專利名稱：熊去氧膽酸的硫酸酯結(jié)合物,及其在炎癥和其它用途中的有益應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
3α,7β-二羥基-5β-膽烷-24-酸(“熊去氧膽酸”或“UDCA”)在臨床上已應(yīng)用了二十多年，最初證明它可有效地治療患有膽石病的病人，最近證明它有望用于治療患有膽汁郁積肝臟疾病的病人。已經(jīng)確知口服UDCA可明顯改善血清肝酶，而且通過長期臨床實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明UDCA有益于早期原發(fā)性膽汁肝硬變的治療。此外，臨床實(shí)驗(yàn)證明UDCA有益于改善患有硬化性膽管炎、囊腫纖維化和慢性肝炎病人的肝功能臨床和生化指標(biāo)。
盡管UDCA對肝病有很好的療效，但其精確作用機(jī)制尚不清楚。早期的推測認(rèn)為膽汁膽酸池的疏水/親水平衡的移動是決定其功效的重要結(jié)定因素；但近期的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并不完全支持這種觀點(diǎn)；而且肝功能的改善幾乎可以肯定是UDCA誘導(dǎo)的明顯膽汁分泌過多的結(jié)果，它易化了潛在較高毒性的膽汁酸或其它內(nèi)源物質(zhì)的膽汁排泄。
在對患有多種肝臟疾病病人的UDCA代謝研究中，在尿中總能觀測到顯著量的UDCA之C-3硫酸酯的存在，并已證明該特異性物質(zhì)可作為UDCA應(yīng)變性有用的標(biāo)志物。此外，動物實(shí)驗(yàn)提示膽汁酸的硫酸酯化可能為一重要的防止膽汁郁積和限制肝細(xì)胞損害的代謝途徑。
膽汁酸的細(xì)胞毒性或膜損害作用與其物理化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。疏水性膽汁酸的膜損害作用要大大高于親水性膽汁酸，已用膽汁酸在反相高壓液相色譜中的保留體積或辛醇/水分配系數(shù)作為細(xì)胞毒性的相對指標(biāo)。奇怪的是人肝臟合成疏水的、本身具有肝臟毒性的鵝去氧膽酸，作為其原生膽汁酸的一種；當(dāng)膽汁郁積時，肝臟累積這種膽汁酸可引發(fā)、導(dǎo)致或加劇肝臟損害。與之相反，UDCA，即鵝去氧膽酸的7β-異構(gòu)體，則為高親水性的并顯示出對疏水性膽汁酸膜損害的對抗作用。這是治療上應(yīng)用UDCA治療多種肝臟疾病的一個理論基礎(chǔ)。UDCA經(jīng)口服或靜脈給藥后，在肝臟中被有效生物轉(zhuǎn)化，其中主要是被結(jié)合。即使在以相對高劑量給藥后，也只能在人膽汁中檢出可忽略濃度和比例的未結(jié)合UDCA。
除治療多種肝臟疾病外，UDCA還可有其它治療作用。在這一方面，致結(jié)腸癌動物模型的數(shù)據(jù)提示了UDCA的保護(hù)性作用。
然而，事實(shí)上要將UDCA轉(zhuǎn)運(yùn)到結(jié)腸上是困難的，按通常治療劑量口服給藥(10-15mg/kg體重/天)，UDCA在腸道被相對好地吸收并在肝臟中主要通過結(jié)合被有效生物轉(zhuǎn)化。因此，要將有效量UDCA定向轉(zhuǎn)運(yùn)到結(jié)腸上是十分困難的。
因此，由于這種向結(jié)腸上的轉(zhuǎn)運(yùn)的限制，擁有一種可使UDCA有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到結(jié)腸上的化合物、組合物或方法將是十分有益的。擁有一種用于轉(zhuǎn)運(yùn)UDCA至消化道其它部分的化合物、組合物或方法也是被希望的。此外，擁有一種用于有效抑制或治療消化道或肝臟炎癥的化合物、組合物或方法將是有利的。
發(fā)明簡述本發(fā)明的一個方面是一種藥理學(xué)可接受的組合物，其包含3 α,7 β-二羥基-5β-膽烷-24-酸(“熊去氧膽酸”或“UDCA”)的硫酸酯和一種藥理學(xué)可接受的載體。在優(yōu)選的組合物中，硫酸酯為UDCA-3-硫酸酯、UDCA-7-硫酸酯、UDCA-3,7-二硫酸酯、甘氨-UDCA-3-硫酸酯、甘氨-UDCA-7-硫酸酯、甘氨-UDCA-3,7-二硫酸酯、?；?UDCA-3-硫酸酯、?；?UDCA-7-硫酸酯、牛磺-UDCA-3,7-二硫酸酯或其混合體。
本發(fā)明的另一方面是一種向哺乳動物傳輸U(kuò)DCA以抑制或治療疾病的方法，該方法包括以有效抑制或治療該疾病的劑量向哺乳動物給藥UDCA硫酸酯。例如，可使用UDCA硫酸酯以有利于抑制或治療消化道的炎癥，如結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸瘤、直腸瘤、結(jié)腸癌變、直腸癌變、潰瘍性結(jié)腸炎、息肉狀腺瘤、家族性息肉病等等。UDCA的硫酸酯還可用于抑制或治療肝臟疾病。UDCA的硫酸酯可用于改善肝臟疾病或肝功能的血清生化性質(zhì)，增加膽汁流量或降低磷脂或膽固醇的膽汁排泄。
本發(fā)明的另一方面是涉及一種用UDCA硫酸酯灌注器官以保持隔離器官的方法。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有幾種優(yōu)點(diǎn)和好處。例如，可將治療有效量的UDCA轉(zhuǎn)運(yùn)到結(jié)腸和消化道其它部分以抑制或治療炎癥，如結(jié)腸癌等等。此外，UDCA的硫酸酯可有效地用于抑制或治療肝臟疾病或改善肝功能。在回顧以下發(fā)明詳述后，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員來說這些優(yōu)點(diǎn)和好處將是顯而易見的。
附圖簡述

圖1A和1B顯示對照鼠和當(dāng)口服給藥UDCA、UDCA-3S、UDCA-7S和UDCA-DS后，UDCA在整個空腸的總量(圖1A)和在肝臟組織中的濃度(圖1B)的比較。在GC-MS分析各樣品前膽汁酸依據(jù)其結(jié)合方式用陰離子交換色譜分離。結(jié)果以所有動物的平均值表達(dá)；圖2顯示對照鼠和口服給藥UDCA、UDCA3-S、UDCA7-S和UDCA-DS鼠的糞便膽汁酸排泄。在GC-MS分析各樣品前膽汁酸依據(jù)其結(jié)合方式用陰離子交換色譜分離。結(jié)果以所有動物的平均值表達(dá)；圖3顯示對照鼠和口服給藥UDCA、UDCA3-S、UDCA7-S和UDCA-DS鼠的糞便中石膽酸/去氧膽酸的比率。結(jié)果以所有動物的平均值表達(dá)；圖4A-4D顯示口服給藥UDCA(圖4A)、UDCA3-S(圖4B)、UDCA7-S(圖4C)和UDCA-DS(圖4D)鼠肝臟組織中的UDCA濃度。在GC-MS分析各樣品前膽汁酸依據(jù)其結(jié)合方式用陰離子交換色譜分離。結(jié)果以所有動物的平均值表達(dá)；圖5A和5B顯示UDCA及其硫酸酯結(jié)合物灌注Ⅳ期Sprague-Dawley鼠的平均膽汁流量和膽汁酸排出量；圖6A-6D顯示UDCA及其硫酸酯結(jié)合物灌注后膽汁酸排泄率和膽汁流量的關(guān)系；圖7A和7B顯示UDCA及其硫酸酯結(jié)合物灌注IV期Sprague-Dawley鼠的平均膽汁膽固醇和磷脂的排出量；圖8A-8E顯示鼠膽汁灌注前(圖8A)，UDCA灌注期間(圖8B)、UDCA3-S灌注期間(圖8C)、UDCA7-S灌注期間(圖8D)和UDCA-DS灌注期間(圖8E)的負(fù)離子FAB-MS譜。
發(fā)明詳述以下出現(xiàn)的其它縮寫包括GC(氣-液色譜)，GC-MS(氣-液色譜質(zhì)譜聯(lián)用)，F(xiàn)AB-MS(快原子轟擊質(zhì)譜)，TLC(薄層色譜)，HPLC(高效液相色譜)，UDCA-3S(熊去氧膽酸3-硫酸酯)，UDCA-7S(熊去氧膽酸7-硫酸酯)，UDCA-DS(熊去氧膽酸3,7-二硫酸酯)，tBDMS醚(特丁基二甲基甲硅烷基醚)和tBDMC(特丁基二甲基氯甲硅烷)。
下列數(shù)據(jù)對比了UDCA的各膽汁酸硫酸酯與未結(jié)合膽汁酸的腸道代謝和行為，并與其它因素一起顯示C-7硫酸酯基的存在使UDCA免于細(xì)菌降解并抑制了腸道對UDCA的吸收。材料與方法UDCA硫酸酯的合成UDCA，純度99％，來自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)。按本發(fā)明詳述后面的一步接一步被詳細(xì)描述的方法制備UDCA的單硫酸酯和二硫酸酯。簡而言之，單硫酸酯的合成包括選擇性保護(hù)UDCA分子中各環(huán)上的羥基，接著硫酸化未保護(hù)羥基并水解保護(hù)基游離出單硫酸酯。將UDCA與氯磺酸反應(yīng)制備UDCA的二硫酸酯結(jié)合物。用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析經(jīng)氧化、溶劑解、并轉(zhuǎn)化成甲基/酯-三甲基甲硅烷基醚衍生物的產(chǎn)物確定硫酸酯基的位置。高壓液相色譜、薄層色譜和毛細(xì)管柱氣相色譜分析確定合成膽汁酸鹽的色譜純度為，UDCA7-硫酸酯和UDCA3,7-二硫酸酯＞97％,UDCA3-硫酸酯＞95％。
動物實(shí)驗(yàn)雄性Sprague-Dawley鼠(Harlan Sprague-Dawley,Inc.Indianapolis,IN)，重210-290 g，置于12小時明-暗循環(huán)中，并用相同標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室飼料喂養(yǎng)3天。接著將動物置于代謝籠中單獨(dú)圈養(yǎng)并喂相同的食物。將UDCA、UDCA 3-硫酸酯、UDCA 7-硫酸酯、和UDCA 3,7-二硫酸酯用管飼法以250 mg/天的劑量連續(xù)給藥四天。每組包含3-6只鼠。每天測量動物的體重。第5天時，在醚麻醉下將動物放血處死。收集血漿并于-20℃下凍藏。切除肝臟，用生理鹽水清洗并于液氮中速凍。每24小時收集尿和糞便并于-20℃下凍藏。所有動物均按國立科學(xué)院制訂的“Guide forthe Care and Use of Laboratory Animals”(National Institutes ofHealth publication no.86-23,revised in 1985)中規(guī)定的方法進(jìn)行人工飼養(yǎng)。膽汁酸的分析腸內(nèi)容物和糞便中的未結(jié)合和硫酸酯膽汁酸將腸內(nèi)容物稱重并剪成小片。將各組動物第4天的糞便(100 mg)合并并碾磨成細(xì)糊。所有樣品均被聲處理，然后在80％甲醇中回流2小時，在氯仿/甲醇(1∶1)中再回流1小時。樣品液蒸干，并將干萃取物用80％甲醇(20ml)重新懸浮。取出甲醇提取物樣品(1/40腸內(nèi)容物和1/20糞便樣品)，并加入內(nèi)標(biāo)降去氧膽酸(10μg)。將該提取液用0.01mol/L醋酸(20ml)稀釋，并首先通過Lipidex 1000柱(bed size,4×1cm；PackardInstrument Co.,Groningen,The Netherlands)，接著再通過Bond-ElutC18柱(Analytichem,Harbor City,CA)。用甲醇(分別為20ml和5ml)淋洗Lipidex 1000柱和Bond-Elut柱回收膽汁酸，將合并的萃取液蒸干。在二乙胺基羥基丙基Sephadex LH-20柱(Lipidex-DEAP；PackageInstrument Co.)上進(jìn)行親脂陰離子交換色譜分離，將未結(jié)合膽汁酸純化并與中性甾醇和結(jié)合膽汁酸分離。用在72％乙醇(7ml)中的0.1mol/L乙酸淋洗接著蒸去溶劑，回收未結(jié)合膽汁酸。用9ml在72％乙醇中的0.3mol/L乙酸(pH9.6)淋洗回收總結(jié)合膽汁酸。加入降去氧膽酸(10μg)后通過Bond-Elut C18柱除去鹽分，然后用5ml甲醇淋洗回收結(jié)合膽汁酸。在甲醇(1ml)、蒸餾四氫呋喃(9ml)和1mol/L三氟乙酸之二氧六環(huán)(0.1ml)溶液的混合液中于45℃下加熱2小時進(jìn)行溶劑解。溶劑解后，在Lipidex-DEAP柱上色譜分離未結(jié)合膽汁酸。將樣品溶于甲醇(0.3ml)中并與2.7ml新蒸重氮甲烷乙醚溶液反應(yīng)，制備甲酯衍生物。蒸去反應(yīng)試劑后，加入50mlTri-Sil試劑(Pierce Chemicals,Rockford,IL)，將甲酯衍生物轉(zhuǎn)化成三甲基甲硅烷基醚。用Lipidex 5000柱(Packard Insrtument Co.)除去衍生化試劑并純化樣品。
血漿和尿中的未結(jié)合和硫酸酯化膽汁酸在每組中，收集每天總動物尿。第1天樣品代表基礎(chǔ)樣品，并收集膽汁酸給藥后第2、3和4天的尿樣。加入降去氧膽酸(1μg)后，用Bond-Elut C18柱定量萃取尿(3ml)和血漿(1ml)中的膽汁酸。液-固萃取后，在Lipidex-DEAP柱上親脂陰離子交換色譜純化和分離未結(jié)合和結(jié)合膽汁酸。溶劑解結(jié)合膽汁酸并用上述方法分離水解產(chǎn)物，然后將膽汁酸轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性的甲酯-三甲基甲硅烷基醚衍生物。
肝臟和腸內(nèi)容物中膽汁酸的結(jié)合程度將肝臟樣品(100mg)磨成細(xì)漿，并將腸內(nèi)容物及糞便中的膽汁酸按上述加熱回流并通過Lipidex 1000柱的方法萃取出來。用親脂陰離子交換色譜按膽汁酸的結(jié)合方式將其組分離。合并各動物的萃取液，并用Lipidex-DEAP柱分離膽汁酸及其結(jié)合物，用以下緩沖液分步淋洗凝膠床在72％乙醇中的0.1 mol/L乙酸(未結(jié)合膽汁酸)；在72％乙醇中的0.3mol/L乙酸，pH 5.0(甘氨酸結(jié)合物)；在72％乙醇中的0.15 mol/L乙酸(pH6.5)(?；撬峤Y(jié)合物)；和在72％乙醇中的0.3mol/L乙酸，pH9.6(硫酸酯結(jié)合物)。蒸去緩沖液后，將硫酸化膽汁酸溶劑解，酰胺化結(jié)合物用50U的膽酰甘氨酸水解酶(Sigma Chemical Co.)在2.5ml的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.6)中于37℃下水解過夜。所得未結(jié)合膽汁酸用Lipidex-DEAP柱純化，并按上述方法制成甲酯-三甲基甲硅烷基醚衍生物。
溶劑解后，在Lipidex-DEAP柱上，淋洗液為在72％乙醇中的0.15mol/L乙酸，pH6.5(6ml)，分離鼠腸的空腸部分酰胺化膽汁酸。按上述方法進(jìn)行酶水解，并按上述方法將所得未結(jié)合膽汁酸分離和衍生化。GC-MS按色譜條件30m×0.25mm DB-1熔融石英毛細(xì)管柱(J&W Scientific,Folson,CA)，從225℃至295℃程序升溫，升溫速度為2℃/min，在最終溫度上恒溫30分鐘，分離甲酯-三甲基甲硅烷基醚衍生物。采用Finnigan4635質(zhì)譜儀(Finnigan Inc.,San Jose,CA)，其上裝有上述相同的氣相色譜柱并按相同條件操作進(jìn)行GC-MS分析。連續(xù)掃描流出組分記錄分子量在50-800 dalton間的電子轟擊(70eV)質(zhì)譜。以參比同系列正構(gòu)烷烴的氣相色譜保留指數(shù)，即亞甲基單元值鑒定膽汁酸，并將基質(zhì)譜與真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)樣品作比較。使用氣相色譜對比各膽汁酸的峰高和內(nèi)標(biāo)的峰高對膽汁酸作定量。液相二級電離質(zhì)譜將約1μl甲醇萃取液加到一小滴置于不銹鋼探頭上的甘油/甲醇基體中后，獲得尿樣的液相二級電離質(zhì)譜的負(fù)離子譜。將探頭置于VG AutospecQ質(zhì)譜儀的離子源中，用一束由碘化銫(35KeV)產(chǎn)生的銫快原子束轟擊樣品靶。獲得質(zhì)量范圍在50-1000 daltons間的負(fù)離子譜。統(tǒng)計(jì)分析分析前將萃取液合并時，數(shù)據(jù)用所有動物的平均±SEM或平均值表達(dá)。用配對的或未配對的雙尾學(xué)生t-檢驗(yàn)法對比不同組的結(jié)果。P值＜0.05說明統(tǒng)計(jì)有顯著性。結(jié)果沿腸道的管腔內(nèi)膽汁酸組成對照組和各給藥膽汁酸動物組的被剔除腸片斷的平均重量是相似的。在對照動物組中，空腸中UDCA的總量(0.03±0.01mg)是微不足道的，僅相當(dāng)于總膽汁酸的0.3％。當(dāng)按最終劑量給藥UDCA、UDCA 3-硫酸酯、UDCA 7-硫酸酯和UDCA 3,7-雙硫酸酯24小時后，所有動物空腸中的UDCA總量(以及占總膽汁酸的百分比)均增加，分別為9.95±0.49mg(35.9％)、3.67±0.45mg(16.4％)、1.09±0.34mg(4.7％)和0.21±0.07mg(2.0％)。結(jié)果表明C-7位結(jié)合硫酸酯基后僅能保持非常少的UDCA(表1)。
在給藥UDCA和UDCA 3-硫酸酯的動物空腸內(nèi)可檢測到大比例的作為外源性給藥UDCA的特征代謝產(chǎn)物Δ22UDCA。但該代謝產(chǎn)物在對照組中未被檢測到，而在給藥C-7結(jié)合硫酸酯的UDCA的動物中其占總空腸膽汁酸的比例＜3％(表1)。
用親脂陰離子交換色譜分離膽汁酸后，檢查空腸中UDCA的結(jié)合方式，發(fā)現(xiàn)給藥UDCA的動物中主要是甘氨-或?；?UDCA，少量的未結(jié)合UDCA和可忽略量的硫酸化UDCA。雖然給藥C-7硫酸酯后在空腸中發(fā)現(xiàn)酰胺化和未結(jié)合形式的UDCA，但空腸中的UDCA總量非常少。在給藥UDCA 3-硫酸酯的鼠中，腸道中含大比例的酰胺化UDCA，表明明顯的生物轉(zhuǎn)化方式為去結(jié)合和/或酰胺化。
對于內(nèi)源性膽汁酸，在對照動物空腸中膽酸為主要膽汁酸，占總膽汁酸的48.5±2.9％(6.82±1010mg)，當(dāng)給藥UDCA后，其量明顯降低(P=0.01)至16.8％±1.3％(4.68±0.65mg)。UDCA3-硫酸酯同樣造成膽酸比例的下降(P=0.05)，但幅度小于UDCA，而給藥UDCA的C-7硫酸酯后反而使膽酸在空腸中的比例上升(P=0.01)(表1)。
在對照動物的結(jié)腸中，大多數(shù)膽汁酸為次生的，經(jīng)鑒定主要為脫氧膽酸和ω-鼠膽酸，僅能檢測到少量石膽酸(表2)。給藥UDCA造成脫氧膽酸的比例下降(P=0.003)，使石膽酸成為主要膽汁酸，占總結(jié)腸膽汁酸的32.0％±0.8％(P=0.0004)。與之相反，給藥UDCA 7-硫酸酯和UDCA 3,7-二硫酸酯使脫氧膽酸和石膽酸在結(jié)腸中的量以及比例均明顯下降。膽汁酸的糞便排泄已發(fā)現(xiàn)各組動物每天糞便排泄量沒有明顯差別。給藥UDCA、UDCA 3-硫酸酯、UDCA 7-硫酸酯和UDCA 3,7-二硫酸酯的動物的總膽汁酸糞便排泄分別為14.85、10.70、12.65和10.88mg/g糞便。所有動物的糞便中均富含UDCA；但在給藥未結(jié)合膽汁酸的動物中，UDCA差不多全多部為未結(jié)合形式。與之相反，在給藥UDCA 7-硫酸酯和UDCA 3,7-二硫酸酯鼠的糞便中僅含可忽略濃度的未結(jié)合UDCA；這兩種結(jié)合物基本上未經(jīng)轉(zhuǎn)化即排到糞便中(圖2)。排到糞便中的主要次級膽汁酸的濃度在各組動物中有差別。在UDCA組中，石膽酸比對照值大大增加，而給藥UDCA 7-硫酸酯和UDCA 3,7-二硫酸酯后石膽酸的糞便排泄則下降。去氧膽酸的排泄也具有同樣趨勢。對比于正常鼠糞，當(dāng)給藥UDCA后石膽酸/去氧膽酸的比例升高20多倍，給藥UDCA 3-硫酸酯升高11倍，但給藥C-7硫酸酯則不增加(圖3)。肝臟組織的膽汁酸組成各膽汁酸在肝臟組織中的濃度和組成概括于表3中。在對照動物中，UDCA的濃度為12.0nmol/g，占總肝臟膽汁酸的2.8％。給藥UDCA和C-3硫酸酯后使肝臟組織中UDCA的濃度和比例增加(圖1)。此外，發(fā)現(xiàn)Δ22UDCA在肝臟中有相對較高的比例。與之相反，當(dāng)對動物給藥C-7硫酸酯膽汁酸后，總UDCA的濃度和百分組成均大大下降。給藥UDCA造成肝臟石膽酸濃度增加，而給藥硫酸酯結(jié)合物時石膽酸濃度下降。在所有給藥膽汁酸的動物組中，去氧膽酸的濃度均下降，其中C-7硫酸酯的下降程度較大。當(dāng)給藥UDCA后肝臟組織的膽酸濃度下降約4倍，但給藥C-7硫酸酯結(jié)合物后則略微上升。
當(dāng)給藥各膽汁酸后，UDCA在肝臟組織中的結(jié)合形式為未結(jié)合UDCA和其C-3硫酸酯均以結(jié)合方式被生物轉(zhuǎn)化，其中主要與牛磺酸結(jié)合。不論是否給藥膽汁酸，在所有動物的肝臟組織中未結(jié)合UDCA和硫酸化UDCA的濃度和比例均可被忽略(圖4)。血漿和尿中的膽汁酸組成給藥UDCA動物中的未結(jié)合血漿UDCA濃度為4.8±2.2μmol/L，該值要明顯高于給藥3-硫酸酯(0.9±0.4μmol/L)、UDCA 7-硫酸酯(0.7±0.5μmol/L)和UDCA 3,7-二硫酸酯(1.0±0.2μmol/L)的動物。在所有動物中硫酸化UDCA濃度類似并均小于0.3μmol/L。
在未對動物給藥膽汁酸前，UDCA的經(jīng)尿排泄是可忽略不計(jì)的(＜0.4nmol/天)。給藥UDCA后，尿中未結(jié)合UDCA排泄量為642.7nmol/天。該值明顯高于給藥硫酸酯結(jié)合物之動物的尿排泄UDCA濃度(UDCA 3-硫酸酯，5.2nmol/天；UDCA 7-硫酸酯，1.8nmol/天；UDCA 3,7-二硫酸酯，1.3nmol/天)。給藥未結(jié)合UDCA(4.6nmol/天)、UDCA 3-硫酸酯(2.7nmol/天)、UDCA 7-硫酸酯(317.8nmol/天)、和UDCA 3,7-二硫酸酯(217.1nmol/天)后，UDCA的硫酸酯結(jié)合物也可在尿中被觀察到。雖然僅占每天給藥劑量的＜0.05％，利用液相二級電離質(zhì)譜分析可檢測到這些膽汁酸結(jié)合物。討論口服UDCA使肝臟組織UDCA濃度大大增加，而且該膽汁酸主要通過酰胺化被結(jié)合。只有可忽略量的未結(jié)合UDCA被檢出(圖4)，在這方面其代謝方式類似于人類。與之相反，當(dāng)給藥C-7硫酸酯和二硫酸酯結(jié)合物時，肝臟UDCA的濃度低于對照動物，表明這些結(jié)合物不被腸道所吸收，因此只有可忽略的UDCA保持。當(dāng)給藥C-3硫酸酯后肝臟UDCA濃度增加，其主要被酰胺化的現(xiàn)象表明發(fā)生明顯的脫硫酸酯基和UDCA 3-硫酸酯的酰胺化。除了在UDCA和UDCA 3-硫酸酯給藥組中有較高比例未結(jié)合UDCA外，UDCA在空腸中的結(jié)合方式平行于肝臟組織(圖1)。前期膽汁酸喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明膽汁酸池的最大富集在4天后達(dá)到，繼續(xù)喂養(yǎng)不使膽汁酸組成發(fā)生進(jìn)一步改變。
從糞便的膽汁酸組成可進(jìn)一步反應(yīng)出UDCA的C-7硫酸酯不易被腸道吸收。在給藥UDCA 7-硫酸酯和UDCA 3,7-二硫酸酯的動物中，糞便的UDCA總量要大大高于給藥UDCA或UDCA 3-硫酸酯動物糞便中的量。此外，UDCA的C-7硫酸酯主要未經(jīng)轉(zhuǎn)化即排到糞便中。這些發(fā)現(xiàn)可被解釋為細(xì)菌硫酸酯的底物特異性，已發(fā)現(xiàn)它僅對C-3膽汁酸底物有活性。給藥UDCA對主要次級膽汁酸和石膽酸以及去氧膽酸的糞便排泄有顯著影響。當(dāng)給藥未結(jié)合UDCA和UDCA 3-硫酸酯時，糞便石膽酸的濃度大大增加，而給藥UDCA 7-硫酸酯和UDCA 3,7-二硫酸酯對這些次級膽汁酸的糞便排泄無明顯作用。
糞便和肝臟石膽酸濃度的增加可被解釋為腸道細(xì)菌對UDCA的生物轉(zhuǎn)化，并且以一較低程度生物轉(zhuǎn)化其C-3硫酸酯。在鼠和人體中UDCA生物轉(zhuǎn)化成石膽酸的程度是類似的。在給藥UDCA動物中脫氧膽酸的增加與己知的競爭性抑制膽酸在末端回腸的吸收一致，它導(dǎo)致增加地溢流入結(jié)腸接著7α-去羥基形成脫氧膽酸。有趣的是UDCAC-7硫酸酯似乎具有相反的作用；在肝臟組織中膽酸的濃度比對照動物略微增加，而糞便中膽酸和去氧膽酸的濃度則下降。
由于UDCA發(fā)生顯著生物轉(zhuǎn)化形成石膽酸并增加了糞便中去氧膽酸的濃度，兩者均為高疏水性膽酸，可能是令人吃驚的是在化學(xué)誘導(dǎo)結(jié)腸癌的動物模型中已發(fā)現(xiàn)UDCA的有益的作用。在這些模型中，已有結(jié)論表明疏水性膽汁酸促進(jìn)腫瘤的增長。結(jié)腸和口服給藥膽汁酸，膽汁分流至盲腸，消膽胺的攝入，食用脂肪和某些纖維，以及所有增加通過結(jié)腸的膽汁酸流量的條件均促進(jìn)腫瘤形成，這與促進(jìn)生長的作用一致。體外實(shí)驗(yàn)表明去氧膽酸和石膽酸為共促有絲分裂的并能增加結(jié)腸上皮細(xì)胞增生的速度。對鳥氨酸脫羧酶活性和HLAⅠ和Ⅱ型抗原也顯示出一些其它的作用。
對于UDCA的化學(xué)保護(hù)作用可以有幾種解釋。當(dāng)在體外共溫孵或在體內(nèi)與有膜損傷作用的疏水性膽汁酸共灌注時，相對高濃度的UDCA以類似于UDCA細(xì)胞保護(hù)的方式緩沖結(jié)腸中石膽酸形成加快的有害作用?；蛘撸Ｗo(hù)作用可能是結(jié)腸去氧膽酸濃度下降的結(jié)果，這暗示去氧膽酸在促結(jié)腸癌中的重要作用。盡管給藥硫酸化膽汁酸也同樣降低結(jié)腸脫氧膽酸的量，理論上UDCA的C-7硫酸酯要比UDCA優(yōu)越，因?yàn)檫@些結(jié)合物不被生物轉(zhuǎn)化成更疏水性的膽汁酸。此外，C-7硫酸酯在小腸中的弱吸收使得應(yīng)用較低劑量而達(dá)到相似的化學(xué)保護(hù)作用。
膽汁酸在人結(jié)腸癌發(fā)生中的作用還不清楚。早期的研究表明患有結(jié)腸癌、息肉狀腺瘤、家族性息肉病的病人中，膽汁酸，特別是石膽酸和去氧膽酸的糞便排泄增加，雖然這些發(fā)現(xiàn)尚未得到其它一些觀察者的證實(shí)。與對照相比，已有報道患有結(jié)腸癌或息肉狀腺瘤的病人糞便中水相石膽酸和去氧膽酸的濃度增加，這些濃度與結(jié)腸細(xì)胞的增生程度相關(guān)。盡管初步實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持UDCA在結(jié)腸癌動物模型和體外細(xì)胞系中有化學(xué)保護(hù)和/或細(xì)胞保護(hù)作用，給藥UDCA后造成石膽酸的生成加快可能會限制UDCA在結(jié)腸中的所有作用。與對照相比給藥UDCA和UDCA 3-硫酸酯后糞便中石膽酸/去氧膽酸的比例大大增加(圖3)。這可能不是理想的，因?yàn)榛加薪Y(jié)腸癌和易感此病的人中糞便石膽酸/去氧膽酸的比例上升，而且這已被建議有診斷價值。另一方面，給藥UDCA7-硫酸酯和UDCA3,7-二硫酸酯不使石膽酸/去氧膽酸的比例發(fā)生變化。雖然統(tǒng)計(jì)上無顯著性，可觀察到該比例有下降的趨勢，而這些次級膽汁酸的定量糞便排泄與對照動物類似。
此外，如上述所討論的那樣，UDCA的C-7位引入硫酸酯基大大增加了分子的親水性，這阻礙腸道吸收，從而易化了UDCA對結(jié)腸的定向傳輸。未結(jié)合UDCA轉(zhuǎn)化成石膽酸，因而增加了糞便石膽酸/去氧膽酸的比率，這被認(rèn)為是結(jié)腸病的一個危險性因素，而與之相反C-7硫酸酯是代謝惰性的。因此，這些結(jié)合膽汁酸在結(jié)腸中的化學(xué)保護(hù)劑作用比UDCA更有效。在鼠膽汁流量和膽汁脂類分泌中熊去氧膽酸硫酸酯的代謝和作用以下一步接一步地詳細(xì)討論UDCA的C-3和C-7硫酸酯以及二硫酸酯結(jié)合物的制備。接著檢查這些膽汁酸在膽管中的肝臟代謝，將這些膽汁酸與UDCA比較以確立其在膽汁流量和膽汁脂類分泌上的作用。材料與方法熊去氧膽酸3-硫酸酯(UDCA-3S)的合成將咪唑(3.5g)和特丁基二甲基氯甲硅烷(1.6g)加到冰冷卻的UDCA(2g)的無水二甲基甲酰胺(1.5ml)-吡啶(0.75ml)溶液中，并將混合液攪拌30分鐘。接著將反應(yīng)液倒入冰水(20ml)中，并用乙酸乙酯(100ml)萃取。有機(jī)相用水洗，無水Na2SO1干燥后蒸干。所得油狀殘留物溶于己烷-乙酸乙酯(體積比為3∶1,250ml)中，并用一40g硅膠(28-200目，AldrichChemical Co.Inc.,Wisconsin)柱過濾。蒸干濾液并將殘?jiān)苡谝掖?，結(jié)晶得產(chǎn)物UDCA-3-特丁基二甲基甲硅烷基醚(2.15g，產(chǎn)率83％)。用乙酸酐(20ml)和吡啶(20ml)在室溫下處理UDCA-3-特丁基二甲基甲硅烷基醚(2.0g)5分鐘得油狀產(chǎn)物UDCA 7-乙酸酯3-特丁基二甲基甲硅烷基醚。向UDCA 7-乙酸酯3-特丁基二甲基甲硅烷基醚的丙酮(24ml)液中加入18％HCl(2.4ml)，并將混合液于室溫下攪拌30分鐘。所得產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，水洗，無水Na2SO1干燥，蒸去溶劑得油狀產(chǎn)物熊去氧膽酸7-乙酸酯(1.2g)。將在無水吡啶(12ml)中的氯磺酸(1.2ml)加到冰冷的UDCA7-乙酸酯(1.2g)的溶液中，并將溶液加熱至50℃。30分鐘后，加入水(400ml)終止反應(yīng)，產(chǎn)物用一大的十八烷基硅烷鍵合硅膠柱MEGA-BOND-ELUT(Varian,Harbor City,CA)吸附，并用甲醇洗脫回收。接著將甲醇萃取液蒸干，將UDCA 7-乙酸酯3-硫酸酯的吡啶鹽溶于0.2M NaOH甲醇溶液中以將其轉(zhuǎn)化成二鈉鹽，然后過濾。濾液用冷乙醚(400ml)稀釋，收集沉淀，用冷乙醚洗滌并干燥。將固體(1.0g)溶于甲醇(10ml)中，加入3.5M NaOH(10ml)，并將溶液在室溫下攪拌18小時。產(chǎn)物用MEGA-BOND-ELUT萃取并用水(500ml)淋洗。將該柱的甲醇萃取液蒸干，溶于0.2MNaOH甲醇溶液(30ml)并過濾。濾液用冷乙醚(300ml)稀釋，收集所得沉淀并用乙醚洗滌。用甲醇(20ml)和乙醚(200ml)重復(fù)該操作三次，制得UDCA-3-硫酸酯二鈉鹽(0.62g，產(chǎn)率50％)。熊去氧膽酸7-硫酸酯(UDCA-7S)的合成將在無水吡啶(9ml)中的氯磺酸(0.9ml)加到冰冷的UDCA 3-特丁基二甲基甲硅烷基醚(900mg)的溶液中，并將混合液加熱至50℃。30分鐘后加入水(400ml)終止反應(yīng)。沉淀出UDCA 3-特丁基二甲基甲硅烷基醚7-硫酸酯的吡啶鹽，水洗，真空干燥后按上述方法用HCl水解。產(chǎn)物用MEGA-BOND-ELUT柱萃取并將甲醇萃取液蒸干后溶于0.2M NaOH甲醇溶液(30ml)中。將該甲醇溶液用冷乙醚(300ml)稀釋，接著按上述方法分離沉淀的二鈉鹽得純UDCA-7-硫酸酯二鈉鹽(640mg，產(chǎn)率76％)。熊去氧膽酸3,7-二硫酸酯(UDCA-DS)的合成將在無水吡啶(10ml)中的氯磺酸(1ml)加到冰冷的UDCA(1g)無水吡啶(10ml)溶液中，并將混合液加熱至50℃。60分鐘后加入水(500ml)終止反應(yīng)。產(chǎn)物用MEGA-BOND-ELUT柱萃取并按上述方法分離得到UDCA-二硫酸酯的二鈉鹽(1.1g，產(chǎn)率9l％)。
用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析所合成化合物經(jīng)氧化、溶劑解并轉(zhuǎn)化成甲基三甲基甲硅烷基醚(Me-TMS)的衍生物，以確定硫酸酯基的位置。高壓液相色譜(HPLC)、薄層色譜(TLC)和毛細(xì)管柱色相氣相(GC)分析確定所合成的化合物色譜純度＞97％。動物實(shí)驗(yàn)腹腔注射戊巴比妥(Nembutal,7.5mg/100g體重)將成年雄性Sprauge-Dawley鼠(體重200-230g)麻醉，并用附加劑量保持鎮(zhèn)靜狀態(tài)。用PE-50聚乙烯管(Clay-Adams,Parsippany,N.J)插到右頸靜脈和總膽管中。實(shí)驗(yàn)中用直腸探頭和恒溫控制的加熱板(Harvard ApparatusCo.,Inc.,Millis,Mas)將體溫控制為37℃。用Harvard泵(HarvardApparatus Co.,Inc.)以1.0ml/h速率向頸靜脈灌注鹽水作為對照，時長為2小時。收集2份10分鐘膽汁樣品作基礎(chǔ)值分析后，靜脈滴注(i.v.)各膽汁酸30分鐘，逐步增加劑量(0.5、1.0、和2.0μmol/min/100g體重)。用含3％人白蛋白的0.45％鹽水配制膽汁酸溶液。每次實(shí)驗(yàn)采用六只動物并將每10分鐘膽汁收集到預(yù)先稱重的試管中。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，心臟穿刺取血，并從膀胱中吸取尿樣。所有生物樣品均在-20℃下貯藏。該動物實(shí)驗(yàn)規(guī)程(#1810044)已被兒童醫(yī)院醫(yī)療中心的生物倫理學(xué)委員會(Cincinnati,Ohio)批準(zhǔn)。分析技術(shù)采用溶劑系統(tǒng)正丁醇-乙酸-水(10∶1∶1，體積比)在預(yù)包被硅膠G板(Merck,0.2mm厚)上進(jìn)行TLC分析。斑點(diǎn)通過噴10％磷鉬酸乙醇溶液，接著在120℃下加熱5分鐘顯色。
使用裝有可變波長UV檢測器的Varian 5000 HPLC儀(VarianAssociates Inc.,Palo Alto,CA)進(jìn)行HPLC分析，該儀器裝有25×0.46cm Hypersil ODS柱(5μm粒徑；Keystone Scientific,Bellefonte,PA)。色譜柱在室溫下操作，淋洗液為甲醇-0.01M磷酸鹽緩沖液(65∶35，體積比)，調(diào)pH為6.8，并按Rossi等人的方法(High pressure liquidchromatographic analysis of eoujugated bile acids in humanbile:simultaneous resolution of sulfated and unsulfatedlithocholyl amidated and the common conjugated bile ducts.J.LipidRes.28∶589(1987))作調(diào)整。流量為1.0ml/min，膽汁酸在205nm處檢測。
在裝有30米DB-1(4mm內(nèi)徑；0.25μm膜厚)的熔融石英毛細(xì)管柱(Jand W Scientific Inc.,Rancho Cordova,CA)的Hewlett-Packard 5890氣相色相儀上進(jìn)行GC分析，升溫程序?yàn)?25℃至295℃每分鐘2℃，在起始溫度時保持2分鐘，在最終溫度時保持30分鐘。氦作為載氣，流速為1.8ml/min。
GC-MS在VG Autospec Q磁場式質(zhì)譜儀或Finnigan 4635四級GC-MS-DS儀上進(jìn)行，裝有相同的色譜柱并在相同色譜條件下進(jìn)行分析。連續(xù)掃描流出組分記錄質(zhì)量范圍在50至1000Da/e范圍內(nèi)的電轟擊(TOeV)質(zhì)譜。
將相當(dāng)于約1μl原始膽汁萃取液、10μl-50μl尿萃取液和μg量合成膽汁酸溶于甲醇中并加到一小滴位于FAB探頭銅靶上的甘油基體中，獲得膽汁樣品、尿和合成化合物的負(fù)離子快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)。將探頭直接引入到質(zhì)譜儀的離子源中并用一束由鞍形場原子槍(Ion Tech,Teddington,Middlesex,UK)、操作條件為8kV和20μA產(chǎn)生的氙快原子束，或由碘化銫(35kV)產(chǎn)生的銫快原子束轟擊含樣品的靶。獲得質(zhì)量范圍在50-1000Da/e間的負(fù)離子譜。膽汁分析假設(shè)密度為1g/ml，按重量確定膽汁的體積。在溶劑解前(未硫酸化膽汁酸)和溶劑解后(總膽汁酸)用酶法檢測膽汁中總3α-羥基膽酸的濃度(Mashige,F.等人，Direct spectrometry of total bile acids inserum.Clin.Chem.27∶1352-1356(1981))。將膽汁流速乘以膽汁酸濃度計(jì)算膽汁酸輸出。按膽堿氧化酶法(Nippin Shoji Kaisha,Ltd.,Osaka,Japan)(Grantz,D.等人，Enzymatic measurement of choline-containing phospholipids in bile.J.Lipid Res.22∶273-276(1981))酶法檢測膽汁磷脂。也用酶法檢測膽固醇(Boehringer Mannehim,Indianapolis,IN)(Fromm,H.等人，Use of simple enzymatic assay forcholesteral analysis in human bile.J.Lipid Res.21∶259-251(1980))。膽汁和尿膽汁酸分析為檢測灌注膽汁酸的肝臟轉(zhuǎn)化，將從六只動物上收集的膽汁合并，萃取、溶劑解、水解和衍生化后用GC-MS分析膽汁膽汁酸。采用GC將各膽汁酸峰高與加到最初膽汁樣品中的內(nèi)標(biāo)降去氧膽酸的峰高作比較，對膽汁酸進(jìn)行定量分析。以相對于正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)，即亞甲基單元值(MU)對膽汁酸進(jìn)行鑒定，并將其質(zhì)譜裂解方式與真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)樣品作比較。最近已有超過100個的真實(shí)膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)樣的質(zhì)譜和保留指數(shù)被收集作為參考(Lawson,A.M.等人，MS spectrometry of bile acids,The Bile Acids,Vol.4,Methods and Applications,167-267頁(1988))。將來自6只動物的尿樣合并并用Bond Elut-C18柱液-固萃取，然后在溶劑解、水解和衍生化后，用GC-MS進(jìn)行分析。使用親脂陰離子交換色譜對膽汁酸組分離對于灌注UDCA-3S的動物，在膽汁酸灌注的最終期間(1.0μmol/min/100g體重)收集膽汁。將膽汁酸溶劑解，并按其結(jié)合方式用親脂陰離子交換凝膠、二乙胺基羥基丙基Sephadex LH-20(Packard Instruments,Groningen,The Netherlands)進(jìn)行組分離。水解并制成Me-TMS醚后用GC-MS對各樣品中的膽汁酸組成作分析。統(tǒng)計(jì)方法結(jié)果以平均±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表達(dá)。膽汁流量和膽汁脂類輸出分別表達(dá)為μl/min/g肝臟和nmol/min/g肝臟。使用INSTAT程序(Graphpad Software Inc.,San Diego,CA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用學(xué)生t-檢驗(yàn)法分析組間各參數(shù)。用單向方差分析(ANOVA)進(jìn)行不同組間統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。當(dāng)發(fā)現(xiàn)不同膽汁酸鹽灌注組的值有顯著性時，用Bonferroni’s t-檢驗(yàn)法對比兩組數(shù)據(jù)。進(jìn)行線性回歸分析。從膽汁酸分泌速率和膽汁流量相關(guān)的回歸線的斜率確定各膽汁酸的利膽作用，并以μl/mol表示。用單向ANOVA進(jìn)行斜率間的比較。結(jié)果膽汁流量和膽汁酸分泌靜脈灌注UDCA、UDCA-3S、SUDCA-7S和UDCA-DS對膽汁流量和膽汁酸分泌速度的影響在圖5A和圖5B中描繪并概括于表4中。所有膽汁酸均有明顯利膽作用，最大膽汁流速順序?yàn)閁DCA-3S＜UDCA＜UDCA-7S=UDCA-DS。灌注UDCA-3S、UDCA、UDCA-DS和UDCA-7S期間所有動物膽汁酸分泌速度均增加，其最大值分別為138.9±11.8、145.1±17.3、222.4±24.3和255.4±18.2nmol/min/g肝臟。作為對比，基礎(chǔ)膽汁酸分泌平均為40±4.2nmol/min/g肝臟。各膽汁酸灌注后膽汁酸分泌速度與膽汁流速的關(guān)系在圖6中顯示。從各回歸線的斜率計(jì)算出的UDCA、UDCA-3S、UDCA-7S和UDCA-DS的表觀利膽作用分別為16±2、15±1、13±1和16±1μl/μmol。各線的截距表明對于所有動物組膽汁酸與膽汁流量的依賴程度相當(dāng)(1.7μl/min/g肝臟)。膽汁脂類分泌灌注UDCA及其硫酸酯結(jié)合物對膽固醇和磷酯的膽汁輸出的作用在圖7A和7B中顯示。在灌注UDCA和UDCA-7S的頭40分鐘，膽汁膽固醇增加，最大分泌速度分別達(dá)到1.88±0.19和1.76±0.21nmol/min/g肝臟，采用UDCA-7S時膽固醇的分泌被維持，而灌注UDCA，甚至是逐步增加劑量時，膽固醇的分泌也明顯下降。在預(yù)灌注期間，相應(yīng)的膽固醇分泌速度平均分別為1.46±0.1和1.42±0.16nmol/min/g肝臟。與之相反，灌注UDCA-3S和UDCA-DS時都明顯降低膽汁膽固醇的輸出，如基礎(chǔ)值相比分別降到0.40±0.05和0.37±0.12nmol/min/g肝臟。灌注UDCA和UDCA-7S明顯增加膽汁磷酯分泌，而與之相反，灌注UDCA-3S和UDCA-DS造成膽汁磷脂分泌明顯減少(表4)。負(fù)離子FAB-MS分析膽汁和尿膽汁酸灌注未結(jié)合UDCA前(基礎(chǔ)期)和灌注期間時合并的鼠膽汁的負(fù)離子FAB-MS譜在圖8A和8B中顯示。在基礎(chǔ)膽汁樣品中離子m/z 514和m/z 498分別代表三羥基和二羥基膽酸的牛磺酸酯結(jié)合物，并代表作為鼠膽汁中主要成份的原生膽汁酸。在灌注UDCA期間，質(zhì)譜中主要離子變?yōu)閙/z.498和m/z 448，說明灌注的UDCA差不多全與?；撬岷透拾彼峤Y(jié)合。離子m/z471表示二羥基膽酸(UDCA)的硫酸酯，而m/z 567和m/z 589(鈉加合物)代表UDCA的flucuronide結(jié)合物。
灌注UDCA-7S期間，質(zhì)譜中(圖8D)主要離子為m/z 471和其鈉加合物m/z 493，這些離子代表未變化的UDCA-7S。沒有別的明顯離子出現(xiàn)表明有UDCA-7S的進(jìn)一步代謝轉(zhuǎn)化。
灌注UDCA-3S期間，離子為m/z 471和m/z 493(鈉加合物)證明膽汁分泌未變化的膽汁酸，離子m/z 550和m/z 600表明與甘氨酸和?；撬狨０坊?圖8C)。
灌注UDCA-DS期間，主要離子為m/z 471和m/z 493(鈉加合物)和m/z573。離子m/z 573代表UDCA-DS,m/z 471和m/z 493為碎片離子。沒有其它離子出現(xiàn)支持UDCA-DS的進(jìn)一步代謝轉(zhuǎn)化(圖8E)。GC-MS分析膽汁膽汁酸表5概括了灌注UDCA及其多種硫酸酯結(jié)合物后膽汁中各膽汁酸的相對百分組成。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，膽酸、α-鼠膽酸和β-鼠膽酸為鼠膽汁中主要膽汁酸。在灌注所有化合物期間，UDCA成為主要膽汁酸并且所有組間百分組成均類似，表明所有硫酸化膽汁酸被肝臟吸收并有效分泌到膽汁中。
雖然未結(jié)合UDCA和UDCA-3S均被進(jìn)一步羥基化而代謝，其中最有可能發(fā)生在側(cè)鏈上，但羥基化代謝物的精確結(jié)構(gòu)尚未被確定，沒有證據(jù)表明UDCA的C-7硫酸酯和二硫酸酯會發(fā)生包括酰胺化的任何生物轉(zhuǎn)化。
對灌注UDCA-3S時分泌入膽汁的膽汁酸結(jié)合物的分離表明，等比例(25％)的灌注膽汁酸以?；撬岷透拾彼峤Y(jié)合物形式被回收，而UDCA則幾乎全部被?；撬岷透拾彼峤Y(jié)合。由于FAB-MS證明UDCA-7S和UDCA-DS難以被生物轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步結(jié)合物的分離被認(rèn)為是沒有必要的。尿膽汁酸的分析所有尿樣的FAB-MS分析表明UDCA的硫酸酯均可被排泄至尿中，GC-MS分析也證明了這一點(diǎn)。但是從定量角度與主要消除途徑膽汁排泄相比，UDCA硫酸酯被排泄至尿中的相對比例小。當(dāng)灌注UDCA時只有占總給藥劑量可忽略比例(0.0l％)的UDCA出現(xiàn)在尿中。對于UDCA-3-硫酸酯、UDCA-7-硫酸酯和UDCA-二硫酸酯來說，其在尿中的相對于總給藥劑量的比例分別為2.8％、0.9％和2.2％。討論上述結(jié)果證明，與UDCA相似，所有硫酸酯結(jié)合物均有顯著利膽作用并增加了膽汁酸的分泌。各膽汁酸的最大膽汁流量順序?yàn)閁DCA-DS=UDCA-7S＞UDCA＞UDCA-3S，不與HPLC保留指數(shù)所確定的其相對疏水/親水性質(zhì)直接相關(guān)。
膽汁酸母核C-7位上硫酸酯基的存在使其具有比UDCA誘導(dǎo)的更高膽汁流量，而C-3硫酸酯，雖然也具有利尿作用，其刺激膽汁流量的效率尚不如未結(jié)合UDCA。這些不同點(diǎn)可被解釋為肝臟首過消除時發(fā)生了C-3明顯的硫酸酯酰胺化，而C-7硫酸酯基則阻礙了生物轉(zhuǎn)化。酰胺化的硫酸酯可能具有較弱的利尿性質(zhì)。有趣的是即使所有被考察膽汁酸造成明顯的膽汁流量不同，這些化合物的膽汁中UDCA的相對比例均類似。
對于到膽固醇和磷脂排泄，趨勢是明顯的。極性(由HPLC保留指數(shù)證明)最大的膽汁酸使膽汁膽固醇和磷脂輸出明顯下降。膽汁酸的疏水/親水性與膽固醇和磷脂排泄間的關(guān)系最可能與分子的凈化能力有關(guān)，即凈化能力較弱而極性高的膽汁酸硫酸酯對細(xì)胞膜的損傷要比疏水性較強(qiáng)的膽汁酸弱。
與未結(jié)合UDCA相比，較低的膽固醇和磷酯排泄和由高親水性UDCA的3-硫酸酯和3,7-二硫酸酯結(jié)合物誘導(dǎo)的較大的膽汁分泌過多的綜合效應(yīng)提示出，這些特殊的膽汁酸硫酸酯有可能是更有效的膽汁郁積肝臟疾病的治療劑。
各UDCA硫酸酯的明顯不同的肝臟生物轉(zhuǎn)化己被觀察到。例如，母核C-7位上硫酸酯基的取代阻礙了肝臟的生物轉(zhuǎn)化，故UDCA-7-硫酸酯和UDCA-二硫酸酯均未經(jīng)轉(zhuǎn)化即被排泄。而對于UDCA的C-3硫酸酯情況則不同，它以有限程度未經(jīng)轉(zhuǎn)化被排泄，而且還明顯地與牛磺酸和甘氨酸酰胺化并進(jìn)一步羥基化，其中羥基化最有可能發(fā)生在側(cè)鏈上。而在膽汁分泌前未結(jié)合UDCA則主要與?；撬峤Y(jié)合，并有較少部分轉(zhuǎn)化成甘氨酸、硫酸酯和Flucuronide結(jié)合物。
甚至以相對高濃度進(jìn)行灌注后，也僅有可忽略量的UDCA硫酸酯排泄至尿中。考慮到主要尿膽汁酸為硫酸酯結(jié)合物后，該發(fā)現(xiàn)是特別令人吃驚的。因此，在患有膽汁郁積肝臟疾病的病人體中膽汁膽汁酸硫酸酯的缺乏以及高比例和高濃度硫酸化尿膽汁酸的出現(xiàn)僅能解釋為膽汁酸腎的硫酸化作用，而不是肝臟的硫酸化作用。這些觀察結(jié)果清楚地表明硫酸化的膽汁酸易于被肝臟吸收并被轉(zhuǎn)運(yùn)到膽汁中，因此不支持常見的肝臟硫酸化作用為膽汁郁積中主要代謝途徑的觀點(diǎn)。據(jù)此，在膽汁郁積期間腎臟可能是保護(hù)肝免受毒性的重要代謝器官。
鼠是明顯產(chǎn)生6β-羥基化膽汁酸、CDCA和UDCA 6β-羥基化的種屬。在本研究中，明顯量的UDCA的羥基化產(chǎn)物，如鼠膽酸異構(gòu)體不能被檢出。已有報道在鼠膽管中牛磺鵝去氧膽酸二硫酸酯和甘氨鵝去氧膽酸二硫酸酯90％被代謝成3α,7α-二硫酸酯、6β-羥基5β-膽烷酸(α-鼠膽酸的3α,7α-二硫酸酯)。在本發(fā)明所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，UDCA-7S和UDCA-二硫酸酯均不被羥基化。這些實(shí)驗(yàn)強(qiáng)烈支持硫酸酯基的存在阻礙了母核的肝臟生物轉(zhuǎn)化。當(dāng)然也可能是由于羥基化酶優(yōu)先作用于酰胺化膽汁酸底物的緣故。
膽汁酸與?；撬岬慕Y(jié)合被認(rèn)為依賴于底物與酶的親合力(膽汁酸輔酶A甘氨酸/?；撬?N-?；?轉(zhuǎn)移酶)以及肝臟中?；撬岬墓?yīng)。我們的FAB-MS和GC-MS結(jié)果表明UDCA-3S部分地與?；撬岷透拾彼狨０坊崾九c未硫酸化膽汁膽汁酸相比硫酸酯與酶的親合較弱。UDCA-7S和UDCA-DS不與?；撬峄蚋拾彼狨０坊挠^察結(jié)果提示7β-硫酸酯基的存在阻礙了酶的活性。
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注結(jié)果用平均±SEM表示ND未檢出表4.UDCA及其硫酸酯結(jié)合物灌注的生理學(xué)效應(yīng)UDCA UDCA-7S UDCA-3S UDCA-DS膽汁流量(μl/min/g肝臟)基礎(chǔ)值 1.97±0.05 1.95±0.081.85±0.062.06±0.08最大值 4.88±0.16 5.83±0.313.34±0.135.92±0.21膽汁鹽輸出(nmol/min/g 肝臟)基礎(chǔ)值 47.30±4.30 34.60±4.40 39.60±3.80 40.20±5.50最大值 145.10±17.30 255.40±18.20138.90±11.80 222.40±24.30膽固醇輸出(nmol/min/g肝臟)基礎(chǔ)值 1.46±0.10 1.42±0.16 1.28±0.05 1.52±0.12最大值 1.88±0.19 1.76±0.23 0.40±0.02 0.37±0.07磷酯輸出(nmol/min/g 肝臟)基礎(chǔ)值 10.30±0.70 9.00±1.00 9.60±0.80 9.80±0.70最大值 17.20±1.90 15.00±1.70 4.00±0.50 2.50±0.30數(shù)值以每組中6個動物的平均±SEM表示。
表5.靜脈灌注UDCA和UDCA的硫酸酯結(jié)合物期間分泌入膽汁中的各膽汁酸的相對百分組成時間(min) DCACDCA a-MCACAUDCA β-MCA MCA其它UDCA 灌注基礎(chǔ)值2.05.48.976.5 3.226.9 1.5nd20-30mins 1.03.04.349.0 51.9 17.2 1.014.650-60mins 0.52.53.921.4 65.9 12.6 0.513.780-90mins 0.71.56.49.879.5 9.9nd 11.9UDCA-7S灌注基礎(chǔ)值5.75.37.258.3 1.418.5 3.6nd20-30mins 2.31.72.520.2 61.3 10.7 1.3nd50-60mins 0.70.60.97.783.6 5.90.6nd80-90mins 1.20.71.39.978.8 7.40.8ndUDCA 3S灌注基礎(chǔ)值2.24.010.8 57.4 2.020.6 3.0nd20-30mins 2.54.66.236.0 33.3 12.4 4.95.250-60mins 1.01.92.714.9 70.6 7.41.511.580-90mins 1.32.53.018.2 67.7 5.22.011.2UDCA-DS灌注基礎(chǔ)值4.26.39.156.7 1.418.0 4.3nd20-30mins 2.12.53.424.5 54.6 9.73.2nd50-60mins 1.20.72.215.3 70.7 6.72.2nd80-90mins nd 0.91.610.6 79.1 6.51.4nd
以上雖然對本發(fā)明的幾個特殊方面進(jìn)行了詳細(xì)討論，但本發(fā)明的范圍并不僅局限于這些方面，而是以以下權(quán)利要求來確定本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種藥理學(xué)可接受的組合物，其包含一種3α,7β-二羥基-5β-膽烷-24-酸(UDCA)的硫酸酯；和一種藥理學(xué)可接受的載體。
2.如權(quán)利要求1所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其中，所述硫酸酯選自UDCA-3-硫酸酯、UDCA-7-硫酸酯、UDCA-3,7-二硫酸酯、甘氨-UDCA-3-硫酸酯、甘氨-UDCA-7-硫酸酯、甘氨-UDCA-3,7-二硫酸酯、?；?UDCA-3-硫酸酯、?；?UDCA-7-硫酸酯、?；?UDCA-3,7-二硫酸酯及其混合體。
3.如權(quán)利要求1所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其中，所述硫酸酯選自UDCA-3-硫酸酯、UDCA-7-硫酸酯、UDCA-3,7-二硫酸酯及其混合體。
4.如權(quán)利要求1所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其中，所述硫酸酯選自UDCA-7-硫酸酯、UDCA-3,7-二硫酸酯及其混合體。
5.如權(quán)利要求1所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其中，所述硫酸酯以有效抑制或治療消化道炎癥的量存在。
6.如權(quán)利要求5所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其中，所述炎癥選自小腸的炎癥、大腸的炎癥及其混合炎癥。
7.如權(quán)利要求5所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其中，所述炎癥選自結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸瘤、結(jié)腸瘤、結(jié)腸癌變、直腸癌變、潰瘍性結(jié)腸炎、息肉狀腺瘤、家族性息肉病及其混合炎癥。
8.如權(quán)利要求1所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其中，所述硫酸酯以有效抑制或治療肝臟炎癥的量存在。
9.如權(quán)利要求1所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其中，所述硫酸酯以有效地轉(zhuǎn)UDCA運(yùn)量至哺乳動物大腸的量存在。
10.如權(quán)利要求9所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其中，所述硫酸酯包括C-7碳上有一硫酸酯基，與UDCA或一種C-7碳上無硫酸酯基的UDCA硫酸酯將UDCA轉(zhuǎn)運(yùn)至大腸相比，所述硫酸酯以更有效地將UDCA轉(zhuǎn)運(yùn)至哺乳動物大腸的量存在。
11.如權(quán)利要求1所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其用于抑制UDCA的腸道吸收。
12.如權(quán)利要求1所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其用于抑制UDCA及其代謝物的腸道生物轉(zhuǎn)化。
13.如權(quán)利要求12所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其用于抑制UDCA及其代謝物的腸道細(xì)菌降解生物轉(zhuǎn)化。
14.如權(quán)利要求13所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其用于抑制UDCA及其代謝物的腸道7α-羥基化生物轉(zhuǎn)化。
15.如權(quán)利要求1所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其中，所述硫酸酯包括C-7碳上有一硫酸酯基，所述組合物降低結(jié)腸中石膽酸及其鹽和去氧膽酸及其鹽的量。
16.如權(quán)利要求1所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其中，所述硫酸酯包括C-7碳上有一硫酸酯基，所述組合物將UDCA轉(zhuǎn)運(yùn)至結(jié)腸但不明顯增加結(jié)腸中石膽酸及其鹽與去氧膽酸及其鹽的比例。
17.如權(quán)利要求1所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其用于改善肝臟疾病和肝功能的血清生化性質(zhì)。
18.如權(quán)利要求17所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其中，所述血清生化性質(zhì)包括選自丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酯酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酸及其混合體的酶的血清濃度。
19.如權(quán)利要求1所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其用于增加膽汁流量。
20.如權(quán)利要求1所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其用于降低選自磷脂、膽固醇及其混合體的脂類的膽汁分泌。
21.如權(quán)利要求1所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其中，所述組合物被制成灌注隔離器官的制劑。
22.權(quán)利要求21所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其中，所述隔離器官選自肝臟、肺、腎和腸。
23.權(quán)利要求1所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其為口服、局部或靜脈給藥的劑型。
24.如權(quán)利要求8所述的藥理學(xué)可接受的組合物，其為靜脈給藥的劑型。
25.一種向哺乳動物傳輸3α,7β-二羥基-5β-膽烷-24-酸(UDCA)以抑制或治療疾病的方法，其包括以下步驟以有效抑制或治療所述疾病的劑量向哺乳動物給藥UDCA硫酸酯。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯選自UDCA-3-硫酸酯、UDCA-7-硫酸酯、UDCA-3,7-二硫酸酯、甘氨-UDCA-3-硫酸酯、甘氨-UDCA-7-硫酸酯、甘氨-UDCA-3,7-二硫酸酯、?；?UDCA-3-硫酸酯、?；?UDCA-7-硫酸酯、?；?UDCA-3,7-二硫酸酯及其混合體。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯選自UDCA-3-硫酸酯、UDCA-7-硫酸酯、UDCA-3,7-二硫酸酯及其混合體。
28.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯選自UDCA-7-硫酸酯、UDCA-3,7-二硫酸酯及其混合體。
29.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述疾病為消化道的炎癥。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述炎癥選自小腸的炎癥、大腸的炎癥及其混合炎癥。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述炎癥選自結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸瘤、結(jié)腸瘤、結(jié)腸癌變、直腸癌變、潰瘍性結(jié)腸炎、息肉狀腺瘤、家族性息肉病及其混合炎癥。
32.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述疾病為肝臟的炎癥。
33.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯以有效地將UDCA轉(zhuǎn)運(yùn)至所述哺乳動物大腸的量給藥。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述硫酸酯包括C-7碳上有一硫酸酯基，與UDCA或一種C-7碳上無硫酸酯基的UDCA硫酸酯將UDCA轉(zhuǎn)運(yùn)至大腸相比，所述硫酸酯以更有效地將UDCA轉(zhuǎn)運(yùn)至所述哺乳動物大腸的量給藥。
35.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述方法抑制UDCA的腸道吸收。
36.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述方法抑制UDCA及其代謝物的腸道生物轉(zhuǎn)化。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述方法抑制UDCA及其代謝物的腸道細(xì)菌降解生物轉(zhuǎn)化。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述方法抑制UDCA及其代謝物的腸道7α-羥基化生物轉(zhuǎn)化。
39.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯包括C-7碳上有一硫酸酯基，所述硫酸酯以足夠降低結(jié)腸中石膽酸及其鹽和去氧膽酸及其鹽的量給藥。
40.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯包括C-7碳上有一硫酸酯基，所述硫酸酯以足夠?qū)DCA轉(zhuǎn)運(yùn)至結(jié)腸但不明顯增加結(jié)腸中石膽酸及其鹽與去氧膽酸及其鹽的比例的量給藥。
41.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述疾病為肝臟疾病，所述硫酸酯以足夠改善肝臟疾病和肝功能的血清生化性質(zhì)的量給藥。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述血清生化性質(zhì)包括選自丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酯酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酸及其混合體的酶的血清濃度。
43.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯以足夠增加膽汁流量的量給藥。
44.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯以足夠降低選自磷脂、膽固醇及其混合體的脂類的膽汁分泌的量給藥。
45.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，所述硫酸酯以選自口服、局部或靜脈給藥及其混合方式給藥。
46.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述硫酸酯以靜脈注射給藥。
47.一種維持隔離器官的方法，其包括以下步驟向所述隔離器官灌注3α,7β-二羥基-5β-膽烷-24-酸(UDCA)的硫酸酯。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述隔離器官選自肝臟、肺、腎和腸。
全文摘要
本發(fā)明的一個方面涉及一種藥理學(xué)可接受的組合物,其包含:一種3α,7β－二羥基－5β－膽烷－24－酸(UDCA)的硫酸酯和一種藥理學(xué)可接受的載體。在優(yōu)選組合物中,所述硫酸酯為UDCA－3－硫酸酯、UDCA－7－硫酸酯、UDCA－3,7－二硫酸酯、甘氨－UDCA－3－硫酸酯、甘氨－UDCA－7－硫酸酯、甘氨－UDCA－3,7－二硫酸酯、牛磺－UDCA－3－硫酸酯、?；牵璘DCA－7－硫酸酯、牛磺－UDCA－3,7－二硫酸酯及其混合體。本發(fā)明另一方面涉及一種向哺乳動物傳輸U(kuò)DCA以抑制或治療疾病的方法,其包括以有效抑制或治療所述疾病的劑量向哺乳動物給藥UDCA硫酸酯。例如,UDCA硫酸酯可用于抑制或治療消化道的炎癥如結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸瘤、結(jié)腸瘤、結(jié)腸癌變、直腸癌變、潰瘍性結(jié)腸炎、息肉狀腺瘤、家族性息肉病等。還可給藥UDCA來抑制或治療肝臟的炎癥。UDCA硫酸酯可用于改善肝臟疾病或肝臟功能的血清生化性質(zhì),增加膽汁流量,或降低磷脂或膽固醇的膽汁分泌。另一方面,本發(fā)明還涉及通過用UDCA硫酸酯灌注器官來維持隔離器官的方法。
文檔編號A61K47/24GK1211185SQ96199708
公開日1999年3月17日 申請日期1996年11月19日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月21日
發(fā)明者肯尼斯·D·R·塞徹爾 申請人:兒童醫(yī)院醫(yī)療中心