背景技術(shù)：

1、編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glut1)的slc2a1基因中的突變與被稱為glut1缺乏綜合征(glut1?ds)的神經(jīng)發(fā)育失調(diào)有關(guān)。glut1ds是一種常染色體顯性失調(diào)，通常表現(xiàn)為散發(fā)病，具有新發(fā)突變，導(dǎo)致單倍性不足并引起癥狀性的雜合性。

2、glut1是不依賴胰島素的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白?；加械湫蚲lut1?ds的患者，也稱為devivo病，其腦內(nèi)葡萄糖水平低，并表現(xiàn)出具有以下特征的表型：早期發(fā)作的癲癇(中位數(shù)12個(gè)月)、發(fā)育遲緩、獲得性小頭畸形(頭部生長(zhǎng)減速)、復(fù)雜運(yùn)動(dòng)障礙(痙攣、共濟(jì)失調(diào)、肌張力障礙)；陣發(fā)性眼頭運(yùn)動(dòng)；以及腦脊液糖分過(guò)少，或腦脊液(csf)中葡萄糖濃度低。此疾病的臨床過(guò)程揭示了早期治療的重要性。alter等人，j.child?neurol.30(2):160-169(2015年)。已發(fā)現(xiàn)glut1參與內(nèi)皮細(xì)胞的功能，包括葡萄糖穿過(guò)血腦屏障(bbb)的轉(zhuǎn)運(yùn)、血管發(fā)生和bbb的維持。然而，關(guān)于glut1在維持bbb物理完整性方面的作用，在單倍性不足的小鼠模型中的研究提供了相互矛盾的證據(jù)。盡管glut1的內(nèi)皮細(xì)胞譜系特異性敲除減少了內(nèi)皮細(xì)胞的能量可用性，并且減少了增殖而不影響遷移，從而延遲了發(fā)育性血管發(fā)生(veys等人，circ.res.2020；127:466-482)，但尚未測(cè)試在內(nèi)皮細(xì)胞中特異性恢復(fù)glut1表達(dá)的效果。

3、tang等人，ann.clin.trans.neurol.2019；6(9):1923-1932中回顧了這種疾病的治療策略。目前的治療標(biāo)準(zhǔn)是生酮飲食，其提高血液中酮體的水平，這些酮體替代葡萄糖，使其可供腦使用。使用甘油三酯三庚酸甘油酯(triheptanoin)的治療已被推薦作為生酮飲食的替代方法。也嘗試了使用腺相關(guān)病毒(aav)載體的基因療法。針對(duì)神經(jīng)元中g(shù)lut1缺乏，已經(jīng)在新生小鼠模型中測(cè)試了在神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子(例如，突觸蛋白)控制下編碼glut1的aav9載體。其他研究使用了組成型啟動(dòng)子(例如，cmv啟動(dòng)子)或內(nèi)源性glut1基因的啟動(dòng)子。還測(cè)試了各種小分子，包括抗驚厥藥碳酸酐酶抑制劑乙酰唑胺等。

4、盡管glut1的單倍性不足會(huì)抑制腦血管發(fā)生，導(dǎo)致相對(duì)較小的腦微血管，這可能與內(nèi)皮頂端細(xì)胞的葡萄糖依賴性有關(guān)，但tang等人觀察到，內(nèi)皮細(xì)胞中的低glut1是否引發(fā)這種病理還有待研究。glut1蛋白在腦的其他細(xì)胞中也有表達(dá)，包括少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞。

5、對(duì)于glut1缺乏綜合征的治療的需求尚未得到滿足。本文提供的基因療法可解決這類需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、發(fā)明概述

1、本發(fā)明總體上涉及基于使用腺相關(guān)病毒(aav)遞送編碼glut1的多核苷酸或其功能變體的基因療法治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或失調(diào)。

2、盡管glut1缺乏綜合征(ds)是神經(jīng)發(fā)育失調(diào)，臨床表現(xiàn)源于缺乏適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)元功能，但目前的基因療法可能(不受理論限制)靶向于負(fù)責(zé)引導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)中血管系統(tǒng)發(fā)生和發(fā)育的內(nèi)皮細(xì)胞。通過(guò)靜脈內(nèi)、直接遞送到腦室內(nèi)系統(tǒng)或兩者結(jié)合的途徑向發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)cns血管系統(tǒng)遞送aav，隨后在內(nèi)皮頂端細(xì)胞中表達(dá)glut1蛋白，可能在血管發(fā)生和神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵窗口期間促進(jìn)整個(gè)cns的血管生長(zhǎng)和形成。此外，向cns血管系統(tǒng)遞送aav，隨后在成熟的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)glut1蛋白，可能通過(guò)增加葡萄糖穿過(guò)血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)神經(jīng)元的葡萄糖可用性增加。

3、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種重組腺相關(guān)病毒(raav)病毒顆粒，其包含載體基因組和衣殼，其中所述載體基因組包含表達(dá)盒，其兩側(cè)有5'和3'反向末端重復(fù)序列(itr)，其中所述表達(dá)盒包含編碼glut1或其功能變體的多核苷酸序列，與啟動(dòng)子操作性連接，并且其中所述衣殼是br1衣殼或其功能變體。

4、在一些實(shí)施方案中，所述衣殼是br1衣殼。

5、在一些實(shí)施方案中，所述衣殼包含多肽序列基序xdgxxwx，其中每個(gè)x是任何氨基酸(seq?id?no:107)。

6、在一些實(shí)施方案中，其中所述衣殼包含多肽序列adgvqwt(seq?id?no:108)、ddgvswk(seq?id?no:109)、sdgltws(seq?id?no:110)或sdglawv(seq?id?no:111)。

7、在一些實(shí)施方案中，所述衣殼包含多肽序列nrgtewd或其具有1、2、3個(gè)或更多個(gè)取代的功能變體。

8、在一些實(shí)施方案中，所述衣殼包含多肽序列nrgtewd(seq?id?no:112)。

9、在一些實(shí)施方案中，與seq?id?no:76中所述的aav2?vp1參考序列相比，所述衣殼在gh環(huán)中包含多肽序列nrgtewd的插入。

10、在一些實(shí)施方案中，所述衣殼包含與seq?id?no:106中所述的aav2?vp3多肽序列共享至少98％、至少99％或100％同一性的vp3多肽。

11、在一些實(shí)施方案中，所述衣殼包含與seq?id?no:105中所述的aav2?vp2多肽序列共享至少98％、至少99％或100％同一性的vp2多肽。

12、在一些實(shí)施方案中，所述衣殼包含與seq?id?no:104中所述的aav2?vp1多肽序列共享至少98％、至少99％或100％同一性的vp1多肽。

13、在一些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是flt-1啟動(dòng)子。

14、在一些實(shí)施方案中，所述flt-1啟動(dòng)子是人類flt-1(hflt-1)啟動(dòng)子。

15、在一些實(shí)施方案中，所述hflt-1啟動(dòng)子與seq?id?no:1共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。

16、在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含polya信號(hào)，任選地人生長(zhǎng)激素(hgh)polya。

17、在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(wpre)，任選地wpre(x)。

18、在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒包含3'非翻譯區(qū)(3'utr)，其包含與seq?id?no:4共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列。

19、在一些實(shí)施方案中，所述編碼glut1的多核苷酸序列是slc2a1多核苷酸。

20、在一些實(shí)施方案中，所述slc2a1多核苷酸是人類slc2a1多核苷酸。

21、在一些實(shí)施方案中，所述編碼glut1的多核苷酸序列與seq?id?no:5共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。

22、在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒的側(cè)翼有5'和3'反向末端重復(fù)序列(itr)，任選地aav2?itr，任選地與seq?id?no:6或seq?id?no:7共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的itr。

23、在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒與seq?id?nos:8-16、seq?id?no:97、seq?id?no:99和seq?id?no:101中的任一項(xiàng)共享至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

24、在一些實(shí)施方案中，所述raav病毒顆粒不是aav2病毒顆粒。

25、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于治療和/或預(yù)防有需要的受試者中的疾病或失調(diào)的方法，包括向所述受試者施用所述raav病毒顆粒。

26、在一些實(shí)施方案中，所述疾病或失調(diào)是神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)。

27、在一些實(shí)施方案中，所述疾病或失調(diào)是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1缺乏綜合征(glut1ds)或de?vivo疾病。

28、在一些實(shí)施方案中，所述raav病毒顆粒通過(guò)腦室內(nèi)(icv)注射施用。

29、在一些實(shí)施方案中，所述raav病毒顆粒通過(guò)靜脈內(nèi)(iv)注射施用。

30、在一些實(shí)施方案中，所述raav病毒顆粒通過(guò)icv注射結(jié)合iv注射施用。

31、在一些實(shí)施方案中，所述施用導(dǎo)致編碼glut1的多核苷酸序列在腦內(nèi)的表達(dá)，任選地，與參考raav病毒顆粒相比以增加的水平表達(dá)。

32、在一些實(shí)施方案中，所述施用導(dǎo)致腦內(nèi)glut1蛋白的表達(dá)增加和/或csf中葡萄糖水平和/或乳酸水平增加，任選地，與參考raav病毒顆粒相比水平增加，其中任選地所述增加是增加至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％或100％。

33、在一些實(shí)施方案中，所述參考raav病毒顆粒是aav2病毒顆粒的變體。

34、在一些實(shí)施方案中，所述參考raav病毒顆粒是aav-bv1病毒顆粒。

35、在一些實(shí)施方案中，所述raav病毒顆粒以1×1012個(gè)載體基因組(vg)、1×1013vg、1×1014vg或3×1014vg的劑量施用。

36、在一些實(shí)施方案中，所述方法導(dǎo)致與使用內(nèi)源glut1啟動(dòng)子或遍在啟動(dòng)子進(jìn)行的方法相比腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的葡萄糖攝取增加。

37、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種在細(xì)胞中表達(dá)glut1的方法，包括將所述細(xì)胞與所述的raav病毒顆粒接觸。

38、在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。

39、在一些實(shí)施方案中，所述內(nèi)皮細(xì)胞是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

40、在一些實(shí)施方案中，所述內(nèi)皮細(xì)胞是體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞。

41、在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是神經(jīng)元。

42、在一些實(shí)施方案中，所述神經(jīng)元是體內(nèi)神經(jīng)元。

43、在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將所述raav病毒顆粒體內(nèi)施用于受試者。

44、在一些實(shí)施方案中，所述raav病毒顆粒導(dǎo)致所述細(xì)胞與接觸含有內(nèi)源glut1啟動(dòng)子或遍在啟動(dòng)子的raav病毒顆粒的細(xì)胞相比其葡萄糖攝取增加。

45、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其中包含所述的raav病毒顆粒。

46、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其中包含所述的raav病毒顆?；蛘咚幬锝M合物，任選地包含使用說(shuō)明書。

47、在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了多核苷酸(例如，載體基因組)、藥物組合物、試劑盒以及其他組合物和方法。

48、下文的詳細(xì)描述中公開(kāi)了各種其他的方面和實(shí)施方案。本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求書的限制。