專利名稱：細(xì)胞篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞篩選方法以及用于該方法的微孔陣列。更詳細(xì)地，本發(fā)明涉及產(chǎn) 生特異性免疫球蛋白的細(xì)胞及產(chǎn)生特異性細(xì)胞因子的細(xì)胞等免疫細(xì)胞的篩選方法、以及用 于該方法的微孔陣列。
背景技術(shù)：
以往，為了制造單克隆抗體，需要制造產(chǎn)生抗原特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。在以往 的雜交瘤細(xì)胞制造方法中，制造出雜交瘤細(xì)胞后對(duì)產(chǎn)生抗原特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆 體進(jìn)行篩選。然而，雜交瘤細(xì)胞的制造效率低下。也就是說(shuō)，并不是所有的B淋巴細(xì)胞均形 成雜交瘤細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞融合的B淋巴細(xì)胞中的一部分形成雜交瘤細(xì)胞。又，即使用受 過(guò)抗原刺激的脾細(xì)胞制造雜交瘤細(xì)胞，也無(wú)法僅得到產(chǎn)生抗原特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞， 得到的大部分雜交瘤細(xì)胞要么將產(chǎn)生無(wú)關(guān)的抗體，要么不產(chǎn)生抗體本身。例如，當(dāng)根據(jù)以往方法找到產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤細(xì)胞時(shí)，用從接受免疫的小鼠 取出的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，播種到約10塊96孔板上。再播種全部細(xì)胞，當(dāng) 由1個(gè)人進(jìn)行篩選時(shí)將受到時(shí)間限制，剩余部分以冷凍等方式進(jìn)行保存。通過(guò)該方法通常 能增殖出大約500個(gè)孔的雜交瘤細(xì)胞。然而，500個(gè)孔的雜交瘤細(xì)胞不可能全部以相同速度進(jìn)行增殖，有些增殖迅速有些 增殖緩慢。因此，無(wú)法同時(shí)核查全部500個(gè)孔的增殖情況。首先，在顯微鏡下核查哪個(gè)孔中 有細(xì)胞增殖，為了核查抗體核查細(xì)胞是否增殖至適當(dāng)?shù)募?xì)胞數(shù)目。隨后，從適當(dāng)?shù)目字腥〖?xì) 胞上清液，確認(rèn)是否產(chǎn)生抗原特異性抗體。這種細(xì)胞的核查與細(xì)胞上清液的核查有必要盡 早進(jìn)行。因?yàn)殡s交瘤細(xì)胞接連不斷的增殖，如果放著不管就會(huì)由于過(guò)度增殖的培養(yǎng)液的營(yíng) 養(yǎng)狀態(tài)惡化而滅絕。因此，必須得在希望的雜交瘤細(xì)胞死亡前進(jìn)行篩選。又，當(dāng)發(fā)現(xiàn)孔中目的雜交瘤細(xì)胞出現(xiàn)增殖時(shí)，常常出現(xiàn)在該孔中增殖出產(chǎn)生目的 抗體的雜交瘤細(xì)胞以外的產(chǎn)生其他抗體的雜交瘤細(xì)胞的情況。又，在丟失雜交瘤細(xì)胞自身 染色體的同時(shí)進(jìn)行增殖將導(dǎo)致產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞失去抗體染色體，無(wú)法獲得抗體。這 種細(xì)胞增殖通常比產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞快得多，如果放著不管，大部分培養(yǎng)的細(xì)胞將變 成不產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。因此，當(dāng)發(fā)現(xiàn)孔中出現(xiàn)希望的雜交瘤細(xì)胞增殖時(shí)，立即將該孔中的細(xì) 胞置于96孔板上，1個(gè)細(xì)胞1個(gè)孔的重新分散(限界稀釋法)，再重新篩選出希望的產(chǎn)生抗 體的雜交瘤細(xì)胞(二次篩選)。在檢出目的雜交瘤細(xì)胞后，至二次篩選結(jié)束，該過(guò)程必須趁 細(xì)胞狀態(tài)沒(méi)有出現(xiàn)惡化時(shí)快速的完成。如上所述，不篩選全部制作出的雜交瘤細(xì)胞，而僅篩選其中一部分，將難以得到能 產(chǎn)生頻率低的抗原特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。
更具體來(lái)說(shuō)，在人抗原特異性抗體的情況中，有一種用EB病毒使末梢B淋巴細(xì)胞 特性轉(zhuǎn)變株化來(lái)篩選產(chǎn)生抗原特異性抗體的細(xì)胞的方法(非專利文獻(xiàn)1)。在該方法中，由 于建立的淋巴細(xì)胞細(xì)胞株的頻率很低，因此得到產(chǎn)生抗原特異性抗體的B淋巴細(xì)胞細(xì)胞株 的準(zhǔn)確率非常低。又，建立細(xì)胞株需要1個(gè)月左右的時(shí)間。此外，建立的B淋巴細(xì)胞細(xì)胞株 產(chǎn)生的抗體量較少。因此即使能制作出小鼠的雜交瘤細(xì)胞，也無(wú)法高效地制作出人的雜交 瘤細(xì)胞系。小鼠的雜交瘤細(xì)胞是可制作的。以往來(lái)說(shuō)，制作雜交瘤細(xì)胞的方法包括以下步驟 對(duì)小鼠進(jìn)行抗原免疫，取出小鼠的脾臟或淋巴結(jié)，調(diào)制淋巴細(xì)胞，將調(diào)制的約108個(gè)淋巴細(xì) 胞和約107個(gè)骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)聚乙烯醇或施加電壓處理進(jìn)行融合，用HAT等選擇性培養(yǎng)基培 養(yǎng)，對(duì)增殖的雜交瘤細(xì)胞用ELISA、流式細(xì)胞儀等進(jìn)行篩選，選出產(chǎn)生抗原特異性抗體的雜 交瘤細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)2、3)。根據(jù)該方法，雖然約300 400個(gè)孔中的雜交瘤細(xì)胞能出現(xiàn) 增殖，但其中產(chǎn)生抗原特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞增殖的孔僅是百分之幾的數(shù)目。這個(gè)數(shù)目 根據(jù)抗原的不同而不同，但在產(chǎn)生抗原特異性抗體的B淋巴細(xì)胞頻率較低的情況下，用該 方法將難以制作出雜交瘤細(xì)胞。因此，本發(fā)明人在不考慮頻率較高的抗原特異性淋巴細(xì)胞的前提下，研究了即使 是頻率較低的抗原特異性淋巴細(xì)胞，也能從其中簡(jiǎn)便地篩選出對(duì)特定抗原具有特異性反應(yīng) 的淋巴細(xì)胞，并由選出的抗原特異性B淋巴細(xì)胞制作出產(chǎn)生抗原特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞 的方法，包括以下步驟選出一個(gè)對(duì)特定抗原具有特異性反應(yīng)的B淋巴細(xì)胞(抗原特異性B 淋巴細(xì)胞)，培養(yǎng)選出的抗原特異性B淋巴細(xì)胞，通過(guò)使培養(yǎng)增殖得到的抗原特異性B淋巴 細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合制作雜交瘤細(xì)胞，由此完成了產(chǎn)生抗原特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞的 制作方法，首先提出了專利申請(qǐng)。(專利文獻(xiàn)1)此外，以一個(gè)一個(gè)的水平來(lái)確定、選擇細(xì)胞，試著使用選出的細(xì)胞。例如，討論了單 獨(dú)一個(gè)個(gè)地檢測(cè)淋巴細(xì)胞的抗原特異性，隨后回收一個(gè)經(jīng)檢測(cè)的抗原特異性淋巴細(xì)胞，用 回收的一個(gè)抗原特異性淋巴細(xì)胞，例如，來(lái)制造抗體的方法(專利文獻(xiàn)2、3)。[專利文獻(xiàn) 1JW02004/087911[專利文獻(xiàn)2]特開(kāi)2004-173681號(hào)公報(bào)[專利文獻(xiàn)3]特開(kāi)2004-187676號(hào)公報(bào)[非專利文獻(xiàn)1]淋巴細(xì)胞機(jī)能檢索法(改訂5版)矢田純一、藤原道夫編，中外醫(yī) 學(xué)社，1994年，《用EB病毒變形B細(xì)胞制作人單克隆抗體》水野文雄、大里外譽(yù)郎，第381-391 頁(yè))[非專利文獻(xiàn)2]淋巴細(xì)胞機(jī)能檢索法(改訂5版)矢田純一、藤原道夫編，中外醫(yī) 學(xué)社，1994年，《用B細(xì)胞雜交瘤制作單克隆抗體的方法》成內(nèi)秀夫，第574-576頁(yè)[非專禾丨J 文獻(xiàn) 3]Monoclonal antibodies in "Antibodies :A Laboratory Manual，，by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, ppl39_pp244，1988[非專利文獻(xiàn)4]In vitro antibody production. In Current Protocols in Immunology. Edited by J. E. Coligan et al.，John ffiley&Sons (New York)，p. 3. 8. 1-3. 8. 16，1991.
[非專利文獻(xiàn)5]Babcook, J. S. , Leslie, K. B. , Olsen, 0. A. , Salmon, R. A. , Schrader, J. ff. A novelstrategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytesproducing antibodies of defined specificities. Proc Natl Acad Sci U S A,93 :7843-7848,1996.[非專利文獻(xiàn)6]Measurement of polyclonal immunoglobulin synthesis using the ELISPOT assay. In Current Protocols in Immunology. Edited by J. E. Coligan et al. , John ffiley&Sons (New York)，p. 7. 14. 1-7. 14. 7，1991.[非專利文獻(xiàn)7]Assays for antibody production. In Current Protocols in Immunology. Edited byj. E. Coligan et al.，John ffiley&Sons (New York)，p. 2. 1. 1-2. 1. 22，1991.[非專利文獻(xiàn)8]J. C. Love, J. L. Ronan, G. M. Grotenbreg, A. G. van der Veen, H. L. Ploegh, Amicroengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specificantibodies. Nature Biotechnology, 24 :703_707,2006.上述專利文獻(xiàn)1 3及非專利文獻(xiàn)1 7的全部?jī)?nèi)容在此特別引入作為參考。在上述現(xiàn)有技術(shù)方法、手冊(cè)中，都是一個(gè)一個(gè)地分別對(duì)淋巴細(xì)胞抗原特異性進(jìn)行 檢測(cè)，再回收經(jīng)檢測(cè)的抗原特異性淋巴細(xì)胞。專利文獻(xiàn)2和3中記載了按細(xì)胞單位來(lái)確認(rèn) 特定細(xì)胞，并記載了可回收特定細(xì)胞的方法。然而，實(shí)際上從多數(shù)淋巴細(xì)胞中檢測(cè)出具有抗 原特異性反應(yīng)的淋巴細(xì)胞并不容易。作為檢測(cè)方法，例如，利用與抗原反應(yīng)的淋巴細(xì)胞中鈣離子濃度升高，經(jīng)熒光檢測(cè) 鈣離子濃度變化，確定抗原特異性淋巴細(xì)胞的方法。然而，細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)的種類將根據(jù) 熒光的產(chǎn)生方式及強(qiáng)度等的不同而不同，既存在受到抗原刺激鈣離子濃度立刻升高導(dǎo)致熒 光強(qiáng)度也升高的淋巴細(xì)胞，也存在經(jīng)抗原刺激一定時(shí)間以后鈣離子濃度才升高導(dǎo)致熒光強(qiáng) 度也升高的淋巴細(xì)胞。此外，有必要基本上一次性同時(shí)測(cè)定數(shù)厘米寬的正方形芯片表面上 保持的1 20萬(wàn)左右的淋巴細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，并且，由于每個(gè)細(xì)胞每次產(chǎn)生的熒光而導(dǎo)致 熒光強(qiáng)度較低，有必要對(duì)熒光進(jìn)行高精度的熒光檢測(cè)。然而，到目前為止，還不存在可同時(shí)測(cè)定上述高度聚集在芯片表面上的多數(shù)且微 弱的熒光強(qiáng)度的方法及裝置?，F(xiàn)有的裝置有激光掃描流式細(xì)胞儀，用激光掃描流式細(xì)胞儀可測(cè)定數(shù)十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞 中每個(gè)細(xì)胞內(nèi)鈣的濃度。然而，一次掃描將耗費(fèi)長(zhǎng)達(dá)10分鐘以上的時(shí)間，對(duì)于抗原刺激后 數(shù)分鐘中熒光強(qiáng)度將發(fā)生變化的淋巴細(xì)胞的檢測(cè)來(lái)說(shuō)，這種方法將缺乏實(shí)時(shí)性，不適宜使用。熒光顯微鏡攝影裝置是在普通的熒光顯微鏡上合并使用攝影裝置。雖然熒光顯微 鏡攝影裝置不存在速度上的問(wèn)題，但普通的顯微鏡的攝影范圍較窄，一次性最多僅能檢測(cè) 1000個(gè)左右，無(wú)法對(duì)數(shù)萬(wàn) 數(shù)十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行一次性熒光檢測(cè)。為了對(duì)細(xì)胞芯片上排列的細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測(cè)，開(kāi)發(fā)出的一種基于DNA微孔陣列掃 描器的細(xì)胞芯片檢測(cè)裝置，可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的熒光。然而，在用激光激發(fā)熒光色素、
6檢測(cè)激發(fā)光的系統(tǒng)中，追蹤時(shí)間變化的檢測(cè)系統(tǒng)用激光進(jìn)行線掃描速度較慢，無(wú)法對(duì)多數(shù) 細(xì)胞領(lǐng)域進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。根據(jù)上述專利文獻(xiàn)2及3中記載的方法檢測(cè)對(duì)抗原有特異性反應(yīng)的細(xì)胞時(shí)，希望 反應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)具有能隨時(shí)捕捉單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)鈣的變化的實(shí)時(shí)性、以及由于需要檢測(cè)多 數(shù)細(xì)胞中非常少的存在(反應(yīng))的細(xì)胞而單個(gè)地同時(shí)解析多個(gè)細(xì)胞的并列性。 因此，本發(fā)明的目的是提供一種能同時(shí)測(cè)定芯片上保持的超過(guò)1萬(wàn)個(gè)、優(yōu)選超過(guò) 10萬(wàn)個(gè)的多數(shù)細(xì)胞的狀態(tài)，例如，淋巴細(xì)胞對(duì)抗原刺激的反應(yīng)性，并能單個(gè)地掌握每個(gè)細(xì)胞 的狀態(tài)的方法。B淋巴細(xì)胞在細(xì)胞表面上表達(dá)一種抗體，當(dāng)病原體(抗原)等侵入時(shí)，抗原與細(xì) 胞表面的抗體相結(jié)合，進(jìn)行活化增殖和分化，最終分化成抗體分泌細(xì)胞。已經(jīng)存在多種確 定抗體分泌細(xì)胞的方法，其中確定單個(gè)抗體分泌細(xì)胞的典型方法是斑點(diǎn)法和ELISP0T法 (Enzyme-linked Immunospot)。斑點(diǎn)法是利用紅細(xì)胞，用抗體分泌細(xì)胞周圍抗原標(biāo)識(shí)的紅細(xì)胞與抗體結(jié)合引起的 溶血作為指標(biāo)來(lái)確定分泌抗原特異性抗體的細(xì)胞的方法(非專利文獻(xiàn)4)。用斑點(diǎn)法進(jìn)行檢 測(cè)分泌抗原特異性抗體的細(xì)胞回收抗體基因的方法已經(jīng)得到實(shí)際應(yīng)用(非專利文獻(xiàn)5)。ELISP0T法是在涂覆有抗原的板上播種細(xì)胞，抗體分泌細(xì)胞分泌的抗體與細(xì)胞 周圍的抗原相結(jié)合，用酶標(biāo)識(shí)的抗Ig抗體等對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的方法(非專利文獻(xiàn)6)。在 ELISP0T法中，用酶標(biāo)識(shí)抗Ig抗體檢測(cè)抗原特異性抗體與細(xì)胞周圍的結(jié)合時(shí)，細(xì)胞自身將 被洗掉，無(wú)法回收抗原特異性抗體分泌細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞也是分泌抗體的細(xì)胞，在篩選雜交瘤細(xì)胞時(shí)通常使用ELISA法 (Enzyme-linked immunosorbent assay)(非專利文獻(xiàn)7)。近來(lái)，該方法得到廣泛發(fā)展，已 有報(bào)道在微小的孔中培養(yǎng)1個(gè)雜交瘤細(xì)胞，用熒光標(biāo)識(shí)過(guò)的抗原等對(duì)孔中分泌的抗體進(jìn)行 檢測(cè)，來(lái)檢測(cè)抗原特異性抗體分泌細(xì)胞的方法(非專利文獻(xiàn)8)。本發(fā)明人為了實(shí)現(xiàn)上述本發(fā)明的目的，為提供一種不同于非專利文獻(xiàn)4 8記載 的方法、新的檢測(cè)能分泌抗原特異性抗體的細(xì)胞等免疫細(xì)胞的方法進(jìn)行多方面探討，由此 完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
以下將描述解決上述課題的本發(fā)明的技術(shù)方案。[1] 一種微孔陣列，該微孔陣列是在基體一側(cè)的主表面上具有多個(gè)孔，孔具有僅可 容納一個(gè)細(xì)胞的尺寸的微孔陣列，其特征在于，至少在上述孔周圍的上述主表面的至少一 部分上含有具有結(jié)合性的物質(zhì)的覆蓋層，所述具有結(jié)合性的物質(zhì)是與上述孔中容納的至少 一部分細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)。[2]如[1]記載的微孔陣列，在該微孔陣列的至少一部分孔中同時(shí)容納細(xì)胞和細(xì) 胞培養(yǎng)液，將上述覆蓋層及孔浸漬在培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)液含有的物質(zhì)能從孔向上述覆蓋層 擴(kuò)散的狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞；除去上述培養(yǎng)后的培養(yǎng)液之后，檢測(cè)孔中容納的至少一部分細(xì)胞 產(chǎn)生的物質(zhì)與上述覆蓋層的物質(zhì)有無(wú)結(jié)合。[3]如[1]或[2]記載的微孔陣列，上述孔中容納的至少一部分細(xì)胞是產(chǎn)生免疫球 蛋白的細(xì)胞或產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞。
[4]如[1]或[2]記載的微孔陣列，上述孔中容納的至少一部分細(xì)胞是產(chǎn)生免疫球 蛋白的細(xì)胞，與產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)是抗免疫 球蛋白抗體或抗原。[5]如[4]記載的微孔陣列，使用與產(chǎn)生的免疫球蛋白相對(duì)應(yīng)的抗體或抗原進(jìn)行 上述有無(wú)結(jié)合的檢測(cè)。[6]如[1]或[2]記載的微孔陣列，上述孔中容納的至少一部分細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞因 子的細(xì)胞，與產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)是抗細(xì)胞因子 抗體或細(xì)胞因子受體。[7]如[6]記載的微孔陣列，使用與產(chǎn)生的細(xì)胞因子相對(duì)應(yīng)的抗體或細(xì)胞因子受 體進(jìn)行上述有無(wú)結(jié)合的檢測(cè)。[8]如[1]或[2]記載的微孔陣列，上述孔中容納的至少一部分細(xì)胞是產(chǎn)生免疫球 蛋白的細(xì)胞，與產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)是細(xì)胞因 子受體或受體。
[9]如[8]記載的微孔陣列，使用細(xì)胞因子或配基進(jìn)行上述有無(wú)結(jié)合的檢測(cè)。[10]如[1] [9]任一項(xiàng)記載的微孔陣列，產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞及產(chǎn)生細(xì)胞因 子的細(xì)胞是天然細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞。[11]如[1] [10]任一項(xiàng)記載的微孔陣列，基體是板狀的。[12]如[1] [11]任一項(xiàng)記載的微孔陣列，不含具有結(jié)合性的物質(zhì)的覆蓋層的上 述主表面的至少一部分涂布有封閉劑，所述的具有結(jié)合性物質(zhì)是具有與孔中容納的細(xì)胞產(chǎn) 生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)。[13]目的細(xì)胞的篩選方法，包括以下步驟基體一側(cè)的主表面上具有多個(gè)孔，孔具有僅可容納一個(gè)細(xì)胞的尺寸，并且至少在 上述孔周圍的上述主表面的至少一部分上具有與目的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié) 合性的物質(zhì)的覆蓋層，在具有覆蓋層的微孔陣列的至少一部分孔中容納了被檢體細(xì)胞和細(xì) 胞培養(yǎng)液；將上述覆蓋層及孔均浸漬在培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)液中含有的物質(zhì)能從孔向上述覆蓋 層擴(kuò)散的狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞；用任意方法除去培養(yǎng)液后，向上述覆蓋層中加入與被檢體細(xì)胞含有的目的細(xì)胞產(chǎn) 生的物質(zhì)特異性結(jié)合的標(biāo)識(shí)物；與上述覆蓋層物質(zhì)結(jié)合后，根據(jù)上述標(biāo)識(shí)物檢測(cè)目的細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)，確定目的 細(xì)胞[14]如[13]記載的篩選方法，包括含有上述被檢體細(xì)胞的細(xì)胞是接受預(yù)期抗原 的刺激能產(chǎn)生物質(zhì)的狀態(tài)的細(xì)胞。[15]如[13]或[14]記載的篩選方法，包括上述被檢體細(xì)胞是產(chǎn)生免疫球蛋白 的細(xì)胞或產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞。[16]如[13]或[14]記載的篩選方法，上述被檢體細(xì)胞包括產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì) 胞，與目的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)是抗免疫球蛋白抗體或抗原，目 的細(xì)胞是產(chǎn)生抗原特異性免疫球蛋白的細(xì)胞。[17]如[16]記載的篩選方法，使用與產(chǎn)生的免疫球蛋白相對(duì)應(yīng)的抗體或抗原進(jìn)行上述有無(wú)結(jié)合的檢測(cè)。
[18]如[13]或[14]記載的篩選方法，上述被檢體細(xì)胞包括產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì) 胞，與目的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)是細(xì)胞因子受體或受體，目的細(xì) 胞是產(chǎn)生抗原特異性免疫球蛋白的細(xì)胞。[19]如[18]記載的篩選方法，使用細(xì)胞因子或配基進(jìn)行上述有無(wú)結(jié)合的檢測(cè)。[20]如[13]或[14]記載的篩選方法，上述被檢體細(xì)胞包括產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞， 與目的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)是抗細(xì)胞因子抗體或細(xì)胞因子受體， 目的細(xì)胞是產(chǎn)生抗原特異性細(xì)胞因子的細(xì)胞。[21]如[20]記載的篩選方法，使用與產(chǎn)生的細(xì)胞因子相對(duì)應(yīng)的抗體或細(xì)胞因子 受體進(jìn)行上述有無(wú)結(jié)合的檢測(cè)。[22]如[13] [21]任一項(xiàng)記載的篩選方法，產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞及產(chǎn)生細(xì)胞 因子的細(xì)胞是天然細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞或細(xì)胞株。[23]目的細(xì)胞的制造方法，包括從孔中回收根據(jù)[13] [22]任一項(xiàng)記載的篩選 方法確定的目的細(xì)胞的步驟。[24]如[23]記載的制造方法，目的細(xì)胞是產(chǎn)生特異性免疫球蛋白的細(xì)胞或產(chǎn)生 特異性細(xì)胞因子的細(xì)胞。依據(jù)本發(fā)明可提供能同時(shí)測(cè)定芯片上保持的例如超過(guò)1萬(wàn)個(gè)、優(yōu)選超過(guò)10萬(wàn)個(gè)的 多數(shù)細(xì)胞的狀態(tài)，例如，淋巴細(xì)胞對(duì)抗原刺激的反應(yīng)性，并能單個(gè)地把握每個(gè)細(xì)胞的狀態(tài)的 方法和手段。


圖1為孔形狀與標(biāo)識(shí)物信號(hào)形狀的關(guān)系示意圖。圖2為以分泌抗體的細(xì)胞為例子的本發(fā)明方法的說(shuō)明圖。圖3為標(biāo)識(shí)物為能與產(chǎn)生物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)(1)的本發(fā)明方法的說(shuō)明圖。圖4-1為制作例1的說(shuō)明圖。圖4-2為制作例1的說(shuō)明圖。圖5-1為制作例2的說(shuō)明圖。圖5-2為制作例2的說(shuō)明圖。
圖5-3為制作例2的說(shuō)明圖。圖6-1為制作例3的說(shuō)明圖。圖6-2為制作例3的說(shuō)明圖。圖7-1為制作例4的說(shuō)明圖。圖7-2為制作例4的說(shuō)明圖。圖7-3為制作例4的說(shuō)明圖。圖8為表面處理方法的說(shuō)明圖。圖9為保持芯片濕度的保濕箱的說(shuō)明圖。圖10為實(shí)施例1中確認(rèn)容納了正在分泌抗原特異性抗體的細(xì)胞的孔的位置的結(jié) 果。A是檢測(cè)分泌出的抗原特異性抗體的Cy3信號(hào)。B是觀察經(jīng)Oregon Green標(biāo)識(shí)的細(xì)胞。圖11為實(shí)施例中1用本發(fā)明方法(FLISPOI^i)確定微孔陣列芯片上的分泌抗原特異性抗體的細(xì)胞的結(jié)果。圖12為實(shí)施例2中用本發(fā)明方法(FLISP0T法)法檢測(cè)經(jīng)HEL免疫的小鼠脾細(xì)胞 中能分泌HEL特異性抗體的細(xì)胞的結(jié)果。圖13為實(shí)施例2用本發(fā)明方法(FLISP0T法)檢測(cè)人末梢血淋巴細(xì)胞中HBs抗原 特異性抗體的細(xì)胞的結(jié)果。圖14為實(shí)施例3的結(jié)果。
圖15為實(shí)施例4 (產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞的檢測(cè))的結(jié)果。圖16為實(shí)施例6 (應(yīng)用于機(jī)能性抗體的篩選)的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式[微孔陣列]本發(fā)明的微孔陣列是在基體一側(cè)的主表面上具有多個(gè)孔，每個(gè)孔具有僅能容納1 個(gè)細(xì)胞的尺寸的微孔陣列。具有上述結(jié)構(gòu)的微孔陣列可直接使用例如上述專利文獻(xiàn)1 3 中記載的微孔陣列。例如，在微孔陣列芯片中設(shè)置了以相同間隔縱橫排列的多個(gè)微孔。微孔的形狀和尺寸沒(méi)有特別限定，微孔的形狀例如可以是圓筒形，除圓筒形之外， 也可以是由多個(gè)面構(gòu)成的多面體(例如長(zhǎng)方體、六棱柱、八棱柱等)、倒圓錐形、倒角錐形 (倒三角錐形、倒四角錐形、倒五角錐形、倒六角錐形、七角以上的倒多角錐)等，還可以是 將兩種以上這些形狀組合得到的形狀。例如可以是一部分為圓筒形，其余部分為倒圓錐形。 另外，為倒圓錐形、倒角錐形時(shí)，底面為微孔的開(kāi)口，不過(guò)也可以是從倒圓錐形、倒角錐形的 頂切除一部分得到的形狀(此時(shí)，微孔的底部平坦)。對(duì)于圓筒形、長(zhǎng)方體，微孔的底部通常 是平坦的，不過(guò)也可以制成曲面(凸面或凹面)。將微孔的底部制成曲面時(shí)，其情形與從倒 圓錐形、倒角錐形的頂切除一部分得到的形狀的情形相同。微孔為圓筒形時(shí)，其尺寸例如可以是直徑為3 100 μ m,生物體細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞 時(shí)，優(yōu)選直徑為4 15 μ m。另外，深度例如可以是3 100 μ m，生物體細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞 時(shí)，可優(yōu)選深度為4 40 μ m。不過(guò)，如上所述，微孔的尺寸應(yīng)考慮要容納在微孔中的生物體 細(xì)胞直徑與微孔尺寸的恰當(dāng)比例來(lái)適當(dāng)?shù)卮_定。微孔的形狀或尺寸可考慮要在微孔中容納的生物體細(xì)胞的種類(生物體細(xì)胞的 形狀或尺寸等)來(lái)適當(dāng)確定，以使一個(gè)微孔中可容納一個(gè)生物體細(xì)胞。為了使一個(gè)微孔中容納一個(gè)生物體細(xì)胞，例如，與微孔的平面形狀內(nèi)切的最大圓 的直徑為要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0. 5 2倍，優(yōu)選0. 8 1. 9倍，更優(yōu)選 0.8 1.8倍的范圍。另外，微孔的深度在要容納的微孔中的生物體細(xì)胞直徑的0.5 4倍的范圍，優(yōu)選 0.8 1.9倍的范圍，更優(yōu)選0.8 1.8倍的范圍適當(dāng)確定。一個(gè)微孔陣列芯片所具有的微孔數(shù)量沒(méi)有特別限定，當(dāng)生物體細(xì)胞為淋巴細(xì)胞 時(shí)，從抗原特異性淋巴細(xì)胞的頻率為IO5個(gè)中至少有1個(gè)、多數(shù)情況約有500個(gè)的角度考慮， 每Icm2的微孔數(shù)例如可以是2，000 1，000, 000個(gè)的范圍。此外，本發(fā)明的微孔陣列至少在上述孔周圍的上述主表面的至少一部分上具有覆 蓋層，該覆蓋層的物質(zhì)是與上述孔中容納的至少一部分細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)。這點(diǎn)是本發(fā)明的微孔陣列的特征。本發(fā)明的微孔陣列中基體可以是板狀的(并不意在限定板的形式)，設(shè)在基體主表面上的多個(gè)孔周圍的主表面的至少一部分上設(shè)置有上述覆蓋層。利用本發(fā)明的微孔陣列 對(duì)孔中容納的至少一部分細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)與覆蓋層物質(zhì)有無(wú)結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)?？字腥菁{的細(xì)胞(被檢體細(xì)胞)可以是例如包含產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞或產(chǎn)生細(xì) 胞因子的細(xì)胞的細(xì)胞群。此外，產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞及產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞可以是天然 細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞或細(xì)胞株。天然細(xì)胞可以是取自哺乳動(dòng)物例如人、小鼠等的細(xì)胞，雜交瘤 細(xì)胞可以是根據(jù)背景技術(shù)中描述的常規(guī)方法制成的雜交瘤細(xì)胞。細(xì)胞株可以是基因?qū)氡?達(dá)型cDNA庫(kù)等的細(xì)胞株。當(dāng)孔中容納的細(xì)胞是包含產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞的被檢體細(xì)胞時(shí)，作為與細(xì)胞產(chǎn) 生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)，可使用能與產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球 蛋白反應(yīng)的抗免疫球蛋白抗體或抗原。因而，上述有無(wú)結(jié)合的檢測(cè)使用的是產(chǎn)生的免疫球 蛋白的抗體或抗原。當(dāng)孔中容納的細(xì)胞是包含產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞的被檢體細(xì)胞時(shí)，作為與細(xì)胞產(chǎn)生 的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)，可使用能與產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子反 應(yīng)的抗細(xì)胞因子抗體或細(xì)胞因子受體。因而，有無(wú)結(jié)合的檢測(cè)使用的是產(chǎn)生的細(xì)胞因子的 抗體或細(xì)胞因子受體?；蛘撸?dāng)孔中容納的細(xì)胞是包含產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞的被檢體細(xì)胞時(shí)，與細(xì)胞 產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)可以是能與產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞產(chǎn)生的免疫 球蛋白反應(yīng)的細(xì)胞因子受體或受體。這時(shí)，有無(wú)結(jié)合的檢測(cè)使用的是細(xì)胞因子受體或與受 體反應(yīng)得到的細(xì)胞因子或配基。產(chǎn)生的免疫球蛋白與細(xì)胞因子受體或受體相結(jié)合，封閉其 與檢測(cè)有無(wú)結(jié)合時(shí)使用的細(xì)胞因子或配基的結(jié)合，來(lái)檢測(cè)有無(wú)結(jié)合。下表1示出了例子。(1)與細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)(結(jié)合性物質(zhì))、(2)孔中容納的細(xì)胞(被檢體細(xì)胞)、(3)細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)(產(chǎn)生物質(zhì))以及(4)確定產(chǎn)生物質(zhì)的標(biāo)識(shí)物(標(biāo)識(shí)物)。此外，為了確定產(chǎn)生物質(zhì)，用來(lái)標(biāo)識(shí)物質(zhì)的物質(zhì)可使用例如熒光物。但不限于熒光 物，還可以是其他標(biāo)識(shí)物。又，可使用抗原及抗體等熒光物質(zhì)為標(biāo)識(shí)物用公知方法進(jìn)行標(biāo) 識(shí)。又，標(biāo)識(shí)物可以是能與產(chǎn)生的物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)，也可以是能與結(jié)合性物質(zhì)特異性 結(jié)合的物質(zhì)。表1
*封閉細(xì)胞因子結(jié)合的抗體的檢測(cè)"封閉配基結(jié)合的抗體的檢測(cè)結(jié)合性物質(zhì)的覆蓋層的形成可以是由下述方法形成的為了確保結(jié)合性物質(zhì)與主 表面的結(jié)合性，例如用硅烷偶聯(lián)劑對(duì)將形成基板的覆蓋層的主表面進(jìn)行表面處理；隨后，在 經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑處理的表面上涂覆含有結(jié)合性物質(zhì)的溶液。對(duì)于覆蓋層來(lái)說(shuō)結(jié)合性物質(zhì)的覆 蓋量可根據(jù)結(jié)合性物質(zhì)種類、細(xì)胞及產(chǎn)生物質(zhì)種類、甚至是標(biāo)識(shí)物種類而適當(dāng)?shù)卮_定。此 夕卜，為了確保結(jié)合性物質(zhì)與主表面的結(jié)合性的表面處理的方法不限于硅烷偶聯(lián)劑處理，還 可以適當(dāng)?shù)剡x擇使用能促進(jìn)由蛋白質(zhì)等構(gòu)成的結(jié)合性物質(zhì)與由無(wú)機(jī)材料(例如硅材料)或有機(jī)材料(例如聚合物材料)構(gòu)成的基板表面相結(jié)合的物質(zhì)。覆蓋有結(jié)合性物質(zhì)的表面根據(jù)覆蓋量的不同，存在沒(méi)有致密地覆蓋結(jié)合性物質(zhì)， 存在未被覆蓋的表面的情況。這時(shí)，特別地，上述經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑處理的表面屬于細(xì)胞產(chǎn)生的 物質(zhì)與基板表面非特異性結(jié)合的情況。這種非特異性結(jié)合是降低檢測(cè)敏感度精確度的原 因。因此，在本發(fā)明中，與孔中容納的細(xì)胞所產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)覆蓋 層沒(méi)有覆蓋的上述主表面的至少一部分上優(yōu)選涂覆有封閉劑。封閉劑例如可舉出由與構(gòu)成 細(xì)胞膜的卵磷脂極性基團(tuán)具有相同結(jié)構(gòu)的2-丙烯酞乙氧基磷脂酸膽(MPC)為構(gòu)成單位的 水溶性聚合物L(fēng)IPIDURE (注冊(cè)商標(biāo))(U C 7 - τ·(注冊(cè)商標(biāo)))。[篩選方法]本發(fā)明的篩選方法是使用上述本發(fā)明的微孔陣列，從包含被檢體細(xì)胞的細(xì)胞群中 篩選目的細(xì)胞的方法，包括以下步驟
(1)微孔陣列的至少一部分孔中同時(shí)容納了被檢體細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液。(2)覆蓋層及孔浸漬在培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)液中含有的物質(zhì)能從孔向覆蓋層擴(kuò)散的 狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞任意長(zhǎng)的時(shí)間。(3)在除去培養(yǎng)液之后，向覆蓋層中加入與被檢體細(xì)胞包含的目的細(xì)胞產(chǎn)生的物 質(zhì)特異性結(jié)合的標(biāo)識(shí)物。(4)與覆蓋層物質(zhì)結(jié)合后，通過(guò)標(biāo)識(shí)物檢測(cè)目的細(xì)胞產(chǎn)生或分泌出的物質(zhì)，確定目 的細(xì)胞。本發(fā)明的篩選方法中采用的(1)與細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物 質(zhì)(結(jié)合性物質(zhì))、(2)孔中容納的細(xì)胞(被檢體細(xì)胞)、(3)細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)(產(chǎn)生物質(zhì)) 以及(4)確定為標(biāo)識(shí)的產(chǎn)生物質(zhì)的物質(zhì)(標(biāo)識(shí)確定物)與在本發(fā)明微孔陣列中的描述相 同，也可以以表1示出的內(nèi)容為例子。步驟(1)微孔陣列的至少一部分孔中同時(shí)容納了包含被檢體細(xì)胞的細(xì)胞(細(xì)胞群)以及細(xì) 胞培養(yǎng)液。在容納細(xì)胞之前用培養(yǎng)液洗凈微孔陣列的孔及其周圍，優(yōu)選在形成結(jié)合性物質(zhì) 覆蓋層時(shí)徹底除去表面附著的雜質(zhì)，以便進(jìn)行高精度的檢測(cè)。細(xì)胞與培養(yǎng)液同時(shí)容納在孔 中。孔中容納的被檢體細(xì)胞可以是包含產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞或產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞的細(xì) 胞群，并且，產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞及產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞可以是天然細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞。 這些細(xì)胞群可以利用公知方法獲得?？字腥菁{的細(xì)胞可以是接受預(yù)期抗原刺激能產(chǎn)生物質(zhì)的狀態(tài)的細(xì)胞。例如，在產(chǎn) 生免疫球蛋白的細(xì)胞的情況中，優(yōu)選接受預(yù)期抗原刺激產(chǎn)生免疫球蛋白的狀態(tài)的細(xì)胞。同 樣地，在產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞的情況中，優(yōu)選接受預(yù)期抗原刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子的狀態(tài)的細(xì) 胞。預(yù)期的抗原沒(méi)有特別限制，可適當(dāng)?shù)剡x自多種蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)、核酸、有機(jī)化合物、無(wú) 機(jī)化合物或它們的組合(包含細(xì)胞)等。培養(yǎng)液根據(jù)容納、檢測(cè)的細(xì)胞種類而適宜地確定。步驟(2)覆蓋層及孔均浸漬在培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)液中含有的物質(zhì)能從孔向覆蓋層擴(kuò)散的狀 態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)的細(xì)胞將產(chǎn)生物質(zhì)，產(chǎn)生的物質(zhì)釋放在培養(yǎng)液中，從孔擴(kuò)散至孔周圍的 覆蓋層。擴(kuò)散到達(dá)覆蓋層的產(chǎn)生的物質(zhì)與構(gòu)成覆蓋層的結(jié)合性物質(zhì)相結(jié)合。培養(yǎng)條件可根 據(jù)細(xì)胞種類適當(dāng)?shù)卮_定，培養(yǎng)時(shí)間可根據(jù)與構(gòu)成覆蓋層的結(jié)合性物質(zhì)相結(jié)合產(chǎn)生的物質(zhì)的量達(dá)到能檢測(cè)出的水平適當(dāng)?shù)卮_定。在容納不產(chǎn)生物質(zhì)的細(xì)胞的孔周圍的覆蓋層上不出現(xiàn) 產(chǎn)生物質(zhì)與結(jié)合性物質(zhì)的結(jié)合。此外，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)生的物質(zhì)將過(guò)度擴(kuò)散，將很難確定 容納了產(chǎn)生產(chǎn)生物質(zhì)的細(xì)胞，所以培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選在容易確定容納了產(chǎn)生產(chǎn)生物質(zhì)的細(xì)胞的 孔的范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)卮_定。步驟(3) 上述培養(yǎng)結(jié)束后，可采用任意方法除去培養(yǎng)液，隨后向覆蓋層中加入能與包含被 檢體細(xì)胞的目的細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)特異性結(jié)合的標(biāo)識(shí)物。目的細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)在培養(yǎng)過(guò)程中 擴(kuò)散，與構(gòu)成覆蓋層的結(jié)合性物質(zhì)相結(jié)合，在這個(gè)階段中加入上述標(biāo)識(shí)物，標(biāo)識(shí)物可與結(jié)合 在覆蓋層上的產(chǎn)生物質(zhì)相結(jié)合，或者與覆蓋層中未被產(chǎn)生物質(zhì)結(jié)合封閉的覆蓋層相結(jié)合。 前者是標(biāo)識(shí)物與產(chǎn)生物質(zhì)具有結(jié)合性的情況，后者是標(biāo)識(shí)物不與產(chǎn)生物質(zhì)相結(jié)合，而是標(biāo) 識(shí)物與構(gòu)成覆蓋層的結(jié)合性物質(zhì)具有結(jié)合性的情況。這點(diǎn)將在下文中詳細(xì)描述。在加入標(biāo)識(shí)物之前，優(yōu)選除去培養(yǎng)液。在培養(yǎng)液中，當(dāng)孔中容納的細(xì)胞例如是產(chǎn)生 免疫球蛋白的細(xì)胞時(shí)，將大量地分泌抗體，這樣的話例如一旦加入抗免疫球蛋白抗體，在與 芯片表面抗體結(jié)合前將與培養(yǎng)液中的抗體相結(jié)合，導(dǎo)致無(wú)法對(duì)結(jié)合在芯片表面的抗體進(jìn)行 檢測(cè)。但是，通過(guò)細(xì)胞與結(jié)合性物質(zhì)的組合，在不除去培養(yǎng)液時(shí)向覆蓋層中加入標(biāo)識(shí)物，檢 測(cè)將不會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。步驟(4)可通過(guò)標(biāo)識(shí)物檢測(cè)與覆蓋層物質(zhì)結(jié)合的目的細(xì)胞所產(chǎn)生的物質(zhì)，確定目的細(xì)胞。 標(biāo)識(shí)物與覆蓋層中結(jié)合的產(chǎn)生物質(zhì)相結(jié)合，因此可通過(guò)檢測(cè)標(biāo)識(shí)物而確定結(jié)合在覆蓋層上 的產(chǎn)生產(chǎn)生物質(zhì)的細(xì)胞(目的細(xì)胞)。當(dāng)標(biāo)識(shí)物是能與產(chǎn)生物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)時(shí)，標(biāo)識(shí)物從孔擴(kuò)散至孔周圍的覆蓋 層，到達(dá)覆蓋層時(shí)與構(gòu)成覆蓋層的結(jié)合性物質(zhì)所結(jié)合的產(chǎn)生物質(zhì)相結(jié)合，在結(jié)合后，檢測(cè)標(biāo) 識(shí)物。另一方面，在不產(chǎn)生物質(zhì)的孔周圍的覆蓋層上將不出現(xiàn)產(chǎn)生物質(zhì)與結(jié)合性物質(zhì)的結(jié) 合，因此，沒(méi)有標(biāo)識(shí)物的結(jié)合就檢測(cè)不出標(biāo)識(shí)物。當(dāng)標(biāo)識(shí)物是能與結(jié)合性物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)時(shí)，標(biāo)識(shí)物從孔擴(kuò)散至孔周圍的覆 蓋層，到達(dá)覆蓋層時(shí)與構(gòu)成覆蓋層的結(jié)合性物質(zhì)相結(jié)合的產(chǎn)生物質(zhì)將阻礙標(biāo)識(shí)物與結(jié)合性 物質(zhì)相結(jié)合。另一方面，在不產(chǎn)生產(chǎn)生物質(zhì)的孔周圍的覆蓋層上將不出現(xiàn)產(chǎn)生物質(zhì)與結(jié)合 性物質(zhì)的結(jié)合，因此，標(biāo)識(shí)物與結(jié)合性物質(zhì)的結(jié)合將不被阻礙，與標(biāo)識(shí)物結(jié)合。這時(shí)，產(chǎn)生產(chǎn) 生物質(zhì)的孔檢測(cè)不到標(biāo)識(shí)物，由此可識(shí)別出能檢測(cè)到標(biāo)識(shí)物的孔。當(dāng)標(biāo)識(shí)物例如是熒光標(biāo)識(shí)時(shí)，可用熒光顯微鏡、熒光圖像掃描器、圖像閱讀器等來(lái) 確定目的細(xì)胞。下述的實(shí)施例主要使用的是正六邊形形狀的孔的芯片(圖1左下)。這時(shí)，信號(hào)大 概以同心圓狀展開(kāi)(圖1左上)。然而，當(dāng)如圖1右下示出的以正六角形孔的傾斜方向進(jìn)入 狹縫時(shí)，產(chǎn)生的抗體等將向狹縫方向展開(kāi)，形成如圖1右上示出的銀河系狀的形狀。如上所 述，介入產(chǎn)生物得到的標(biāo)識(shí)物發(fā)出的信號(hào)將出現(xiàn)與孔形狀不同的形狀。mm^m^r^m^n^m^mmmu α)當(dāng)孔中容納的被檢體細(xì)胞包含產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生免疫球蛋 白，如果向覆蓋層中加入抗免疫球蛋白抗體或抗原作為結(jié)合性物質(zhì)，產(chǎn)生的免疫球蛋白將 與覆蓋層結(jié)合，可用該免疫球蛋白的抗體或抗原檢測(cè)產(chǎn)生的與覆蓋層結(jié)合的免疫球蛋白。在容納了不產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞，即受到抗原刺激也不產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞的孔周 圍，免疫球蛋白不會(huì)從孔中擴(kuò)散出，因此可識(shí)別出容納了產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞的孔。因 而，可確定目的細(xì)胞即產(chǎn)生抗原特異性免疫球蛋白的細(xì)胞。根據(jù)圖2進(jìn)行更詳細(xì)地說(shuō)明。(A)向芯片表面上結(jié)合了抗免疫球蛋白(Ig)抗體的硅制微孔陣列芯片各孔中加 入抗體分泌細(xì)胞。(B)培養(yǎng)細(xì)胞，分泌抗體。細(xì)胞分泌出的抗體與孔周圍的抗Ig抗體結(jié)合。(C)隨后加入熒光標(biāo)識(shí)的抗原，抗原與孔周圍捕捉的抗原特異性抗體相結(jié)合。 (D)用熒光顯微鏡、掃描器等觀察，觀察抗原特異性抗體是否以圓環(huán)狀在孔周圍展 開(kāi)。 標(biāo)識(shí)物是能與產(chǎn)牛物質(zhì)特異件結(jié)合的物質(zhì)的情況(2)當(dāng)孔中容納的被檢體細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生細(xì)胞因子，如 果向覆蓋層中加入抗細(xì)胞因子抗體或細(xì)胞因子受體作為結(jié)合性物質(zhì)，產(chǎn)生的細(xì)胞因子與覆 蓋層相結(jié)合，可用與該細(xì)胞因子相對(duì)的抗體或細(xì)胞因子受體檢測(cè)產(chǎn)生的與覆蓋層結(jié)合的細(xì) 胞因子。在容納了不產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞、即在抗原刺激下不產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞的孔周 圍，細(xì)胞因子不從該孔中擴(kuò)散出，因此可識(shí)別出容納了產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞的孔。因而，可 確定目的細(xì)胞即產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞。標(biāo)識(shí)物是能與結(jié)合件物質(zhì)特異件結(jié)合的物質(zhì)的情況當(dāng)孔中容納的被檢體細(xì)胞是產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生免疫球蛋 白，向覆蓋層中加入細(xì)胞因子受體或受體作為結(jié)合性物質(zhì)，產(chǎn)生的一部分免疫球蛋白與覆 蓋層相結(jié)合，產(chǎn)生的與覆蓋層結(jié)合的一部分免疫球蛋白將阻礙細(xì)胞因子受體或受體與標(biāo)識(shí) 物即細(xì)胞因子或配基的結(jié)合，標(biāo)識(shí)物在容納了產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞的孔周圍將不進(jìn)行結(jié) 合。在容納了不產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞、即在抗原刺激下不產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞的孔周 圍，免疫球蛋白不從該孔擴(kuò)散出，無(wú)法阻礙細(xì)胞因子受體或受體與細(xì)胞因子或配基的結(jié)合； 又，在容納了雖然產(chǎn)生免疫球蛋白但該免疫球蛋白不與非細(xì)胞因子受體的受體結(jié)合的細(xì)胞 的孔周圍，以及，在容納了雖然產(chǎn)生免疫球蛋白且該免疫球蛋白與非細(xì)胞因子受體的受體 結(jié)合但不阻礙細(xì)胞因子受體或受體與細(xì)胞因子或配基結(jié)合的細(xì)胞的孔周圍，與從孔中擴(kuò)散 出的免疫球蛋白進(jìn)行結(jié)合，但不封閉細(xì)胞因子受體或受體與細(xì)胞因子或配基的結(jié)合，可識(shí) 別容納了產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞的孔。因而，可確定目的細(xì)胞即產(chǎn)生抗原特異性免疫球蛋 白的細(xì)胞。下文基于圖3說(shuō)明上述方法。(A)在芯片表面涂覆受體。(B)向微孔中添加抗體分泌細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。分泌的抗體進(jìn)行擴(kuò)散。受體特異性抗 體與孔周圍的受體相結(jié)合。(C)當(dāng)與受體結(jié)合的抗體是在受體上配基結(jié)合部分結(jié)合時(shí)，熒光標(biāo)識(shí)配基將不與 受體結(jié)合。(D)當(dāng)與受體結(jié)合的抗體是在受體上配基結(jié)合部分以外結(jié)合時(shí)，熒光標(biāo)識(shí)配基將 與受體結(jié)合。[目的細(xì)胞的制造方法]
本發(fā)明包括目的細(xì)胞的制造方法，該方法包括從孔中回收根據(jù)上述本發(fā)明的篩選 方法確定的目的細(xì)胞。目的細(xì)胞可以是產(chǎn)生特異性免疫球蛋白的細(xì)胞或產(chǎn)生特異性細(xì)胞因 子的細(xì)胞。
此外，本發(fā)明還可從回收的目的細(xì)胞開(kāi)始，回收抗原特異性免疫球蛋白基因mRNA， 表達(dá)抗體cDNA，制造抗原特異性抗體蛋白質(zhì)。又，還可以從產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞開(kāi)始，回收 該細(xì)胞表達(dá)的T細(xì)胞受體基因mRNA，回收T細(xì)胞受體cDNA，并通過(guò)將其導(dǎo)入其他細(xì)胞，來(lái)表 達(dá)T細(xì)胞受體蛋白質(zhì)。實(shí)施例以下將基于實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。示出了微孔陣列芯片的制作例。制作例1示出了使用硅基板的制作例。圖4-1是制作例1的微孔陣列芯片的例子。此外圖 4-2示出了其制作步驟的例子。(1)在硅基板Ι-b上形成氧化膜I-a。(2)在基板上涂布光致抗蝕劑1-c、例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)0FPR_800，用曝光機(jī)形 成圖案。(3)用氟酸緩沖液對(duì)光致抗蝕劑1-c露出的氧化膜Ι-a進(jìn)行蝕刻。(4)用干式蝕刻法、濕式蝕刻法形成深10 20微米的微孔Ι-d。用蝕刻法適當(dāng)?shù)?除去光致抗蝕劑1-c。(5)用引物處理以形成均勻結(jié)合抗體的表面。例如硅烷化處理，在表面、孔內(nèi)壁上 形成硅烷基Ι-e。同時(shí)，在這個(gè)處理步驟中使用的材料、方法可以多種多樣，并不對(duì)本制作例 的處理做出限定。(6)依據(jù)本發(fā)明進(jìn)行抗體分泌細(xì)胞的檢測(cè)。制作例2為了清楚的觀察到細(xì)胞分泌的抗體，可以在孔周圍設(shè)置壁。圖5-1示出了其外觀， 圖5-2示出了其制作例。(1)在硅基板2-b上形成氧化膜2-a。(2)在基板上涂布光致抗蝕劑2-c、例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)0FPR_800，用曝光機(jī)形 成圖案。(3)用氟酸緩沖液對(duì)光致抗蝕劑2-c露出的氧化膜2-a進(jìn)行蝕刻。(4)除去光致抗蝕劑2-c，用蝕刻法形成深1 5微米的凹形2-d。(5)在基板上再次涂布光致抗蝕劑2-e、例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)0FPR_800，用曝光 機(jī)形成圖案。當(dāng)凹形較深時(shí)，優(yōu)選使用東京應(yīng)化工業(yè)(株)0MR-85等負(fù)性抗蝕劑。(6)用干式蝕刻法裝置形成深10 20微米的孔2-f。(7)用引物處理以形成均勻結(jié)合抗體的表面。例如硅烷化處理，在表面、孔內(nèi)壁上 形成硅烷基2-g。同時(shí)，在這個(gè)處理步驟中使用的材料、方法可以多種多樣，并不對(duì)本制作例 的處理做出限定。(8)依據(jù)本發(fā)明進(jìn)行抗體分泌細(xì)胞的檢測(cè)。在本例子中，在孔的周圍形成抑制抗體 擴(kuò)散的壁，抗體擴(kuò)散將抑制散景，容易識(shí)別圖像。
圖5-3是根據(jù)本制作例進(jìn)行了試作。制作例3由于孔周圍表面積的增大，能更明確地觀測(cè)分泌的抗體?？梢酝ㄟ^(guò)例如形成多孔 硅結(jié)構(gòu)或凹凸結(jié)構(gòu)來(lái)增大表面積。例如特開(kāi)平6-21509中記載了多孔硅的制作方法。凹凸 結(jié)構(gòu)例如可通過(guò)蝕刻法、蒸鍍等方法制成。圖6-1示出了其外觀，圖6-2示出了其制作例。(1)在硅基板3-b上形成氧化膜3-a。(2)在基板上涂布光致抗蝕劑3-c、例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)0FPR_800，用曝光機(jī)形 成圖案。(3)用氟酸緩沖液對(duì)光致抗蝕劑3-c露出的氧化膜3-a進(jìn)行蝕刻。
(4)為了增大露出部分開(kāi)口的表面積，例如制作多孔結(jié)構(gòu)3-d。多孔結(jié)構(gòu)可通過(guò)陽(yáng) 極轉(zhuǎn)化處理等方法形成。優(yōu)選用氟酸和硝酸的混酸在表面上形成納米結(jié)構(gòu)。(5)在基板上再次涂布光致抗蝕劑3-e、例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)0FPR-800，用曝光 機(jī)形成圖案。用干式蝕刻法裝置形成深10 20微米的孔3-f。(6)用引物處理以形成均勻結(jié)合抗體的表面。例如硅烷化處理，在表面、孔內(nèi)壁上 形成硅烷基3-g。同時(shí)，在這個(gè)處理步驟中使用的材料、方法可以多種多樣，并不對(duì)本制作例 的處理做出限定。(7)依據(jù)本發(fā)明進(jìn)行抗體分泌細(xì)胞的檢測(cè)。在本例子中，增大孔周圍的表面積、提 高熒光標(biāo)識(shí)結(jié)合密度，將更容易識(shí)別圖像。制作例4通過(guò)與僅在孔周圍的局部存在的抗體相結(jié)合能更明確地觀測(cè)抗體分泌。本方法根 據(jù)圖案形成等進(jìn)行終止來(lái)獲得具有僅與孔周圍的抗體相結(jié)合的能力的物質(zhì)。圖7-1示出了 其外觀，圖7-2示出了其制作例。在硅基板4-b上形成氧化膜4-a。(1)在基板上涂布光致抗蝕劑4-c、例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)0FPR_800，用曝光機(jī)形 成圖案。(2)用氟酸緩沖液對(duì)光致抗蝕劑4-c露出的氧化膜4-a進(jìn)行蝕刻。(3)用引物4_d處理以形成均勻結(jié)合抗體的表面。例如用硅烷偶聯(lián)劑、六甲基二硅 氮烷等終止表面。此外，在這個(gè)處理步驟中使用的材料、方法可以多種多樣，并不對(duì)本制作 例的處理做出限定。(4)在此基礎(chǔ)上，再次涂布光致抗蝕劑4-e、例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)0FPR-800。(5)用曝光機(jī)使光致抗蝕劑4-e形成抗體結(jié)合的圖案。抗體結(jié)合圖案的尺寸必須 比孔大，約1微米左右，接近相鄰孔間隔的二分之一。(6)此外，用曝光機(jī)使光致抗蝕劑4-e加工形成孔圖案。(7)用干式蝕刻法形成深10 20微米孔4-f的孔圖案。當(dāng)形成孔時(shí)，同時(shí)除去 與沒(méi)有受到光致抗蝕劑4-e保護(hù)的抗體結(jié)合的物質(zhì)4-d?？梢杂醚醯入x子體等進(jìn)行除去步
馬聚ο(8)用丙酮等有機(jī)溶劑除去光致抗蝕劑4-e。因而，由于僅在孔周圍存在結(jié)合抗體 的物質(zhì)，可能使抗體結(jié)合范圍僅在局部存在。(9)如果以上步驟使用具有感光性的硅烷偶聯(lián)劑，將能更為簡(jiǎn)化。更具體地，在根 據(jù)制作例1完成加工后，涂布感光性硅烷偶聯(lián)劑，曝光形成預(yù)期圖案，能得到與本制作例相同的結(jié)果。在根據(jù)本制作例制作的微孔陣列芯片上播種熒光標(biāo)識(shí)抗體，圖7-3示出了觀察到 的結(jié)合狀態(tài)。僅觀察孔周圍部分的抗體結(jié)合。又，本制作例的特征是僅在孔周圍形成抗體結(jié) 合表面，它能通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選使用岸本產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社Mix系列等。在聚對(duì)苯撐二 甲基(poly(p-Xylylene)樹(shù)脂表面形成氨基也可能獲得與本制作例相同的結(jié)合表面。又， 如果必要的話可在抗體結(jié)合表面以外部分上形成具有與抗體結(jié)合用引物相反效果的膜，也 能得到相同效果，例如可舉出東洋合成工業(yè)株式會(huì)社· BI0SURFINE等。表面處理方法(圖8)
為使抗Ig抗體均勻地結(jié)合，用以下方法進(jìn)行表面處理。1.除去基板5_a表面的油分等污染物。除去污染物的方法例如用有機(jī)溶劑、酸及 堿洗滌，用氧等離子體等干燥洗滌。可以根據(jù)污染容易度適當(dāng)?shù)剡x擇基板材料。2.其中為了提高基板與抗體等結(jié)合的引物表面的結(jié)合密度，可以在基板表面上形 成置換引物的氫氧基5-b。為了除去基板表面上形成氫氧基的表面微粒子，例如可用左 右的氨水進(jìn)行洗凈。隨后，用水徹底清洗。在硅的情況中，可以用RCA洗滌代替SC-I洗滌。 但是，如果在步驟1中形成了徹底結(jié)合引物的表面，則可省略步驟2。3.在表面結(jié)合引物5-c。浸入硅烷偶聯(lián)劑等中，徹底置換表面的氫氧基。引物例 如是六甲基二硅氮烷，表面經(jīng)疏水化處理。此外，本處理步驟中的引物材料、方法可以多種 多樣，并不對(duì)本表面處理例做出限定。引物主要是硅烷偶聯(lián)劑或硅烷劑，特征在于能結(jié)合有機(jī)物及無(wú)機(jī)物，用作表面改 良劑，具有疏水化表面。用作半導(dǎo)體主要以六甲基二硅氮烷為典型的材料?？筛鶕?jù)基板材 料適當(dāng)?shù)剡x擇引物，例如信越〉'J 二一 > (silicone)社出售的硅烷偶聯(lián)劑、硅烷劑等。引物涂布的方法可多種多樣，有浸漬、旋涂、氣體擴(kuò)散、N2氣泡噴射等，有必要根據(jù) 選擇的材料選擇使用最合適的方法。例如在氣體擴(kuò)散法中，可以將其暴露在5 10分鐘左 右氣化的引物密閉容器氛圍氣體中進(jìn)行實(shí)施。依據(jù)本制作例得到的微孔陣列芯片不限于是由硅形成，還可以由樹(shù)脂、金屬、玻璃 等形成。其形態(tài)也不僅限于材料單體，還可以是形成在基板上的膜形狀。樹(shù)脂可舉出例如丙烯酸樹(shù)脂、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、ABS、聚氨酯、環(huán)氧樹(shù)脂、 熱硬化型樹(shù)脂、光硬化性樹(shù)脂、光溶解性樹(shù)脂等。這些樹(shù)脂可以通過(guò)噴射、壓縮、熱硬化、光 硬化、干式蝕刻法等成型。可以在玻璃、硅、金屬基板上用樹(shù)脂制膜進(jìn)行成型加工。成型為 微孔形狀的樹(shù)脂還可與硅相同，用引物進(jìn)行表面處理，可以進(jìn)行抗體結(jié)合。例如，可根據(jù)本 發(fā)明記載的表面處理方法進(jìn)行實(shí)現(xiàn)。又，也可以利用感光性引物，與硅相同地形成抗體結(jié)合 圖案。其中，可以考慮與樹(shù)脂材料的結(jié)合性適當(dāng)?shù)剡x擇所使用的引物。此外，如果樹(shù)脂表面 具有能與抗體耦合而結(jié)合的能力，具有抗體結(jié)合性，則還能降低成本。金屬可舉出例如鋁、鋁合金、銅合金、金、不銹鋼等。這些金屬可通過(guò)金型成形、蝕 刻法等成型。也可以在玻璃、硅及金屬基板上制得金屬膜進(jìn)行成型加工。成型為微孔形狀 的金屬還可與硅相同地用引物進(jìn)行表面處理，以便能結(jié)合抗體。例如可根據(jù)本發(fā)明記載的 表面處理方法實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。其中，可以考慮與金屬材料的結(jié)合性而進(jìn)行適當(dāng)?shù)剡x擇所使用 的引物。可用蝕刻法使玻璃形成微孔。又，還可在表面用樹(shù)脂、硅、金屬制膜，形成微孔。成型為微孔形狀的金屬可與硅相同用引物進(jìn)行表面處理，以便能結(jié)合抗體。例如可根據(jù)本發(fā) 明記載的表面處理方法實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。其中使用的引物可考慮與玻璃、表面制膜材料的結(jié)合 性而進(jìn)行適當(dāng)選擇。以下的實(shí)施例使用了根據(jù)制作例1制作的硅制微孔陣列芯片。但是，實(shí)施例中使用芯片的孔的表面形狀是六角形的(制作例1是圓形的)。實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)方法(試驗(yàn)I)1.[涂布抗人IgG芯片]在經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑處理的硅制微孔陣列芯片上加入80 μ L 按10 μ g/mL的濃度用PBS稀釋的抗人IgG抗體，為防止芯片上的液體變干將芯片置入保濕 箱(圖9)，室溫(15-25°C)下靜置1小時(shí)，使抗IgG抗體結(jié)合在硅芯片表面上。這時(shí)，與下 述步驟2不同的，不進(jìn)行減壓脫氣，也不向孔中加入抗體，而是將抗體分布在孔周圍。(之 后，當(dāng)孵化芯片時(shí)通常將其放入上述保濕箱中防止干燥。)2.[封閉]除去芯片上的抗體溶液，向芯片中加入IOOyL PBS，隨后重復(fù)3次除去 的洗滌操作后，向芯片上加入100 μ L含有0.2% (v/v) Lipidure (日本油脂(株)、BL-B03 Lipidure (5wt% ))的PBS，用真空泵減壓徹底除去微孔內(nèi)的氣泡，使芯片表面及孔內(nèi)充滿 Lipidure液。室溫(15-25°C )下靜置15分鐘，進(jìn)行封閉。3.[細(xì)胞添加]用100 μ L含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液清洗芯片3次后，向芯 片上加入用含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液清洗2次的Χ63/116細(xì)胞(相對(duì)于B型肝炎病 毒表面抗原(HBs抗原)分泌人IgG)或HyHELlO 110TC細(xì)胞(相對(duì)于雞蛋溶菌酶(HEL)分 泌小鼠/人嵌合體抗體)，將細(xì)胞置入孔內(nèi)，在室溫下靜置10分鐘。4.[細(xì)胞培養(yǎng)]用含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液清洗沒(méi)加入孔內(nèi)的細(xì)胞數(shù)次(直 到除去多余的細(xì)胞)并除去后，向芯片上加入80 μ L 10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液，將芯片 置入CO2孵化器(37°C，5%C02)中，培養(yǎng)芯片上細(xì)胞2 3小時(shí)。5.[生物素標(biāo)識(shí)抗原的結(jié)合]在防止細(xì)胞從孔中漏出的同時(shí)，除去芯片表面的 緩沖液，在芯片表面上加入約100 μ L PBS清洗芯片，重復(fù)數(shù)次后除去PBS，向芯片上加入 80 μ L 1 μ g/mL生物素標(biāo)識(shí)HEL或生物素標(biāo)識(shí)HBs抗原，室溫下靜置30分鐘。6.與5相同的用PBS洗凈芯片后，向芯片上加入80 μ L原液稀釋1000倍的Cy3標(biāo) 識(shí)抗生蛋白鏈菌素(SIGMA，S-6402)，同樣地在室溫下靜置30分鐘。7.與5相同的用PBS洗凈芯片后，向芯片上加入PBS，在熒光顯微鏡下觀察Cy3的 熒光，以孔周圍擴(kuò)展出圓環(huán)形的Cy3的熒光為指標(biāo)，確認(rèn)容納了分泌抗原特異性抗體的細(xì) 胞的孔的位置(圖10)。8.向芯片上加入80 μ L 1 μ g/mL的Oregon Green,室溫下靜置3分鐘，使Oregon Green標(biāo)識(shí)細(xì)胞。與5相同的用PBS洗凈芯片后，向芯片中加入新鮮的PBS，以O(shè)regon Green 的熒光為指標(biāo)觀察細(xì)胞，同時(shí)用微操作裝置回收分泌了目的抗原特異性抗體的細(xì)胞。用本發(fā)明的方法(FLISP0T法)確定微孔陣列芯片上的分泌抗原特異性抗體的細(xì) 胞在涂布了抗IgG抗體的硅制微孔陣列芯片上培養(yǎng)HyHELlO 110TC細(xì)胞、X63/116細(xì) 胞、110TC細(xì)胞(陰性對(duì)照、不分泌抗體)，隨后，用生物素標(biāo)識(shí)HEL或生物素標(biāo)識(shí)HBs抗原 及Cy3標(biāo)識(shí)抗生蛋白鏈菌素檢測(cè)抗原特異性抗體的分泌(圖11A)。如圖IlA所示，檢測(cè)到的分泌出的抗體在孔周圍呈圓環(huán)狀分布。沒(méi)有分泌抗體的添加了 110TC的芯片上沒(méi)有檢測(cè) 到信號(hào)。然后用Oregon Green對(duì)細(xì)胞染色并確認(rèn)細(xì)胞。(圖11B)這種染色是抗原特異性的，在加入了 HyHELlO 110TC細(xì)胞的芯片上能檢測(cè)到生物 素標(biāo)識(shí)HEL的信號(hào)，但檢測(cè)不到生物素標(biāo)識(shí)HBs抗原的信號(hào)。相反，在加入了 X63/116細(xì)胞 的芯片上不能檢測(cè)到生物素標(biāo)識(shí)HEL的信號(hào)，而能檢測(cè)到生物素標(biāo)識(shí)HBs抗原的信號(hào)(沒(méi) 有示出數(shù)據(jù))。根據(jù)FLISP0T法確定分泌抗原特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞(應(yīng)用試驗(yàn)I)制作經(jīng)HEL蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞，用常規(guī)的聚乙烯醇的方法制作與 X63. Ag8. 653骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞。在HAT選擇性培養(yǎng)基中選擇雜交瘤細(xì)胞后， 向涂布了抗小鼠IgG抗體的微孔陣列芯片上加入雜交瘤細(xì)胞，洗滌除去未置入孔中的細(xì)胞 后，在芯片上培養(yǎng)1小時(shí)30分鐘。用生物素標(biāo)識(shí)HEL及PE標(biāo)識(shí)抗生蛋白鏈菌素檢測(cè)相對(duì) 于HEL分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞(圖11A)。隨后在細(xì)胞中加入Oregon Green確認(rèn)細(xì)胞位置 (圖11B)。(圖11C)是A和B的組合。實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)方法(試驗(yàn)II)制作小鼠⑶138陽(yáng)性細(xì)胞(抗體分泌細(xì)胞)1.制作小鼠脾細(xì)胞。2.在100 ii L細(xì)胞懸浮液中按每106細(xì)胞小于1 y g的量加入抗小鼠⑶138抗體， 4°C時(shí)孵化15分鐘。3用lOmLPBS洗凈細(xì)胞2次后，將細(xì)胞懸浮于100 u LPBS中，在細(xì)胞懸浮液中按每 106細(xì)胞小于1 P g的量加入抗大鼠k鏈抗體結(jié)合微珠，4°C時(shí)孵化15分鐘。4.用lOmLPBS洗凈細(xì)胞2次后，將細(xì)胞懸浮在1000 u L PBS中，用AutoMACS回收 CD138陽(yáng)性細(xì)胞。制作人⑶138陽(yáng)性細(xì)胞1.根據(jù)人末梢血常規(guī)方法(用于淋巴細(xì)胞的比重離心法)分離淋巴細(xì)胞。2.按每107細(xì)胞加入20 ii L的量加入Fc受體封閉試劑(S >歹二一 才歹夕 (miltenyibiotec)(株))后，按每106細(xì)胞小于1 y g的量加入抗CD138抗體結(jié)合微珠，4°C 時(shí)孵化15分鐘。3.用lOmLPBS洗凈細(xì)胞2次后，將細(xì)胞懸浮在1000 ii LPBS中，用AutoMACS回收 CD138陽(yáng)性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)方法(延續(xù)試驗(yàn)II)1.以下實(shí)驗(yàn)中在孵化芯片時(shí)采用與試驗(yàn)I相同的防止干燥措施。2.在經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑處理的硅制微孔陣列芯片上加入80 y L用PBS稀釋的10 u g/ mL來(lái)自驢的抗山羊IgG抗體，為防止芯片上的液體變干而將芯片置入保濕箱(圖1)中，室 溫(15 25°C )靜置1小時(shí)，使來(lái)自驢的抗山羊IgG抗體結(jié)合在硅芯片表面。3.除去芯片上的抗體溶液，用100 ii L PBS清洗3次后，在芯片上加入100 y L含 0. 2% (v/v)Lipidure(日本油脂(株)、BL_B03Lipidure (5wt% ))的 PBS，減壓除去微孔內(nèi) 的氣泡，在芯片表面及孔內(nèi)充滿Lipidure液。室溫下靜置15分鐘進(jìn)行封閉。4.用100iiL含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液清洗芯片3次后，在芯片上加入用IOmL PBS洗滌1次的⑶138陽(yáng)性抗體分泌細(xì)胞(將1 2X IO6個(gè)細(xì)胞懸浮在30 μ LPBS 中)，將細(xì)胞置入孔內(nèi)，室溫下靜置10分鐘。5.用含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌除去沒(méi)有進(jìn)入孔內(nèi)的細(xì)胞，隨后在芯片 上加入80 μ L 10 μ g/mL來(lái)自山羊的抗人(或小鼠)IgG,室溫下靜置30分鐘，使抗體結(jié)合在 芯片表面的抗山羊IgG抗體上。
6.在防止細(xì)胞溢出孔的同時(shí)用含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液洗凈芯片后，再向 芯片中加入80 μ L含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液，在CO2孵化器內(nèi)(37°C，5%C02)培養(yǎng)細(xì) 胞3小時(shí)。7.下面的步驟按照試驗(yàn)I步驟5之后的步驟進(jìn)行。用本發(fā)明的方法(FLISP0T法)檢測(cè)經(jīng)HEL免疫的小鼠脾細(xì)胞中的分泌HEL特異 性抗體的細(xì)胞用經(jīng)雞蛋溶菌酶(HEL)免疫的BALB/c小鼠脾細(xì)胞調(diào)制CD138陽(yáng)性細(xì)胞，按照試驗(yàn) II在結(jié)合了來(lái)自驢的抗山羊IgG抗體的硅制微孔陣列芯片上添加細(xì)胞，通過(guò)隨后的試驗(yàn)來(lái) 自山羊的抗小鼠IgG抗體結(jié)合在芯片上后，培養(yǎng)細(xì)胞約3小時(shí)。然后，加入生物素標(biāo)識(shí)HEL 及Cy3標(biāo)識(shí)抗生蛋白鏈菌素，在熒光顯微鏡下檢測(cè)正在分泌HEL特異性IgG抗體的細(xì)胞(圖 12)。隨后，用微操作裝置回收細(xì)胞，擴(kuò)增抗體基因。其制作出的結(jié)果是7個(gè)IgG中有6個(gè) 結(jié)合了 HEL(沒(méi)有示出數(shù)據(jù))。用本發(fā)明的方法(FLISP0T法)檢測(cè)人末梢血淋巴細(xì)胞中分泌HBs抗原特異性抗 體的細(xì)胞按照試驗(yàn)II用經(jīng)HBs抗原疫苗增強(qiáng)的健康人的末梢血調(diào)制⑶138陽(yáng)性細(xì)胞。按 照試驗(yàn)II向結(jié)合了來(lái)自驢的抗山羊IgG抗體的硅制微孔陣列芯片上添加⑶138陽(yáng)性細(xì)胞， 隨后按照試驗(yàn)在芯片上結(jié)合來(lái)自山羊的抗人IgG抗體，培養(yǎng)細(xì)胞約3小時(shí)。之后，加入生物 素標(biāo)識(shí)HBs抗原及Cy3標(biāo)識(shí)抗生蛋白鏈菌素，在熒光顯微鏡下檢測(cè)正在分泌HBs抗原特異 性IgG抗體的細(xì)胞(圖13)。在獲得同意的志愿者接種HBs疫苗7天后，從眼睛采血IOOmL,從末梢血淋巴細(xì)胞 中選出CD138陽(yáng)性細(xì)胞，播種到涂布了抗人IgG的芯片上。細(xì)胞培養(yǎng)后，用生物素標(biāo)識(shí)HBs 抗原及Cy3標(biāo)識(shí)抗生蛋白鏈菌素檢測(cè)分泌HBs特異性抗體的細(xì)胞?；厥杖?4個(gè)孔中的 細(xì)胞。接種HBs疫苗8天后，從眼睛采血IOOmL,從其中的末梢血淋巴細(xì)胞中按照相同方法 檢測(cè)分泌HBs特異性抗體的細(xì)胞，回收57個(gè)孔的細(xì)胞。根據(jù)這些細(xì)胞制作抗體53對(duì)H鏈 和L鏈的cDNA。將cDNA經(jīng)表達(dá)載體的H鏈和L鏈對(duì)通過(guò)基因?qū)?93T細(xì)胞(來(lái)自人胎兒 腎的細(xì)胞株)中，回收培養(yǎng)的上清液，用ELISA解析上清液中分泌的抗體是否與HBs抗原結(jié) 合。結(jié)果可產(chǎn)生41個(gè)抗體蛋白，其中36個(gè)具有HBs抗原特異性。實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)方法(試驗(yàn)III)1.向經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑處理的硅制微孔陣列芯片上添加80 μ L用PBS稀釋的10 μ g/ mL抗原(HEL蛋白)，為防止芯片上的液體變干，將芯片置入保濕箱(圖9)中，室溫(15 250C )下靜置1小時(shí)，使HEL蛋白結(jié)合在硅芯片表面。(之后，在芯片孵化時(shí)通常置入上述 箱中防止干燥。)2.除去芯片上的抗原溶液，用IOOyL PBS洗凈3次后，向芯片上添加IOOyL含0. 2% (v/v) Lipidure (日本油脂(株)、BL_B03Lipidure (5wt% ))的 PBS，減壓除去微孔內(nèi) 氣泡，在芯片表面及孔內(nèi)充滿Lipidure液。室溫下靜置15分鐘，進(jìn)行封閉。3.根據(jù)試驗(yàn)II從經(jīng)HEL免疫的小鼠脾細(xì)胞調(diào)制⑶138陽(yáng)性細(xì)胞。4.用含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液洗凈芯片后，在芯片上添加用IOmL PBS洗滌 1次的⑶138陽(yáng)性細(xì)胞(1 2 X IO6個(gè)細(xì)胞懸浮在30 μ L PBS中)，將細(xì)胞置入孔內(nèi)，靜置 約10分鐘。5.用含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌除去沒(méi)有進(jìn)入孔內(nèi)的細(xì)胞，在芯片上添 加80μ L含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液，將芯片置入CO2孵化器(37 °C，5% CO2)中，培養(yǎng) 芯片上的細(xì)胞3小時(shí)。 6.在防止細(xì)胞要從孔中溢出的同時(shí)，除去芯片表面的緩沖液，在芯片表面上添加 IOOyL PBS，重復(fù)數(shù)次上述操作，洗凈芯片后，在芯片上添加80 μ L 1 μ g/mLCy3標(biāo)識(shí)抗小鼠 IgG，室溫下靜置30分鐘。7.與6相同用PBS洗凈芯片后，在芯片上添加PBS，在熒光顯微鏡下觀察Cy3熒 光，以Cy3熒光在孔周圍以圓環(huán)狀展開(kāi)為指標(biāo)確認(rèn)容納有正在分泌抗原特異性抗體的細(xì)胞 的孔的位置(圖14)。8.在芯片上添加80 μ L Oregon Green,室溫下靜置3分鐘，用Oregon Green標(biāo)識(shí) 細(xì)胞。與上述6相同用PBS洗凈芯片后，在芯片上加入新鮮的PBS，以O(shè)regonGreen的熒光 為指標(biāo)觀察細(xì)胞，同時(shí)用微操作裝置回收正在分泌目的抗原特異性抗體的細(xì)胞。實(shí)施例4實(shí)驗(yàn)方法(應(yīng)用試驗(yàn)IV)用酶標(biāo)識(shí)抗原或用酶標(biāo)識(shí)抗體代替熒光標(biāo)識(shí)抗原或熒光標(biāo)識(shí)抗體。變更點(diǎn)1.在酶標(biāo)識(shí)抗原或酶標(biāo)識(shí)抗體發(fā)生作用后，在芯片上添加加入了酶的基質(zhì)的緩沖
液，在室溫中孵化。2.基質(zhì)在酶作用下產(chǎn)生的產(chǎn)物呈環(huán)狀沉淀在孔周圍。用光學(xué)顯微鏡觀察，檢測(cè)分 泌抗體的細(xì)胞。酶堿性磷酸酶，基質(zhì)BCIP/NBT也可以用量子點(diǎn)(quantum dot)代替熒光色素結(jié)合的抗原、抗體進(jìn)行檢測(cè)。產(chǎn)生 細(xì)胞因子的細(xì)胞的檢測(cè)1.在芯片上結(jié)合抗細(xì)胞因子抗體而不是在芯片上結(jié)合抗IgG抗體，隨后在芯片上 播種正在分泌細(xì)胞因子的T細(xì)胞等，產(chǎn)生細(xì)胞因子。2.分泌出的細(xì)胞因子結(jié)合在孔周圍的抗細(xì)胞因子抗體上。3.隨后，加入熒光或酶標(biāo)識(shí)的抗細(xì)胞因子抗體，可檢測(cè)到孔周圍結(jié)合的細(xì)胞因子 環(huán)，進(jìn)行分泌細(xì)胞因子的T細(xì)胞等的檢測(cè)。芯片上的免疫斑點(diǎn)檢測(cè)(ImmunoSpot Assay on Chip(ISAC))分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞檢測(cè)方法1.從人末梢血調(diào)制淋巴細(xì)胞，在CO2孵化器內(nèi)(37°C，5% CO2)內(nèi)在lOng/mL卟啉 醇肉豆蓮酸乙酸酉旨(phorbol myristate acetate) (PMA), 1 μ M 伊屋諾霄素(ionomycine)的存在下刺激一夜。2.回收洗凈淋巴細(xì)胞后，在涂布了抗人IFNY抗體的微孔陣列芯片上加入細(xì)胞， 為了防止干燥置入保濕箱(圖9)中，在0)2孵化器內(nèi)(37°C，5%C02)內(nèi)培養(yǎng)5小時(shí)。3用PBS-TWeen20洗凈芯片后，在芯片上添加生物素標(biāo)識(shí)抗人IFN y抗體，在保濕 箱內(nèi)室溫下孵化30分鐘。4.用PBS-TWeen20洗凈芯片后，添加鏈酶親和素，在保濕箱內(nèi)室溫下孵化30分鐘。5.用PBS-TWeen20洗凈芯片后，在熒光顯微鏡下觀察分泌的細(xì)胞因子信號(hào)。(曝光2秒)圖15示出了結(jié)果。實(shí)施例5 (獲得封閉抗體)1.以下實(shí)驗(yàn)中芯片孵化時(shí)與試驗(yàn)I相同采取了防干燥措施。2.在經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑處理的硅制微孔陣列芯片上添加80 y L用PBS稀釋的10 u g/ mLTRAIL-Rl/Fc，為防止芯片上的液體變干，將芯片置入保濕箱(圖9)中，室溫(15 25°C) 下靜置1小時(shí)，待TRAIL-Rl/Fc結(jié)合在硅芯片表面上。3.除去芯片的抗體溶液，用100 iiL PBS洗滌3次后，在芯片上添加100 iiL含 0. 2% (v/v)Lipidure(日本油脂(株)、BL_B03Lipidure (5wt% ))的 PBS，減壓除去微孔內(nèi) 氣泡，將芯片表面及孔內(nèi)充滿Lipidure液。室溫下靜置15分鐘進(jìn)行封閉。4.用lOOii L含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌芯片3次后，在芯片上加入先用 10mL洗滌1次后再用1000 ii L含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌2次的⑶138陽(yáng)性抗體 分泌細(xì)胞(1 2X 106個(gè)細(xì)胞懸浮在30 ii L含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液中)，將細(xì)胞置 入孔內(nèi)，室溫下靜置10分鐘。5.在防止細(xì)胞從孔中溢出的同時(shí)用含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)液洗凈芯片，再 向芯片上添加80iiL含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液，在0)2孵化器內(nèi)(37°C，5%C02)中培 養(yǎng)細(xì)胞3小時(shí)。6.在防止細(xì)胞從孔中溢出的同時(shí)除去芯片表面的緩沖液，在芯片表面添加約 100 UL的PBS，再除去，重復(fù)數(shù)次上述操作，洗凈芯片后，在芯片上添加80P LI y g/mL生物 素標(biāo)識(shí)TRAIL，室溫下靜置30分鐘。7.與6相同用PBS洗凈芯片后，在芯片上添加80 y L原液稀釋1000倍的Cy3標(biāo)識(shí) 抗生蛋白鏈菌素(SIGMA，S-6402)，同樣在室溫下靜置30分鐘。8.與6相同用PBS洗凈芯片后，在芯片上添加PBS，在熒光顯微鏡下觀察Cy3的熒 光，以芯片表面的孔周圍有Cy3的熒光時(shí)呈紅色，沒(méi)有結(jié)合Cy3的熒光時(shí)呈黑色圓環(huán)狀為指 標(biāo)，確認(rèn)容納了正在分泌TRAIL-Rl/Fc與其配基的TRAIL間封閉的細(xì)胞的孔的位置。9.在芯片上添加80 ii L lu g/mL Oregon Green,室溫下靜置3分鐘使Oregon Green標(biāo)識(shí)。與6相同用PBS洗凈芯片后，在芯片上加入新鮮的PBS，以O(shè)regon Green的熒 光為指標(biāo)觀察細(xì)胞，同時(shí)用微操作裝置回收正在分泌目的抗原特異性抗體的細(xì)胞。實(shí)施例6 (應(yīng)用于機(jī)能性抗體的篩選)在芯片表面涂布受體蛋白，在芯片上播種由經(jīng)受體蛋白免疫的小鼠脾細(xì)胞調(diào)制的 CD138細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)后，添加生物素標(biāo)識(shí)配基及Cy3標(biāo)識(shí)抗生蛋白鏈菌素。雖然芯片大部 分結(jié)合了生物素標(biāo)識(shí)配基/Cy3標(biāo)識(shí)抗生蛋白鏈菌素，但由于封閉了受體配基結(jié)合而產(chǎn)生機(jī)能性抗體的細(xì)胞的孔周圍生物素標(biāo)識(shí)配基/Cy3標(biāo)識(shí)抗生蛋白鏈菌素的結(jié)合被阻斷，因 此是暗色的。圖16示出了結(jié)果。左生物素標(biāo)識(shí)配基/Cy3標(biāo)識(shí)抗生蛋白鏈菌素的檢測(cè)結(jié) 果。中觀察Oregon Green對(duì)細(xì)胞的標(biāo)識(shí)。右重合左圖和中圖的結(jié)果。產(chǎn)業(yè)上的實(shí)用性本發(fā)明可用于與篩選產(chǎn)生特異性免疫球蛋白的細(xì)胞及產(chǎn)生特異性細(xì)胞因子的細(xì)胞等免疫細(xì)胞的方法相關(guān)聯(lián)的技術(shù)領(lǐng)域，例如與抗體醫(yī)藥等免疫相關(guān)的醫(yī)藥或診斷領(lǐng)域。
權(quán)利要求
一種微孔陣列，該微孔陣列是在基體一側(cè)的主表面上具有多個(gè)孔，孔具有僅可容納一個(gè)細(xì)胞的尺寸的微孔陣列，其特征在于，至少在上述孔周圍的上述主表面的至少一部分上含有具有結(jié)合性的物質(zhì)的覆蓋層，所述具有結(jié)合性的物質(zhì)是與上述孔中容納的至少一部分細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1記載的微孔陣列，在該微孔陣列的至少一部分孔中同時(shí)容納細(xì)胞和細(xì) 胞培養(yǎng)液，將上述覆蓋層及孔浸漬在培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)液含有的物質(zhì)能從孔向上述覆蓋層 擴(kuò)散的狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞；除去上述培養(yǎng)后的培養(yǎng)液之后，檢測(cè)孔中容納的至少一部分細(xì)胞 產(chǎn)生的物質(zhì)與上述覆蓋層的物質(zhì)有無(wú)結(jié)合。
3.如權(quán)利要求1或2記載的微孔陣列，上述孔中容納的至少一部分細(xì)胞是產(chǎn)生免疫球 蛋白的細(xì)胞或產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1或2記載的微孔陣列，上述孔中容納的至少一部分細(xì)胞是產(chǎn)生免疫球 蛋白的細(xì)胞，與產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)是抗免疫 球蛋白抗體或抗原。
5.如權(quán)利要求4記載的微孔陣列，使用與產(chǎn)生的免疫球蛋白相對(duì)應(yīng)的抗體或抗原進(jìn)行 上述有無(wú)結(jié)合的檢測(cè)。
6.如權(quán)利要求1或2記載的微孔陣列，上述孔中容納的至少一部分細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞因 子的細(xì)胞，與產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)是抗細(xì)胞因子 抗體或細(xì)胞因子受體。
7.如權(quán)利要求6記載的微孔陣列，使用與產(chǎn)生的細(xì)胞因子相對(duì)應(yīng)的抗體或細(xì)胞因子受 體進(jìn)行上述有無(wú)結(jié)合的檢測(cè)。
8.如權(quán)利要求1或2記載的微孔陣列，上述孔中容納的至少一部分細(xì)胞是產(chǎn)生免疫球 蛋白的細(xì)胞，與產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)是細(xì)胞因 子受體或受體。
9.如權(quán)利要求8記載的微孔陣列，使用細(xì)胞因子或配基進(jìn)行上述有無(wú)結(jié)合的檢測(cè)。
10.如權(quán)利要求1 9任一項(xiàng)記載的微孔陣列，產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞及產(chǎn)生細(xì)胞因子 的細(xì)胞是天然細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求1 10任一項(xiàng)記載的微孔陣列，基體是板狀的。
12.如權(quán)利要求1 11任一項(xiàng)記載的微孔陣列，不含具有結(jié)合性的物質(zhì)的覆蓋層的上 述主表面的至少一部分涂布有封閉劑，所述的具有結(jié)合性物質(zhì)是具有與孔中容納的細(xì)胞產(chǎn) 生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)。
13.目的細(xì)胞的篩選方法，包括以下步驟基體一側(cè)的主表面上具有多個(gè)孔，孔具有僅可容納一個(gè)細(xì)胞的尺寸，并且至少在上述 孔周圍的上述主表面的至少一部分上具有與目的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性 的物質(zhì)的覆蓋層，在具有覆蓋層的微孔陣列的至少一部分孔中容納了被檢體細(xì)胞和細(xì)胞培 養(yǎng)液；將上述覆蓋層及孔均浸漬在培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)液中含有的物質(zhì)能從孔向上述覆蓋層擴(kuò) 散的狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞；用任意方法除去培養(yǎng)液后，向上述覆蓋層中加入與被檢體細(xì)胞含有的目的細(xì)胞產(chǎn)生的 物質(zhì)特異性結(jié)合的標(biāo)識(shí)物；與上述覆蓋層物質(zhì)結(jié)合后，根據(jù)上述標(biāo)識(shí)物檢測(cè)目的細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)，確定目的細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求13記載的篩選方法，包括含有上述被檢體細(xì)胞的細(xì)胞是接受預(yù)期抗 原的刺激能產(chǎn)生物質(zhì)的狀態(tài)的細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求13或14記載的篩選方法，包括上述被檢體細(xì)胞是產(chǎn)生免疫球蛋白的 細(xì)胞或產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求13或14記載的篩選方法，上述被檢體細(xì)胞包括產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì) 胞，與目的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)是抗免疫球蛋白抗體或抗原，目 的細(xì)胞是產(chǎn)生抗原特異性免疫球蛋白的細(xì)胞。
17.如權(quán)利要求16記載的篩選方法，使用與產(chǎn)生的免疫球蛋白相對(duì)應(yīng)的抗體或抗原進(jìn) 行上述有無(wú)結(jié)合的檢測(cè)。
18.如權(quán)利要求13或14記載的篩選方法，上述被檢體細(xì)胞包括產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì) 胞，與目的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)是細(xì)胞因子受體或受體，目的細(xì) 胞是產(chǎn)生抗原特異性免疫球蛋白的細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求18記載的篩選方法，使用細(xì)胞因子或配基進(jìn)行上述有無(wú)結(jié)合的檢測(cè)。
20.如權(quán)利要求13或14記載的篩選方法，上述被檢體細(xì)胞包括產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞， 與目的細(xì)胞產(chǎn)生的至少一部分物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)是抗細(xì)胞因子抗體或細(xì)胞因子受體， 目的細(xì)胞是產(chǎn)生抗原特異性細(xì)胞因子的細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求20記載的篩選方法，使用與產(chǎn)生的細(xì)胞因子相對(duì)應(yīng)的抗體或細(xì)胞因子 受體進(jìn)行上述有無(wú)結(jié)合的檢測(cè)。
22.如權(quán)利要求13 21任一項(xiàng)記載的篩選方法，產(chǎn)生免疫球蛋白的細(xì)胞及產(chǎn)生細(xì)胞因 子的細(xì)胞是天然細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞或細(xì)胞株。
23.目的細(xì)胞的制造方法，包括從孔中回收根據(jù)權(quán)利要求13 22任一項(xiàng)記載的篩選方 法確定的目的細(xì)胞的步驟。
24.如權(quán)利要求23記載的制造方法，目的細(xì)胞是產(chǎn)生特異性免疫球蛋白的細(xì)胞或產(chǎn)生 特異性細(xì)胞因子的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種能同時(shí)測(cè)定在芯片上超過(guò)1萬(wàn)個(gè)抗原刺激下的淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性、及掌握個(gè)別細(xì)胞狀態(tài)的方法，以及用于該方法的裝置。本發(fā)明的微孔陣列是在基體的一側(cè)主表面上具有多個(gè)孔，孔具有僅可容納一個(gè)細(xì)胞的尺寸的微孔陣列。在孔周圍的主表面上形成了與孔中容納的細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)的覆蓋層。涉及一種篩選目的細(xì)胞的方法，包括在上述微孔陣列的孔中同時(shí)容納被檢體細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液；將覆蓋層與孔浸漬在培養(yǎng)液中；在培養(yǎng)液中含有的物質(zhì)能從孔向覆蓋層擴(kuò)散的狀態(tài)下培養(yǎng)細(xì)胞；向覆蓋層提供標(biāo)識(shí)物，該標(biāo)識(shí)物可與被檢體細(xì)胞含有的目的細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)特異性結(jié)合；根據(jù)標(biāo)識(shí)物檢測(cè)目的細(xì)胞產(chǎn)生的已與覆蓋層物質(zhì)相結(jié)合的物質(zhì)，由此確定目的細(xì)胞。
文檔編號(hào)G01N33/15GK101861383SQ20088010169
公開(kāi)日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2008年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月2日
發(fā)明者小幡勤, 岸裕幸, 村口篤, 金艾順 申請(qǐng)人:富山縣;SC World株式會(huì)社