失。因此，ObR的框1基序似乎是決定ObR激活能通過(guò)HRRE調(diào)節(jié)基因誘導(dǎo)的激活途徑的重要決定因素。
由ObR通過(guò)IL-6RE進(jìn)行的基因誘導(dǎo)需要接近ObR的極端C-末端的序列(圖11B)。相反，通過(guò)HRRE進(jìn)行的ObR基因誘導(dǎo)似乎不需要這些C-末端序列。另外，除去ObR胞內(nèi)域序列的氨基酸965-1165之間的大約200個(gè)氨基酸之后僅對(duì)由所述元件進(jìn)行的基因誘導(dǎo)產(chǎn)生很小的影響，而是取決于氨基酸868-965之間的大約17個(gè)氨基酸的近膜序列。因此，所提出的ObR框2基序(Lee等，1996,Nature 379:632-635)(從ObR aa 1066-1075)似乎對(duì)由HRRE進(jìn)行的基因誘導(dǎo)不產(chǎn)生作用。EMSA分析表明，HRRE的基因誘導(dǎo)作用與ObR激活STAT5B的能力相關(guān)。有趣的是，已完全缺失了所有胞內(nèi)域酪氨酸殘基、并因此缺失了所有潛在的SH2?？课稽c(diǎn)的OB-RΔ965-1165，依然能夠低水平進(jìn)行STAT5B激活，并通過(guò)HRRE進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)激發(fā)。只有當(dāng)ObR的近膜序列被除去之后(OB-RΔ868-1165)，HRRE基因誘導(dǎo)作用和STAT5B的激活作用才會(huì)完全喪失。與此吻合的是，含有突變型框1基序的OB-R(box lmt)同樣不能誘導(dǎo)由HRRE實(shí)現(xiàn)的基因誘導(dǎo)作用，并可因此推測(cè)其不能激活STAT5B。
13.OBR的多聚化ObR的一級(jí)結(jié)構(gòu)提示，它與IL-6-型細(xì)胞因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞基的關(guān)系極為密切。這一類型的成員可通過(guò)異源二聚化或同源二聚化而被激活(Kishimeto等，1994,Cell 76:253-262；Heldm等，l995,Cell 80:213-223)。前者包括IL-6的受體、白血病抑制因子(LIF)、制癌蛋白M、IL-11和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)，它們均擁有共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物gp130(Kishimoto等，1994,1994,Cell 76:253-262；Taga等，1989.Cell58:573-581)。不過(guò)，早先我們已發(fā)現(xiàn)ObR似乎獨(dú)立于gp130進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Baumann等，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:XXX-XXX)。因此，ObR可以在有關(guān)其它輔助鏈的條件下起作用，如被IL-3、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-5(IL-3Rβ)、或IL-2、IL-4、IL-7和IL-9(IL-2Rγ)的受體所共用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞基。不過(guò)，ObR可在不能表達(dá)IL-3Rβ或IL-R-γ的肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)(Wang等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310)。另外，ObR可以被同源二聚化所激活，正如由粒細(xì)胞集落刺激因子受體(G-CSFR)所證實(shí)的(Fukanaga等，1991,EMBO J.10:2855-2865；Ishezaka-Ikeda等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:123-127)。因此，為了確定ObR是否具有二聚化并以同源二聚體的型式進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，構(gòu)建了編碼與ObR的胞內(nèi)域結(jié)合的G-CSFR胞外域的嵌合受體，或具有與G-CSFR的胞內(nèi)域結(jié)合的ObR胞外域的反復(fù)受體(reciprocal receptor)，并對(duì)其進(jìn)行了分析(圖14)。
13.1材料和方法13.1.1.細(xì)胞按照Baumann等所披露的方法(1989,Ann.N.Y.Acad.Sci.557:280-297)培養(yǎng)COS-1、COS-7和H-35細(xì)胞。在含有0.5％胎牛血清和1μM地塞米松的培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行模擬刺激，或用添加了100ng/ml人萊普亭(Roche)、IL-6(Genetics Institute)、或G-CSF(Immunex Corp.)的同一種培養(yǎng)基進(jìn)行處理。
13.1.2表達(dá)載體及CAT報(bào)導(dǎo)基因結(jié)構(gòu)長(zhǎng)型人ObR的表達(dá)載體如上文所述(第9節(jié))，全長(zhǎng)G-CSFR或截短的G-CSFR(ΔCyto)(Ziegler等，1993,Mol.Cell.Bvol.13:2384-2390)，以及大鼠STAT1、STAT3和STAT5B已在現(xiàn)有技術(shù)中披露(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257；Ripperger等，1995,J.Biol.Chem.270:29998-30006)。在本文中，術(shù)語(yǔ)“Δcyto”是指胞質(zhì)域的缺失。G-CSFR/ObR嵌合受體是通過(guò)PCR制備的，它編碼人G-CSFR的胞外域(aa1-598)，該胞外域鄰接人ObR的跨膜域和胞內(nèi)域(aa829-1165)。通過(guò)PCR制備ObR/G-CSFR嵌合受體，它編碼與人G-CSFR的胞內(nèi)域(aa631-813)結(jié)合的小鼠ObR胞外域和跨膜序列(aa1-860)。CAT報(bào)導(dǎo)基因結(jié)構(gòu)、pHRRE-CAT和pIL-6-CAT已在現(xiàn)有技術(shù)中披露(Lai等，1995,J.Biol.Chem.270:23254-23257；Morella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310)。
13.1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分析用DEAE葡聚糖方法(Lopata等，1984,Nucleic Acids Res.12:5707-5717)轉(zhuǎn)染COS-1和H-35細(xì)胞，并用脂轉(zhuǎn)染胺方法(Tartaglia等，1984,Cell 83:1263-1271)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。為了分析STAT蛋白激活作用，在無(wú)血清培養(yǎng)基中保持COS細(xì)胞16小時(shí)，隨后用100ng/ml萊普亭或G-CSF處理細(xì)胞15分鐘。
為了做CAT測(cè)定，對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)分，并用配體處理24小時(shí)。測(cè)定CAT報(bào)導(dǎo)活性，并以所獲得的每個(gè)實(shí)驗(yàn)系列的非處理對(duì)照培養(yǎng)物的值的相對(duì)值型式表示。按照Sadowski等所披露的方法(1993,Science 26:1739-1744)，用全細(xì)胞提取物作電泳遷移率變動(dòng)分析，以分析STAT蛋白的DNA結(jié)合力。在該EMSA分析中，將放射標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸SIEm67(用于STAT1和STAT3)和TB-2(用于STAT5B)用作結(jié)合底物。按照Cheng和Flangan所披露的方法(1994,Cell 79:157-168)，通過(guò)定量AP-OB融合蛋白的細(xì)胞表面結(jié)合力分析COS細(xì)胞中的受體表達(dá)。
13.1.4免疫印跡所有免疫印跡均按Baumann等所披露的方法進(jìn)行(1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:XXX-XXX)，并按照生產(chǎn)商(Amersham)所披露的方法，通過(guò)加強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)顯現(xiàn)免疫活性蛋白。對(duì)STAT5B特異的兔多克隆抗血清購(gòu)自Santa Curz Biotechnology?？辜?xì)菌表達(dá)的G-CSF-R胞外域的山羊多克隆抗血清是在Roswell Park Cancer Institute Springville Laboratories制備的。
13.2結(jié)果和討論下面將披露的實(shí)驗(yàn)提示，盡管ObR胞質(zhì)域的二聚化可能足以進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但隨著配體結(jié)合，也可形成較高級(jí)別的同源寡聚體。
13.2.1同源二聚化OBR胞內(nèi)域可能足以進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由于已證實(shí)嵌合受體復(fù)合體對(duì)于分析細(xì)胞因子受體激活作用十分有效(Movella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310；Vigon等，1993，癌基因(Oncogene)8:2607-2615；Baumann等，1994,Mol.Cell.Biol.14:138-146)，制備了ObR/G-CSFR和G-CSFR/ObR嵌合體，并進(jìn)行了研究，作為分析ObR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的一種工具(圖14A)。為了分析G-CSFR/ObR嵌合受體是否能夠產(chǎn)生與野生型ObR相當(dāng)?shù)呐潴w誘導(dǎo)的信號(hào)，測(cè)試該嵌合體的STAT激活作用和轉(zhuǎn)錄激發(fā)作用。G-CSFR/ObR與STAT蛋白的共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了一種由G-CSF-誘導(dǎo)的STAT1、STAT3和STAT5B激活作用。這一結(jié)果與由OB在ObR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中誘導(dǎo)的STAT蛋白激活作用相似。通過(guò)對(duì)用G-CSFR/ObR轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物進(jìn)行免疫印跡分析證實(shí)了嵌合受體的表達(dá)。上述結(jié)果表明，由G-CSF介導(dǎo)的ObR胞質(zhì)域的二聚化，可產(chǎn)生一種ObR-類型的STAT蛋白的激活作用。另外，已發(fā)現(xiàn)G-CSFR/ObR嵌合體可以激發(fā)轉(zhuǎn)錄作用，這一結(jié)果是在用IL-6RE和HRRE報(bào)導(dǎo)結(jié)構(gòu)對(duì)H-35細(xì)胞進(jìn)行受體共轉(zhuǎn)染之后，通過(guò)檢測(cè)該細(xì)胞中的基因誘導(dǎo)而測(cè)定的(圖14B)。已發(fā)現(xiàn)所誘發(fā)的反應(yīng)類似于ObR或內(nèi)源IL-6R所述報(bào)導(dǎo)基因結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)作用。
上述結(jié)果表明，兩個(gè)ObR胞質(zhì)域的同源二聚化可啟動(dòng)由ObR進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，類似于由野生型G-CSFR實(shí)現(xiàn)的介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制。不過(guò)，G-CSFR/ObR嵌合體不能確切地證明OB配體具有使ObR胞外域二聚化的能力。因此，分析了由含有與G-CSFR胞內(nèi)域結(jié)合的ObR胞外域的相互嵌合體產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性(圖14A)。事實(shí)上，ObR/G-CSFR嵌合體可以介導(dǎo)相當(dāng)于由野生型ObR、G-CSFR/ObR和野生型G-CSFR的基因誘導(dǎo)作用(圖14B)。因此，綜合上述結(jié)果表明，ObR無(wú)須輔助鏈來(lái)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且，兩個(gè)ObR胞內(nèi)域的聚合似乎足以實(shí)現(xiàn)受體激活。
兩個(gè)ObR胞內(nèi)域的聚合足以產(chǎn)生一個(gè)伴隨配體誘導(dǎo)的激活作用的信號(hào)這一事實(shí)表明，ObR可通過(guò)受體的同源二聚化起作用。如果是這樣的話，由ObR實(shí)現(xiàn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是“有害的”，即超量表達(dá)一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷型同源二聚化配偶體，類似于受體酪氨酸激酶家族成員所表現(xiàn)出的特征(Paulson等，1989,J.Biol.Chem.264:17615-17618；Svensson等，1990,J.Biol.Chem.265:20863-20868；Wen等，1992,J.Biol.Chem.267:2512-2518；Fantl等，1993,Annu.Rev.Biochem.62:453-481)。如上文所述(第12節(jié))，僅含有胞質(zhì)域的6個(gè)近膜氨基酸的ObR是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷型(圖11B)。因此，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，以確定一種截短的、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷型ObR的表達(dá)是否會(huì)破壞由全長(zhǎng)ObR進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。用截短的受體OB-RΔ868-1165和全長(zhǎng)ObR對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，并測(cè)定這種復(fù)合體激發(fā)一種報(bào)導(dǎo)基因結(jié)構(gòu)表達(dá)的能力，其中，OB-RΔ868-1165的量相對(duì)全長(zhǎng)ObR是逐漸加大的。用量逐漸加大的截短O(píng)bR不會(huì)減弱由野生型受體進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖15A)。不過(guò)，即使在截短受體的用量大大超出全長(zhǎng)受體用量的情況下，所觀察到的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制也未能達(dá)到由超量表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷型截短G-CSFR(Δcyto)對(duì)G-CSFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制(圖15A和15C)。所觀察到的ObR和G-CSFR對(duì)顯性失活阻抑的不同的敏感性，是其胞外域的特征，這是由用受體嵌合體進(jìn)行的顯性失活研究所證實(shí)的(圖15B和15C)。
對(duì)obR這種弱的顯性失活阻抑加一種可能的解釋是，兩個(gè)ObR分子的相互作用可能需要位于所述受體胞內(nèi)區(qū)的功能域。為了驗(yàn)證這種可能性，檢驗(yàn)了由一種突變性受體進(jìn)行的ObR顯性失活阻抑，該突變型是通過(guò)ObR框3基序中的一個(gè)氨基酸置換(Y1141F)產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷而實(shí)現(xiàn)的。如上所述，這種突變可完全破壞H-35細(xì)胞中由IL-6RE實(shí)現(xiàn)的ObR調(diào)節(jié)基因誘導(dǎo)的作用(第12節(jié))。因此，對(duì)OB-R(Y1141F)抑制由該增強(qiáng)因子實(shí)現(xiàn)的野生型ObR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力進(jìn)行了研究。所述研究表明，提高轉(zhuǎn)染突變型OB-RY1141F對(duì)野生型受體的比例，不會(huì)明顯抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖15E)。因此，ObR框3突變體和OB-RΔ868-1165在其反式阻抑野生型ObR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的能力表現(xiàn)相似。有趣的是，截短的或框3突變型ObR受體的低水平表達(dá)，可產(chǎn)生對(duì)野生型ObR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的輕度加強(qiáng)作用。而且，在有用量逐漸加大的截短O(píng)B-RΔ868-1165的條件下，還可觀察到ObR/G-CSFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的類似特征(圖15A、15B和15C)。
如上所述(第11節(jié))，ObR可以在有IL-6-型細(xì)胞因子受體的gp130信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的中和抗體的條件下，在肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。而且，所述肝癌細(xì)胞不能表達(dá)其它特征性的細(xì)胞因子受體輔助鏈IL-2Rγ或IL-3Rβ(Wang等，1995,Blood 86:1671-1679；Morella等，1995,J.Biol.Chem.270:8298-8310)。因此，ObR可能是通過(guò)一個(gè)與受體同源二聚化相關(guān)的機(jī)制起作用。在Ⅰ型細(xì)胞因子受體家族的成員中，推測(cè)由G-CSFR進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是通過(guò)配體誘導(dǎo)的受體同源二聚化而啟動(dòng)的(Fukanaga等，1991,EMBO J.10:2855-2865；Ishezaka-IKeda等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.90:123-127)。如上所述，已證實(shí)將嵌合受體用于分析細(xì)胞因子受體激活作用是十分有效的(Movella等，1995，同上；Vigon等，1993，同上；Baumann等，1994，同上)，制備了ObR/G-CSFR和G-CSFR/ObR嵌合體，并將其作為分析ObR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的工具加以研究。所述研究揭示，G-CSFR/ObR嵌合體可有效啟動(dòng)IL-6RE-CAT和HRRE-CAT報(bào)導(dǎo)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄作用(圖14B)。由于G-CSFR在結(jié)合G-CSF時(shí)被認(rèn)為可形成同源二聚體，這意味著兩個(gè)胞內(nèi)ObR域的聚合足以啟動(dòng)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。ObR/G-CSFR嵌合體還以這種方式通過(guò)IL-6RE和HRRE介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活作用(圖14B)。上述結(jié)果表明，萊普亭結(jié)合可以使兩個(gè)ObR胞外域二聚化，由此引發(fā)至少兩個(gè)胞內(nèi)G-CSFR域的結(jié)合，并激活所述受體復(fù)合體。而且，上述結(jié)果表明，可以制備出能像ObR激動(dòng)劑那樣通過(guò)兩個(gè)ObR鏈的簡(jiǎn)單交聯(lián)而起作用的小型分子或抗體。
正如就可通過(guò)簡(jiǎn)單的同源二聚化而激活的受體所預(yù)測(cè)的那樣，一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷型同源二聚化配偶體的共表達(dá)，可大大減弱由全長(zhǎng)G-CSFR和G-CSFR/嵌合體實(shí)現(xiàn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。不過(guò)，OB-RΔ868-1165不能如此有效地抑制由全長(zhǎng)ObR或ObR/G-CSFR嵌合體進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，可能的情況是，萊普亭與細(xì)胞表面受體的結(jié)合可導(dǎo)致較高級(jí)別的寡聚化(受體數(shù)＞2/復(fù)合體)，正如在IL-10受體復(fù)合體上所證實(shí)的(Tan等，1995,J.Biol.Chem.21:12906-12911)以及在活化素/TGF-βR家族的成員上所證實(shí)的(Brand等，1993,J.Biol.Chem.268:11500-11503；Weiser等，1993,Mol.Cell.Biol.13:7239-7247；Wrana等，1994,Cell 71:1003-1014；Moustakas等，1993,J.Biol.Chem.268:22215-22218；Henis等，1994,J.Cell Biol.126:139-154)。按照這一模式，由全長(zhǎng)ObR或ObR/G-CSFR嵌合體進(jìn)行的配體結(jié)合，可導(dǎo)致兩個(gè)以上受體鏈的聚合，而且，只是兩個(gè)胞內(nèi)域的并列對(duì)于信號(hào)發(fā)生來(lái)說(shuō)就足夠了。預(yù)計(jì)這種復(fù)合體對(duì)顯性失活阻抑的抵抗力很強(qiáng)。含G-CSFR/ObR嵌合體的復(fù)合體中的G-CSFR(Δcyto)對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的強(qiáng)有力的抑制表明，當(dāng)處于簡(jiǎn)單的同源二聚體結(jié)構(gòu)的前后時(shí)，ObR胞內(nèi)域會(huì)受到有效抑制。盡管OB-RΔ868-1165有可能處于細(xì)胞膜上與野生型ObR不同的部位，但ObR胞內(nèi)域的一個(gè)酪氨酸殘基的突變(Y1141F)似乎不大可能導(dǎo)致改變了的受體膜定位。因此，我們對(duì)由OB-RΔ868-1165或OB-RY1141F介導(dǎo)的類似抑制效應(yīng)的觀察表明，我們的結(jié)果并非是由改變了的膜定位所致。OB-RΔ868-1165和OB-RY1141F低的表達(dá)水平，可以小規(guī)模地增強(qiáng)全長(zhǎng)ObR和ObR/G-CSFR嵌合體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們推測(cè)，這一效果可歸因于配體呈遞(Andres等，1989,(細(xì)胞生物學(xué)雜志)(J.Cell Biol.)109:3137-3145；Massaugue等，1992,Cell 69:1067-1070；Lin等，1993，(細(xì)胞生物學(xué)動(dòng)態(tài))(Trends.Cell Biol.)3:14-19)或配體轉(zhuǎn)移，正如早先在TNF受體上所證實(shí)的(Tarstaglia等，1993,J.Biol.Chem.268:18542-18548)。
如上所述，短型ObR可能在體內(nèi)起著轉(zhuǎn)運(yùn)或清除功能(Tartaglia等，1995,Cell 83:1263-1271)。不過(guò)，長(zhǎng)型和短型ObR可能在功能上相互作用的可能性提示我們，短型ObR可以調(diào)節(jié)長(zhǎng)型ObR的活性。這一結(jié)論得到了在小鼠體內(nèi)主要的天然形成的非信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)短型ObR(含有34個(gè)氨基酸的胞內(nèi)域)，它還相當(dāng)于存在于db/db小鼠中的突變形ObR，可抑制長(zhǎng)型受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的事實(shí)的支持。
14.微生物的保藏已于標(biāo)明的日期將下列微生物交由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville,Maryland)保藏，并被授予所標(biāo)明的保藏號(hào)微生物 克隆ATCC保藏號(hào) 保藏日期大腸桿菌菌株 famj5312 6995211月22日19955312B4F3大腸桿菌h-ObRDfahj5312d6996312月5日1995大腸桿菌h-ObR-p87 h-ObR-p876997212月28日1995本發(fā)明并不局限于由本文所披露的具體實(shí)施方案限定的范圍，這些實(shí)施方案只是就本發(fā)明的某一方面進(jìn)行說(shuō)明的，而且，功能上等同的方法及要素也屬于本發(fā)明的范疇。事實(shí)上，除了本文所圖示和說(shuō)明的方案之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)閱讀上述說(shuō)明書(shū)及附圖可以很容易地理解本發(fā)明的各種改進(jìn)。這些改進(jìn)被視為落在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人Tartaglia,Louis A.
Tepper.RobertⅠ.
Culpepper,Janice A.
White,David W。
(ⅱ)發(fā)明名稱Ob受體及診斷和治療體重疾病的方法(ⅲ)序列數(shù)50(ⅳ)相關(guān)地址(A)收件人Fish和Richardson P.C.
(B)街道225 Franklin Street(C)城市Boston(D)州Massachusetts(E)國(guó)家U.S.A.
(F)郵編021001-2804(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀型式(A)媒體類型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件WordPerfect(Version 5.1)(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/708,123(B)申請(qǐng)日1996.09.03(C)分類(ⅶ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/638,524(B)申請(qǐng)日1996.04.26(ⅶ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/599,455(B)申請(qǐng)日1996.01.22(ⅶ)在先申請(qǐng)資料
(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/583,1 53(B)申請(qǐng)日1995.12.28(ⅶ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/570,142(B)申請(qǐng)日1995.12.11(ⅶ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/569,485(B)申請(qǐng)日1995.12.08(ⅶ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/566,622(B)申請(qǐng)日1995.12.04(ⅶ)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/562,663(B)申請(qǐng)日1995.11.27(ⅷ)律師/代理人資料(A)姓名Meikeljohn,Ph.D.,Anita L.
(B)注冊(cè)號(hào)35,283(C)文件/檔案號(hào)07334/019001(ⅸ)電信資料(A)電話(617)542-5070(B)傳真(617)542-8906(C)電傳200154(2)序列1資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度3097bp(B)類型核酸(C)鏈型雙(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS
(B)位置61..2742(ⅹⅰ)序列描述序列1GTCGACCCAC GCGTCCGGAG GAATCGTTCT GCAAATCCAG GTGTACACCT CTGAAGAAAG60ATG ATG TGT CAG AAA TTC TAT GTG GTT TTG TTA CAC TGG GAA TTT CTT108Met Met Cys Gln Lys Phe Tyr Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Leu1 5 10 15TAT GTG ATA GCT GCA CTT AAC CTG GCA TAT CCA ATC TCT CCC TGG AAA156Tyr Val Ile Ala Ala Leu Asn Leu Ala Tyr Pro Ile Ser Pro Trp Lys20 25 30TTT AAG TTG TTT TGT GGA CCA CCG AAC ACA ACC GAT GAC TCC TTT CTC204Phe Lys Leu Phe Cys Gly Pro Pro Asn Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu15 35 40 45TCA CCT GCT GGA GCC CCA AAC AAT GCC TCG GCT TTG AAG GGG GCT TCT252Ser Pro Ala Gly Ala Pro Asn Asn Ala Ser Ala Leu Lys Gly Ala Ser50 55 60GAA GCA ATT GTT GAA GCT AAA TTT AAT TCA AGT GGT ATC TAC GTT CCT300Glu Ala Ile Val Glu Ala Lys Phe Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Val Pro65 70 75 80GAG TTA TCC AAA ACA GTC TTC CAC TGT TGC TTT GGG AAT GAG CAA GGT348Glu Leu Ser Lys Thr Val Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly85 90 95CAA AAC TGC TCT GCA CTC ACA GAC AAC ACT GAA GGG AAG ACA CTG GCT396Gln Asn Cys Ser Ala Leu Thr Asp Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala100 105 110TCA GTA GTG AAG GCT TCA GTT TTT CGC CAG CTA GGT GTA AAC TGG GAC444Ser Val Val Lys Ala Ser Val Phe Arg Gln Leu Gly Val Asn Trp Asp115 120 125ATA GAG TGC TGG ATG AAA GGG GAC TTG ACA TTA TTC ATC TGT CAT ATG492Ile Glu Cys Trp Met Lys Gly Asp Leu Thr Leu Phe Ile Cys His Met130 135 140GAG CCA TTA CCT AAG AAC CCC TTC AAG AAT TAT GAC TCT AAG GTC CAT540Glu Pro Leu Pro Lye Asn Pro Phe Lys Asn Tyr Asp Ser Lys Val His145 150 155 160CTT TTA TAT GAT CTG CCT GAA GTC ATA GAT GAT TCG CCT CTG CCC CCA588Leu Leu Tyr Asp Leu Pro Glu Val Ile Asp Asp Ser Pro Leu Pro Pro165 170 175CTG AAA GAC AGC TTT CAG ACT GTC CAA TGC AAC TGC AGT CTT CGG GGA636Leu Lys Asp Ser Phe Gln Thr Val Gln Cys Asn Cys Ser Leu Arg Gly180 185 190TGT GAA TGT CAT GTG CCG GTA CCC AGA GCC AAA CTC AAC TAC GCT CTT684Cys Glu Cys His Val Pro Val Pro Arg Ala Lys Leu Asn Tyr Ala Leu195 200 205CTG ATG TAT TTG GAA ATC ACA TCT GCC GGT GTG AGT TTT CAG TCA CCT732Leu Met Tyr Leu Glu Ile Thr Ser Ala Gly Val Ser Phe Gfn Ser Pro210 215 220CTG ATG TCA CTG CAG CCC ATG CTT GTT GTG AAA CCC GAT CCA CCC TTA780Leu Met Ser Leu Gln Pro Met Leu Val Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu225 230 235 240GGT TTG CAT ATG GAA GTC ACA GAT GAT GGT AAT TTA AAG ATT TCT TGG828Gly Leu His Met Glu Val Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile ser Trp245 250 255GAC AGC CAA ACA ATG GCA CCA TTT CCG CTT CAA TAT CAG GTG AAA TAT876Asp Ser Gln Thr Met Ala Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr260 265 270TTA GAG AAT TCT ACA ATT GTA AGA GAG GCT GCT GAA ATT GTC TCA GCT924Leu Glu Asn Ser Thr Ile Val Arg Glu Ala Ala Glu Ile Val Ser Ala275 280 285ACA TCT CTG CTG GTA GAC AGT GTG CTT CCT GGA TCT TCA TAT GAG GTC1972Thr Ser Leu Leu Val Asp Ser Val Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val290 295 300CAG GTG AGG AGC AAG AGA CTG GAT GGT TCA GGA GTC TGG AGT GAC TGG1020Gln Val Arg Ser Lys Arg Leu Asp Gly Ser Gly Val Trp Ser Asp Trp305 310 315 320AGT TCA CCT CAA GTC TTT ACC ACA CAA GAT GTT GTG TAT TTT CCA CCC1068Ser Ser Pro Gln Val Phe Thr Thr Gln Asp Val Val Tyr Phe Pro Pro325 330 335AAA ATT CTG ACT AGT GTT GGA TCG AAT GCT TCT TTT CAT TGC ATC TAC1116Lys Ile Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe His Cys Ile Tyr340 345 350AAA AAC GAA AAC CAG ATT ATC TCC TCA AAA CAG ATA GTT TGG TGG AGG1164Lys Asn Glu Asn Gln Ile Ile Ser Ser Lys Gln Ile Val Trp Trp Arg355 360 365AAT CTA GCT GAG AAA ATC CCT GAG ATA CAG TAC AGC ATT GTG AGT GAC1212Asn Leu Ala Glu Lys Ile Pro Glu Ile Gln Tyr Ser Ile Val Ser Asp370 375 380CGA GTT AGC AAA GTT ACC TTC TCC AAC CTG AAA GCC ACC AGA CCT CGA1260Arg Val Ser Lys Val Thr Phe Ser Asn Leu Lys Ala Thr Arg Pro Arg385 390 395 400GGG AAG TTT ACC TAT GAC GCA GTG TAC TGC TGC AAT GAG CAG GCG TGC1308Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu Gln Ala Cys405 410 415CAT CAC CGC TAT GCT GAA TTA TAC GTG ATC GAT GTC AAT ATC AAT ATA1356His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile Asn Ile420 425 430TCA TGT GAA ACT GAC GGG TAC TTA ACT AAA ATG ACT TGC AGA TGG TCA1404Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met 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Leu Cys660 665 670AGT GTG AGG AGG TAC GTT GTG AAG CAT CGT ACT GCC CAC AAT GGG ACG2124Ser Val Arg Arg Tyr Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr675 680 685TGG TCA GAA GAT GTG GGA AAT CGG ACC AAT CTC ACT TTC CTG TGG ACA2172Trp Ser Glu Asp Val Gly Asn Arg Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Thr690 695 700GAA CCA GCG CAC ACT GTT ACA GTT CTG GCT GTC AAT TCC CTC GGC GCT2220Glu Pro Ala His Thr Val Thr Val Leu Ala Val Asn Ser Leu Gly Ala705 710 715 720TCC CTT GTG AAT TTT AAC CTT ACC TTC TCA TGG CCC ATG AGT AAA GTG2268Ser Leu Val Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val725 730 735AGT GCT GTG GAG TCA CTC AGT GCT TAT CCC CTG AGC AGC AGC TGT GTC2316Ser Ala Val Glu Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val740 745 750ATC CTT TCC TGG ACA CTG TCA CCT GAT GAT TAT AGT CTG TTA TAT CTG2364Ile Leu Ser Trp Thr Leu Ser Pro Asp Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu755 760 765GTT ATT GAA TGG AAG ATC CTT AAT GAA GAT GAT GGA ATG AAG TGG CTT2412Val Ile Glu Trp Lys Ile Leu Asn Glu Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu770 775 780AGA ATT CCC TCG AAT GTT AAA AAG TTT TAT ATC CAC GAT AAT TTT ATT2460Arg Ire Pro Ser Asn Val Lys Lys Phe Tyr Ile His Asp Asn Phe Ile785 790 795 800CCC ATC GAG AAA TAT CAG TTT AGT CTT TAC CCA GTA TTT ATG GAA GGA2508Pro Ile Glu Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Val Phe Met Glu Gly805 810 815GTT GGA AAA CCA AAG ATA ATT AAT GGT TTC ACC AAA GAT GCT ATC GAC2556Val Gly Lys Pro Lys Ile Ile Asn Gly Phe Thr Lys Asp Ala Ile Asp820 825 830AAG CAG CAG AAT GAC GCA GGG CTG TAT GTC ATT GTA CCC ATA ATT ATT2604Lys Gln Gln Asn Asp Ala Gly Leu Tyr Val Ile Val Pro Ile Ile Ile835 840 845TCC TCT TGT GTC CTA CTG CTC GGA ACA CTG TTA ATT TCA CAC CAG AGA2652Ser Ser Cys Val Leu Leu Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser His Gln Arg850 855 860ATG AAA AAG TTG TTT TGG GAC GAT GTT CCA AAC CCC AAG AAT TGT TCC2700Met Lys Lys Leu Phe Trp Asp Asp Val Pro Asn Pro Lys Asn Cys Ser865 870 875 880TGG GCA CAA GGA CTG AAT TTC CAA AAG AGA ACG GAC ACT CTT2742Trp Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys Arg Thr Asp Thr Leu885 890TGAAGTCTCT CATGACCACT ACAGATGAAC CCAATCTACC AACTTCCCAA CAGTCCATAC2802AATATTAGAA GATGTTTACA TTTTGATGGA GGGAAACAAA CCTAAACTAT GGTTTGAATG2862ACTAAGAAAT AACATTTGAT GAGCTTATTA GAGAAGTGTA TATTTTGTGG CCACAATGTA2922GGTTTGATGT AGTTCAGTTT GGGACATATG CTTGATTTTC AGGGCATCAA AAATTTAAAG2982TTGATATTCA TGGACTCTGC ATTTTATTTC TTAAGTCATA AAATGATAAT GGTGTGACGG3042TTGGTGTCAG AACCTATTTG GGTACAGATC ACCAAAATAT GGTAGGTAAT GCCTT3097(2)序列2資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度894aa(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述序列2Met Met Cys Gln Lys Phe Tyr Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Leu1 5 10 15Tyr Val Ile Ala Ala Leu Asn Leu Ala Tyr Pro Ile Ser Pro Trp Lys20 25 30Phe Lys Leu Phe Cys Gly Pro Pro Asn Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu35 40 45Ser Pro Ala Gly Ala Pro Asn Asn Ala Ser Ala Leu Lys Gly Ala Ser50 55 60Glu Ala Ile Val Glu Ala Lys Phe Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Val Pro65 70 75 80Glu Leu Ser Lys Thr Val Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly85 90 95Gln Asn Cys Ser Ala Leu Thr Asp Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala100 105 110Ser Val Val 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(A)長(zhǎng)度29bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列9CATCTTACTT CAGAGAAGTA CACCCATAA29(2)序列10資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度35bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列10CATCTTACTT CAGAGAAGTA CACCCATAAT CCTCT35(2)序列11資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度35bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列11AATCATCTTA CTTCAGAGAA GTACACCCAT AATCC35(2)序列12資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29bp
(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列12CTTACTTCAG AGAAGTACAC CCATAATCC29(2)序列13資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列13TCAGAGAAGT ACACCCATAA TCC23(2)序列14資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列14AAGTACACCC ATAATCC17(2)序列15資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度56bp(B)類型核酸
(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型RNA(ⅹⅰ)序列描述序列15ACAGAAUUUU UGACAAAUCA AAGCAGANNN NUCUGAGNAG UCCUUACUUC AGAGAA56(2)序列16資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度57bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型RNA(ⅹⅰ)序列描述序列16GGCCCGGGCA GCCUGCCCAA AGCCGGNNNN CCGGAGNAGU CGCCAGACCG GCUCGUG57(2)序列17資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度56bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型RNA(ⅹⅰ)序列描述序列17UGGCAUGCAA GACAAAGCAG GNNNNCCUGA GNAGUCCUUA AAUCUCCAAG GAGUAA56(2)序列18資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度50bp(B)類型核酸(C)鏈型單
(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型RNA(ⅹⅰ)序列描述序列18UAUAUGACAA AGCUGUNNNN ACAGAGNAGU CCUUGUGUGG UAAAGACACG50(2)序列19資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度61bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型RNA(ⅹⅰ)序列描述序列19AGCACCAAUU GAAUUGAUGG CCAAAGCGGG NNNNCCCGAG NAGUCAACCG UAACAGUAUG60U61(2)序列20資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度69bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型RNA(ⅹⅰ)序列描述序列20UGAAAUUGUU UCAGGCUCCA AAGCCGGNNN NCCGGAGNAG UCAAGAAGAG GACCACAUGU60CACUGAUGC69(2)序列21資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度61bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型RNA(ⅹⅰ)序列描述序列21GGUUUCUUCA GUGAAAUUAC ACAAAGCAGC NNNNGCUGAG NAGUCAGUUA GGUCACACAU60C61(2)序列22資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度53bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型RNA(ⅹⅰ)序列描述序列22ACCCAUUAUA ACACAAAGCU GANNNNUCAG AGNAGUCAUC UGAAGGUUUC UUC53(2)序列23資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列23GCTGCACTTA ACCTGGC17(2)序列24資料
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列24GGATAACTCA GGAACG16(2)序列25資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列25CACTATTTGC CCTTCAG17(2)序列26資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列26GCCTGAGATA GGGGTGC17(2)序列27資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度17bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列27CACTATTTGC CCTTCAG17(2)序列28資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列28GCCTGAGATA GGGGTGC17(2)序列29資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8aa(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述序列29Pro Asn Pro Lys Asn Cys Ser Trp1 5(2)序列30資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24bp(B)類型核酸
(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列30CCAAACCCCA AGAATTGTTC CTGG24(2)序列31資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度9aa(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述序列31Lys Ile Met Glu Asn Lys Met Cys Asp1 5(2)序列32資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度26bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列32TCRCACATYT TRTTNCCCAT TATCTT26(2)序列33資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8aa(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述序列33Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys1 5(2)序列34資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列34GCACAAGGAC TGAATTTCCA AAAG24(2)序列35資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列35CTGCCTGAAG TGTTAGAAGA20(2)序列36資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列36
GCTGAACTGA CATTAGAGGT G21(2)序列37資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列37ACCTATGAGG ACGAAAGCCA GAGAC25(2)序列38資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列38TGTGAGCAAC TGTCCTCGAG AACT24(2)序列39資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度42bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列39
GTCACGATGT CGACGTGTAC TTCTCTGAAG TAAGATGATT TG42(2)序列40資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度53bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列40GTCAGGTCAG AAAAGCTTAT CACTCTGTGT TTTTCAATAT CATCTTGAGT GAA53(2)序列41資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列41AAGCTTTTCT GACCTGACNN N21(2)序列42資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度3854bp(B)類型核酸(C)鏈型雙(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置61..3546(ⅹⅰ)序列描述序列42GTCGACCCAC GCGTCCGGAG GAATCGTTCT GCAAATCCAG GTGTACACCT CTGAAGAAAG60ATG ATG TGT CAG AAA TTC TAT GTG GTT TTG TTA CAC TGG GAA TTT CTT108Met Met Cys Gln Lys Phe Tyr Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Leu1 5 10 15TAT GTG ATA GCT GCA CTT AAC CTG GCA TAT CCA ATC TCT CCC TGG AAA156Tyr Val Ile Ala Ala Leu Asn Leu Ala Tyr Pro Ile Ser Pro Trp Lys20 25 30TTT AAG TTG TTT TGT GGA CCA CCG AAC ACA ACC GAT GAC TCC TTT CTC204Phe Lys Leu Phe Cys Gly Pro Pro Asn Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu35 40 45TCA CCT GCT GGA GCC CCA AAC AAT GCC TCG GCT TTG AAG GGG GCT TCT252Ser Pro Ala Gly Ala Pro 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CCAAACTAAG TGTGTCTATT TTCTCTCAGT AATACANATG AAACATATGA GGAAGCCCTC3726ATTAATCTAC TAATGTAGAT GGACTCTTAC TGAATATATT CCCAAGATAC TTGGGGAAGT3786CTCCCTAATT CTAGCTAAAA GAANTAGAAC TACTAAACAC TGAATCTGGA AAAAAAAAAA3846AAAAAAAG3854(2)序列43資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1162aa(B)類型氨基酸(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述序列43Met Met Cys Gln Lys Phe Tyr Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Leu1 5 10 15Tyr Val Ile Ala Ala Leu Asn Leu Ala Tyr Pro Ile Ser Pro Trp Lys20 25 30Phe Lys Leu Phe Cys Gly Pro Pro Asn Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu35 40 45Ser Pro Ala Gly Ala Pro Asn Asn Ala Ser Ala Leu Lys Gly Ala Ser50 55 60Glu Ala Ile Val Glu Ala Lys Phe Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Val Pro65 70 75 80Glu Leu Ser Lys Thr Val Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly85 90 95Gln Asn Cys Ser Ala Leu Thr Asp Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala100 105 110Ser Val Val Lys Ala Ser Val Phe Arg Gln Leu Gly Val Asn Trp Asp115 120 125Ile Glu Cys Trp Met Lys Gly Asp Leu Thr Leu Phe Ile Cys His Met130 135 140Glu Pro Leu Pro Lys Asn Pro Phe Lys Asn 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360 365Asn Leu Ala Glu Lys Ile Pro Glu Ile Gln Tyr Ser Ile Val Ser Asp370 375 380Arg Val Ser Lys Val Thr Phe Ser Asn Leu Lys Ala Thr Arg Pro Arg385 390 395 400Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu Gln Ala Cys405 410 415His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile Asn Ile420 425 430Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser435 440 445Pro Ser Thr Ile Gln Ser Leu Val Gly Ser Thr Val Gln Leu Arg Tyr450 455 460His Arg Arg Ser Leu Tyr Cys Pro Asp Ser Pro Ser Ile His Pro Thr465 470 475 480Ser Glu Pro Lys Asn Cys Val Leu Gln Arg Asp Gly Phe Tyr Glu Cys485 490 495Val Phe Gln Pro Ile Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp Ile Arg500 505 510Ile Asn His Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu515 520 525Pro Asp Ser Val Val Lys Pro Leu Pro Pro Ser Asn Val Lys Ala Glu530 535 540Ile Thr Val Asn Thr Gly Leu Leu Lys Val Ser Trp Glu Lys Pro Val545 550 555 560Phe Pro Glu Asn Asn Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu Ser Gly565 570 575Lys Glu Ile Gln Trp Lys Thr His Glu Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys580 585 590Ser Ala Ser Leu Leu Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gln595 600 605Val Arg Cys Arg Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser610 615 620Ser Pro Ala Tyr Thr Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly625 630 635 640Pro Glu Phe Trp Arg Lys Met Asp Gly Asp Val Thr Lys Lys Glu Arg645 650 655Asn Val Thr Leu Leu Trp Lys Pro Leu Thr Lys Asn Asp Ser Leu Cys660 665 670Ser Val Arg Arg Tyr Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr675 680 685Trp Ser Glu Asp Val Gly Asn Arg Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Thr690 695 700Glu Pro Ala His Thr Val Thr Val Leu Ala Val Asn Ser Leu Gly Ala705 710 715 720Ser Leu Val Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val725 730 735Ser Ala Val Glu Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val740 745 750Ile Leu Ser Trp Thr Leu Ser Pro Asp Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu755 760 765Val Ile Glu Trp Lys Ile Leu Asn Glu Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu770 775 780Arg Ile Pro Ser Asn Val Lys Lys Phe Tyr Ile His Asp Asn Phe Ile785 790 795 800Pro Ile Glu Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Val Phe Met Glu Gly805 810 815Val Gly Lys Pro Lys Ile Ile Asn Gly Phe Thr Lys Asp Ala Ile Asp820 825 830Lys Gln Gln Asn Asp Ala Gly Leu Tyr Val Ile Val Pro Ile Ile Ile835 840 845Ser Ser Cys Val Leu Leu Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser His Gln Arg850 855 860Met Lys Lys Leu Phe Trp Asp Asp Val Pro Asn Pro Lys Asn Cys Ser865 870 875 880Trp Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys Pro Glu Thr Phe Glu His Leu885 890 895Phe Thr Lys His Ala Glu Ser Val Ile Phe Gly Pro Leu Leu Leu Glu900 905 910Pro Glu Pro Ile Ser Glu Glu Ile Ser Val Asp Thr Ala Trp Lys Asn915 920 925Lys Asp Glu Met Val Pro Ala Ala Met Val Ser Leu Leu Leu Thr Thr930 935 940Pro Asp Pro Glu Ser Ser Ser Ile Cys Ile Ser Asp Gln Cys Asn Ser945 950 955 960Ala Asn Phe Ser Gly Ser Gln Ser Thr Gln Val Thr Cys Glu Asp Glu965 970 975Cys Gln Arg Gly Pro Ser Val Lys Tyr Ala Thr Leu Val Ser Asn Asp980 985 990Lys Leu Val Glu Thr Asp Glu Glu Gln Gly Phe Ile His Ser Pro Val995 10001005Ser Asn Cys Ile Ser Ser Asn His Ser Pro Leu Arg Gln Ser Phe Ser101010151020Ser Ser Ser Trp Glu Thr Glu Ala Gln Thr Phe Phe Leu Leu Ser Asp1025103010351040Gln Gln Pro Thr Met Ile Ser Pro Gln Leu Ser Phe Ser Gly Leu Asp104510501055Glu Leu Leu Glu Leu Glu Gly Ser Phe Pro Glu Glu Asn His Arg Glu106010651070Lys Ser Val Cys Tyr Leu Glu Val Thr Ser Val Asn Arg Arg Glu Ser107510801085Gly Val Seu Leu Thr Gly Glu Ala Gly Ile Leu Cys Thr Phe Pro Ala109010951100Gln Cys Leu Phe Ser Asp Ile Arg Ile Leu Gln Glu Arg Cys Ser His1105111011151120Phe Val Glu Asn Asn Leu Ser Leu Gly Thr Ser Gly Glu Asn Phe Val112511301135Pro Tyr Met Pro Gln Phe Gln Thr Cys Ser Thr His Ser His Lys Ile114011451150Met Glu Asn Lys Met Cys Asp Leu Thr Val11551160(2)序列44資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16bp(B)類型核酸(C)鏈型雙(D)拓樸結(jié)構(gòu)不詳(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述序列44TCRCACATYT TRTTNCCCAT TATCTT16(2)序列45資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)單(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列45CCCAATGTCG ACATGATGTG TCAGAAATTC 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(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列48TTTTTGGATC CCACCTGCAT CACTCTGGTG30(2)序列49資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度48bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列49TTTAACTTGT CATATCCAAT TACTCCTTGG AGATTTAAGT TGTCTTGC48(2)序列50資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30bp(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述序列50TTTTTGGATC CCACCTGCAT CACTCTGGTG30
權(quán)利要求
1．一種分離的核酸分子，它含有obR基因的核苷酸序列。
2．一種分離的核酸分子，它編碼一種Ob受體或其片段，該分子具有如下的核苷酸序列編碼圖1所示氨基酸序列或由保藏于ATCC的保藏號(hào)69952的cDNA克隆famj5312中所含cDNA編碼的氨基酸序列的；或編碼圖6所示氨基酸序列的；或編碼圖3所示氨基酸序列，或由ATCC保藏的保藏號(hào)為69963的cDNA克隆fahj5312d中所含的氨基酸序列，或由ATCC保藏的基因組克隆h-ObR-p87中所含的氨基酸序列的；或能在嚴(yán)格條件下與(a)、(b)或(c)的核苷酸序列或其補(bǔ)體雜交的。
3．一種分離的核苷酸序列，它編碼一種相當(dāng)于Ob受體蛋白的胞外域、跨膜域或胞質(zhì)域的多肽，或編碼Ob受體蛋白的一種其中缺失了跨膜域或胞質(zhì)域的缺失突變型。
4．一種分離的核苷酸序列，它編碼一種嵌合蛋白，該蛋白包括與一種異源多肽融合的權(quán)利要求3的多肽。
5．如權(quán)利要求4的分離的核苷酸序列，其中，所述異源多肽是一種免疫球蛋白的恒定區(qū)。
6．一種核苷酸載體，含有權(quán)利要求1,2,3,4或5的核苷酸序列。
7．一種表達(dá)載體，含有權(quán)利要求1,2,3,4,或5的核苷酸序列，該序列與一個(gè)核苷酸調(diào)控序列操作連接在一起，而該調(diào)控序列控制所述核苷酸序列在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
8．如權(quán)利要求7的表達(dá)載體，其中，所述調(diào)控序列選自巨細(xì)胞病毒hCMV立即早期基因、SV40腺病毒的早期或晚期啟動(dòng)子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、噬菌體λ的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)、fd外被蛋白的操縱區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子、酸性磷酸酶的啟動(dòng)子和酵母α-交配因子的啟動(dòng)子。
9．一種用遺傳工程方法產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，它含有權(quán)利要求1,2,3,4或5的核苷酸序列。
10．一種用遺傳工程方法產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，它含有權(quán)利要求1,2,3,4或5的核苷酸序列，該核苷酸序列與一個(gè)核苷酸調(diào)控序列操作連接在一起，而該調(diào)控序列控制所述核苷酸序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
11．如權(quán)利要求10的遺傳工程宿主細(xì)細(xì)胞，其中，所述宿主細(xì)胞是成纖維細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵(CHO)細(xì)胞、COS細(xì)胞、或VERO細(xì)胞、下丘腦細(xì)胞或脈絡(luò)叢細(xì)胞。
12．一種分離的Ob受體蛋白。
13．一種分離的Ob受體蛋白，具有圖1,3或6所示的氨基酸序列或由含于由ATCC保藏的保藏號(hào)為69952的cDNA克隆famj5312中的cDNA編碼的氨基酸序列，或由含于由ATCC保藏的保藏號(hào)為69963的cDNA克隆fahj5312d中的cDNA編碼的氨基酸序列，或由保藏于ATCC的基因組克隆h-obR-p87編碼的氨基酸序列。
14．一種多肽，具有相當(dāng)于Ob受體蛋白的胞外域、跨膜域或胞質(zhì)域的氨基酸序列，或Ob受體蛋白的一種其中的跨膜域或胞質(zhì)域已缺失的缺失突變型。
15．一種嵌合蛋白，含有與一種異源多肽融合的權(quán)利要求14的多肽。
16．如權(quán)利要求15的多肽，其中，所述異源多肽是一種免疫球蛋白的恒定區(qū)。
17．一種抗體，它能免疫特異地結(jié)合權(quán)利要求12或13的Ob受體蛋白。
18．一種抗體，它能免疫特異地結(jié)合權(quán)利要求14的多肽。
19．一種診斷哺乳動(dòng)物的體重疾病的方法，包括測(cè)定患者樣品中ObR基因的表達(dá)。
20．如權(quán)利要求19的方法，其中，所述表達(dá)是通過(guò)檢測(cè)obR基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物而測(cè)定的。
21．如權(quán)利要求19的方法，其中，所述表達(dá)是通過(guò)測(cè)定obR基因產(chǎn)物測(cè)定的。
22．一種診斷哺乳動(dòng)物的體重疾病的方法，包括檢測(cè)所述哺乳動(dòng)物基因組中所含的obR基因突變。
23．一種篩選可用于治療體重疾病的化合物的方法，包括讓一種化合物接觸一種能表達(dá)obR基因的培養(yǎng)的宿主細(xì)胞，并檢測(cè)該obR基因表達(dá)方面的變化，由該培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)的obR基因產(chǎn)物的活性的變化，或宿主細(xì)胞蛋白的酪氨酸磷酸化方面的變化，或該宿主細(xì)胞中離子流動(dòng)方面的變化。
24．如權(quán)利要求23的方法，其中，所述obR基因的表達(dá)是通過(guò)測(cè)定該obR基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物而檢測(cè)的。
25．如權(quán)利要求23的方法，其中，所述obR基因的表達(dá)是通過(guò)測(cè)定Ob受體蛋白而檢測(cè)的。
26．如權(quán)利要求23的方法，其中，宿主細(xì)胞的酪氨酸磷酸化是用一種抗-磷酸酪氨酸抗體測(cè)定的。
27．一種治療哺乳動(dòng)物的低體重疾病的方法，包括對(duì)該哺乳動(dòng)物給藥一種化合物，該化合物的用量足以抑制通過(guò)內(nèi)源性O(shè)b實(shí)現(xiàn)的Ob受體激活作用。
28．如權(quán)利要求27的方法，其中，所述低體重疾病是厭食、惡病質(zhì)、食欲過(guò)盛、AIDS相關(guān)的消瘦或癌癥相關(guān)的消瘦。
29．如權(quán)利要求27的方法，其中，所述化合物被釋放至下丘腦或脈絡(luò)叢中。
30．如權(quán)利要求27的方法，其中，所述化合物是一種拮抗劑，它能與所述Ob受體結(jié)合，并抑制該受體的激活作用。
31．如權(quán)利要求27的方法，其中，所述化合物能結(jié)合內(nèi)源Ob，并中和Ob活性。
32．如權(quán)利要求31的方法，其中，所述化合物是一種相當(dāng)于Ob受體胞外域的多肽或能與Ob結(jié)合的所述胞外域的一部分、一種缺少跨膜域或胞質(zhì)域的缺失突變型Ob受體蛋白、一種包括Ob受體的胞外域的嵌合型融合蛋白、或能與Ob結(jié)合的所述胞外域的一部分，或一種與一種異源多肽融合的跨膜缺失突變型。
33．如權(quán)利要求32的方法，其中，所述嵌合型融合蛋白的異源多肽是一種免疫球蛋白的恒定區(qū)。
34．如權(quán)利要求32或33的方法，其中，所述化合物是通過(guò)對(duì)所述哺乳動(dòng)物給藥能在該哺乳動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)并分泌所述多肽或融合蛋白的遺傳工程細(xì)胞而釋放至該哺乳動(dòng)物體內(nèi)的。
35．如權(quán)利要求31的方法，其中，所述化合物是一種抗獨(dú)特型抗體，或其Fab部分，它能模擬Ob受體的胞外域并中和內(nèi)源Ob。
36．一種治療哺乳動(dòng)物的低體重疾病的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物給藥一種化合物，該化合物的用量足于抑制所述Ob受體在體內(nèi)的表達(dá)。
37．如權(quán)利要求36的方法，其中，所述低體重疾病是厭食、惡病質(zhì)、食欲過(guò)盛、AIDS相關(guān)的消瘦或癌癥相關(guān)的消瘦。
38．如權(quán)利要求36的方法，其中，所述化合物被釋放至下丘腦或脈絡(luò)叢中。
39．如權(quán)利要求36的方法，其中所述化合物是一種反義寡核苷酸，它能抑制編碼所述Ob受體的mRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯。
40．如權(quán)利要求36的方法，其中，所述化合物是一種核酶，它能抑制編碼所述Ob受體的mRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯。
41．如權(quán)利要求36的方法，其中，所述化合物是一種寡核苷酸，它能與所述Ob受體基因的調(diào)控區(qū)形成三重螺旋，并抑制轉(zhuǎn)錄。
42．如權(quán)利要求36的方法，其中，所述化合物是一種重組DNA結(jié)構(gòu)，它能通過(guò)定向同源重組使Ob受體基因或其調(diào)控區(qū)失活。
43．一種治療哺乳動(dòng)物的低體重疾病的方法，包括對(duì)該哺乳動(dòng)物給藥一種化合物，該化合物的用量足于抑制由內(nèi)源Ob與該Ob受體結(jié)合所誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
44．如權(quán)利要求43的方法，其中，所述低體重疾病是厭食、惡病質(zhì)、食欲過(guò)盛、AIDS相關(guān)的消瘦或癌癥相關(guān)的消瘦。
45．如權(quán)利要求43的方法，其中，所述化合物被釋放至下丘腦或脈絡(luò)叢。
46．如權(quán)利要求43的方法，其中，所述化合物能抑制Ob受體一誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的胞內(nèi)介體的活性。
47．如權(quán)利要求46的方法，其中，所述化合物能抑制一種酪氨酸激酶或一種酪氨酸磷酸酶。
48．如權(quán)利要求43、44或45的方法，其中，所述化合物是一種受一個(gè)調(diào)控序列控制的編碼一個(gè)不能轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的Ob受體的寡核苷酸結(jié)構(gòu)，所述調(diào)控序列可指導(dǎo)該不能轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的受體在體內(nèi)的靶細(xì)胞中的表達(dá)。
49．如權(quán)利要求48的方法，其中，所進(jìn)寡核苷酸結(jié)構(gòu)編碼一種Ob受體的不能轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的缺失突變型，其中，所述胞質(zhì)域全部或部分缺失。
50．一種治療哺乳動(dòng)物肥胖的方法，包括對(duì)哺乳動(dòng)物給藥一種化合物，該化合物的用量足以上調(diào)一種功能性O(shè)b受體在該哺乳動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)。
51．如權(quán)利要求50的方法，其中，所述化合物被釋放至下丘腦或脈絡(luò)叢。
52．如權(quán)利要求50或51的方法，其中，所述的哺乳動(dòng)物表達(dá)缺陷型ob受體而所述化合物包括一種受一個(gè)調(diào)控區(qū)控制的編碼一種功能性O(shè)b受體的核苷酸結(jié)構(gòu)，所述調(diào)控區(qū)能指導(dǎo)該功能性受體在哺乳動(dòng)物的靶細(xì)胞中表達(dá)。
53．如權(quán)利要求50或51的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物能表達(dá)一種突變型Ob受體，而所述化合物包括一種編碼一種野生型Ob受體的核苷酸結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可通過(guò)定向同源重組校正所述內(nèi)源突變。
54．一種編碼一種Ob受體的分離的核酸分子，該核酸分子具有編碼圖3所示氨基酸序列的氨基酸1-868的核苷酸序列。
55．一種編碼一種Ob受體的分離的核酸分子，該核酸分子具有編碼圖3所示氨基酸序列的氨基酸1-965的核苷酸序列。
56．一種編碼一種Ob受體的分離的核酸分子，該核酸分子具有編碼圖3所示氨基酸序列的氨基酸1-1065的核苷酸序列。
57．一種編碼一種Ob受體的分離的核酸分子，該核酸分子具有編碼圖3所示氨基酸序列的氨基酸1-1115的核苷酸序列。
58．一種編碼一種Ob受體的分離的核酸分子，它能誘導(dǎo)IL-6RE介導(dǎo)的基因表達(dá)。
59．一種編碼一種Ob受體的分離的核酸分子，它能誘導(dǎo)HRRE介導(dǎo)的基因表達(dá)。
60．如權(quán)利要求54-57中任一項(xiàng)的分離的核酸分子，所述分子編碼一種氨基酸序列，該序列與圖3所述氨基酸序列的相同性至少為90％。
61．如權(quán)利要求59的分離的核酸分子，該分子編碼一種氨基酸序列，該序列與圖3所示氨基酸序列的氨基酸1-965的相同性至少為90％。
62．一種檢驗(yàn)一種試劑是否是用于治療體重疾病的候選試劑的方法，包括(a)用所述試劑處理能表達(dá)一種編碼ObR多肽的基因的真核細(xì)胞；和(b)在有所述試劑的條件下測(cè)定所述真核細(xì)胞對(duì)所述基因的表達(dá)；其中，如果在有所述試劑的條件下所述基因的表達(dá)不同于在沒(méi)有所述試劑的條件下所述真核細(xì)胞對(duì)所述基因的表達(dá)，則該試劑被確認(rèn)為是治療所述體重疾病的候選試劑。
63．如權(quán)利要求62的方法，還包括在沒(méi)有所述試劑的條件下測(cè)定所述真核細(xì)胞對(duì)所述基因的表達(dá)。
64．一種檢驗(yàn)一種試劑是否是用于治療體重疾病的候選試劑的方法，包括(a)用所述試劑處理能表達(dá)一種編碼ObR多肽的基因的真核細(xì)胞；和(b)測(cè)定所述試劑與所述真核細(xì)胞的結(jié)合；其中，如果所述試劑與所述真核細(xì)胞的結(jié)合不同于所述試劑與不能表達(dá)所述基因的對(duì)照真核細(xì)胞的結(jié)合，而該對(duì)照真核細(xì)胞在其它方面相同于該表達(dá)所述基因的真核細(xì)胞，則該試劑被確認(rèn)為是治療體重疾病的候選試劑。
65．如權(quán)利要求64的方法，還包括測(cè)定所述試劑與所述對(duì)照真核細(xì)胞的結(jié)合。
66．一種檢驗(yàn)一種試劑是否是用于治療體重疾病的候選試劑的方法，包括(a)用所述試劑處理一種ObR多肽；和(b)測(cè)定所述試劑與所述ObR多肽的結(jié)合；其中，當(dāng)所述試劑能選擇性地結(jié)合所述ObR多肽時(shí)，則該試劑被確認(rèn)為是治療體重疾病的候選試劑。
67．如權(quán)利要求62、64、或66的方法，其中，所述ObR多肽包括ObR的胞質(zhì)域。
68．如權(quán)利要求67的方法，其中，所述胞質(zhì)域包括圖3中的氨基酸861-1165。
69．如權(quán)利要求67的方法，其中，所述ObR多肽還包括ObR的胞外域。
70．如權(quán)利要求66的方法，其中，所述ObR多肽與一種可檢測(cè)的標(biāo)記物融合。
71．如權(quán)利要求62或64的方法，其中，所述真核細(xì)胞是脈絡(luò)叢細(xì)胞。
72．如權(quán)利要求62或64的方法，其中，所述基因是一種重組基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼Ob受體(ObR)－一種參與哺乳動(dòng)物體重調(diào)節(jié)的受體蛋白－的核苷酸的發(fā)現(xiàn)、識(shí)別和鑒定。本發(fā)明涉及
文檔編號(hào)A61K38/00GK1211255SQ96199796
公開(kāi)日1999年3月17日 申請(qǐng)日期1996年11月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月27日
發(fā)明者路易斯·A·塔塔格利亞, 羅伯特·I·泰珀, 賈尼斯·A·卡爾佩珀, 戴維·W·懷特 申請(qǐng)人:米倫紐姆醫(yī)藥公司