專利名稱：包含重組病毒載體的多價疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及 重組DNA和病毒載體疫苗領域。更具體地，本發(fā)明涉及重組DNA和攜帶編碼多價抗原的核酸的病毒載體和/或佐劑。
背景技術：
幾千年來，結(jié)核病(TB)在世界范圍內(nèi)一直是人類健康的主要威脅。由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的TB是暴露于空氣傳播的結(jié)核分枝桿菌細菌感染而引起的肺部感染性疾病。該菌具有強感染性，據(jù)估計，目前約有1/3的世界人口(20億人)受到感染。進一步預計，TB每年已致超過2百萬的世界人口死亡。只有5-10%的具有免疫能力的人群對TB敏感，并且其中超過85%的人群將發(fā)展成只在肺中的疾病，而HIV感染人群也能發(fā)展成更容易導致死亡的全身性疾病。約90%的結(jié)核分枝桿菌感染的人群將不會發(fā)展成疾病。然而，在這些潛伏感染個體中，該細菌能存活許多年，并且在免疫系統(tǒng)變?nèi)醯那闆r下例如在HIV感染后能被重新激活。因為其潛伏特性，所以通常感染個體必須通過給予幾種抗生素12個月以上進行治療， 該治療通常不是非常有吸引力的治療，因為費用和可能的多藥抗性的發(fā)生，該治療也不是一個在大多數(shù)發(fā)展中國家中非常有效的治療。一種相對成功的TB疫苗已經(jīng)被開發(fā)出來卡介苗(BCG)疫苗在二十世紀早期產(chǎn)生，1921年首次將其給予個體。BCG疫苗是基于奶牛的牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis) 細菌的減毒株。該疫苗相對安全，可以容易和相當便宜的生產(chǎn)。在2000年，BCG疫苗覆蓋了 86%的世界人群。然而，該疫苗似乎對成人肺TB不是特別有效，因為發(fā)展中國家的許多地區(qū)仍然有非常高的TB發(fā)生率，盡管進行了 BCG疫苗接種項目。據(jù)估計，BCG疫苗預防了僅5%的TB造成的所有疫苗可預防的死亡(Kaufmarm，2000)。由于BCG疫苗普遍相當?shù)偷谋Ｗo率，以及由于針對兒童時期和散布TB的特異性保護，所以基于其它系統(tǒng)和其它領域例如抗其它熱帶感染疾病和HIV的疫苗所獲得的知識， 更多的努力被用于開發(fā)新的、應用更加廣泛的抗TB疫苗上(Wang and Xing綜述，2002)。不同方法被用來開發(fā)新TB疫苗，范圍從亞單位疫苗和DNA疫苗到修飾的分枝桿菌菌株。此外，也產(chǎn)生了基于重組病毒的疫苗，該疫苗通過基因輸送載體例如修飾的Ankara 痘苗(MVA)載體和復制缺陷型腺病毒載體能將結(jié)核分枝桿菌抗原轉(zhuǎn)移至抗原呈遞細胞?？筎B的裸DNA疫苗記載在W096/15241中(也參見EP0792358)，同時許多報道記載了來自結(jié)核分枝桿菌的多種抗原以重組或純化的形式應用于疫苗W0 95/01441、 WO 95/14713、W096/37219、US 6，599，510、WO 98/31388、WO 98/44119、WO 99/04005、WO 99/24577,WO 00/21983,WO 01/0415UW0 01/79274,W02004/006952,US 2002/0150592。也提示了應用包含不同TB抗原的融合蛋白見WO 98/44119、EP 0972045以及EP 1449922， 這些文獻公開了 ESAT-6和MPT59融合多肽的應用(MPT59也稱為Ag85B或85B抗原)。
盡管所有這些和其它產(chǎn)生抗結(jié)核病疫苗的努力以確保強的細胞和體液免疫應答以及長效高保護率，但這樣的疫苗目前還沒有獲得。附圖簡述圖 1 :pAdApt35Bsu. myc 圖譜圖 2 :pAdApt35Bsu. TB. LM 圖譜圖 3 :pAdApt35Bsu. TB. SM 圖譜圖 4 :pAdApt35Bsu. TB. FLM 圖譜圖 5 :pAdApt35Bsu. TB. 3M 圖譜圖 6 :pAdApt35Bsu. TB. 4M 圖譜圖 7 :pAdApt35Bsu. TB. 5M 圖譜圖 8 :pAdApt35Bsu. TB. 6M 圖譜圖 9 :pAdApt35Bsu. TB. 7M 圖譜

圖10.抗-TB抗原多克隆抗體與Ad35病毒感染A549細胞的裂解物的Western印記，所述Ad35病毒包含不同組TB抗原的核酸，具有myc-標記(A)和不含myc-標記(B)。 (C)與⑶相似，有分子量標記。參見表I注釋。圖11.使用含不同組編碼結(jié)核抗原的核酸的7種不同腺病毒載體(DNA)的免疫方案的實驗設計。圖12.在不含肽的刺激下，干擾素-Y生產(chǎn)(IFNY+)染色陽性的抗原特異性脾細胞百分率(A :CD4+細胞，B :CD8+細胞)。圖13.在Ag85A抗原相關肽刺激下，干擾素-Y生產(chǎn)(IFN γ +)染色陽性的抗原特異性脾細胞百分率(Α ⑶4+細胞，B ⑶8+細胞)。圖14.在Ag85B抗原相關肽刺激下，干擾素-Y生產(chǎn)(IFN γ +)染色陽性的抗原特異性脾細胞百分率(Α ⑶4+細胞，B ⑶8+細胞)。圖15.在ΤΒ10. 4抗原相關肽刺激下，干擾素-Y生產(chǎn)(IFN γ +)染色陽性的抗原特異性脾細胞百分率(Α ⑶4+細胞，B ⑶8+細胞)。圖16. ICN染色陽性的⑶4+和⑶8+脾細胞百分率總述，該脾細胞獲自注射了三聯(lián)插入片段(triple insert)TB-L(A)和TB-S(B)的小鼠血清。圖17.包含編碼Ag85A、Ag85B和TblO. 4抗原的核酸的不同劑量TB-S的劑量應答效應。Ag85A(A)、Ag85B(C)和 TB 10.4(E)的 CD4 反應。Ag85A(B)、Ag85B(D)和 TB10. 4(F) 的CD8反應。(G)含校正肽庫(adjusted peptide pool)的Ag85B的CD8反應(參見實施例6)左圖，TB-L感染；右圖，TB-S感染。圖18. BCG引發(fā)且不同Ad-ΤΒ載體加強的CD4和CD8反應。Ag85A(A)、Ag85B(C)禾口 TB10. 4(E)的 CD4 反應。Ag85A(B)、Ag85B (D)和 TB10. 4(F)的 CD8 反應。圖19. TB-LM的核苷酸序列
圖20. TB-SM的核苷酸序列圖21. TB-FLM的核苷酸序列圖22. TB-LM的氨基酸序 列

圖23. TB-SM的氨基酸序列圖24. TB-FLM的氨基酸序列
圖25.長期讀數(shù)的BCG引發(fā)/Ad35_TB加強實驗的Ag85A刺激。上部⑶4反應， 下部CD8反應。Ad35. E =空Ad35病毒。圖26.長期讀數(shù)的BCG引發(fā)/Ad35_TB加強實驗的Ag85B刺激。上部⑶4反應， 下部CD8反應。Ad35. E =空Ad35病毒。

圖27.長期讀數(shù)的BCG引發(fā)/Ad35_TB加強實驗的TB10. 4刺激。上部⑶4反應， 下部CD8反應。Ad35. E =空Ad35病毒。發(fā)明_既述本發(fā)明涉及重組病毒載體，優(yōu)選復制缺陷腺病毒，更優(yōu)選重組人腺病毒血清型 AdlU Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50，其中病毒載體包括異源核酸序列，該序列編碼來自一種或多種結(jié)核致病菌的至少兩種抗原的(融合)多肽。編碼的抗原可以直接連接，即形成一個單一多肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗原以前體多蛋白存在，在該情況下， 他們通過由共表達的特異性蛋白酶識別的接頭序列連接。異源核酸可以包括編碼蛋白酶的基因。由于抗原存在在融合產(chǎn)物中，所以直接連接的融合蛋白可引發(fā)期望的免疫應答，同時包含蛋白酶位點的蛋白被切割為分離的抗原形式，每一抗原也可產(chǎn)生期望的免疫應答。蛋白酶優(yōu)選通過被細胞蛋白酶識別的蛋白酶識別位點連接至抗原。與使用僅包括單一轉(zhuǎn)基因編碼單位的病毒載體的免疫或治療相比，兩種方案提供了額外的或甚至是協(xié)同的作用。更通常地，本發(fā)明也涉及包括異源核酸序列的病毒載體，該序列編碼被蛋白酶特異切割位點分隔的多抗原。可以理解，這樣的抗原可以來自廣泛來源，包括但不限于感染物，例如病毒、 細菌和寄生蟲，因此，根據(jù)本發(fā)明這個方面，該抗原并不限于來自結(jié)核致病菌的抗原。來自結(jié)核分枝桿菌(Tuberculosis mycobacterium)的抗原作為非限制性的實例，以說明這種多價病毒載體疫苗如何產(chǎn)生，在進入宿主細胞之后該抗原如何分離，以及該抗原能產(chǎn)生免疫應答。本發(fā)明還涉及病毒載體共表達的遺傳佐劑的應用。這些佐劑由核酸編碼，該核酸是導入病毒載體基因組的異源核酸序列的一部分。佐劑與特異抗原共同表達，因此能刺激針對抗原的免疫應答。具體地，編碼佐劑的序列可與編碼抗原的序列直接連接，但優(yōu)選地與編碼一個或多個抗原的序列由編碼蛋白酶識別位點的接頭序列分隔。在后一情況中，佐劑與抗原分別存在在宿主中，其能與抗原一起提供免疫刺激效應。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及包含重組病毒載體的多價疫苗。優(yōu)選的病毒載體是重組腺病毒(Ad) 載體。本發(fā)明的重組腺病毒載體包括編碼至少兩種不同抗原的異源核酸序列。抗原可位于單一多肽中。這些決定簇可以是來自病毒、細菌和寄生病原體的抗原，或者宿主抗原， 例如但不限于自身免疫抗原或腫瘤抗原。在優(yōu)選的實施方案中，抗原來自結(jié)核(TB)致病菌，更優(yōu)選來自結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌(M. africanum)或牛分枝桿菌(M. bovis) 或者其組合。抗原可以是全長天然蛋白，抗原與宿主蛋白或模擬物的嵌合融合體，源自病原體的抗原的一或多個片段，或者仍可引發(fā)期望免疫應答的其它突變體?？傻湫偷赜糜诒景l(fā)明病毒載體的編碼TB抗原的基因包括但不限于Ag85A(MPT44)、Ag85B(MPT59)、 Ag85C (MPT45)、TB10. 4 (CFP7)、ESAT-6、CFP7A、CFP7B、CFP8A、CFP8B、CFP9、CFP10、CFPlOA, CFP11、CFP16、CFP17、CFP19、CFP19A、CFP19B、CFP20、CFP21、CFP22、CFP22A、CFP23、CFP23A、 CFP23B、CFP25、CFP25A、CFP26 (MPT51) CFP27、CFP28、CFP29、CFP30A、CFP30B、CWP32、CFP50、MPT63、MTC28、LHP、MPB59、MPB64、MPT64、TB15、TB18、TB21、TB33、TB38、TB54、TB12. 5、 TB20. 6、TB40. 8、TB10C、TB15A、TB17、TB24、TB27B、TB13A、TB64、TB11B、TB16、TB16A、TB32、 TB32A、TB51、TB 14、TB27、HBHA、GroEL、GroES (W095/01441、WO 98/44119、US 6,596,281、 US 6，641，814、WO 99/04005、WO 00/21983、WO 99/24577)以及公開在 WO 92/14823、 W095/14713.W0 96/37219,US 5, 955, 077,US 6, 599, 510,WO 98/31388,US 2002/0150592、 WO 01/04151、WO 01/70991、WO 01/79274、W02004/006952、WO 97/09428、WO 97/09429、 WO 98/16645、W098/16646、WO 98/53075、WO 98/53076、WO 99/42076、WO 99/42118、 WO 99/51748、WO 00/39301、WO 00/55194、WO 01/23421、W001/24820、WO 01/25401、WO 01/62893、WO 01/98460、WO 02/098360、W003/070187、US 6，290，969、US 6，338，852、US 6，350，456、US6, 458，366、US 6，465，633、US 6，544，522、US 6，555，653、US 6，592，877、US 6，613，881、US 6，627，198中的抗原。特定用途的抗原融合體是本文首次公開的那些(例如Ag85A-Ag85B-TB 10. 4及其組合)，但也已知如ESAT-6-MPT59和MPT59-ESAT-6這樣的融合體已經(jīng)公開在W098/44119和上述參考文獻中?！獋€利用多抗原的方法可以通過單個載體中存在有兩個或多個分離的表達盒，每個表達盒包含各自感興趣的基因來實現(xiàn)。該方法具體有以下優(yōu)點，例如與載體空間利用度相關分隔的盒通常包括各自的啟動子和/或誘導物以及各自的多腺苷酸化信號序列。這種盒通常在病毒載體中需要獨立位置，這將導致更繁瑣的克隆步驟，而稱為“啟動子干擾” 或“壓制(squelching)”(啟動子發(fā)揮作用 所要求的細胞因素的有限可利用度)的現(xiàn)象可限制不同啟動子的表達水平。以本文公開的涉及多TB抗原融合體的重組病毒載體為例，現(xiàn)在可以制備包含編碼多于一個抗原的多個核酸的重組腺病毒載體，其中病毒載體產(chǎn)生強免疫應答，而應用單一插入體引發(fā)有限效應。具體地，這些載體編碼重組遺傳嵌合物，其在單順反子mRNA中表達兩種或多種抗原，例如以融合蛋白形式。當DNA疫苗或病毒載體用于激發(fā)對所載抗原的T 細胞免疫時，該方法是有效的。然而，這種融合蛋白可能有其它不能事先預料的額外缺點， 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種融合體可能會扭曲免疫顯性模式而不能總是以相同潛能激發(fā)針對所有靶抗原的免疫，而遺傳融合體表達的第二個也可能更重要的缺點是由于融合配偶體緊密靠近或其它原因，各個成分不能折疊成天然構(gòu)象。由于這些原因，遺傳融合體可能引發(fā)針對無義表位的抗體應答，這種抗體不能識別原始病原體所展示的天然表位，對抗擊感染較弱。本發(fā)明人現(xiàn)在開發(fā)了一種系統(tǒng)，其中多抗原由單一異源核酸序列編碼，其中表達的多蛋白被加工成分離的抗原多肽。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及能使多抗原表達的病毒載體，所述多抗原被依次加工成分離的抗原，由此避免與遺傳融合體相關的可能限制，同時也不需要獨立的表達盒。迄今，還沒有記載能使病毒載體表達的遺傳融合體精確加工為分離抗原的組合物或方法。DNA或病毒載體包含的核酸編碼的多抗原的表達是利用蛋白酶(PR)例如禽類白血病病毒(ALV ；本文稱為PR-ALV)編碼的病毒蛋白酶證明的，其中所述抗原接著被加工成分離的抗原。在ALV中，ALV-I^R形成gag蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域已知催化gag和gag-pol前體加工，這是ALV復制的關鍵步驟(Skalka綜述.1989)。產(chǎn)生了獨特的ALV-PR定向加工系統(tǒng)。含有ALV-I3R和給定抗原的多蛋白通過DNA或病毒載體表達，其中ALV-I5R優(yōu)選形成多蛋白的N末端，后面緊接與ALV-PR 消化位點連接的抗原序列。優(yōu)選兩個不同的切割位點用于該系統(tǒng)。一個切割位點(GSSGPWPAPEPPAVSLAMTMEHRDRPLV ；SEQ ID NO 22)釋放 ALV-PR，另一切割位點(PPSKSKKGG AAAMSSAIQPLVMAVVNRERDGQTG ；SEQ ID NO 21)則被ALV-PR所識別，用于分離在分離多肽中的其它被編碼的抗原?；蛘?，ra和其切割位點可由其它逆轉(zhuǎn)錄病毒所編碼或基于其它逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如人免疫缺陷病毒(HIV)、鼠白血病病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和勞斯肉瘤病毒。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明公開了包含編碼來自結(jié)核分枝桿菌的多抗原的核酸序列的重組病毒載體，其中不同的核酸序列被編碼ALV蛋白酶識別位點的序列彼此分隔。 在該情況下，分離的TB抗原以多蛋白的形式產(chǎn)生而后加工，這樣它們被切割成分離的抗原多肽，各自導致免疫應答?？梢岳斫?，ALV蛋白酶系統(tǒng)不限于應用TB-特異性抗原。本領域技術人員將會理解該系統(tǒng)有可能應用其它抗原，這些抗原與TB抗原不同或與之組合，以及其可應用于其它治療方案，例如基因治療及腫瘤免疫。優(yōu)選地，包含被蛋白酶位點分隔的多抗原編 碼序列的病毒載體是腺病毒載體。病毒載體可以是病毒顆粒本身，術語病毒載體也可以指編碼病毒顆粒的核酸。腺病毒載體優(yōu)選是重組載體，其基于或衍生于在低百分數(shù)的靶群中遭遇中和活性的腺病毒種或血清型。 這些腺病毒有時也稱為“稀有”腺病毒，因為它們通常不會在人群中規(guī)律流行。因此，優(yōu)選的血清型是 Adll、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49 和 Ad50。本文所用的“抗原”是指蛋白質(zhì)或其片段，在動物或人類細胞或組織中表達時，其能引發(fā)免疫應答。例子包括但不限于病毒蛋白、細菌蛋白、寄生物蛋白、細胞因子、趨化因子、免疫調(diào)節(jié)劑以及治療劑?？乖梢允且吧偷鞍住⒃摰鞍椎慕囟绦问?、該蛋白的突變形式、或該蛋白的任何其它變體，在每種情況下，在接種的動物或人宿主中表達時均能夠引發(fā)免疫應答?？梢岳斫?，當抗原直接融合時，該融合是重組分子生物學的結(jié)果；因此，本文所用的兩種抗原的直接融合體并不是指發(fā)生在自然界的單一野生型蛋白的兩個抗原部分。為了清楚起見，當單一野生型蛋白的兩個抗原部分(兩部分通常直接連接于蛋白內(nèi))通過本文所公開的接頭(例如通過ALV蛋白酶位點，如下文所述)連接時，該融合體也是本發(fā)明的一部分。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及直接連接或通過一個或多個蛋白酶位點連接的不同蛋白質(zhì)(有抗原活性)。在更優(yōu)選的實施方案中，編碼蛋白酶的基因與感興趣的蛋白相連，更優(yōu)選通過另一種蛋白酶位點相連。不同抗原不需要來自同一病原物種。多物種不同抗原的組合也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，其中不同抗原由單一載體內(nèi)的核酸序列編碼?！八拗骺乖笔侵复嬖谠谑荏w動物細胞或組織的蛋白或其部分，例如但不限于細胞蛋白、免疫調(diào)節(jié)劑或治療劑。抗原可以由密碼子優(yōu)化的合成基因編碼，及用常規(guī)重組DNA方法構(gòu)建。如上所述，包含ALV蛋白酶系統(tǒng)的重組病毒載體表達的抗原可以是在侵入動物宿主、在動物宿主內(nèi)建群或在動物宿主內(nèi)復制之前或期間由任何病毒、細菌或寄生病原體表達的任何分子。這些病原體在人、家畜或野生動物宿主中可以是感染性的。病毒抗原來自的病毒病原體包括但不限于正粘病毒，例如流感病毒；逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如RSV、HTLV-I和HTLV-II ；皰疹病毒，例如EBV ；CMV或單純皰疹病毒；慢病毒，例如 HIV-I和HIV-2 ；彈狀病毒，例如狂犬病毒；小RNA病毒，例如脊髓灰質(zhì)炎病毒；痘病毒，例如痘苗病毒；輪狀病毒；以及細小病毒，例如腺伴隨病毒(AAV)。
病毒抗原的例子在下組可以找到，包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)抗原Rev、 Pol、Nef、Gag、Env, Tat、Tat 突變衍生物，例如 Tat_A31_45、gpl20 的 T-細胞和 B-細胞表位、HIV-I Env和gpl20的嵌合衍生物，例如gpl20與⑶4的融合體、截短或修飾的HIV-I Env，例如gpl40或HIV-IEnv和/或gpl40的衍生物。其它例子是乙肝表面抗原、輪狀病毒抗原，例如VP4和VP7，流感病毒抗原，例如血凝素、神經(jīng)氨酸酶或核蛋白，以及單純皰疹病毒抗原，例如胸苷激酶。細菌抗原衍生自的細菌病原體的例子包括但不限于分枝桿菌屬(Mycobacterium spp·)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、沙門氏菌屬(Salmonella spp·)、志賀氏菌屬 (Shigella spp.)、大腸桿菌(E coli)、立克次氏體屬(Rickettsia spp.)、李斯特氏菌屬 (Listeria spp.)、肺炎軍團菌(Legionella pneumoniae)、Fansicella spp.、假單胞菌屬 (Pseudomonas spp.)、弧菌屬(Vivrio spp.)以及布氏疏螺方寵體(Borellia burgdorferi)。細菌病原體的保護性抗原的例子包括產(chǎn)腸毒性大腸桿菌的菌體抗原，例如CFA/I 菌毛抗原和熱不穩(wěn)定毒素的非毒性B亞基；百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis) pertactin,百日咳博德特氏菌的腺苷酸環(huán)化酶-溶血素、破傷風梭菌(Clostridium tetani)破傷風毒素C片段、布氏疏螺旋體OspA、普氏立克次氏體(Rickettsia prowazekii)和斑疹傷寒立克次氏體(Rickettsia typhi)保護性類結(jié)晶表面層蛋白 (protective paracrystal 1 ine-surface-layer proteins)、單核細Ifiii1 生李 寺氏 Iif (Listeria monocytogenes)的李斯特菌溶胞素(也稱作〃 Llo"和〃 Hly")和/或超氧化物岐化酶(也稱為"SOD"和"p60")、幽門螺桿菌的脲酶以及炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthrax)的致死毒素的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或保護性抗原。寄生抗原衍生自的寄生病原體包括但不限于瘧原蟲屬(Plasmodium spp.)， 例如惡性癥原蟲(Plasmodium falciparum)；維蟲屬(Trypanosome spp.)，例如克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)；賈第蟲屬(Giardia spp.)，例如腸賈第蟲(Giardia intestinalis)；牛蜱屬(Boophilus spp.)；巴倍蟲屬(Babesia spp.)，例如田鼠巴倍蟲 (Babesia microti)；內(nèi)阿米巴屬(Entamoeba spp.)，例如溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)；艾美蟲屬(Eimeria spp.)，例如巨型艾美耳球蟲(Eimeria maxima)；利什曼原蟲屬(Leishmania spp.)；血吸蟲屬(Schistosome spp. ) ；Brugia 屬(Brugia spp.)； Fascida 屬(Fascidaspp.)；惡絲蟲屬(Dirofilaria spp.)；吳策絲蟲屬(Wuchereria spp.)；以及盤尾絲蟲屬(Onchocerea spp·)。寄生病原體的保護性抗原的例子包括瘧原蟲屬的環(huán)子孢子蛋白(CS)或肝期特異性(LSA)抗原LSA-I和LSA-3，例如P. bergerii或惡性瘧原蟲的那些或其免疫原性突變體；瘧原蟲屬的裂殖子表面抗原、溶組織內(nèi)阿米巴的半乳糖特異性凝集素、利什曼原蟲屬的gp63、碩大利什曼原蟲(Leishmania major)的gp46、Brugia malayi的副肌球蛋白、曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)的丙糖磷酸異構(gòu)酶、蛇形毛圓線蟲(Trichostrongylus colubriformis)的分泌的球蛋白樣蛋白、Frasciola h印atica、牛血吸蟲(Schistosoma bovis)和日本血吸蟲(S. japonicum)的谷胱甘肽_S_轉(zhuǎn)移酶以及牛血吸蟲和日本血吸蟲的 KLH。如上所述，包含編碼ALV或ALV樣蛋白酶的核酸的重組病毒載體可編碼宿主抗原， 其可以是任何細胞蛋白、免疫調(diào)節(jié)劑、或治療劑或其部分，其可在受體細胞中表達，其包括但不限于腫瘤、移植物、和自身免疫抗原或者腫瘤、移植物、自身免疫抗原的片段和衍生物。 因此，在本發(fā)明中，病毒載體可以編碼腫瘤、移植物或自身免疫抗原，或者其部分或衍生物。 或者，病毒載體可以編碼合成基因(如上所述制備)，所述合成基因編碼腫瘤特異的移植物或自身免疫抗原或其部分。這種抗原的實例包括但不限于前列腺特異抗原、MUC1、gplOO、 HER2、TAG-72、CEA、MAGE-1、酪氨酸酶、CD3 以及 IAS β 鏈。具體地，通過在單一多蛋白中導入多個多肽并在需要這些多個(分離)多肽的宿主中將該多蛋白加工成分離的多肽，本文公開的ALV蛋白酶位點技術也可用于基因治療應 用。作為進一步增強病毒載體免疫原性的手段，編碼至少一個抗原和佐劑的表達盒被構(gòu)建，其能用于增強對所述病毒載體表達抗原的宿主應答。該佐劑在本文中也稱作“遺傳佐劑”，因為基因編碼用作佐劑的蛋白。優(yōu)選的應用如上所述應用蛋白酶和連接蛋白酶位點， 在翻譯后將抗原從佐劑切開，盡管在某些實施方案中，佐劑也可直接與抗原連接。病毒載體編碼的特定佐劑可以選自廣泛的遺傳佐劑。在優(yōu)選的實施方案中，佐劑是霍亂毒素 A 亞基(CtxA ；實例GenBank accession no. X00171、AF175708、D30053、 D30052)，或其功能部分和/或功能突變衍生物，例如Ctx的A亞基的Al結(jié)構(gòu)域(CtxAl ； GenBank accession no. K02679)。或者，任何細菌腺苷二磷酸核糖外毒素家族成員的細菌毒素都可以使用。非限制性的實例是腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素A亞基(EltA)和百日咳毒素Sl亞基。其它的實例是腺苷酸環(huán)化酶-溶血素，例如百日咳博德特氏菌、支氣管炎博德特氏菌(B. bronchis印tica)或副百日咳博德特氏菌(B. parapertussis) cyaA基因?；蛘?，特定的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶毒素可以是霍亂毒素A亞基(即CtxA)的任何衍生物或其部分(即Ctx A亞基的Al結(jié)構(gòu)域(即CtxAl))，所述霍亂毒素來源于任何經(jīng)典霍亂弧菌(Vibrio cholerae)菌株(例如菌株395)或El-Tor霍亂弧菌(例如菌株2125)，所述 El-Tor霍亂弧菌顯示出降低的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶催化活性但仍保留了結(jié)構(gòu)完整性，包括但不限于第7位的精氨酸被賴氨酸取代(R7K)、41位的絲氨酸被苯丙氨酸取代(S41F)、61位的絲氨酸被賴氨酸取代(S61K)、63位的絲氨酸被賴氨酸取代(S63K)、53位的纈氨酸被天冬氨酸取代(V53D)、97位的纈氨酸被賴氨酸取代(V97K)或104位的酪氨酸被賴氨酸取代 (Y104K)或者其組合。或者，特定的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶毒素可以是任何完全類似的霍亂毒素的衍生物，但由于分別在催化位點或臨近催化位點的突變所致而已經(jīng)是無毒的蛋白。這樣的突變體可以通過下文所述的常規(guī)定點誘變方法制備。在另一實施方案中，ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶毒素是分離自任何腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素的A亞基(LtxA)的任何衍生物，所述腸產(chǎn)毒性大腸桿菌包括但不限于大腸桿菌菌株H10407，其顯示出降低的ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶催化活性但仍保留了結(jié)構(gòu)完整性，包括但不限于R7K、S41F、S61K、S63K、V53D、V97K或Y104K或其組合?；蛘撸囟ǖ腁DP-核糖轉(zhuǎn)移酶毒素可以是任何完全類似的霍亂毒素衍生物，所述衍生物由于在催化位點或臨近催化位點的突變而無毒。這樣的突變體可以通過下文所述的常規(guī)定點誘變方法制備。雖然ADP-核糖基化毒素是有效的佐劑，但本發(fā)明的病毒載體編碼的佐劑也可以是來自病毒、細菌或原生動物生物體的任何生物活性蛋白、免疫調(diào)節(jié)DNA、雙鏈RNA或小抑制RNA (本文稱為siRNA)。特定的生物活性蛋白可以選自但不限于下列第1類.該類佐劑通過抑制Rho——宿主小GTPase而誘導凋亡。抑制Rho已經(jīng)清楚與誘導凋亡相關。誘導凋亡是驅(qū)使旁觀者T細胞應答的有用方法，也是誘導CTL的有效方法。至今，該策略還沒有在任何實驗系統(tǒng)中被評估。SopE活性結(jié)構(gòu)域包含在氨基酸78-240中，它僅需要486bp 基因用于表達。大腸桿菌CNF-I的催化結(jié)構(gòu)域可能有類似特性。第2類.細菌膜孔蛋白已經(jīng)顯示出具有免疫調(diào)節(jié)活性。這些疏水同源三聚體蛋白形成允許Mr < 600Da分子通過膜的孔。膜孔蛋白的實例包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的OmpF、OmpC和OmpD蛋白。 第3類.雙鏈RNA(dsRNA)激活宿主細胞，包括樹突狀細胞。編碼由內(nèi)含子或核酶所間隔的反向重復序列的mRNA的表達導致dsRNA的表達。第4類.肽基序(motive) [WYF]xx[QD] xx[WYF]已知可誘導CDld-限制性NK T細胞應答(Kronenberg和Gapin，2002)。具有該基序融合到T4f ibritin卷曲-卷曲基序的肽的表達可產(chǎn)生三聚體肽，其將在⑶Id-限制性T細胞上交聯(lián)TCR，從而激活先天宿主應答。第5類.siRNA可用于靶向宿主mRNA分子， 抑制免疫應答(例如kir)，調(diào)節(jié)免疫應答(例如B7. 2)或阻止交叉呈遞(例如Rho)。第6 類.SiRNA’ s能用于靶向共刺激分子例如⑶80和⑶86的疫苗。抑制這些分子將阻止共刺激，從而導致T細胞無反應性。驚奇地，如本文公開的，已發(fā)現(xiàn)TB致病菌抗原例如TB10. 4蛋白不僅本身能用作抗原，而且甚至能用作其它TB抗原例如Ag85A的佐劑在存在三聯(lián)插入片段的情況中 (Ag85A-Ag85B-TB10. 4)，驚奇地發(fā)現(xiàn)構(gòu)建體中TB10. 4的存在刺激了針對Ag85A的免疫應答，而TB10. 4的缺失顯示出針對⑶8+脾細胞的弱作用(參見實施例4和圖13B)。進一步研究TB10. 4佐劑效應發(fā)現(xiàn)當存在于三聯(lián)構(gòu)建體中時，TB10. 4實際刺激了針對Ag85A的⑶8細胞的活化，而各個編碼獨立抗原的獨立載體的感染沒有導致這種刺激，這強烈提示TB10. 4 抗原應該 存在于同一載體中或者存在于同一翻譯產(chǎn)物中。本發(fā)明還涉及編碼通過蛋白酶識別位點融合的至少一個抗原和細胞因子的病毒載體。這種載體用于增加對所述病毒載體表達的裝載抗原的宿主應答。病毒載體編碼的細胞因子的實例是白介素-4(IL-4)、IL-5、IL-6、IL-10、IL_12p4。、IL_12p7。、TGF β 和 TNFa。導入功能性表達盒以產(chǎn)生在真核細胞或組織中能表達免疫調(diào)節(jié)劑的病毒載體的重組DNA和RNA方法是本領域已知的。本文描述了用于構(gòu)建表達多于一個的抗原的病毒載體的組合物和方法，所述抗原來自TB致病菌，優(yōu)選結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌和/或牛分枝桿菌。優(yōu)選地，病毒載體是復制缺陷型重組腺病毒載體。一個深入研究和經(jīng)常應用的腺病毒血清型是腺病毒5 (Ad5)。 在小鼠和恒河猴研究中，抗Ad5免疫的存在顯示基本抑制了基于Ad5的疫苗的免疫原性。I 期臨床實驗的早期數(shù)據(jù)顯示該問題也發(fā)生在人類中。為避開先前感染了最常見的人腺病毒(例如Ad5)的個體中已存在免疫性的問題，一個有前景的策略涉及開發(fā)來自不會面臨這種已存在免疫性的腺病毒血清型的重組載體。被鑒定為特別有用的人腺病毒載體是基于血清型11、26、34、35、48、49和50，如WO 00/70071、WO 02/40665 和 WO 2004/037294 所示(也參見 Vogels et al. 2003)。其他人發(fā)現(xiàn)腺病毒24(Ad24)也是特別有利的，因為它示出是稀有血清型(W0 2004/083418)。因此，在優(yōu)選的實施方案中，所述病毒載體是衍生自選自下組的血清型的腺病毒Adll、Ad24、 Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50。這種選擇人腺病毒作為疫苗載體的優(yōu)點具體地在于人通常不會感染這些野生型腺病毒。因此，抗這些血清型的中和抗體在人群中大體上很少見。這與血清型5不同，因為人經(jīng)常感染這種野生型血清型。當用作隨后的重組疫苗載體時，例如一種利用腺病毒的抗瘧疾疫苗，親本野生型血清型感染過程中所引起的免疫應答可對重組腺病毒血清型的效力產(chǎn)生負面影響。不同腺病毒血清型在世界范圍人群的傳播因地區(qū)不同而不同。通常，優(yōu)選的血清型在世界大多數(shù)地區(qū)的宿主中遇到低中和活性，如WO 00/70771所述。在另一優(yōu)選的實施方案中，腺病毒是猿猴、犬或牛腺病毒，因為這些病毒在給予重組病毒的(人類)宿主中不會遇到預先存在的免疫。本領域的普通技術人員可以很好理解在人基因治療或疫苗中使用的猿猴腺病毒。此外，發(fā)現(xiàn)犬和牛腺病毒也可在體外感染人細胞，因此也可應用于人類。特別優(yōu)選的猿猴腺病毒是分離自黑猩猩的那些。合適的例子包括 C68(也稱為 Pan 9 ；US 6, 083, 716)以及 Pan 5、6 和 7 (W003/046124)；也參見 WO 03/000851。因此，在低比例需要免疫的人群中遇到中和活性的那些病毒影響重組載體的選擇。本發(fā)明的優(yōu)點有多種。利用被認為是安全的且能懸浮生長至極高體積的細胞，并利用不含任何動物或人來源成分的培養(yǎng)基，可以將重組病毒例如重組腺病毒生產(chǎn)至非常高的滴度。而且，已知重組腺病毒引發(fā)抗腺病毒基因組中異源核酸序列編碼的蛋白的強免疫應答。 本發(fā)明人意識到包含多抗原的疫苗將提供針對TB致病菌更強更廣泛的免疫應答。此外，盡管單抗原本身也能在小鼠純系株中誘導保護，但是包含幾種抗原的混合物(cocktail)是令人信服的應用于人類的更好疫苗，因為它很少可能會在異源人群中遇到MHC相關的無應答。然而，從疫苗開發(fā)的實踐立場來看，生產(chǎn)和配制由多個構(gòu)建體組成的疫苗是非常昂貴的。除了簡化制備方法外，單一構(gòu)建體能保證抗原呈遞細胞對組分的等量吸收，由此產(chǎn)生廣泛特異性的免疫應答。在本發(fā)明的一個特定方面，復制缺陷型重組病毒載體包括編碼抗原決定簇的核酸序列，其中所述異源核酸序列是密碼子優(yōu)化的以提高在哺乳動物優(yōu)選人類中的表達。密碼子優(yōu)化是基于需要的氨基酸含量、在感興趣的哺乳動物中的常用優(yōu)化密碼子使用以及為確保正確表達應該避免的諸多方面。這些方面可以是剪接供體或受體位點、終止密碼子、 Chi-位點、poly(A)延伸序列、GC-和AT-富含序列、內(nèi)部TATA盒等等。哺乳動物宿主的密碼子優(yōu)化方法是本領域技術人員熟知的，可以在多處分子生物學文獻中發(fā)現(xiàn)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的復制缺陷型重組腺病毒載體，其中所述異源核酸中腺嘌呤加胸腺嘧啶的含量與胞嘧啶加鳥嘌呤含量相比少于87%、優(yōu)選少于 80%、更優(yōu)選少于59%及最優(yōu)選等于約45%。攜帶異源基因的重組腺病毒載體的生產(chǎn)是本領域熟知的，典型地涉及利用包裝細胞系、連接物構(gòu)建體(adapter construct)和粘粒以及從腺病毒基因組的El區(qū)缺失至少一個功能性部分(還可參見下文包裝系統(tǒng)和優(yōu)選的細胞系)。本發(fā)明的疫苗典型容納在藥學可接受的載體或賦形劑中。藥學可接受的載體或賦形劑是本領域熟知的，并廣泛用于眾多的治療產(chǎn)品中。優(yōu)選地，應用在疫苗中效果好的載體。更優(yōu)選地，疫苗進一步包含佐劑。本領域已知佐劑可進一步增強針對所應用的抗原決定簇的免疫應答。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的試劑盒在治療、預防或診斷治療TB中的應用。本發(fā)明的包含TB抗原的重組病毒載體可用于疫苗接種方案，其中其與BCG組合使用。它們還可以用作引發(fā)劑或加強劑，分別在BCG接種之前或之后增加所需的免疫應答。也可以預見，本文公開的不同病毒載體可用于引發(fā)-加強方案中，其中一個載體在另一個之后。此外，包含直接連接的抗原的載體可以與包含由蛋白酶位點連接的抗原的載體如此組合。也可以預見引發(fā)-加強方案用一種腺病毒血清型作為引發(fā)劑，而用另一血清型用作加強劑(選自優(yōu)選的人、猿猴、犬或牛腺病毒)。本發(fā)明的病毒載體也可與包含純化(重組生產(chǎn)的)抗原的疫苗和/或包含編碼類似或相同抗原的裸DNA或RNA的疫苗組合使用。因此，本發(fā)明涉及包含編碼來自至少一種結(jié)核(TB)致病菌的兩種或多種抗原的核酸序列的重組復制缺陷型腺病毒?？梢岳斫猓嚯目梢园瑤讉€抗原部分或抗原片段(=抗原)。而且，蛋白本身也可以被認為是“抗原”。優(yōu)選地，所述重組腺病毒是人或猿猴腺病毒。更優(yōu)選地，用作本發(fā)明重組載體的腺病毒選自下組人腺病毒血清型Adll、 Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50。提供優(yōu)選抗原的TB致病菌優(yōu)選是結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌和/或牛分枝桿菌，所述兩個或多個抗原優(yōu)選選自由結(jié)核分枝桿菌的 Ag85A、Ag85B、ESAT-6、f72和TB10. 4開放讀框編碼的抗原所組成的組中。在更優(yōu)選的實施方案中，所述核酸序列編碼至少兩種抗原，所述抗原選自由結(jié)核分枝桿菌Ag85A、Ag85B 和TB10. 4開放讀框編碼的抗原所組成的組中。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的腺病毒包括編碼全長蛋白Ag85A、Ag85B和TB10. 4的核酸序列，其中更優(yōu)選這三種蛋白由包含下列序列的核酸所編碼，其中在所述序列中編碼各個蛋白的基因以5’至3’的順序克隆 (Ag85A-Ag85B-TB10. 4)。本發(fā)明涉及本發(fā)明的重組腺病毒，其中至少兩種所述抗原表達自一個多蛋白。在一個優(yōu)選的實施方案中，至少兩種所述抗原連接以形成融合蛋白。連接可以直接連接或通過至少一個氨基酸的連接接頭連接。當接頭用于連接兩個獨立抗原以提供本發(fā)明的兩個或多個抗原的融合蛋白時，優(yōu)選使用SEQ ID NO 23的一個或多個接頭。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的重組腺病毒或本發(fā)明的重組多核苷酸載體的多價TB 疫苗，其進一步包括藥學上可接受的賦形劑，任選擇地包括佐劑。許多藥學上可接受的賦形劑和佐劑是本領域已知的。本發(fā)明進一步涉及免疫哺乳動物以預防或治療TB的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物本發(fā)明的重組腺病毒、多價TB疫苗或重組多核苷酸載體。一方面，本發(fā)明涉及免疫哺乳動物以預防或治療TB的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物本發(fā)明的重組腺病毒、多價TB疫苗或重組多核苷酸載體用作引發(fā)免疫的步驟；以及給予所述哺乳動物本發(fā)明的重組腺病毒、多價TB疫苗或重組多核苷酸載體用作加強免疫的步驟。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的重組腺病毒、多價TB疫苗或重組多核苷酸載體，它們其中一種用作藥物，優(yōu)選在結(jié)核預防、治療或診斷治療中應用。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的重組腺病毒、多價TB疫苗或重組多核苷酸載體在制備預防或治療結(jié)核的藥物中的應用。在一個特定方面，本發(fā)明涉及包含編碼兩個或多個抗原及蛋白酶識別位點的核酸序列的重組多核苷酸載體，其中所述抗原被表達為多蛋白，所述多蛋白包括分隔所述兩個或多個抗原中至少兩個抗原的蛋白酶識別位點。優(yōu)選地，所述多核苷酸載體是裸DNA載體、 裸RNA載體、質(zhì)粒載體或病毒載體。在優(yōu)選的實施方案中，所述病毒載體包裝至復制缺陷型人或猿猴腺病毒中?？梢岳斫猓《据d體可認為是兩種實體編碼病毒的病毒DNA可用作核酸載體，而通過感染宿主細胞，病毒(包含病毒載體DNA)也可用于轉(zhuǎn)移感興趣的核酸至宿主細胞。因此，本文所用的“載體”是指轉(zhuǎn)移感興趣的基因或感興趣的多個基因至宿主的手段。其可以通過直接注射DNA、RNA、質(zhì)粒或病毒核酸載體實現(xiàn)，也可以通過用重組病毒(此時其用作載體)感染宿主細胞而實現(xiàn)。如本文所示，病毒可用于免疫哺乳動物(例如小鼠)， 而DNA (例如以攜帶感興趣的基因和病毒DNA—部分的連接物質(zhì)粒(adapter plasmid)的形式)也可直接注射于哺乳動物而免疫所述哺乳動物?；诼鉊NA、RNA或質(zhì)粒的疫苗是本領域已知的，而基于重組病毒的疫苗也是已知的。為清楚起見，所有輸送感興趣的基因或感興趣的多個基因至宿主細胞的實體都被認為是“載體”。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述載體中的核酸包括編碼蛋白酶的序列，其中優(yōu)選所述蛋白酶在表達時表達為多蛋白的一部分，并通過蛋白酶識別位點與至少一個所述抗原連接。特別地，優(yōu)選的蛋白酶識別位點包括SEQ ID NO :21或22所示序列。更優(yōu)選的是本發(fā)明的重組多核苷酸載體，其中所述蛋白酶來自禽類白血病病毒(ALV)。優(yōu)選地，通過蛋白酶識別位點連接的抗原來自于至少一種結(jié)核(TB)致病菌，其中所述TB致病菌優(yōu)選是結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌和/或牛分枝桿菌。兩種或多種抗原優(yōu)選選自由結(jié)核分枝桿菌的 Ag85A、Ag85B、ESAT-6和TB10. 4開放讀框編碼的抗原所組成的組，其中最優(yōu)選所述異源核酸序列編碼選自由結(jié)核分枝桿菌的Ag85A，Ag85B和TB10. 4開放讀框編碼的抗原所組成組的至少兩種抗原。更優(yōu)選的是本發(fā)明的多核苷酸，其中抗原是全長Ag85A、Ag85B和TB10. 4 多肽，其所述編碼基因以5’至3’順序克隆。基于這些和其它結(jié)核抗原的融合蛋白在US 5，916，558、WO 01/24820、WO 03/070187 和 WO 2005/061534 中描述。然而，編碼本文所公開的融合蛋白的本發(fā)明核酸用于整合入重組腺病毒載體的用途沒有公開。另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼抗原和遺傳佐劑異源核酸序列的重組多核苷酸載體。術語“遺傳佐劑”指核酸序列編碼的蛋白質(zhì)分子(proteinaceous molecule) 0所述抗原和所述遺傳佐劑可直接連接或者在另一實施方案中間接連接，例如通過包含第一蛋白酶識別位點進行連接。在另一優(yōu)選方面，所述多核苷酸載體是裸DNA載體、裸RNA載體、質(zhì)粒載體或病毒載體。病毒載體優(yōu)選包裝至復制缺陷型人或猿猴腺病毒，其中所述腺病毒更優(yōu)選的選自由人腺病毒血清型Adll、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49和Ad50所組成的組。 也優(yōu)選包括編碼蛋白酶的序列的核酸，其中所述蛋白酶優(yōu)選通過第二蛋白酶識別位點連接于所述抗原和/或所述遺傳佐劑。優(yōu)選的第二蛋白酶識別位點包括SEQ ID N0:22所示序列，而優(yōu)選的第一蛋白酶識別位點包括SEQ ID NO :21所示序列。優(yōu)選的蛋白酶是來自禽類白血病病毒(ALV)的蛋白酶，而抗原優(yōu)選來自至少一種結(jié)核(TB)致病菌，更優(yōu)選來自結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌和/或牛分枝桿菌。優(yōu)選的抗原選自下組Ag85A、Ag85B、ESAT-6 和TB10. 4。最優(yōu)選的實施方案是下述載體，其中所述異源核酸序列編碼選自由結(jié)核分枝桿菌的抗原Ag85A、Ag85B和TB10. 4所組成組的至少兩種抗原，其中進一步優(yōu)選含有下述融合多肽，所述融合多肽按N至C末端的順序包含全長Ag85A、Ag85B和TB10. 4蛋白。如本文所公開的，TB10. 4有預想不到的佐劑活性，因為發(fā)現(xiàn)其可刺激針對多蛋白中存在的其它抗原(特別是Ag85A)的免疫應答。TB10. 4佐劑是優(yōu)選的遺傳佐劑。因此， 本發(fā)明也提供了包含編碼TB10. 4抗原與至少一種其它抗原的核酸的重組載體，其中抗原優(yōu)選是結(jié)核抗原，更優(yōu)選Ag85A抗原。在更優(yōu)選的實施方案中，載體包括編碼TB10. 4抗原和至少Ag85A和Ag85B抗原的核酸。如下所概括，TB10. 4被認為可增加多抗原翻譯產(chǎn)物至蛋白體的加工，從而致使⑶8應答顯著增加。很可能該效應并不僅僅限于Ag85A和TB10. 4，TB10. 4抗原不只局限于結(jié)核疫苗，而有更廣泛的應用。因此，在另一實施方案中，本發(fā)明也涉及包含編碼TB10. 4和至少一種其它抗原的核酸的重組載體，其中其它抗原不是分枝桿菌(Mycobacterium)抗原。本發(fā)明公開了分枝桿菌TB10. 4抗原用作遺傳佐劑的用途。此夕卜，本發(fā)明公開了 TB10. 4抗原在制備用于治療、診斷和/或預防除結(jié)核之外疾病的藥物中的應用，并且至少在該疾病中針對感興趣的抗原的免疫應答需要佐劑作用的刺激。因此，本發(fā)明公開了結(jié)核分枝桿菌TB10. 4中的抗原能用作其它抗原例如Ag85A的佐劑。因此，本發(fā)明也涉及應用分枝桿菌抗原TB10. 4作為遺傳佐劑。此外，在另一實施方案中，本發(fā)明涉及分枝桿菌抗原TB10. 4在制備用于治療或預防疾病的藥物中的應用，其中宿主對某抗原或感興趣的治療組分的免疫應答需要被刺激。本領域技術人員能確定針對給定感興趣抗原的免疫應答水平，以及通過利用例如本文通過TB10. 4所示的遺傳佐劑的佐劑的額外刺激是否對治療對象有益。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的重 組多核苷酸載體，其中所述遺傳佐劑包括霍亂毒素(CtxAl)或其突變衍生物，所述突變衍生物包括63位氨基酸絲氨酸被賴氨酸所取代 (AIk63)。本發(fā)明也涉及多價TB疫苗，所述疫苗包括本發(fā)明的重組多核苷酸載體，進一步包括藥學上可接受的賦形劑，任選地包括佐劑。
實施例實施例1.構(gòu)建攜帶結(jié)核分枝桿菌抗原的基于Ad35的連接物質(zhì)粒 在此記載了適合產(chǎn)生能夠表達單個或多個TB抗原的El缺失的、基于 Ad35載體的連接物質(zhì)粒的構(gòu)建。例子涉及TB抗原Ag85A(Swissprot#P17944)、 Ag85B(Swissprot#P31952)和 TB10. 4(Swissprot#053693)作為利用基于腺病毒復制缺陷型載體產(chǎn)生單抗原和多抗原疫苗制品的非限制性實例的手段方法。如上所述，本文應用的原理也可應用于任何預防或治療多肽的組合。構(gòu)建 pAdApt35Bsu. mycpAdApt35Bsu連接物質(zhì)粒記載在申請人的申請WO 2004/001032中。該質(zhì)粒含有 Ad35基因組的左側(cè)部分(包括左側(cè)反向末端重復(ITR))，進一步缺失功能性El區(qū)和包含插入至El區(qū)的CMV啟動子表達盒。該連接物也包括功能性PlX啟動子和El區(qū)下游的Ad35 區(qū)域，該區(qū)域足夠與包含Ad35基因組剩余部分的粘粒發(fā)生同源重組，從而導致在包裝細胞中產(chǎn)生重組復制缺陷型腺病毒，所述包裝細胞提供用于功能性復制及包裝產(chǎn)生的病毒的所有必要元件和功能。利用這種連接物質(zhì)粒產(chǎn)生重組腺病毒是本領域技術人員已知的方法。pAdApt35Bsu用NheI和XbaI消化，按商品使用說明用Qiaquick凝膠抽提試劑盒 (Qiagen)從瓊脂糖凝膠中分離含5kb載體的片段。雙鏈(ds)接頭從下列單鏈(ss)寡核苷酸制備(Sigma合成):Myc-oIigol 5' -CTA GCA AGA AAA CCG AGC AGA AGC TGA TCT CCG AGGAGG ACC TGT GAT AAT-3‘ (SEQ ID NO 1)和 Myc_oligo2 5' -CTAGAT TAT CAC AGG TCC TCC TCG GAG ATC AGC TTC TGC TCGGTT TTC TTG-3 ‘ (SEQ ID NO :2)。將兩個寡核苷酸用2 μ 1的0. 5 μ g/ μ 1的貯存液混合于總體積20 μ 1的退火緩沖液中(IOmM TriS-HCl ΡΗ7. 9，IOmM MgCl2, ImM 二硫蘇糖醇)，之后用 PCR 儀 98°C溫育 2min，接著以 0. 6°C /min 速率冷卻至4°C。接著，將所得ds接頭與上述制備的pAdApt35Bsu載體在3X、6X、9X摩爾過量于接頭下連接。用NheI或XbaI消化檢測菌落的接頭序列的插入是否是正確的方向，這些位點只有方向正確時才能恢復。測序證實接頭由期望的序列組成。所得連接物質(zhì)粒命
名為 pAdApt35Bsu. myc (圖 1)。以下，提供了克隆多組不同構(gòu)建體的方法。所有構(gòu)建體及其相應的插入片段綜述
于表I。表I.包括編碼TB抗原的核酸的構(gòu)建體名稱及其相應的插入片段。ALV =禽類白血病病毒蛋白酶；dig* =細胞蛋白酶識別的蛋白酶識別位點；dig =
ALV蛋白酶識別的蛋白酶識別位點；X =非蛋白酶識別位點的活動接頭；myc = myc-標記
權利要求
1.一種重組核酸分子，包含編碼結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的 Ag85A、Ag85B和TB10. 4抗原的融合蛋白的核酸序列，其中所述序列包含以5'至3'的順序并受啟動子控制的Ag85A、Ag85B和TB10. 4開放讀框。
2.權利要求1的重組核酸分子，其中所述抗原包含SEQID NO 7的1-676位氨基酸。
3.權利要求1或2的重組核酸分子，其中所述編碼抗原的核酸包含SEQID N0:14的 13-2043位核苷酸。
4.一種重組復制缺陷型腺病毒，其包含權利要求1-3任一項的重組核酸分子，其中所述腺病毒是牛、犬或猿猴腺病毒。
5.權利要求4的重組復制缺陷型腺病毒，其中所述腺病毒是分離自黑猩猩的猿猴腺病毒。
6.權利要求5的重組復制缺陷型腺病毒，其是C68(也稱為Pan9)、Pan5、Pan6或Pan7腺病毒。
7.一種結(jié)核疫苗，其包含權利要求4-6任一項的重組腺病毒和藥學上可接受的賦形齊U，以及任選存在的佐劑。
8.權利要求4-6任一項的重組腺病毒在制備用于誘導針對結(jié)核的免疫應答的藥物中的用途。
9.分枝桿菌抗原TB10.4用于刺激對感興趣的抗原的免疫應答的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含重組載體例如重組腺病毒的疫苗。本載體包括編碼來自一種或多種結(jié)核病致病菌的至少兩種抗原的異源核酸。本發(fā)明也涉及特異性蛋白酶識別位點連接抗原的應用，其中通過蛋白酶識別位點，所編碼的抗原可被切割分離。切割后，抗原以獨立方式引起免疫應答。重組載體可以包括編碼切割接頭和分離抗原的蛋白酶的核酸。本發(fā)明進一步涉及所述重組載體編碼的遺傳佐劑的應用，其中所述遺傳佐劑也可通過可切割的接頭及特異性蛋白酶的存在而切割。
文檔編號C12N15/861GK102220357SQ20111009278
公開日2011年10月19日 申請日期2005年11月15日 優(yōu)先權日2004年11月16日
發(fā)明者D·霍恩, J·薩多夫, K·拉多塞維奇, M·J·E·哈文加, R·福格爾斯, Y·A·W·斯凱基 申請人:Aeras全球肺結(jié)核疫苗基金會, 克魯塞爾荷蘭公司