專利名稱:凍干的b型肝炎疫苗的制作方法
本發(fā)明是有關(guān)B型肝炎疫苗的凍干制劑。特別是有關(guān)B型肝炎疫苗的凍干制劑，是通過HBs抗原得到純化的產(chǎn)品，在鋁凝膠和一種穩(wěn)定劑存在下經(jīng)凍干而制備的B型肝炎疫苗的凍干制劑，上述HBs抗原是由能夠產(chǎn)生HBs抗原的轉(zhuǎn)化生物體來表達(dá)，該抗原是用常規(guī)DNA重組技術(shù)制備的。
B型肝炎是一種由B型肝炎病毒引起的疫病(下文用“HBV”表示)，并包含有免疫學(xué)上和臨床上非常重要的問題。但從未找到任何有效的治療方法。為此，主要研究的是預(yù)防方法。合適的預(yù)防方法是提供一種以HBs抗原為有效成份的疫苗給恐怕要感染HBV的人。一種疫苗已在實(shí)踐中使用，這種疫苗的制備方法是從一組僅稱為“帶菌者”的潛伏病毒攜帶者的血漿里得到的高純HBs抗原制備的。
然而，血源疫苗是以HBs抗原陽性者的血漿里得到的，因此其制備方法存在有各種各樣的問題，比如得到足夠的原始血漿就很困難;為必須在黑猩猩體內(nèi)作安全試驗(yàn)，以便證明在制劑中不留有感染因子，如B型肝炎病毒或任何其它血源病毒;此外，要得到足夠的試驗(yàn)用黑猩猩也很困難。
為了解決這些問題，許多研究者正在從事研究獲得大量起始HBs抗原的技術(shù)，采用的辦法是用DNA重組技術(shù)，通過將一個(gè)編碼HBs抗原蛋白質(zhì)的HBV DNA到大腸桿菌或酵母里，并用這樣獲得的轉(zhuǎn)化了的微生物來表達(dá)HBs抗原。最近，用這些重組微生物表達(dá)HBs抗原已獲成功。特別是在用重組體酵母生產(chǎn)HBs抗原已在工業(yè)規(guī)模內(nèi)完成，其后，已經(jīng)進(jìn)行試驗(yàn)純化這樣獲得的HBS抗原，并制備B型肝炎疫苗的制劑。
B型肝炎疫苗對(duì)預(yù)防醫(yī)務(wù)工作者的病毒感染很有效，對(duì)于偶爾和B型肝炎病人和潛在的病毒帶毒者以及病人、帶菌者及嬰兒的家屬接觸的研究者預(yù)防也有效，此時(shí)病毒是通過血液感染的。據(jù)說在日本，通常發(fā)現(xiàn)的帶菌者為總?cè)丝诘?-3%，而在東南亞和非洲達(dá)10-15%。因此，提取B型肝炎疫苗在世界范圍內(nèi)都是需要的。根據(jù)這個(gè)論點(diǎn)，需要在世界范圍內(nèi)包括日本在內(nèi)，制造廣泛可得到的B型肝炎疫苗，而且重要的是要提供一種穩(wěn)定的且能長期保存的制劑。
商用B型肝炎疫苗是從血源HBs抗原產(chǎn)品中獲得的一種液態(tài)制劑，而且在儲(chǔ)藏期間能逐漸失去其抗原效價(jià)。
在此情況下，本發(fā)明人研究了在工業(yè)規(guī)模上制備長時(shí)期內(nèi)，有更大儲(chǔ)存穩(wěn)定性的B型肝炎疫苗的方法，而且還發(fā)現(xiàn)了能用重組體源HBs抗原代替血源HBs抗原，以及在特定條件下凍干HBs抗原得到所要的疫苗。
已知一種未活化的疫苗是通過摻入佐劑，如鋁凝膠而制備的，為的是在用疫苗時(shí)提高人體內(nèi)的抗體產(chǎn)率。B型肝炎疫苗制劑一般也摻和了鋁凝膠。對(duì)于凍干B型肝炎疫苗來說，假若B型肝炎疫苗只是由凍干的HBs抗原制得的，那么它必須是通過預(yù)先把HBs抗原(下文偶爾稱為“HBsAg”)溶解于注射用鹽水和注射用蒸餾水內(nèi)，且使用前再將此溶液和鋁凝膠混合而制備的。這樣的方法中，在每一最小使用單位的容器里，HBsAg在鋁凝膠上的吸附是有不同的，這取決于制備步驟的順序、溫度、搖動(dòng)混合的條件等因素，因此抗體的產(chǎn)生率就可能依每一批疫苗有所變化。此外，當(dāng)一種重組體源HBs抗原采用與普通液體制劑相同的條件凍干時(shí)，凍干過程中，疫苗的抗原效價(jià)會(huì)不合需要地降低。
本發(fā)明人深入細(xì)致地研究了吸附于鋁凝膠上的重組體源HBsAg的凍干條件。研究的結(jié)果還不能說明這樣的一些問題，如抗原效價(jià)的降低或性質(zhì)的劣化，但能給出所要的具有比普通液體制劑有更大儲(chǔ)存穩(wěn)定性的凍干制劑。還進(jìn)一步研究了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定制劑的成份。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所要的凍干制劑的制備可通過在懸浮態(tài)鋁凝膠上吸附純化重組體源HBsAg，溶解穩(wěn)定劑和任選的懸浮液保護(hù)劑，以及凍干通過上述步驟所制備的混合物。
本發(fā)明的一個(gè)目的是使用能產(chǎn)生HBs抗原的重組體微生物，提供一種改良制B型肝炎疫苗的凍干制劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是為了得到一種有極好儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的凍干B型肝炎疫苗的，而提供一個(gè)重組體源HBs抗原的凍干方法。這些和另外一些目的以及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，將使熟練技術(shù)人員根據(jù)下列敘述得以明了。
本發(fā)明的凍干B型肝炎疫苗可通過將鋁凝膠加到一種重組體源HBs抗原幾乎是中性的緩沖溶液的水溶液中，使HBs抗原吸附到鋁凝膠上，再往其中加入一種選自氨基酸和/或糖類的穩(wěn)定劑以及任選的膠體物質(zhì)，另一任選的普通防腐劑、等滲劑等，以制備一種疫苗溶液，將其凍干，最好是在按最小使用單位分裝成瓶之后再凍干。用這種方法獲得的B型肝炎疫苗凍干制劑能在長時(shí)間內(nèi)保持很高的抗原效價(jià)，而且每批制劑每一含最小使用單位的瓶裝制劑，都具有相同的抗原效價(jià)，困此使用起來是很便利的。
起始的純化重組體源HBs抗原的制備程序是將一個(gè)編碼從B型肝炎病毒DNA分離的HBs抗原的基因引入大腸桿菌、酵母、培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞等生物體，從而由基因轉(zhuǎn)化微生物，并通過HBs抗原基因的活動(dòng)表達(dá)HBs抗原。制備重組體源HBs抗原的方法早已為人所知。例如，Valenzuela報(bào)導(dǎo)過制備重組體酵母源HBs抗原的方法(參見Valenzuela，Nature，298，347(1982)和日本專利(申請(qǐng))第一次公開77823/1983)，方法包括制備一種穿梭載體(PHB516)，在其中有一個(gè)HBS基因，它被結(jié)合到一個(gè)具有PBR322質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)域的穿梭載體(PMA56)中的酵母乙醇脫氧酶啟動(dòng)于中，一個(gè)2μ質(zhì)粒Trp1復(fù)制起始區(qū)域，Trp1及酵母乙醇脫氧酶啟動(dòng)子區(qū)域;將此穿梭載體引入酵母，以制備轉(zhuǎn)化的酵母并培養(yǎng)轉(zhuǎn)化酵母，以產(chǎn)生所要的HBs抗原。
另外一種已知的制備酵母源HBs抗原的方法已由Miyanohara等人(參見proc.Natl.Acad.Sci.，USA.80，1(1983)和日專利(申請(qǐng))第一次公開31799/1984)報(bào)導(dǎo)。這個(gè)方法包括制備一個(gè)穿梭載體(PAH203)，在其中有一個(gè)HBs基因被連接到一個(gè)具有2μ質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)域的穿梭載體中的可轉(zhuǎn)錄酸性磷酸酶啟動(dòng)子內(nèi)，一個(gè)pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)域，一個(gè)酵母染色體的復(fù)制起始區(qū)域，參與亮氨酸合成的酵母leu2基因，一個(gè)大腸桿菌抗氨芐青霉素基因和一個(gè)酵母的可抑制酸性磷酸酶啟動(dòng)子區(qū)域;將穿梭載體引入酵母〔AH22(a，leu2，his4，Canl，Cir+)〕以制備轉(zhuǎn)化酵母;并培養(yǎng)轉(zhuǎn)化酵母以產(chǎn)生所要的HBs抗原。
另據(jù)Hitzeman報(bào)導(dǎo)，曾制備了一個(gè)其中的HBs基因被連接到酵母3-磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動(dòng)子上的穿梭載體，之后被用于制備能產(chǎn)生HBs抗原的轉(zhuǎn)化酵母(參見Hitzeman，Nucleic Acids Research，11(9)，2745(1983)和日本專利(申請(qǐng))第一次公開109427/1983)。
此外又據(jù)Nozaki等人報(bào)導(dǎo)，通過將HBs基因與具有插入到起源于Coll E1，pMB1或p15A的大腸桿菌質(zhì)粒中的SV4O DNA的復(fù)制起始區(qū)域的，并且不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制抑制的區(qū)域的載體重組，而制得一個(gè)重組DNA。而通過用這些重組DNA轉(zhuǎn)化這個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，即小鼠LTK細(xì)胞，之后再培養(yǎng)這個(gè)轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞，從而獲得所要的HBs抗原(參見30th Plenary Session of The Society of Virology，Japan，Abstracts，P-1069(1982)和日本專利(申請(qǐng))第一次公開36698/1984)。還有一些利用DNA重組技術(shù)，通過動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生HBs抗原的報(bào)告，如日本專利(申請(qǐng))第一次公開56685/1983，995/1983和39784/1982。
將如此得到的HBs抗原用常規(guī)純化方法加以高純度提純。這些方法通常都是用于分離和純化生物活性物質(zhì)的，如破碎細(xì)胞、抽提細(xì)胞碎片、用硫酸銨鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、用聚乙二醇分級(jí)分離、親合層析、用蔗糖和氯化鋁的超速離心等，而高度純化了的HBs抗原被用作本發(fā)明的凍干B型肝炎疫苗制劑。
從上述重組微生物獲得的純化HBs抗原，按下述方法凍干。將HBs抗原溶解于水中或接近中性的合適濃度的緩沖液中，如0.01 M磷酸鹽緩沖液、0.01M檸檬酸鹽緩沖液，或0.005M McIlvaine氏緩沖液，以使HBs抗原和其它添加物具有下述濃度即含在蛋白質(zhì)提濃物中HBs抗原不多于0.1W/V%，最好小于0.02W/V%。作為佐劑加進(jìn)去的鋁凝膠，其含量按重量計(jì)，為HBs抗原重量的3至10倍。
HBsAg吸附在鋁凝膠上，是通過將含HBs抗原的溶液與鋁凝膠混合而進(jìn)行的，或者通過把適當(dāng)含量的氯化鋁溶液加入含HBs抗原的溶液1并向其中加入適當(dāng)濃度的氫氧化鈉水溶液，借以產(chǎn)生了氫氧化鋁凝膠，同時(shí)HBs抗原被吸附于其上。如使用磷酸鈉水溶液代替氫氧化鈉水溶液時(shí)，則產(chǎn)生磷酸鋁凝膠，而HBs抗原便吸附在此凝膠上。因此本發(fā)明所用的鋁凝膠包括氫氧化鋁凝膠和磷酸鋁凝膠。
如此獲得的吸附HBs抗原的鋁凝膠懸浮液與穩(wěn)定劑、一種任選的防腐劑以及等滲劑相混合，之后將混合物凍干。
穩(wěn)定劑包括氨基酸和多糖類。氨基酸和多糖可以單獨(dú)使用，但最好是兩者一起使用。膠體物質(zhì)作為一種穩(wěn)定劑，可任選一種加進(jìn)去。
適用的氨基酸有甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸等或其鹽(如谷氨酸單鈉)，它們可單獨(dú)使用或兩個(gè)或兩個(gè)以上合并使用，通常的使用量為0.1-2.0W/V%。適用的糖類有單糖，如葡萄糖、木糖、半乳糖、果糖等，二糖如乳糖、麥芽糖、蔗糖等，以及糖醇如甘露醇、山梨醇、木糖醇等，它們可被單獨(dú)使用，也可兩個(gè)或兩個(gè)以上合并使用。其用量一般為0.1-15W/V%。適用的膠體物質(zhì)如明膠，人白蛋白、dextrane等，其用量通常為0.01-0.1W/V%。任選的防腐劑如乙基汞硫代水陽酸鈉，其使用量為0.05-0.1W/V%。
當(dāng)使用凍干疫苗時(shí)，為了使其能在生理上是等滲的，制劑最好和一種中性鹽混合。中性鹽包括氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂，最好的中性鹽是氯化鈉，它可以被用于上面提到過的其它中性鹽的混合物中。通常所含中性鹽的濃度為0.1-3W/V%，最好是0.5-2W/V%。
如此制備的疫苗溶液分裝到一個(gè)劑量單位包裝的容器內(nèi)，以使每個(gè)容器含有的HBs抗原量為20到1000μg。分裝到每一個(gè)容器的溶液通過常規(guī)快速凍干法或慢速凍干法凍干，而得到所要的凍干制劑。凍干通常是在下列條件下進(jìn)行的即將該溶液于低溫下(如-40℃或更低，最好是-50℃或更低)，在大氣壓下，予凍干幾個(gè)小時(shí)(如3-10小時(shí))，然后在固定的較高溫度(如0°-8℃)，于減壓條件下(如0.01毫米汞柱)一期凍干至幾十小時(shí)，這階段產(chǎn)品溫度將低于-35℃(如大約-38℃)，之后，產(chǎn)品要在固定的升高的溫度(為25°-30℃)更為降低的壓力下(如0.001-0.005毫米汞柱)二期凍干幾小時(shí)到幾十個(gè)小時(shí)(如6-10小時(shí)，最好是7-9小時(shí))。
凍干制劑至少含有重組體源HBs抗原，鋁凝膠，一種穩(wěn)定劑和一種中性鹽。
用上述方法制備的B型肝炎疫苗的凍干制劑具有良好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，而不降低抗原效價(jià)，另外當(dāng)使用時(shí)，能迅速溶解于注射溶液中。
當(dāng)使用本發(fā)明的凍干制劑時(shí)，將制劑溶于注射用蒸餾水或注射用生理鹽水，以便將HBs抗原蛋白質(zhì)的濃度調(diào)整到5μg/ml到50μg/ml，并將鹽的濃度調(diào)到接近等滲。生理上的等滲溶液是為皮下用藥時(shí)使用的。疫苗的劑量對(duì)成人一次用藥量通常按HBs抗原蛋白質(zhì)計(jì)為5μg到50μg。
本發(fā)明的制劑，按《生物制品最低要求》(Minimum Requirement of Biological Products)(日本衛(wèi)生和福利部(厚生省)1981年發(fā)布的第287號(hào)通告)中規(guī)定的，依普通實(shí)驗(yàn)方法用豚鼠作試驗(yàn)，未顯現(xiàn)異常毒性。
本發(fā)明可用下述參考例加以說明，但這些例子不應(yīng)看作是對(duì)上述方法的限制。
參考例1來源于重組體酵母的純化HBs抗原的制備按照Miyanohara等人的方法(參見日本專利(申請(qǐng))第一次公開31799/1984)，制備并培養(yǎng)在組體酵母，以產(chǎn)生HBs抗原，依如下方法分離并純化HBs抗原(1)、HBV DNA的制備(ⅰ)、病毒DNA的制備將由10名HBsAg和HBeAg陽性者的(Subtype adr)采集的正常血漿(700ml)，以5，000r.p.m離心20分鐘，以除去不溶物。將所得到的溶液于4℃，18.000r.p.m離心8小時(shí)，并將所得到的沉淀物重新溶解于10ml含10mM Tris-Hcl，0.1M Nacl和1mM EDTA的緩沖液(PH7.5)中。將該溶液加到含30%蔗糖的離心管的頂部，于4℃，39.000r.p.m離心4小時(shí)。所得到的沉淀再次溶解于如上述的同樣的緩沖液中。
此緩沖液需在一反應(yīng)混合物中，于37℃，舊HBV聚合酶處理30分鐘。該混合物(500μl)含有67mM Tris-Hcl(PH7.5)，80mM NH4cl，25mM Mgcl2，0.5%(W/V%，下同)NP40(tergitol，Sigma公司制造)，0.1%2-巰基乙醇，330μM dcTP(三磷酸脫氧胺苷酯)，dGTP(三磷酸脫氧鳥苷)和dATP(三磷酸脫氧腺苷)，0.5μMα-〔32P〕dTTP(三磷酸脫氧胸苷)。向反應(yīng)混合物中加入終濃度為330μM的dTTP，并將該混合物置于37℃進(jìn)一步反應(yīng)3小時(shí)。然后再向反應(yīng)混合物中加同樣體積的100mM EDTA溶液。通過上述的DNA聚合反應(yīng)，DNA單股區(qū)域都被修復(fù)為完好的雙股，以得到〔32P〕標(biāo)記的材料。將該物加到離心管的頂部，管內(nèi)予先順次放入30%，20%和10%的蔗糖水溶液，于4℃，39，000r.p.m離心4.5小時(shí)。
為了水解與DNA結(jié)合得很緊的蛋白質(zhì)，將上述獲得的沉淀于1mg/ml的鏈霉蛋白酶E(Kaken化學(xué)公司制造)和0.2%十二烷基磺酸鈉水溶液的混合物中(200μl)中，于37℃處理2小時(shí)。將所得到的混合物用苯酚(200μl)抽提兩次，之后再用乙醚洗所得到的含DNA抽提物，以除去苯酚溶劑而得到HBV DNA溶液。由此得到的DNA具有的2.5×106CPm/μg比放射活性，并能用于被限制性內(nèi)切酶消化。
(ⅱ)、HBV DNA的克隆化通過使用入一噬菌體Sharon 16A DNA作為載體，將上述方法獲得的雙股環(huán)狀HBV DNA克隆化，然后通過用已知的質(zhì)粒pACYC177作為載體再次克隆化。具體方法如下
(A)、在入-噬菌體Sharon 16A寄主-載體系統(tǒng)中先隆化在10mM Tris-Hcl(PH7.4)，7mM Mgcl2，100mM Nacl和7mM 2-巰基乙醇的混合物(20μl)中，于37℃用核酸內(nèi)切酶XhoI處理HBV DNA(20ng)2小時(shí)。得到的混合物用苯酚(20μl)抽提，并再用乙醚抽提，再往水層加兩倍體積的冷乙醇以沉淀DNA。將混合物于-70℃放置1小時(shí)，之后以10，000r.P.m離心5分鐘，回收沉淀的DNA。將如此分離的沉淀物溶解于10mM Tris-Hcl(PH7.4)和1mM EDTA的混合物(5μl)中。按上述的同樣方法經(jīng)核酸內(nèi)切酶XhoI裂解而得到HBV DNA和等摩爾量的λ-噬菌體Sharon 16A DNA(有一個(gè)Xho I的識(shí)別位點(diǎn))，與T4DNA連接酶〔由50mM Tris-Hcl(PH7.4)，10mM Mgcl2，10mM二硫蘇糖醇，100μg/ml牛血清白蛋白，0.5mM ATP和0.5μl酶制劑(T4連接酶，Takara生物藥品公司制造，1-5×103單位/ml)〕組成的混合物(10μl)。T4連接酶于4℃反應(yīng)18小時(shí)。將反應(yīng)混合物用苯酚之后用乙醚抽取，之后再用乙醇依上述方法進(jìn)行沉淀。將該沉淀物溶解于10mM Tris-Hcl(PH7.4)和1mM DETA的混合物(10μl)中。
將退火的DNA按“Method in Engymolgy”，68，299-309所述的方法經(jīng)體外包裝操作而生成λ-噬菌體，并且用大腸桿菌DP50 SupF(參見Blattner，F(xiàn).R.et al.，Scieucl，196，161，1977)作指示物在L-瓊脂板(23Cm×23Cm)上進(jìn)一步產(chǎn)生噬菌斑(104)。這些噬菌斑用上述方法制備的32P標(biāo)記的HBV DNA作探針(參見SCience，196，180，1977)將這些噬菌斑作噬菌斑雜交，以便篩選由具有HBV DNA的噬菌體形成的噬菌斑。通過這一方法，得以分離出所要的噬菌體的集合物。
(B)、用質(zhì)粒pACYC177作載體再克隆從上述(A)中獲得的具有HBV DNA噬菌體，通過使用大腸桿菌DP50-SuPF作為感染的細(xì)菌，按上述“Methods in Enzymology”，68，245-378，1979的方法制備噬菌體DNA。這樣獲得的DNA用Xho I在與上述相同條件下消化2小時(shí)，并將得到的反應(yīng)混合物經(jīng)使用0.75%瓊脂糖凝膠的電泳分離，得到HBV DNA(3.2Kb)。將此HBV DNA吸附于DEAE(二乙氨乙基纖維素)紙上(日本Toyo Roshi公司制造)，以便與載體DNA分離，然后用1M Nacl水溶液淋洗，而得到在兩端上具有Xho I末端的HBV DNA。
另外，在卡那霉素-抗性基因內(nèi)有一單個(gè)的Xho I裂解位點(diǎn)的質(zhì)粒pACYC177(參見Chang，A.C.Y.，Cohen，S.N.;J.Bacteriol.，134，1141-1156，1978)可用Xho I對(duì)產(chǎn)物依上述同樣方法用苯酚抽提，乙醚處理及乙醇沉淀。
這樣得到的用Xho I裂解的pACYC177與在上述方法中得到的Xho I-末端HBV DNA以1∶5摩爾比例進(jìn)行混合，并通過上述的T4DNA連接酶催化的反應(yīng)，反應(yīng)18小時(shí)使之共價(jià)結(jié)合。
將反應(yīng)混合物(10μl)加到由M.V.Norgard，Gene，3，279(1978)中所描述方法制備的0.1ml大腸桿菌X1776(參見R.III.Curtiss，et al.，“Molecular Cloning of recombinant DNA”esd.W.A.Scott and R.Werner，page99，Academic press(1877)〕中，將混合物混勻，并在0℃使其靜置25分鐘。將混合物移到含氨芐青霉素(20μg/ml)，α-生物素(1μg/ml)，二氨基庚二酸(100μg/ml)和胸腺嘧啶(20μg/ml)的L-瓊脂板上，并于37℃培養(yǎng)過夜。生成的菌落移到含卡那霉素(20μg/ml)的瓊脂板和含氨芐青霉素(20μg/ml)的瓊脂板上，篩選出只在含氨芐青霉素的瓊脂板上生長的菌落。用Matsubara(J.Virol.，16，479，1975)所述的方法由篩選出來的菌落制備質(zhì)粒。所獲得的質(zhì)粒，即pACYC177-HBV DNA(定名為“pHBV”)的重組體DNA，用Xho I在上述相同的條件下處理，而得到完整的HBV DNA片段(3.2Kb)。
(2)、穿梭載體pAM82的制備含有組構(gòu)可抑制的酸性磷酸酶(RAP)的60.000道爾頓多肽(P60)基因的大約8.000核苷酸對(duì)EcoRI片段(RAP可從酵母S2882C基因庫得到，參見Clarke，L.and Carbon，J.Cell，9，91-99，1976)被插入已知的大腸桿菌質(zhì)粒pBR322的EcoRI位點(diǎn)，從而得到一種用作起始材料的質(zhì)粒。
為了除去RAP編碼順序，起始質(zhì)粒被限制性內(nèi)切酶Sal I消化并再次與T4DNA連接酶共價(jià)結(jié)合。所得到的質(zhì)粒pAT25，缺失Sal I位點(diǎn)到酸性磷酸酶基因片段5.2Kb〔所說的質(zhì)粒pAT25是由一個(gè)有從EcoRI位點(diǎn)到pBR322的Sal I位點(diǎn)的片段的質(zhì)粒。pBR322含有抗氨芐青霉素基因和一個(gè)從EcoRI位點(diǎn)到酵母酸性磷酸酶基因的Sal I位點(diǎn)的片段，在其中這兩個(gè)片段各以其相對(duì)應(yīng)的末端相聯(lián)接〕。
在上述pAT25的EcoRI位點(diǎn)插入一個(gè)含arsl和Trpl基因的EcoRI片段(1.4Kb)，Trpl基因是用EcoRI處理質(zhì)粒YRP7(參見Struhl，K.et al.，proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，76，1035-1039，1979)而得到的。經(jīng)上述插入后得到質(zhì)粒pAT26。所說的arsl-Trpl片段在Trpl基因內(nèi)，有一個(gè)限制酶Hind III的單一識(shí)別位點(diǎn)。
在上述pAT26的Hind III位點(diǎn)上插入一個(gè)含有Leu2和2μori的Hind III片段，得到穿梭載體pAT77。2μ ori是通過用Hind III處理質(zhì)粒pSLEl(參見Tohe，A.et al.，J.Bacteriol.，141，413-416，1980)而制得的。載于啤酒酵母(即Saccharomyces Cerevisiae AH 22/pAT77)已根據(jù)布達(dá)佩斯條約寄存于日本工業(yè)科學(xué)與技術(shù)廳所屬發(fā)酵研究所，登記號(hào)為“FERMBP-324”。
如此用Sal I裂解獲得的pAT77(1μg)，在20mM Tris-Hcl(PH8.2)，12mM Cacl2，12mM Mgcl2，0.2M Nacl和1mM EDTA的溶液(50μl)中，用核酸外切酶BAL 31(0.1單位)處理30秒至1分鐘。該反應(yīng)混合物按上述方法用苯酚抽提，乙醇沉淀。將所得到的沉淀與Xho I聯(lián)結(jié)物(linker，1 Pmol)混合，并按上述條件與T4 DNA連接酶連接，反應(yīng)進(jìn)行12小時(shí)。采用R.III.Curtiss等人所述的方法“Molecular Cloning of recombinaut DNA”eds.W.A.Scott and R.Werner，Page99，Academic Press(1977)用上述反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。按K.Matsubara(J.Virol.，16，479，1975)所述的方法，所得到的轉(zhuǎn)化菌中制備質(zhì)粒DNAs。根據(jù)Maxam-Gilbert法(參見Maxam，A.&Gilbert，W.，Pro.Natl.Acad.Sci.，74，560-564)，測(cè)定了所得DNA的核苷酸的順序，進(jìn)一步用BAL31切掉酸性磷酸酶基因區(qū)域。由這些DNA中，篩選并分離所要的質(zhì)粒pAM82。
將載體pAM82中編碼磷酸酶結(jié)構(gòu)基因的產(chǎn)品P60的第一個(gè)氨基酸(蛋白酸)密碼子ATG中的“A”定為“+1”，切掉直到till-33的區(qū)域。載于啤酒酵母(即Saccharomyces Cerevisiae AH 22/PAM82)的PAM82已根據(jù)布達(dá)佩斯條約寄存于日本工業(yè)科學(xué)與技術(shù)廳所屬發(fā)酵研究所，登記號(hào)為“FERM BP-313”。
(3)、HBsAg基因表達(dá)質(zhì)粒的制備用Xho I處理質(zhì)粒pHBV獲得的HBV DNA與Xho I裂解穿梭載體pAM82，在上述相同的條件下，以5∶1摩爾比例，通過T4DNA連接酶進(jìn)行重組。
用反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌α1776，并從所得到的抗氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化菌里制備質(zhì)粒DNA。用各種限制酶如Xho I，Xba I和Hind III分析所制備的質(zhì)粒DNA。借以測(cè)定插入到載體中的HBV DNA及其插入方向。
如此獲得的HBsAg基因表達(dá)質(zhì)粒(定名為PAH203)，在向磷酸酶啟動(dòng)子下游方向的順序上，有HBs基因和HBc基因。
(4)、轉(zhuǎn)化酵母的制備起始酵母是啤酒酵母AH22〔a，Leu2，his4，Can1(Cir+)〕，已根據(jù)布達(dá)佩斯條約寄存于日本工業(yè)科學(xué)與技術(shù)廳所屬發(fā)酵研究所，登記號(hào)為“FERM BP-312”。起始酵母接種于含2%多胨(Polypeptone)，1%酵母提取物和2%葡萄糖的YPD培養(yǎng)基(100ml)上，并于30℃下培養(yǎng)過夜，之后，用離心法收集細(xì)胞。用滅菌水(20ml)洗收集的細(xì)胞，懸浮于1.2M山梨醇和100μg/ml酶解酶(zymolyase)-60.000(日本Seikagaku Kogyo公司制造)的溶液(5ml)中，將懸浮液于30℃下靜置30分鐘而得到球狀體。用1.2M山梨醇溶液洗滌球狀體三次，然后懸浮于2M山梨醇、10mM Cacl2和10mM Tris-Hcl(PH7.5)的溶液(0.6ml)中。將所制備的懸浮液以每份為60μl的體積分裝小試管中。上述(3)制備的重組體質(zhì)粒pAH203(30μl)溶液加到懸浮液中?；旌暇鶆蚝?，按10mM終濃度加進(jìn)0.1M Cacl2(3μl)，再將混合物置于室溫下靜置5-10分鐘。往所得到的混合物里加1ml的20%聚乙二醇4.000溶液，10mM Cacl2和10mM Tris-Hcl(PH7.5)各1ml，并將混合物置于室溫靜置20分鐘。將得到的混合物(每份0.2ml)加到含22%山梨醇、2%葡萄糖、0.7%酵母氮基氨基酸、2%YPD、20μg/ml組氨酸和3%瓊脂的培養(yǎng)基(10ml)中，將其置于45℃的恒溫上。輕輕混合以后，在含有預(yù)先制備的1.2M山梨醇，并且還含有0.7%酵母氮堿氨基酸、2%葡萄糖、20μg/ml組氨酸和2%瓊脂的最低限度培養(yǎng)板上加一層該混合物，并將其靜置。培養(yǎng)板置于30℃下培養(yǎng)得到不需亮氨酸的酵母的菌落。菌落再置于添加亮氨酸(20μg/ml)BurkHolder最低限度培養(yǎng)基(minimal medium)上培養(yǎng)〔參見Tohe，A，et al.，J.Bachterol.，113，727-738，1973〕從而得到所要的轉(zhuǎn)化酵母啤酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)PAH 203。
(5)、用轉(zhuǎn)化酵母生產(chǎn)HBsAg上述(4)中所獲得的轉(zhuǎn)化酵母接種于添了組氨酸(20μg/ml)的BurkHolder最低限度培養(yǎng)基(10ml)，并于30℃培養(yǎng)。所得培養(yǎng)物進(jìn)一步接種到添加組氨酸(20μg/ml)BurkHolder最低限度培養(yǎng)基(10l)于30℃培育并加攪拌48小時(shí)。用離心法收集處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，懸浮于不含磷酸鹽(在BurkHolder最低限度培養(yǎng)基中，用Kcl替代KH2Po4制得，繼之補(bǔ)加20μg/ml組氨酸)的最低限度培養(yǎng)基中(10l)，細(xì)胞濃度大約為4×106細(xì)胞/ml。于30℃培養(yǎng)24小時(shí)后，培養(yǎng)基以4.000r.p.m離心10分鐘，收集細(xì)胞(大約120g)。
(6)、HBs抗原純化產(chǎn)品的制備在重復(fù)使用上述(5)的方法制備的細(xì)胞中(約1Kg)，加進(jìn)0.1M磷酸鹽緩沖液(PH7.2)(5l)，并在600到700Kg/Cm2壓力下用Manton-Gaulin破碎機(jī)處理上述混合物以搗碎細(xì)胞。搗碎的細(xì)胞經(jīng)離心除去粗大的碎細(xì)胞片，得到HBs抗原的粗提物。通過滴加10%的醋酸水溶液將粗提物的PH值調(diào)到5.2?；旌衔镉?℃下攪拌30分鐘后，用離心法除去沉淀物。
往所獲得的上清液中加氨水以調(diào)節(jié)PH約為6.5，并緩慢向上清液加硫酸銨其終濃度為2.5M，但要保持上述PH值。使其靜置30分鐘后，混合物經(jīng)離心取出含HBs抗原的沉淀物。將這樣獲得的沉淀物懸浮于0.1M磷酸鹽緩沖液(PH7.2)約300ml中，混合物對(duì)上述所用的同樣緩沖液滲析。
滲析后，混合物用0.1M磷酸鹽緩沖液稀釋3倍左右，然后使其通過氫氧磷灰石填充柱(凝膠含量約1l)，該柱預(yù)先已用上述同種緩沖液平衡，通過以上步驟HBs抗原就吸附在凝膠上。該柱用平衡時(shí)所用的緩沖液仔細(xì)洗滌，然后再用0.2M磷酸鉀緩沖液(PH7.2，約3l)通過柱，以除去沾污物。此后，用0.5M磷酸鉀緩沖液(PH7.2，約3l)通過柱，以洗脫HBs抗原。對(duì)0.1M磷酸鉀緩沖液滲析后，含HBs抗原的部份再次通過事先已用上述同種緩沖液平衡過的氫氧磷灰石柱(凝膠含量約500ml)，通過上述步驟HBs抗原就被吸附在凝膠上。再用有一濃度梯度為0.2→0.5M的磷酸鉀緩沖液(約2l)通過柱以收集含HBs抗原的部份。
這樣獲得的含HBs抗原的部份(約1000ml)，對(duì)0.01M磷酸鹽緩沖液滲析，然后用中空纖維超濾器(Minimodule，日本Asahi化學(xué)工業(yè)公司制造)濃縮至100ml。
一種50%蔗糖溶液，一種20%蔗糖溶液和所獲得的含HBs抗原部份以三層加入Hitachi Rp-42超速離心機(jī)的離心管中，于4℃，以27.000r.p.m離心16小時(shí)，通過這一步驟HBs抗原被濃縮在蔗糖溶液介面周圍。
這樣純化的含HBs抗原的部份，對(duì)加入了0.14M Nacl的0.01M磷酸鹽緩沖液滲析，并向其中加濃度為1.2g/ml的氯化銫。用Hitachi RP-42超速離心機(jī)以25.000r.p.m，于10℃將混合物離心60小時(shí)，得到純化的HBs抗原。這樣經(jīng)純化的含HBs抗原的部份對(duì)加入了0.14M Nacl的0.01M磷酸鹽緩沖液滲析，之后用Minimodule(日本Asahi公司制造)中空纖維超濾器濃縮。所得物對(duì)加入了0.14M Nacl的0.01M磷酸鹽緩沖液滲析，然后經(jīng)過濾除菌以得到HBs抗原的純品(HBs抗原蛋白質(zhì)含量106μg/ml;12ml)。
根據(jù)SDS-聚丙烯晴凝膠電泳，上述獲得的HBs抗原的純品顯現(xiàn)亞基蛋白質(zhì)(分子量約25.000)單一帶。此外，使用抗重組源HBs抗原一豚鼠抗體和一種抗人源HBs抗原豚鼠抗體的免疫擴(kuò)散法，與人源HBs抗原的標(biāo)準(zhǔn)品比較，兩種HBs抗原純品表現(xiàn)了同樣的抗原性。
參考例2來源于重組的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的純化HBs抗原的制備根據(jù)Nozaki等人的方法(參見日本專利(申請(qǐng))第一次公開36689/1984)，制備并培養(yǎng)重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以產(chǎn)生HBs抗原，HBs抗原的分離和純化如下(1)HBV DNA BamRI片段的制備上述參考例1中制備的質(zhì)粒PHBV，(1)采用一般方法用BamHI處理，所得到的反應(yīng)混合物再用0.75%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以得到HBV DNA的BamHI片段。
(2)載體(PXRIIG BamHI片段)的制備將穿梭載體pXRIIG(得自美國Harvard大學(xué))(1μg)加入含有10mM Tris-Hcl(PH8.0)，7mM Mgcl2，100mM Nacl和2mMα-巰基乙醇的混合物(20μl)，并往里加1個(gè)單位的BamHI(一個(gè)單位每1小時(shí)能完全消化1μg λ DNA的酶活性)，將該混合物置于30℃下反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)混合物用苯酚抽提，水層用乙醚抽提，然后用乙醇沉淀。將沉淀物溶解于水中，該溶液用于制備重組體DNA。
(3)、HBV DNA pXRIIG重組體DNA的制備含有HBV DNA BamHI片段(150ng)和pXRIIG BamHI片段(50ng)的溶液(50μl)于16℃與T4 DNA連接酶反應(yīng)4小時(shí)。
用上述同種方法獲得的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌α1776。再按上述(1)(B)所述的方法將所得到的轉(zhuǎn)化菌在L-瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)12小時(shí)后，篩選出在瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落，再把篩選出來的菌落分別加到含四環(huán)素(TC)(10μg/ml)瓊脂培養(yǎng)基和含氯芐青霉素(Ap)(40μg/ml)的瓊脂培養(yǎng)基上，將在含TC的瓊脂培養(yǎng)基中不能生長而在含AP的瓊脂培養(yǎng)基上能生長的菌落篩選出來。每一種菌落都在上面已提及過的大腸桿菌α1776的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并用上述同種方法提取質(zhì)粒。借助使用各種限制酶(如BamHI、XhoI、HindIII、SalI)的裂解圖分析，篩選出含HBV DNA的三個(gè)BamHI片段和pXR-IIG(所述重組體DNA定名為pSHB3)的一個(gè)片段的重組DNA。
(4)、小鼠LTK-細(xì)胞的轉(zhuǎn)化制備下列液體A和液體B液體A含有50mM Hepes(即N-2-羥乙基
嗪-N-2-乙基磺酸)，280mM Nacl，和15mM Na2HPO4·12H2O的溶液(1.25ml，PH7.1)。
液體B含有pSHB3(50μg)，PTK(2.5μg)(參見Colbere-Garapin，F(xiàn).，Proc.Natl.Acad.Scic.USA，76，3755，1979)，鮭魚精子DNA(帶基因DNA，Carrier DNA)(50μg)和2M Cacl2(0.15ml)的DNA溶液(1.1ml)混合物。
攪伴下將液體B滴加到液體A中，混合物于室溫下放置30分鐘。用滴管吸取足夠量后，將混合液(0.5ml)逐滴加入盛有單層小鼠LTK-細(xì)胞的燒瓶內(nèi)(約105細(xì)胞/燒瓶)。為了使混合物吸附在細(xì)胞上，室溫下將燒瓶放置30分鐘，并往其中加入Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(下文稱“DMEM”，5ml)，該培養(yǎng)基含有10%小牛血清(參見Dulbecco，R & Freeman，G.;Virology.8，396，1959)，并將該混合物置在5%Co2環(huán)境下，于37℃，培養(yǎng)約5小時(shí)。換新的DMEM后，將混合物進(jìn)一步培養(yǎng)24小時(shí)。然后，培養(yǎng)基換成含次黃嘌呤(15μg/ml)、氨基蝶呤(1μg/ml)和胸腺嘧啶核苷(5μg/ml)的培養(yǎng)基(下文稱“HAT”培養(yǎng)基)〔參見Littlefield;J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，3961-3965，(1963)〕。培養(yǎng)持續(xù)期間，每2天到3天換一次新的HAT培養(yǎng)基。4個(gè)星期以后，收集TK+細(xì)胞菌落，從而獲得所要的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
(5)、用轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)HBs抗原將上述(4)中所制備的轉(zhuǎn)化小鼠L細(xì)胞接種到含10%小牛血清，青霉素(250單位/ml)和鏈霉素(0.2μg/ml)的DMEM培養(yǎng)基，將該混合物在37℃下培養(yǎng)1周。培養(yǎng)肉湯的上清液中含有濃度大約為400ng/ml的HBs抗原。
(6)、純化用轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的HBs抗原按上述(5)重復(fù)培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)物上清液(10l)，用中空纖維超濾器(Minimodule，日本ASahi化學(xué)工業(yè)公司制造)將其濃縮至1000ml。在通過加入氨水保持溶液PH值為6.5時(shí)，緩慢加入硫酸銨，使終濃度為2.5M。靜置30分鐘后，用離心法把HBs抗原的沉淀物分離出來。將所得到的沉淀物溶于加入了0.14M Nacl的0.01M磷酸鹽緩沖溶液(PH7.2)(100ml)中，此混合物對(duì)上述所用的相同的緩沖液滲析。
滲析后，將該混合物通過瓊脂糖(Sepharose CL 6B)(由瑞典pharmacia公司制造)(凝膠含量2l)柱作凝膠過濾層析。收集并儲(chǔ)集含HBs抗原的部份(通過紫外吸收監(jiān)測(cè)儀分析測(cè)定，從洗脫開始相當(dāng)于外水體積的第一個(gè)峰部分)。將集中的部分對(duì)0.1M磷酸鉀緩沖液(PH7.2)滲析，然后通過預(yù)先已用上述相同的緩沖液平衡的氫氧磷灰石(凝膠含量大約為250ml)柱，HBs抗原就吸附在凝膠上。用平衡所用同樣緩沖液沖洗柱以除去沾污物，之后用0.5M磷酸鉀緩沖液以洗脫HBs抗原。含HBs抗原部份(約250ml)對(duì)0.01M磷酸鹽緩沖液(PH6.2)滲析，再用中空纖維超濾器濃縮至50ml。
將50%蔗糖溶液，20%蔗糖溶液和上述制備的含HBs抗原的部份分別加入Hitachi RP-42型超速離心機(jī)的離心管，形成三個(gè)層，于4℃，以27.000 r.p.m超速離心16小時(shí)，借此HBs抗原就被集中于兩蔗糖溶液層的界面。
經(jīng)純化的含HBs抗原的部份，在以加入了0.14M Nacl的0.01M磷酸鹽緩沖液中滲析，然后用Minimodule(日本Asahi化學(xué)工業(yè)公司制造)濃縮。用過濾法除菌，而得到一種純化的HBs抗原產(chǎn)物(HBs抗原蛋白質(zhì)含量98μg/ml;14ml)。
例1將氫氧化鋁凝膠加入按參考例1方法生產(chǎn)的重組體源HBs抗原純化產(chǎn)物的溶液中，凝膠加入量按重量(按氫氧化鋁重量計(jì)算)為HBs抗原蛋白質(zhì)的8倍?；旌衔锝?jīng)離心除去上清液，從而得到吸附了HBs抗原的氫氧化鋁凝膠。
然而，當(dāng)重復(fù)使用上述方法時(shí)，用磷酸鋁代替氫氧化鋁，可得到吸附了HBs抗原的磷酸鋁凝膠。
向每份由上述獲得的吸附HBs抗原鋁凝膠中，如表1所列的溶于加入了0.14M Nacl的0.01M磷酸鹽緩沖液(PH6.0)的各種穩(wěn)定劑，即得到疫苗溶液(HBs抗原蛋白質(zhì)濃度40μg/ml)。
每份1ml的這種溶液裝入2ml的小瓶里，并于-50℃，常壓下予凍干6小時(shí)。繼之在減壓到0.04毫米汞柱的壓力后，于5℃一期凍干15小時(shí)，之后在0.04毫米汞柱、30℃下經(jīng)二期凍干8小時(shí)。從而就得到所要的凍干制劑。
向凍干的產(chǎn)物流水號(hào)1-11中分別加入生理鹽溶液(各2ml)，并加入檸檬酸鈉以完全溶解鋁凝膠。通過使用AUSRIA II(日本Dainabbott放射性同位素實(shí)驗(yàn)室制造)的放射免疫分析法，測(cè)定溶液中的HBs抗原，然后將得到的數(shù)據(jù)與參考值(凍干前的產(chǎn)物)比較。相對(duì)抗原性如表2所示。
＊)凍干產(chǎn)品的抗原性對(duì)未凍干產(chǎn)品抗原性的相對(duì)值(后者值以1計(jì))。
例2在按參考例1所述方法制備的重組體源HBs抗原的純品溶液中(HBs抗原蛋白質(zhì)濃度96μg/ml)，加入氯化鋁(60mg)水溶液(5ml)。用1N的NaoH調(diào)節(jié)溶液的PH到6.1。混合物經(jīng)離心除去上清液，而得到吸附了HBs抗原的鋁凝膠。將所得到的凝膠與含乳糖(10W/V%)，l-谷氨酸單鈉(0.4W/V%)、精氨酸(0.4W/V%)、明膠(0.08W/V%)和乙基汞硫代水陽酸鈉(0.005W/V%)，加入了0.14M Nacl的0.01M磷酸鹽緩沖液(PH6.2，72ml)混合。
將所得的疫苗溶液以每份0.5ml分裝到2ml小瓶中，然后按例1所述的方法進(jìn)行凍干處理。
上述例2中所獲得的凍干疫苗制劑與起始儲(chǔ)備品比較，檢定其在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)的免疫源性。也就是將凍干疫苗制劑溶于蒸餾水，豚鼠背部皮下注射，接種量分別是0.5μg，1μg和2μg HBsAg。5周后，從動(dòng)物體內(nèi)采血，用放射免疫測(cè)定法(使用檢測(cè)抗HBs抗體的藥盒AUSAB，日本Dainabbott公司制造)測(cè)其抗HBs抗體。作為參照，同樣測(cè)定了用起始儲(chǔ)備品接種的抗體效價(jià)。結(jié)果列于表3。
＊對(duì)應(yīng)每種凍干疫苗注射量的平均抗體值與起始儲(chǔ)備品平均抗體值相比的平均相對(duì)值(后者值以1計(jì))。
凍干疫苗也進(jìn)行了如下儲(chǔ)藏穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。
將凍干疫苗在恒定溫度下保持一固定時(shí)間后，向疫苗樣品中加入檸檬酸鈉，以溶解鋁凝膠，然后用放射免疫測(cè)定法測(cè)其抗原性。凍干產(chǎn)物的相對(duì)值計(jì)算是以與HBs抗原的標(biāo)準(zhǔn)樣品相比計(jì)算的(即通過把人蛋白加到人源HBs抗原的純制品內(nèi)，分裝到各小瓶里，將其保持在-80℃凍干狀態(tài)，當(dāng)測(cè)定時(shí)，液化樣品作為參考)(參考抗體值以1計(jì))。每一種樣品的相對(duì)值列于表4(此處所列凍干樣品值以1計(jì))。
本發(fā)明的凍干產(chǎn)品甚至于37℃保存25周仍是穩(wěn)定的，而且該產(chǎn)品和液體疫苗有很大的差別(參見下文對(duì)比例1中所公開部分)。
此外，對(duì)37℃保存25周的樣品進(jìn)行了異常毒性檢驗(yàn)，結(jié)果未觀察到任何異常毒性。
對(duì)比例1將含氫氧化鋁凝膠的懸浮液(2.9ml)加到例2所用的重組體源HBs抗原純品的溶液(HBs抗原蛋白質(zhì)濃度96μg/ml)(50ml)中。該混合物經(jīng)離心除去上清液，而得到一種吸附了HBs抗原的鋁凝膠。鋁凝膠和含乙基汞硫代水楊酸鈉(50μg/ml)的加入了0.14M Nacl的0.01M磷酸鹽緩沖液(PH6.0)(60ml)混合，而得出疫苗溶液。該疫苗溶液(每份1ml)被分裝到2ml小瓶，得到液體疫苗制劑。
該疫苗制劑按例2的方法進(jìn)行儲(chǔ)藏穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果列于表5。
此外，將例2中制備的疫苗制劑，未經(jīng)凍干(即靜置)作儲(chǔ)藏穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果列于表6。
例3按參考例2中所述同樣方法制備的重組體源HBs抗原(HBs抗原蛋白質(zhì)濃度105μg/ml)純化產(chǎn)物的溶液(80ml)內(nèi)，加入氫氧化鋁(50mg)水溶液(5ml)。該混合物經(jīng)離心除去上清液而得到吸附了HBs抗原的鋁凝膠。如此得到的鋁凝膠和含乳糖(10W/V%)、甘氨酸(1W/V%)、明酸(0.05W/V%)、乙基汞硫代水楊楊酸鈉(0.005W/V%)以及加入了0.14M Nacl的0.01M磷酸鹽緩沖液液(PH6.0，105ml)混合。
把所獲得疫苗溶液以每份1ml分裝入2ml小瓶，按例1的方法進(jìn)行凍干處理。
凍干產(chǎn)品按例2的方法進(jìn)行儲(chǔ)藏穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果列于表7。
1)用例2的方法測(cè)定于37℃保存25周的樣品，按上述方法進(jìn)行異常毒性試驗(yàn)，但未觀察到任何異常毒性。
權(quán)利要求
1.B型肝炎疫苗的凍干制劑，包含通過能產(chǎn)生HBs抗原的重組的生物體產(chǎn)生的純化B型肝炎病毒表面抗原，在穩(wěn)定劑存在下將其以凍干狀態(tài)吸附于鋁凝膠上，所說的凍干制劑是通過在純化的重組體源HBs抗原中，加入鋁凝膠和穩(wěn)定劑并凍干此混合物而制備的。
2.按權(quán)利要求
1的制劑，其中鋁凝膠是選自氫氧化鋁凝膠和磷酸鋁凝膠中之一者。
3.按權(quán)利要求
1的制劑，其中穩(wěn)定劑是選自氨基酸或其鹽和糖類中之一者。
4.按權(quán)利要求
3的制劑，其中至少含有一種氨基酸或其鹽和至少一種糖化物。
5.按權(quán)利要求
3的制劑，其中之穩(wěn)定劑是至少一種氨基酸或其鹽，至少一種糖和至少一種膠體物質(zhì)的組合。
6.按權(quán)利要求
4的制劑，其中之氨基酸及其鹽選自甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸單鈉、精氨酸和賴氨酸之一者;而糖是選自葡萄糖、木糖、半乳酸、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇和木糖醇中之一者。
7.按權(quán)利要求
5的制劑，其中氨基酸或其鹽是選自甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸單鈉、精氨酸和賴氨酸中之一者;糖化物是選自葡萄糖、木糖、豐乳糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇和木糖醇中之一者;膠體物質(zhì)是選自明膠、人白蛋白和dextrane之一者。
8.制備B型肝炎疫苗的凍干制劑的方法，包括由能產(chǎn)生HBs抗原的重組生物體，產(chǎn)生的純化的B型肝炎病毒表面抗原的水溶液中，加入一種鋁凝膠和一種穩(wěn)定劑，將吸附于鋁凝膠上的B型肝炎病毒表面抗原的混合物分至最小使用單位，并凍干每一使用單位的混合物。
9.按權(quán)利要求
8的方法，其中的凍干步驟包括低溫大氣壓下幾小時(shí)的預(yù)凍干;較高溫度減壓下十到幾十小時(shí)的一期凍干;再升高溫度并更低壓力下幾小時(shí)到十小時(shí)的二期凍干三個(gè)步驟。
專利摘要
B型肝炎疫苗的凍干制品，包括由能產(chǎn)生HBs抗原的重組生物體產(chǎn)生的純化的B型肝炎病毒表面抗原，在穩(wěn)定劑存在下此制品以凍干狀態(tài)吸附于鋁凝膠上；所說的凍干制劑制備的步驟包括向純化的重組體源HBs抗原中加入鋁凝膠和穩(wěn)定劑，并凍干該混合物。所說的凍干制劑能長期穩(wěn)定地保存而不失其抗原效價(jià)；并能用于B型肝炎病毒感染的預(yù)防。
文檔編號(hào)A61K31/695GK85101017SQ85101017
公開日1987年1月10日 申請(qǐng)日期1985年4月1日
發(fā)明者大友信也, 水野喬介, 濱田福三郎, 上寬 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan