專利名稱：一種甲型肝炎滅活疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種甲型肝炎滅活疫苗的制備方法以及由所述方法制備的甲型肝炎滅活疫苗。
背景技術：
甲型肝炎，簡稱甲肝，是一類高發(fā)病率的病毒性傳染病，可導致暴發(fā)流行，我國是甲型肝炎的高流行區(qū)，接種甲型肝炎疫苗是預防甲肝流行的最有效措施。
目前世界上有兩種疫苗用于甲肝的預防控制，一種是甲肝減毒活疫苗，甲型肝炎減毒活疫苗如L-A-1株已規(guī)模生產(chǎn)近20年，在預防控制甲肝的暴發(fā)流行、降低發(fā)病率方面，起到了巨大作用，但減毒活疫苗存在毒力返祖、對一些個體如免疫缺陷者可能誘發(fā)嚴重疾病等缺點；另一種為滅活疫苗。甲型肝炎滅活疫苗免疫后抗體產(chǎn)生快，可用于控制甲肝暴發(fā)流行的應急免疫接種，在安全性、有效性及使用范圍等方面均優(yōu)于減毒活疫苗。近10年來，甲肝滅活疫苗的應用均顯示其具有安全性好、免疫后抗體水平高、保護率高、效期長、穩(wěn)定性好的優(yōu)點。
滅活疫苗常用強毒株制備，在生產(chǎn)過程中存在感染操作者致病的危險，用減毒株制備甲肝滅活疫苗的操作過程更為安全，且大大提高疫苗的安全性，因此有必要研制用減毒株制備滅活疫苗，同時實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)的制備甲肝滅活疫苗的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中制備用強毒株制備甲肝滅活疫苗存在感染風險的缺陷，提供一種用減毒株制備甲型肝炎滅活疫苗的方法，該方法所需甲肝病毒量少，工藝簡單，具有規(guī)模化應用前景。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術方案 一種制備甲型肝炎滅活疫苗的方法，包括如下步驟 步驟1將甲型肝炎病毒毒種接種于人胚肺二倍體細胞2BS株，培養(yǎng)至病毒增殖高峰期，用胰酶常規(guī)消化細胞； 步驟2離心取沉淀加入細胞裂解液，使其充分作用； 步驟3加入聚乙二醇使其充分作用，離心取沉淀用PBS緩沖液懸浮，加入氯仿抽提，制備粗制甲肝病毒液； 步驟4步驟3制備的粗制甲肝病毒液經(jīng)凝膠層析純化后，經(jīng)0.2μm濾膜除菌，滅活； 步驟5將步驟4制備的甲肝病毒液經(jīng)超濾膜超濾，經(jīng)氫氧化鋁佐劑吸附，制成甲型肝炎滅活疫苗。
作為優(yōu)選，步驟1所述毒種為甲型肝炎病毒L-A-1減毒株，已于1992年12月21日保藏在武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNo.V92004。
作為優(yōu)選，步驟1所述培養(yǎng)為利用多層細胞工廠或3L轉瓶進行培養(yǎng)。
細胞工廠(cell factory)，是一種設計精巧的細胞培養(yǎng)裝置，可在有限的空間內(nèi)利用最大限度的培養(yǎng)表面，從而節(jié)省了大量的空間，并可節(jié)省貴重的培養(yǎng)液。更重要的是，它可有效地保證操作的無菌性，從而避免因污染而帶來的原料、勞務和時間損失。在本發(fā)明的具體實施方式
中，采用丹麥NUNC公司生產(chǎn)的NUNC多層細胞工廠，是目前應用較多的細胞工廠系統(tǒng)，可用于如疫苗、單克隆抗體或生物制藥等工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，特別適合于貼壁細胞，也可用于懸浮培養(yǎng)。
作為優(yōu)選，步驟2具體為離心取沉淀加入細胞裂解液在2-8℃作用16-24h，所述細胞裂解液為含質量百分比2-5％乙二胺四乙酸二鈉的0.2-0.5％去氧膽酸鈉溶液。本發(fā)明所述細胞裂解液為發(fā)明人經(jīng)過大量試驗研制的細胞裂解液，可有效裂解病毒感染的細胞，使甲肝病毒充分釋放。
步驟3中經(jīng)PEG沉淀、氯仿抽提，可基本去除細胞雜蛋白。作為優(yōu)選，步驟3所述聚乙二醇分子量為6000，終濃度為體積百分比8％～10％。
作為優(yōu)選，步驟3所述PBS緩沖液為pH 5.5～7.5的0.01-0.02mol/L的PBS緩沖液。
作為優(yōu)選，步驟4所述滅活具體為終濃度為200-250μg/ml的甲醛溶液滅活12-14天。步驟4所述凝膠優(yōu)選為丙烯葡聚糖凝膠，在具體實施方式
中采用上海索萊寶生物科技有限公司生產(chǎn)的Sephacryl S-400HR。
作為優(yōu)選，步驟5所述超濾膜的截留分子量為50-100KD。
本發(fā)明還提供由所述方法制備的甲型肝炎滅活疫苗。
作為優(yōu)選，所述疫苗中滅活甲肝病毒濃度為640～1280EU/ml。經(jīng)小鼠體內(nèi)效力試驗結果表明，本發(fā)明所述甲型肝炎滅活疫苗抗原含量為1280EU/ml時，半數(shù)有效稀釋倍數(shù)高于參比苗，其免疫原性優(yōu)于參比苗。
本發(fā)明采用的甲型肝炎病毒L-A-1減毒株的抗原性滴度達到較高水平，可有效地提高病毒產(chǎn)率，且減毒株制備的疫苗更加安全；使用國際上先進的細胞培養(yǎng)器多層細胞工廠，進行細胞培養(yǎng)，有效利用了空間，從而節(jié)省廠房面積，提高疫苗生產(chǎn)能力；經(jīng)PEG沉淀、氯仿抽提，可基本去除細胞雜蛋白，再經(jīng)一步凝膠過濾層析純化，可得到高純度較高的甲肝病毒。
本發(fā)明所述方法簡化了工藝，降低了生產(chǎn)成本，并能夠實現(xiàn)甲型肝炎滅活疫苗的規(guī)?；a(chǎn)。
具體實施例方式 本發(fā)明公開了一種制備甲型肝炎滅活疫苗的方法及由所述方法制備的疫苗，本領域技術人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及產(chǎn)品已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。
本發(fā)明提供的制備甲型肝炎滅活疫苗的方法，包括步驟1將甲型肝炎病毒毒種接種于人胚肺二倍體細胞2BS株，培養(yǎng)至病毒增殖高峰期，用胰酶常規(guī)消化細胞；步驟2離心取沉淀加入細胞裂解液，使其充分作用；步驟3加入聚乙二醇使其充分作用，離心取沉淀用PBS緩沖液懸浮，加入氯仿抽提，制備粗制甲肝病毒液；步驟4步驟3制備的粗制甲肝病毒液經(jīng)凝膠層析純化后，經(jīng)0.2μm濾膜除菌，滅活；步驟5將步驟4制備的甲肝病毒液經(jīng)超濾膜超濾，經(jīng)氫氧化鋁佐劑吸附，制成甲型肝炎滅活疫苗。
按照本發(fā)明，具體實施方式
中的實施例采用國際上先進的細胞培養(yǎng)器細胞工廠或3L轉瓶，培養(yǎng)接種了甲型肝炎病毒L-A-1減毒株的人胚肺二倍體細胞(2BS株)，同時采用胰酶和細胞裂解液裂解病毒感染的細胞，使甲肝病毒充分釋放，有效地提高了疫苗生產(chǎn)能力，能夠實現(xiàn)甲型肝炎滅活疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)，且簡化了工藝，降低了生產(chǎn)成本。
下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明 實施例1 取長滿單層的轉瓶培養(yǎng)的人二倍體細胞(2BS株)，經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化，按比例接種至10層、40層細胞工廠，同時取L-A-1減毒株工作種子批毒種經(jīng)適當稀釋，接種人二倍體細胞，置35℃±0.5℃靜止培養(yǎng)19-26天，期間每隔7-10天換液1次，待病毒增殖高峰期，棄去培養(yǎng)液，洗滌后經(jīng)胰酶消化，將病毒感染的細胞懸液離心棄上清；離心沉淀按2-4倍比例加入含質量百分比2-5％乙二胺四乙酸二鈉的0.2-0.5％去氧膽酸鈉溶液，室溫振蕩2h，充分混勻，4℃作用24h，以充分裂解細胞，使病毒釋放；加入終濃度為8％的聚乙二醇(MW6000)，4℃沉淀過夜，4500r/min離心1.5h；離心沉淀用1/10體積的0.01mol/L PBS緩沖液(pH 6.3)懸浮；加入等體積氯仿，重復抽提3～5次，制成粗制甲肝病毒液；將Sephacryl S-400HR凝膠裝入層析柱中，用0.01mol/L PBS緩沖液(pH 6.3)平衡后，將粗制甲肝病毒液上樣，用0.01mol/L PBS緩沖液(pH 6.3)洗脫，收集病毒洗脫峰，為純化的甲肝病毒液；再經(jīng)0.2μm濾膜除菌過濾，在無菌條件下加入終濃度為200μg/ml的甲醛37℃滅活12天。滅活的甲肝病毒液經(jīng)50KD的超濾膜超濾，進一步檢定合格后，根據(jù)病毒抗原性滴度水平做適當稀釋，經(jīng)氫氧化鋁佐劑吸附制成半成品，將半成品分裝于無菌的西林瓶中，制成成品疫苗。
表1.實施例1制備的甲肝滅活疫苗成分 本發(fā)明制備的甲型肝炎滅活疫苗經(jīng)檢定，無菌試驗、異常毒性試驗、pH值等檢定項目均合格，氫氧化鋁吸附后甲肝病毒無解離，體外相對效力達到1.48，檢定數(shù)據(jù)見表1。
細菌內(nèi)毒素檢查方法和異常毒性檢查方法均參照現(xiàn)行版《中國藥典》附錄相關方法進行；體外相對效力測定參照《中國藥典》(2010版)附錄XS進行。
表2實施例1制備的甲肝滅活疫苗成品檢定結果 實施例2 取長滿單層的轉瓶培養(yǎng)的人二倍體細胞(2BS株)，經(jīng)0.25％胰蛋白酶消化，按比例接種3L轉瓶，同時取L-A-1減毒株工作種子批毒種經(jīng)適當稀釋，接種人二倍體細胞，置35℃±0.5℃旋轉培養(yǎng)19-26天，期間每隔7-10天換液1次，待病毒增殖高峰期，棄去培養(yǎng)液，洗滌后經(jīng)胰酶消化，將病毒感染的細胞懸液離心棄上清；離心沉淀按2-4倍比例加入含質量百分比2-5％乙二胺四乙酸二鈉的0.2-0.5％去氧膽酸鈉溶液(細胞裂解液)，室溫振蕩2h，充分混勻，4℃作用24h，以充分裂解細胞，使病毒釋放；加入終濃度為10％的聚乙二醇(MW6000)，4℃沉淀過夜，4500r/min離心1.5h；離心沉淀用1/10體積的0.01mol/L PBS緩沖液(pH 6.3)懸??；加入等體積氯仿，重復抽提3～5次，制成粗制甲肝病毒液；將Sephacryl S-400HR凝膠裝入層析柱中，用0.01mol/L PBS緩沖液(pH7)平衡后，將粗制甲肝病毒液上樣，用0.02mol/L PBS緩沖液(pH7)洗脫，收集病毒洗脫峰，為純化的甲肝病毒液；再經(jīng)0.2μm濾膜除菌過濾，在無菌條件下加入終濃度為250μg/ml的甲醛37℃滅活14天。滅活的甲肝病毒液經(jīng)100KD的超濾膜超濾，進一步檢定合格后，根據(jù)病毒抗原性滴度水平稀釋至1280EU/ml，經(jīng)氫氧化鋁佐劑吸附制成半成品，將半成品分裝于無菌的西林瓶中，制成成品疫苗。甲肝滅活疫苗(1.0ml)含有如下成分 表3.實施例2制備的甲肝滅活疫苗成分 本發(fā)明制備的甲型肝炎滅活疫苗經(jīng)檢定，無菌試驗、異常毒性試驗、pH值等檢定項目均合格，氫氧化鋁吸附后甲肝病毒無解離，體外相對效力達到1.59，成品檢定數(shù)據(jù)見表4。
細菌內(nèi)毒素檢查方法和異常毒性檢查方法均參照現(xiàn)行版《中國藥典》附錄相關方法進行；體外相對效力測定參照《中國藥典》(2010版)附錄XS進行。
表4實施例2制備的甲肝滅活疫苗檢定結果 實施例3 將本發(fā)明實施例1、實施例2提供的甲型肝炎滅活疫苗進行小鼠體內(nèi)效力試驗，計算半數(shù)有效稀釋倍數(shù)，觀察其免疫原性。
取雌性NIH小鼠，體重16-18g，隨機分組。試驗分為4組，每組20只，陰性對照組注射氫氧化鋁疫苗稀釋劑；試驗苗1組和試驗苗2組分別注射實施例1和實施例2制備的疫苗，1280EU/ml；參比苗組國外甲型肝炎滅活疫苗，1440EU/ml。用疫苗稀釋劑將試驗苗和參比苗進行4倍系列稀釋，共3個稀釋度1∶4、1∶16和1；64。每只小鼠腹腔注射1.0ml，免疫4周后，心臟采血，離心分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA競爭抑制法檢測抗HAV抗體，按照Reed-Muench法計算半數(shù)有效稀釋倍數(shù)。結果見表5。
表5本發(fā)明所述甲肝滅活疫苗小鼠效力試驗結果
小鼠體內(nèi)效力試驗結果表明，實施例1和實施例2制備的甲肝滅活疫苗抗原含量為1280EU/ml時，半數(shù)有效稀釋倍數(shù)均高于參比苗，其免疫原性優(yōu)于參比苗，因此本發(fā)明提供的甲肝滅活疫苗優(yōu)選HAV抗原含量為1280EU/ml。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種制備甲型肝炎滅活疫苗的方法，包括如下步驟
步驟1將甲型肝炎病毒毒種接種于人胚肺二倍體細胞2BS株，培養(yǎng)至病毒增殖高峰期，用胰酶常規(guī)消化細胞；
步驟2離心取沉淀加入細胞裂解液，使其充分作用；
步驟3加入聚乙二醇使其充分作用，離心取沉淀用PBS緩沖液懸浮，加入氯仿抽提，制備粗制甲肝病毒液；
步驟4步驟3制備的粗制甲肝病毒液經(jīng)凝膠層析純化后，經(jīng)0.2μm濾膜除菌，滅活；
步驟5將步驟4制備的甲肝病毒液經(jīng)超濾膜超濾，經(jīng)氫氧化鋁佐劑吸附，制成甲型肝炎滅活疫苗。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1所述毒種為甲型肝炎病毒L-A-1減毒株，已于1992年12月21日保藏在武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No.V92004。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1所述培養(yǎng)為利用多層細胞工廠或3L轉瓶進行培養(yǎng)。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2具體為離心取沉淀加入細胞裂解液在2-8℃作用16-24h，所述細胞裂解液為含質量百分比2-5％乙二胺四乙酸二鈉的0.2-0.5％去氧膽酸鈉溶液。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3所述聚乙二醇分子量為6000，終濃度為體積百分比8％～10％。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3所述PBS緩沖液為pH 5.5～7.5的0.01-0.02mol/L的PBS緩沖液。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4所述滅活為終濃度為200-250μg/ml的甲醛溶液滅活12-14天。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5所述超濾膜的截留分子量為50-100KD。
9.根據(jù)權利要求1-8任一項所述方法制備的甲型肝炎滅活疫苗。
10.根據(jù)權利要求9所述的甲型肝炎滅活疫苗，其特征在于，所述疫苗滅活甲肝病毒濃度為640～1280EU/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，公開了一種甲型肝炎滅活疫苗的制備方法，即培養(yǎng)接種了甲肝病毒L-A-1減毒株的人胚肺二倍體細胞2BS細胞株至病毒增殖高峰期，用胰酶、細胞裂解液常規(guī)消化細胞，收獲病毒液，經(jīng)PEG沉淀、氯仿抽提，去除細胞雜蛋白，再經(jīng)一步凝膠過濾層析純化、濾膜除菌、超濾膜超濾、氫氧化鋁佐劑吸附，制成甲型肝炎滅活疫苗。由此方法制得的甲型肝炎滅活疫苗經(jīng)小鼠體內(nèi)效力試驗結果表明，半數(shù)有效稀釋倍數(shù)高于參比苗，其免疫原性優(yōu)于參比苗。本發(fā)明所述方法可提高疫苗安全性，簡化工藝，降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)甲型肝炎滅活疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號A61P31/14GK101816786SQ20101016051
公開日2010年9月1日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權日2010年4月30日
發(fā)明者劉令九, 岳立廣, 趙小琳, 徐艷玲, 侯麗娟, 李海濱, 劉兵, 岳丹, 蔡暉, 徐曉霞, 李景良 申請人:長春生物制品研究所