專利名稱：定向治療變應(yīng)性應(yīng)答的Fcε－PE嵌合蛋白及制法和含有它的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體涉及治療變應(yīng)性應(yīng)答的新方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及定向消除FcεRI表達(dá)細(xì)胞的Fcε-PE嵌合蛋白，它的生產(chǎn)方法，以及含有它的藥物組合物。該嵌合蛋白包括與細(xì)胞殺傷部分連接的IgE分子一部分的細(xì)胞導(dǎo)向部分，所述殺傷部分可識(shí)別和消滅超量表達(dá)特異性受體的細(xì)胞。用于本發(fā)明的嵌合蛋白中的殺傷部分是細(xì)菌毒素假單胞菌屬(Pseudomonas)外毒素(PE)(銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的產(chǎn)物)。
世界人口的約百分之二十患有各種變應(yīng)性疾病如哮喘、變應(yīng)性鼻炎、食物過(guò)敏、特應(yīng)性皮炎和過(guò)敏癥。過(guò)去十年中變應(yīng)性疾病流行的驚人的增多已導(dǎo)致明確需要更有效的療法。
IgE和肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞間的相互作用是變應(yīng)性應(yīng)答中的主要效應(yīng)途徑。IgE結(jié)合高親和性受體(FcεRI)的恒定區(qū)，幾乎全部見于這些細(xì)胞的表面。雖然解離速度低，但結(jié)合作用本身不會(huì)刺激細(xì)胞。然而，細(xì)胞表面結(jié)合的IgE被多價(jià)抗原交聯(lián)會(huì)引起受體凝聚，觸發(fā)爆發(fā)性細(xì)胞脫粒由此變態(tài)反應(yīng)介體如細(xì)胞脫粒由此釋放變態(tài)反應(yīng)介體如組胺和5-羥色胺(seretonin)。
FcεRI受體的分布限于參加變應(yīng)性應(yīng)答的細(xì)胞這一事實(shí)使它成為利用嵌合細(xì)胞毒素的定向免疫療法的有吸引力候選物。嵌合細(xì)胞毒素是一類通過(guò)基因融合技術(shù)構(gòu)建的新型定向分子。這些分子包括細(xì)胞導(dǎo)向部分和細(xì)胞殺傷部分，使它們能識(shí)別和消滅超量表達(dá)特異性受體的細(xì)胞。
用于嵌合蛋白構(gòu)建物的細(xì)菌毒素假單胞菌屬外毒素(PE)，是銅綠假單胞菌的產(chǎn)物。進(jìn)入胞質(zhì)后，PE通過(guò)它的ADP-核糖基化活性抑制蛋白質(zhì)合成，于是引起細(xì)胞死亡(Middlebrook，J.I.，和Dorland，R.B.1984.Bacterial toxinscellular mechanisms of action.Microbiol.Rev.48，199.)。有效的嵌合細(xì)胞毒素已通過(guò)將編碼各種生長(zhǎng)因子或單鏈抗體的cDNAs與缺乏內(nèi)在細(xì)胞結(jié)合能力的PE衍生物融合而構(gòu)建。這些嵌合蛋白之一稱為IL2-PE40，被構(gòu)建以導(dǎo)向和選擇性地消除超量表達(dá)IL2受體的活化T細(xì)胞，已證實(shí)能在自身免疫病、移植物排異反應(yīng)和癌的各種模型中提供有效的和選擇性的免疫抑制作用(Lorberboum-Galski，H.1994.Interleukin 2-Pseudomonas exotoxin A(IL2-PE40)chimeric proteinfor targeted immunotherapy and the study of immune responses.J.Toxicol.-Toxin Rewiews，13(1)，105.)。
在細(xì)菌中表達(dá)的IgE的整個(gè)重組恒定區(qū)(Fcε)對(duì)FcεRI受體的親和性，比得上天然IgE的，以及具有敏化嗜堿性粒細(xì)胞關(guān)于抗IgE誘導(dǎo)的組胺釋放的能力。當(dāng)測(cè)試在細(xì)菌中表達(dá)的人Fcε的重組片段的受體結(jié)合性時(shí)，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)于該恒定區(qū)的域2和域3接頭處殘基301-376的肽足以高親和性地結(jié)合該受體。還有人報(bào)道了受體結(jié)合不需ε鏈二聚化(Helm，B.，Marsc，P.，Vercelli，D.，Padlan，E.，Gould，H.，和Geha，R.1988.The mast cell binding site on human immunoglobulin E.Nature331，180.)。
本發(fā)明大體涉及治療變應(yīng)性應(yīng)答的新方法。目前，用于治療哮喘和變應(yīng)性疾病的主要已知藥物有如下幾類1.β2興奮劑-通過(guò)刺激β2腎上腺受體引起氣道擴(kuò)張。
2.甲基黃嘌呤(Methylxantines)-平滑肌松弛藥，引起支氣管擴(kuò)張。
3.糖皮質(zhì)素-減輕炎癥。
4.色甘酸鈉-防止肥大細(xì)胞脫粒。
5.抗組胺藥-防止組胺作用于它的靶細(xì)胞。
雖然已廣為應(yīng)用，但這些藥物具有下列顯著的缺點(diǎn)1.特異性所有這些藥物(色甘酸鈉除外)的作用都不是肥大細(xì)胞特異性的。因此，它們不能防止變態(tài)反應(yīng)介體的釋放，而是顛倒或阻止由它們的作用引起的效果。這些藥物是根據(jù)癥狀而治療的，它只在變應(yīng)性反應(yīng)開始后才開始作用，所以不能用于預(yù)防方面。
2.毒性由于不是特異性的，所以這些藥物作用于各種組織和器官會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。β2興奮劑的主要副作用是震顫，但它們還可引起心臟的心律失常；甲基黃嘌呤刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起神經(jīng)質(zhì)、惡心、嘔吐、厭食、頭痛和心肌引起的心搏過(guò)速。在高血漿含量時(shí)存在癲癇發(fā)作和心律失常的危險(xiǎn)?？菇M胺藥影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)起鎮(zhèn)靜作用。類固醇最有害，可抑制垂體的-腎上腺的作用，引起液體和電解質(zhì)失調(diào)，引起高血壓、血糖過(guò)多，增大對(duì)感染的敏感性，引起骨質(zhì)疏松癥以及阻止兒童的生長(zhǎng)。
3.效果的持久性β-腎上腺素能興奮劑、氨基黃嘌呤(aminoxantines)和抗組胺藥大多數(shù)是短期作用藥物，所以必須經(jīng)常施用。類固醇是長(zhǎng)期作用藥物，也具有長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間，所以對(duì)于急癥價(jià)值很小。
僅有的肥大細(xì)胞特異性藥物是色甘酸鈉。該藥物可用作預(yù)防藥，基本上沒(méi)有副作用。然而，它的半壽命很短，誘導(dǎo)時(shí)間很長(zhǎng)，它只能局部應(yīng)用并且只有部分病人能響應(yīng)它。所有這些使色甘酸鈉的應(yīng)用很有限。
近年來(lái)已報(bào)道了一些關(guān)于干擾IgE和它的高親和性受體之間相互作用的嘗試，作為抗變態(tài)反應(yīng)療法的基礎(chǔ)。業(yè)已研究了作為IgE-FcεRI相互作用的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的重組肽，它們包括來(lái)自IgE(Helm，B.，Kebo，D.，Vercelli，D.，Glovsky，M.M.，Gould，H.，Ishizaka，K.，Geha，R.，和Ishizaka，T.1989.Blocking the passive sensatization of human mastcells and basophil granolocytes with IgE antibodies by a recombinanthumanε-chain fragment of 76 amino acids.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，9465.)或FcεRI(Ra，C.，Kuromitsu，s.，Hirose，T.，Yasuda，S.，F(xiàn)uruichi，K.，和Okumura，K.1993.Soluble human high affinityreceptor for IgE abrogates the IgE-mediated allergic reaction.Int.Immunol.5，47.；Haak-Frendscho，M.，Ridgway，J.，Shields，R.，Robbins，K.，Gorman，C.，和Jardieu，P.1993.Human IgE receptor a-chain IgGchimera blocks passive cutaneous anaphylaxis reaction in vivo.J.Immunol.151，351.)的結(jié)構(gòu)元件。還試驗(yàn)了生成的單克隆抗體，它們抗IgE(Baniyash，M.，和Eshhar，Z.1984.Inhibition of IgE binding to mastcells and basophils by monoclonal antibodies to murine IgE.Eur.J.Immunol.14，799)或FcεRI(Kitani，S.，Kraft，D.，F(xiàn)ischler，C.，Mergenhagen，S.E.，和Siraganian，R.P.1988.Inhibition of allergicreactions with monoclonal antibody to the high affinity IgE receptor.J.Immunol.140，2585.)，能阻止IgE與受體的結(jié)合而不會(huì)引起肥大細(xì)胞脫粒。然而，IgE對(duì)FcεRI的親和性很高(KM＝10-10M)，所以一旦與它的受體結(jié)合，IgE分子就保持與細(xì)胞膜連接達(dá)數(shù)周。此外，肥大細(xì)胞能在低受體占據(jù)下活化少到5％的受體的交聯(lián)度就足以引起肥大細(xì)胞脫粒。該系統(tǒng)的這兩項(xiàng)性能妨礙競(jìng)爭(zhēng)劑的抑制作用，因此限制它們的臨床價(jià)值。我們的抗變態(tài)反應(yīng)分子在遠(yuǎn)為更小的程度上依賴于同IgE競(jìng)爭(zhēng)的能力。一旦通過(guò)非占據(jù)的IgE受體進(jìn)入靶細(xì)胞，該嵌合蛋白就影響靶細(xì)胞。此外，受體在肥大細(xì)胞成熟過(guò)程中的早期表達(dá)，會(huì)使得在未成熟的靶細(xì)胞能釋放介體之前而消除它們。由于受體不是在干細(xì)胞上表達(dá)的，所以大體上未損壞骨髓。
IgE系統(tǒng)相當(dāng)復(fù)雜且性質(zhì)多種多樣。IgE及其結(jié)合結(jié)構(gòu)之間的相互作用除變應(yīng)性應(yīng)答之外還有很多功能，其中的一些剛開始出現(xiàn)?？笽L-4的單克隆抗體、IL-4受體或低親和性IgE受體消除IgE在小鼠內(nèi)的表達(dá)但具有更普遍的免疫抑制效果。因此本發(fā)明(其中高親和性IgE受體而不是整個(gè)IgE系統(tǒng)被定向)的優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的。
本發(fā)明大體涉及治療變應(yīng)性應(yīng)答的新方法，它基于通過(guò)嵌合細(xì)胞毒素Fc2’-3-PE40而定向消除表達(dá)FcεRI受體的細(xì)胞。編碼小鼠IgE分子Fc區(qū)的氨基酸301-437的序列被遺傳融合至PE40-缺乏細(xì)胞結(jié)合域的PE截短了的形式。產(chǎn)生于大腸桿菌(E.coli.)的該嵌合蛋白，特異性地且有效地殺傷表達(dá)FcεRI受體的小鼠肥大細(xì)胞系，以及得自骨髓的初級(jí)肥大細(xì)胞。
本發(fā)明提供了定向消除FcεRI表達(dá)細(xì)胞的嵌合蛋白，它特別適用于治療變應(yīng)性應(yīng)答。所述嵌合蛋白包括FcεRI表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞導(dǎo)向部分和細(xì)胞殺傷部分。優(yōu)選的殺傷部分是細(xì)菌毒素假單胞菌屬外毒素(PE)。該假單胞菌屬外毒素是銅綠假單胞菌的產(chǎn)物。
本發(fā)明還涉及制備所述蛋白質(zhì)的方法。該嵌合蛋白是通過(guò)將小鼠IgE分子的Fc區(qū)與PE40(缺乏細(xì)胞結(jié)合域的PE截短了的形式)遺傳融合而制備的。
本發(fā)明還提供了用于治療變應(yīng)性疾病以及治療增生癥和惡性腫瘤的藥物組合物，它包括上述嵌合蛋白作為活性成分和常規(guī)的佐劑產(chǎn)品。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備這些藥物組合物的方法，它包括將小鼠IgE分子的Fc區(qū)與PE40遺傳融合以及，如果需要的話，添加常規(guī)的佐劑產(chǎn)品。本發(fā)明的藥物組合物可呈用于注射、局部施藥或口服的任意合適的形式。
與現(xiàn)有已知藥物相比，本發(fā)明的Fc-PE嵌合蛋白具有如下一些優(yōu)點(diǎn)1.特異性Fc-PE是高度特異性的，影響負(fù)責(zé)釋放變應(yīng)性介體的細(xì)胞(肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)。由于它可防止變應(yīng)性侵襲，所以它作為預(yù)防性療法有很大的價(jià)值。
2.毒性由于它作用于效應(yīng)細(xì)胞(affector cells)而不是作用于它的靶器官，所以如果有的話，F(xiàn)c-PE也只有很小的副作用。此外，由于該受體不是在干細(xì)胞上表達(dá)的，所以可預(yù)測(cè)它不會(huì)損壞骨髓和沒(méi)有免疫抑制作用。預(yù)計(jì)在治療結(jié)束后的數(shù)周以內(nèi)會(huì)重新出現(xiàn)正常的生理狀態(tài)。
3.效果的持久性因?yàn)榉蚀蠹?xì)胞需經(jīng)歷數(shù)周才能成熟，所以可預(yù)計(jì)Fc-PE的效果是長(zhǎng)期的，不需經(jīng)常施用。此外，由于體外研究指出，在不到4小時(shí)內(nèi)觀察到細(xì)胞蛋白質(zhì)合成減少80％，所以預(yù)計(jì)Fc-PE的誘導(dǎo)時(shí)間比較短，使它可應(yīng)用于急性期變應(yīng)性反應(yīng)中。
Fcε-PE還可適用于治療肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的增生癥和惡性腫瘤，如全身性肥大細(xì)胞增生病(呈良性和惡性形式)和嗜堿細(xì)胞性白血病?；煵贿m于良性肥大細(xì)胞增生病患者，因?yàn)樗袊?yán)重的副作用。另一方面，沒(méi)有良好的治療惡性病的臨床方案。Fcε-PE嵌合蛋白具有高度的潛能和選擇性，能用于涉及表達(dá)FcεRI受體的細(xì)胞的良性病和惡性病。
下述實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出，本發(fā)明的Fc2’-3-PE40嵌合蛋白是有效的和選擇性的變態(tài)反應(yīng)療法中有希望的候選物。
本發(fā)明提供了用于定向消除FcεRI表達(dá)細(xì)胞的Fcε-PE嵌合細(xì)胞毒素蛋白，特別適用于治療變應(yīng)性應(yīng)答如哮喘、變應(yīng)性鼻炎、食物過(guò)敏、特應(yīng)性皮炎和過(guò)敏癥。
本發(fā)明將通過(guò)下列實(shí)驗(yàn)而得以進(jìn)一步詳細(xì)描述。這些實(shí)驗(yàn)不是想限定本發(fā)明的范圍而只是演示和闡釋它。
1.Fcε-PE40嵌合蛋白的構(gòu)建。
小鼠IgE恒定區(qū)的片段(Fcε)被用作嵌合蛋白的導(dǎo)向部分，因?yàn)樗Y(jié)合人高親和性IgE受體和小鼠高親和性IgE受體(Conrad，D.H.，Wingard，J.R.，和Ishizaka，T.1983 The interaction of human androdent IgE with the human basophil IgE receptor.J.Immunol.130，327.)。
我們應(yīng)用相應(yīng)于a.a.301-437的一條序列，它包含區(qū)域2的COOH端和整個(gè)區(qū)域3(C2’-C3)。我們還應(yīng)用相應(yīng)于a.a.225-552的一條序列，它包含全部C2-C4區(qū)域。這些片段的cDNA是應(yīng)用從小鼠B細(xì)胞分離的RNA和一特定的引物組通過(guò)RT-PCR而得到的，所述小鼠B細(xì)胞被同位素轉(zhuǎn)換以分泌IgE。應(yīng)用抗-Thy1.2和兔補(bǔ)體通過(guò)負(fù)選擇分離得自6周齡BALB/C小鼠的脾的B細(xì)胞。在脂多糖(LPS，10μg/ml)和IL4(500u/ml)存在下以2×106個(gè)細(xì)胞/ml的密度將細(xì)胞培養(yǎng)5天以誘導(dǎo)同種型轉(zhuǎn)換而生產(chǎn)IgE。5天后，分離全部細(xì)胞RNA(由BIOTECK Laboratories，Houston，USA生產(chǎn)的RNAzol TM B分離試劑盒)。然后應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega，USA)在生產(chǎn)廠商建議的條件下將全部RNA(2.5μg)逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。用TE緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.6，1mM EDTA)將cDNA稀釋成總體積為1ml后在4℃下貯存?zhèn)溆谩?br> Fcε片段是應(yīng)用cDNA和一對(duì)合成的寡核苷酸引物通過(guò)PCR產(chǎn)生的，這對(duì)引物是用于Fcε2’-3序列的5’-GCG GAT CCC ATA TGG AGCAAT GGA TGT CGT-3’(有義，起始于核苷酸406，根據(jù)基因庫(kù)序列J00476)和5’-GCG GAT CCC ATA TGT GGG GTC TTG GTG ATGGAA C-3’(反義，起始于核苷酸813)以及用于Fcε2-4序列的5’-GCGGAT CCC ATA TGC GAC CTG TCA ACA TCA CTG-3’(有義，起始于核苷酸175)和5’-GCG GAT CCC ATA TGG GAG GGA CGG AGGGAG G-3’(反義，起始于核苷酸1167)。
合成的寡核苷酸是在Applied Biosystems DNA合成儀上合成并在寡核苷酸純化柱體上純化的。將Vent聚合酶(Biolabs)用于擴(kuò)增。將反應(yīng)混合物在DNA熱循環(huán)儀(MJ Research，Inc，USA)中保溫33次循環(huán)。每次循環(huán)包括在95℃下1min.，在退火溫度下1min.和在72℃2min。用于每個(gè)引物對(duì)的MgSO4濃度和退火溫度為對(duì)于Fc2’-3’是2.5mM和61℃，對(duì)于Fc2-4是2mM和57℃。
編碼IL2-PE40的pHL 906質(zhì)粒以前已被描述過(guò)(Fishman，A.，Bar-Kana，Y.，Steinberger，I.，和Lorberboum-Galski，H.1994.Increased cytotoxicity of IL2-PE chimeric proteins containing targetingsignal for lysosomal membranes，Biochem.33，6235.)。用Ndel切割pHL906質(zhì)粒，得更大的3596bp片段。將上述Fcε片段插入pHL906的Ndel位點(diǎn)。所得質(zhì)粒pAF 2302和pAF 2415分別編碼C2’-C3片段和C2-C4片段，各自融合PE40的5’，這兩種質(zhì)粒通過(guò)限制酶切分析和序列分析而表征(未示出結(jié)果)。應(yīng)用大腸桿菌菌株HB101來(lái)轉(zhuǎn)化和制備這些質(zhì)粒。
2.嵌合蛋白的表達(dá)和部分純化由質(zhì)粒pAF 2302編碼的新設(shè)計(jì)的嵌合蛋白Fcε-PE40是在大腸桿菌菌株BL21(λ-DE3)內(nèi)表達(dá)的，該大腸桿菌菌株攜帶了呈溶源性和可誘導(dǎo)形式的T7 RNA聚合酶基因。在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG，最終濃度為1mM)存在下在O.D.6000.5時(shí)誘導(dǎo)180min。將一片表達(dá)細(xì)胞懸浮于含0.2mg/ml溶菌酶(lysosyme)的TE緩沖液(50mM Tris pH8.0，1mM EDTA)，聲波處理(三個(gè)30s脈沖)再在30,000×g下離心30min。分出上清液(可溶性部分)并保存供分析用。將離心片置于提取緩沖液(6M鹽酸胍，0.1M Tris pH8.6，1mM EDTA，0.05M NaCl和10mM DTT)中變性并在4℃下攪拌30min。在30,000×g下離心該懸浮液達(dá)15min使它變清亮，棄去離心片。然后將上清液對(duì)0.1MTris(pH8.0)、1mM EDTA、0.25mM NaCl和0.25mM L-精氨酸透析16h。在15,000×g下離心該透析液達(dá)15min，將所得上清液(不溶性部分，鹽酸胍處理過(guò))用作嵌合蛋白來(lái)源。應(yīng)用凝膠電泳法鑒定蛋白質(zhì)(圖2)。整個(gè)細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)分布圖顯示了該嵌合蛋白的高表達(dá)水平。
通過(guò)Western印跡分析應(yīng)用抗PE的抗體(圖3A)和抗IgE的抗體(Serotec，England)(圖3B)進(jìn)一步鑒定該蛋白質(zhì)。將電泳后的樣品轉(zhuǎn)到硝酸纖維素上并按所述方法(Lorberboum-Galski，H.，F(xiàn)itzgerald，D.J.，Chaudhary V.，Ashya，S.，和Pastan，I.1988.Cytotoxicactivity of an interleukin 2-Pseudomonas exotoxin chimeric proteinproduced in Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，1992.)進(jìn)行免疫印跡分析。按生產(chǎn)廠商的說(shuō)明使用Vectastain ABC試劑盒(VectorLaboratories，USA)。該嵌合體與兩種抗體反應(yīng)，于是證實(shí)了框內(nèi)的全長(zhǎng)嵌合蛋白的克隆和產(chǎn)生。
表達(dá)細(xì)胞的亞細(xì)胞分級(jí)揭示了不溶性部分(包含體)尤其富含嵌合蛋白(圖2)。因此將該部分用作嵌合蛋白的來(lái)源。
如前所述，應(yīng)用富合作底物的延伸因子2的小麥胚提取物測(cè)定試驗(yàn)樣品的ADP-核糖基化活性，表明該新型嵌合蛋白是酶促活潑的(未示出結(jié)果)。
3.Fc2’-3-PE40嵌合蛋白對(duì)小鼠肥大細(xì)胞系的效應(yīng)。
測(cè)試了該嵌合蛋白對(duì)各種已知能表達(dá)FcεRI受體的小鼠肥大細(xì)胞系的細(xì)胞毒性效應(yīng)。通過(guò)蛋白質(zhì)合成的抑制作用估測(cè)該嵌合蛋白的細(xì)胞毒性活性，用[3H]亮氨酸摻入測(cè)定。用含0.25％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水稀釋后，不同濃度的該嵌合蛋白被加入接種于96孔板中達(dá)20h的2×104個(gè)細(xì)胞/0.2ml，接著用2μCi[3H]-亮氨酸脈沖處理8h。結(jié)果以對(duì)比實(shí)驗(yàn)的百分?jǐn)?shù)表示，對(duì)比實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞未接觸該嵌合蛋白。所有分析都在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中重復(fù)進(jìn)行三次。
應(yīng)用了表達(dá)FcεRI受體的三個(gè)靶細(xì)胞系MC-9，一種來(lái)源于胎小鼠肝且依靠IL3生長(zhǎng)的肥大細(xì)胞系；C57，一種來(lái)源于小鼠骨髓不依賴于IL3的肥大細(xì)胞系；以及來(lái)源于小鼠中期受孕(midgestation)初期胎盤的、Abelson病毒轉(zhuǎn)化的肥大細(xì)胞系。
發(fā)現(xiàn)Fcε-PE40對(duì)試驗(yàn)的所有細(xì)胞系以劑量依賴性方式呈細(xì)胞毒性(圖4)。MC-9系和C57系對(duì)嵌合毒素特別敏感，它們的ID50分別為50-75ng/ml和100-125ng/ml。Abelson細(xì)胞系的敏感性要小得多(ID50為1200-1500ng/ml)。
4.Fcε-PE40應(yīng)答的特異性為了檢驗(yàn)Fc2’-3-PE40活性的特異性，產(chǎn)生兩種對(duì)比蛋白質(zhì)PE40和Fc2’-3-PE40M，估測(cè)它們對(duì)靶細(xì)胞和非靶細(xì)胞的效應(yīng)。為構(gòu)建Fc2’-3-PE40M，用EcoRI和BamHI切割編碼PE的C端122個(gè)氨基酸的區(qū)，并用在氨基酸553處有缺失的相應(yīng)片段置換。
正如所料，沒(méi)有內(nèi)在導(dǎo)向能力的PE40對(duì)靶細(xì)胞系無(wú)影響(圖4)。Fc2’-3-PE40M(它的Fc2’-3部分與突變的、酶促惰性形式PE40連接)也對(duì)靶細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性(圖4)。
此外，有可能通過(guò)整個(gè)小鼠IgE(40μg/ml，圖5A)或通過(guò)αPE多克隆抗體(10μg/ml，圖5B)阻止Fc2’-3-PE40對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
還測(cè)試了Fc2’-3-PE40對(duì)小鼠各種非靶細(xì)胞系的影響(表1)。造血源的所有細(xì)胞系都未受嵌合蛋白的影響。意外地發(fā)現(xiàn)，雖然成纖維細(xì)胞系和血腫細(xì)胞系的ID50值比MC-9細(xì)胞的值高20倍，但它們對(duì)嵌合毒素表現(xiàn)出一定的敏感性(表1)。
上述信息表明，F(xiàn)c2’-3-PE40對(duì)肥大細(xì)胞系的毒性效果是由于Fc2’-3部分介導(dǎo)的特異性響應(yīng)的緣故，所述Fc2’-3部分將嵌合體的細(xì)胞毒性部分(PE40)導(dǎo)向細(xì)胞。
5.嵌合蛋白對(duì)初級(jí)肥大細(xì)胞的作用。
看來(lái)得自建立的各細(xì)胞系的新鮮鼠肥大細(xì)胞反應(yīng)各不相同，我們還測(cè)試了得自正常小鼠的初級(jí)肥大細(xì)胞對(duì)Fc2’-3-PE40的敏感性。在IL3存在下培養(yǎng)二周后，小鼠骨髓分化成幾乎純的細(xì)胞群，它們具有未成熟肥大細(xì)胞的形態(tài)，含有顆粒并表達(dá)FcεRI受體。
殺死4～6周大小的BALB/C小鼠，使它們的骨髓在無(wú)菌下從股骨涌入冷的0.9％NaCl。用0.9％NaCl將細(xì)胞懸浮液洗兩次，在300×g下離心10min，最后重懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中含10％熱滅活的胎牛血清、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉(sodiumpiruvate)、0.1mM非必需氨基酸、5×10-5M β-巰基乙醇、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和20u/ml重組小鼠IL3。以106個(gè)細(xì)胞/ml的密度將細(xì)胞置于37℃的組織培養(yǎng)瓶中在5％CO2加濕的氣氛中生長(zhǎng)2-3周。每7天更換一次培養(yǎng)基。從第7天開始在培養(yǎng)物中加入重組IL4(10u/ml)。
為觀察成熟程度，將細(xì)胞固定在載玻片上，用酸性甲苯胺藍(lán)(pH1.0)染色后在油浸顯微鏡下觀測(cè)。
在培養(yǎng)的第16天測(cè)試了嵌合蛋白對(duì)得自骨髓的肥大細(xì)胞(BMMC)的影響。如圖6所示，F(xiàn)c2’-3-PE40對(duì)BMMC以劑量依賴性方式表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，ID50為125ng/ml。在高嵌合蛋白劑量時(shí)，幾乎100％抑制蛋白質(zhì)合成。對(duì)比蛋白質(zhì)Fc2’-3-PE40M或PE40都未對(duì)BMMC表現(xiàn)細(xì)胞毒性(圖6)。因此，初級(jí)肥大細(xì)胞對(duì)嵌合蛋白的應(yīng)答類似于建立的肥大細(xì)胞系(圖4和圖6)。
6.Fc2’-3-PE40的受體特異性除了高親和性FcεRI受體外，還報(bào)道了其它三種低親和性結(jié)合IgE的膜表面結(jié)構(gòu)-低親和性FcεRII受體、εBP半乳糖苷結(jié)合蛋白(也稱為MAC-2或CBP35)和FcγRII/III受體。這些結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在各類細(xì)胞上，主要是造血源細(xì)胞，但也出現(xiàn)在成纖維細(xì)胞(εBP)上。除了FcεRI之外，F(xiàn)cγRII/III和εBP也出現(xiàn)在肥大細(xì)胞膜上。由于我們的目標(biāo)是只定向肥大細(xì)胞，所以重要的是要證實(shí)嵌合蛋白不識(shí)別這些結(jié)構(gòu)因此不能通過(guò)它們被內(nèi)化。理論上，我們的嵌合蛋白不符合低親和性IgE結(jié)合結(jié)構(gòu)FcεRII、εBP和FcγRII/III的結(jié)合要求。FcεRII只結(jié)合二硫鍵連接的ε鏈二聚物，而我們的蛋白質(zhì)缺乏對(duì)二聚化極為重要的區(qū)域4。εBP只結(jié)合糖基化的IgE；由于Fc2’-3-PE40是在細(xì)菌內(nèi)產(chǎn)生的，所以它不被糖基化。FcγRII/III結(jié)合IgE-免疫復(fù)合體而不結(jié)合游離的IgE。然而受體結(jié)合的問(wèn)題通過(guò)實(shí)驗(yàn)解決。
對(duì)已知能表達(dá)除FcεRI外的這些受體的C57肥大細(xì)胞進(jìn)行了關(guān)于εBP和FcγRII/III的實(shí)驗(yàn)。為了測(cè)試該嵌合蛋白是否能通過(guò)FcγRII/III受體進(jìn)入細(xì)胞，在添加該嵌合蛋白之前將細(xì)胞與2.4G2抗體(Pharmigen)(50μg/m)預(yù)培養(yǎng)。能與FcγRII受體和FcγRIII受體的胞外域結(jié)合的該單克隆抗體被證實(shí)為IgE結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。從圖7A中可見，對(duì)比細(xì)胞以及與抗體預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)Fc2’-3-PE40的細(xì)胞應(yīng)答沒(méi)有差別。
我們隨后檢驗(yàn)了εBP是否與Fc2’-3-PE40的細(xì)胞毒性有關(guān)。由于εBP與膜糖決定子連接，所以在培養(yǎng)基中加入乳糖會(huì)導(dǎo)致它從細(xì)胞表面解離。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)存在或不存在乳糖(25mM，圖7B)時(shí)細(xì)胞對(duì)Fc2’-3-PE40的應(yīng)答沒(méi)有差別。
在2.4G2抗體和乳糖存在下另外對(duì)成纖維細(xì)胞系進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系對(duì)嵌合蛋白是部分應(yīng)答的(表1)。再次發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)c2’-3-PE40細(xì)胞毒性對(duì)處理的細(xì)胞和對(duì)比細(xì)胞沒(méi)有差別(未示出結(jié)果)。
為了檢測(cè)Fc2’-3-PE40是否影響攜帶FcεRII的細(xì)胞，我們應(yīng)用了0.12A3細(xì)胞系，即表達(dá)FcεRII受體的小鼠B細(xì)胞雜交瘤。甚至在高劑量(＞5000ng/ml，圖8A)時(shí)，0.12A3細(xì)胞也對(duì)Fc2’-3-PE40完全沒(méi)有應(yīng)答。由于該細(xì)胞系在長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)失去受體，所以該檢測(cè)之后用抗該受體的B3B4抗體(Pharmigin)進(jìn)行FACS分析。結(jié)果表明，該受體在54％的細(xì)胞上表達(dá)了(結(jié)果未示出)。
另外對(duì)新鮮的小鼠B脾細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，所述B細(xì)胞與LPS(50μg/ml)一起預(yù)培養(yǎng)16小時(shí)以刺激FcεRII的表達(dá)。由FACS分析測(cè)得，雖然有69％的細(xì)胞表達(dá)了該受體，但Fc2’-3-PE40對(duì)這些B脾細(xì)胞無(wú)影響(圖8B)。
總之，這些結(jié)果表明，F(xiàn)c2’-3-PE40不結(jié)合低親和性IgE結(jié)合的結(jié)構(gòu)，即FcεRII、FcγRII/III和εBP。
7.Fc2’-3-PE40對(duì)細(xì)胞脫粒的影響因?yàn)镕c2’-3-PE40可能的臨床應(yīng)用性，所以重要的是要測(cè)試用Fc2’-3-PE40處理肥大細(xì)胞是否會(huì)導(dǎo)致FcεRI被該嵌合蛋白結(jié)合時(shí)觸發(fā)的變應(yīng)性介體釋放。
將C57細(xì)胞用[3H]-羥色胺(10μci/ml)預(yù)標(biāo)記一夜，洗滌，以2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度于96孔組織培養(yǎng)板中置于含10％FCS的DMEM中，再在37℃下與Fc2’-3-PE40(10μg/ml)一起培養(yǎng)。在不同的時(shí)間點(diǎn)上，分離上清液并測(cè)定釋放入上清液中的5-羥色胺(seretonin)。將未標(biāo)記的細(xì)胞也與Fc2’-3-PE40一起培養(yǎng)，在相同的時(shí)間間隔用[3H]亮氨酸進(jìn)行脈沖處理1hr以測(cè)定嵌合毒素對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制。添加嵌合蛋白后1/2、4或8hr，在Fc2’-3-PE40處理過(guò)的細(xì)胞和未處理的細(xì)胞之間，上清液中[3H]5-羥色胺含量沒(méi)有差別(圖9A)。在4h時(shí)蛋白質(zhì)合成的抑制達(dá)80％，且8h時(shí)為90％(圖9B)。這些結(jié)果表明，在受體結(jié)合期間或在抑制蛋白質(zhì)合成時(shí)Fc2’-3-PE40不會(huì)導(dǎo)致釋放應(yīng)變性介體。
8.Fcε-PE40的電泳特征在非還原條件下對(duì)電泳處理過(guò)的樣品進(jìn)行Western印跡分析(從樣品緩沖液中除去2-巰基乙醇)表明Fc2’-3-PE40嵌合蛋白主要作為單體存在(

圖10b)。至于非變性PAGE，從樣品緩沖液中除去2-巰基乙醇，且未對(duì)樣品加熱。此外，用凝膠中等體積的水、樣品緩沖液和電極操作緩沖液置換SDS。在非變性條件下，該嵌合蛋白以寬帶形式(圖10c)泳動(dòng)。單獨(dú)的非變性系統(tǒng)不能區(qū)別分子量、電荷和構(gòu)象對(duì)蛋白質(zhì)電泳遷移率的影響。然而，泳道中分子的近似性指示它們?cè)谶@些參數(shù)方面不可能差別很大。
9.內(nèi)化分析該嵌合蛋白的體外活性只是靠它的內(nèi)化實(shí)現(xiàn)。為了測(cè)試該嵌合蛋白是否被內(nèi)化，在37℃下將5×105個(gè)細(xì)胞/3ml與20μg該嵌合蛋白一起培養(yǎng)1小時(shí)。用冷PBS洗滌3次后，將該片狀物用0.5ml酸溶液(0.15MNaCl，0.15M乙酸(pH3))在冰上處理3min以除去膜結(jié)合的嵌合蛋白。然后加入50％FCS中和該pH，接著用RPMI/10％FCS洗滌3次。用0.3ml RIPA裂解緩沖液(150mM NaCl，1mM EDTA，20mM tris-HClpH7.4，1mM苯甲基磺酰氟，15％SDS，1％脫氧膽酸(deoxycholycacid)，1％Nonidet P-40)裂解該細(xì)胞片狀物。各樣品經(jīng)過(guò)電泳后應(yīng)用α-PE和ECL檢測(cè)系統(tǒng)(Amersham)進(jìn)行免疫印跡分析。Western印跡分析揭示，F(xiàn)c2’-3-PE40嵌合蛋白無(wú)疑地被內(nèi)化入靶細(xì)胞(圖11)。
10.Fc2’-3-PE40對(duì)細(xì)胞脫粒的影響在37℃下將C57細(xì)胞與[3H]-羥色胺(10μci/ml)一起培養(yǎng)一夜。洗滌細(xì)胞3次以除去游離的[3H]-羥色胺，在Tyrod’s緩沖液(10mMHepes pH7.4，130mM NaCl，5mM KCl，5.6mM葡萄糖，0.5％BSA)中以2.5×105個(gè)細(xì)胞/0.5ml置于24孔組織培養(yǎng)板中，再在4℃下與IgE(10μg/ml)培養(yǎng)1小時(shí)。然后添加MgCl2和CaCl2至最終濃度分別為1mM和1.6mM，接著在37℃下與二硝基苯基-人血清白蛋白(DNP-HSA，50ng/ml)一起培養(yǎng)30分鐘或與不同濃度的嵌合蛋白一起培養(yǎng)不同的時(shí)間。通過(guò)離心收集無(wú)細(xì)胞的上清液并測(cè)定釋放的[3H]-羥色胺的量。對(duì)測(cè)試的任意濃度的嵌合蛋白未觀測(cè)到脫粒作用(圖12a)。作為對(duì)比，在相同條件下將同IgE一起預(yù)培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞與DNP接觸。DNP觸發(fā)脫粒的效應(yīng)清晰可見(圖12a)。Fc2’-3-PE40也在其與靶細(xì)胞相互作用的后期未引起任何脫粒(圖12b)，但它抑制蛋白質(zhì)合成達(dá)80％以上(圖12c)。我們的結(jié)果表明，F(xiàn)c2’-3-PE40在其與細(xì)胞的相互作用期間的任何階段都不觸發(fā)脫粒。
權(quán)利要求
1.通過(guò)定向消除FcεRI表達(dá)細(xì)胞而治療變應(yīng)性應(yīng)答的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包括FcεRI表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞導(dǎo)向部分和細(xì)胞殺傷部分。
2.權(quán)利要求1的嵌合蛋白，其中的殺傷部分是細(xì)菌毒素假單胞菌屬外毒素(PE)。
3.權(quán)利要求1的嵌合蛋白，其中的細(xì)胞導(dǎo)向部分是小鼠IgE分子的Fc區(qū)。
4.權(quán)利要求1的嵌合蛋白，其中的細(xì)胞導(dǎo)向部分和細(xì)胞殺傷部分被遺傳融合。
5.權(quán)利要求1的嵌合蛋白，其中編碼小鼠IgE分子Fc區(qū)的氨基酸225-552的序列被遺傳融合至PE40、即缺乏細(xì)胞結(jié)合域的PE截短了的形式。
6.權(quán)利要求1的嵌合蛋白，其中編碼小鼠IgE分子Fc區(qū)的氨基酸301-437的序列被遺傳融合至PE40、即缺乏細(xì)胞結(jié)合域的PE截短了的形式。
7.用于選自下列的變應(yīng)性疾病的權(quán)利要求1的嵌合蛋白哮喘、變應(yīng)性鼻炎、食物過(guò)敏、特應(yīng)性皮炎和過(guò)敏癥。
8.用于治療變應(yīng)性疾病以及治療增生癥和涉及表達(dá)FcεRI受體的細(xì)胞的惡性腫瘤的藥物組合物，它包括權(quán)利要求1-6中定義的嵌合蛋白作為活性成分和常規(guī)的佐劑產(chǎn)品。
9.權(quán)利要求8的用于治療變應(yīng)性疾病以及治療增生癥和惡性腫瘤的藥物組合物，其中所述組合物呈適當(dāng)?shù)男问焦┳⑸?靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi))，鼻內(nèi)，鞘內(nèi)，皮內(nèi)，經(jīng)皮，吸入，局部施用，口服，持續(xù)釋放，或通過(guò)包括經(jīng)腸途徑的其它任意途徑。
10.制備權(quán)利要求9定義的藥物組合物的方法，它包括將小鼠IgE分子的Fc區(qū)與PE進(jìn)行遺傳融合以及，如果需要的話，添加常規(guī)的佐劑產(chǎn)品。
11.一種質(zhì)粒，它包括一種啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子與編碼權(quán)利要求1-5中定義的肽的DNA分子操作性地連接。
全文摘要
本發(fā)明大體涉及治療變應(yīng)性應(yīng)答的新方法,它基于通過(guò)嵌合細(xì)胞毒素Fc
文檔編號(hào)A61P11/06GK1207686SQ96199668
公開日1999年2月10日 申請(qǐng)日期1996年12月18日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月18日
發(fā)明者A·費(fèi)史曼, S·亞科尼, H·勞伯波姆－蓋爾斯基 申請(qǐng)人:耶路撒冷希伯來(lái)語(yǔ)大學(xué)依蘇姆研究開發(fā)公司