本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種獼猴桃果皮提取物及其制備方法與在抑制脂肪酸合酶活性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂肪酸合酶是生物細(xì)胞內(nèi)合成脂肪過程中最重要的酶。田維熙等對家禽脂肪酸合酶的研究發(fā)現(xiàn)，家禽腹腔的脂肪水平和脂肪酸合酶活性有很高的正相關(guān)，并提出控制脂肪酸合酶活性是控制動物體脂水平的有效方法的理論(田維熙,1994.動物的體脂水平和脂肪酸合酶活性的調(diào)控.生命的化學(xué),14,(1):184；田維熙等,1996.不同生長期蛋雞的體脂水平和肝臟脂肪酸合酶活性的關(guān)系.生物化學(xué)雜志，12(2):234-236；Mei Li et al.,1999.Factors influencing the levels of fatty acid synthase complex activity in fowl.Biochemistry and Molecular Biology International,47(1):63-69)。2000年，霍普金斯大學(xué)Loftus等對小鼠脂肪酸合酶的研究結(jié)果證明，抑制脂肪酸合酶可造成丙二酸單酰輔酶A的積累，而后者抑制與進(jìn)食相關(guān)的下丘腦神經(jīng)肽Y的表達(dá)，在不影響小鼠活動能力的情況下使食欲下降，體重降低。T.Loftus等指出，脂肪酸合酶可以作為控制體重潛在的治療靶位(Loftus.T.M.et al.,2000.Science,288(5475):2379-2381)。此外，許多研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成酶(FAS)的活性和表達(dá)在幾乎所有的非病態(tài)成人組織中表現(xiàn)出極低的水平，而在許多類型的癌組織如直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、肺癌、肝癌等中其活性顯著提高，表達(dá)顯著上調(diào)。同時，還有研究發(fā)現(xiàn)FAS的抑制劑cerulenin能夠殺死癌細(xì)胞和阻礙異種移植瘤的生長，其他FAS抑制劑如cerulenin的衍生物C75、β-內(nèi)酯orlistat、EGCG及其他天然來源的黃酮類化合物等和抗生素triclosan也已被確認(rèn)可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制腫瘤細(xì)胞的生長。以上結(jié)果表明，脂肪酸合酶可能是潛在的治療肥胖癥和腫瘤的雙重靶點(diǎn)。因此，研制和開發(fā)脂肪酸合酶的抑制劑將具有重大的現(xiàn)實(shí)意義及開發(fā)潛力。
獼猴桃(Actinidia chinensis Planch)為獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia Lindl)的一種落葉木質(zhì)藤本植物，果可食用，風(fēng)味獨(dú)特。獼猴桃除含有獼猴桃堿、蛋白水解酶、單寧果膠和糖類等有機(jī)物，以及鈣、鉀、硒、鋅、鍺等微量元素和人體所需17種氨基酸外，還含有豐富的維生素C、葡萄酸、果糖、檸檬酸、蘋果酸、脂肪，是新興的健康食品，具有很高的營養(yǎng)價值。中國專利公開號CN105230896A發(fā)明了一種以獼猴桃果汁為組分的水果減肥茶。公開號CN105520007A的中國專利發(fā)明了一種石斛獼猴桃復(fù)合飲料及其制備方法，該復(fù)合飲料可有效地補(bǔ)充人體必需的營養(yǎng)因子，維持膳食平衡。又如公開號CN105361036A的中國專利發(fā)明了一種有減肥效果的蛹蟲草獼猴桃酵素制作過程。以上專利中發(fā)明的含獼猴桃的保健食品，都是基于獼猴桃的傳統(tǒng)功效。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的是提供一種獼猴桃果皮提取物的制備方法。
本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：
1)將獼猴桃果皮進(jìn)行脫脂處理，得到脫脂后獼猴桃果皮；
2)將步驟1)得到的脫脂后獼猴桃果皮超聲提取，收集上清液，即得到獼猴桃果皮提取物。
上述方法步驟1)中，所述脫脂處理為用有機(jī)溶劑對所述獼猴桃果皮進(jìn)行回流提取，過濾去除所述有機(jī)溶劑，得到脫脂處理后獼猴桃果皮；
或所述獼猴桃果皮和所述有機(jī)溶劑的配比為1g：(6-20)ml或1g:(10-20)ml；
或所述回流提取的溫度為30-90℃，時間為1-12小時或1-7小時；
或步驟2)中，所述超聲提取采用的提取液為乙醇水溶液；
所述超聲提取為將所述脫脂處理后獼猴桃果皮用乙醇水溶液進(jìn)行超聲提取得到超聲產(chǎn)物；再過濾收集所述超聲產(chǎn)物的上清液；
所述超聲功率大于100W；所述超聲的方式為依次超聲3次，每次超聲的時間為10-30min。(超聲為分別依次超聲3次，每次超聲結(jié)束后將超聲提取液收集后，更換新溶液，再次超聲，一共進(jìn)行三次。)
上述方法中，步驟2)中，所述乙醇水溶液的體積百分含量為20-95％。
上述方法中，步驟2)中，在所述收集上清液的步驟后，還包括如下步驟：先去除所述上清液中的乙醇，再用乙酸乙酯萃取所述上清液，收集有機(jī)相，最后去除所述有機(jī)相中的乙酸乙酯，得到獼猴桃果皮提取物。
上述方法中，所述上清液和所述乙酸乙酯的體積比為1:(1-4)。
上述方法中，所述去除所述上清液中的乙醇或所述去除所述有機(jī)相中的乙酸乙酯均通過減壓濃縮去除；
所述減壓濃縮的溫度為35-55℃、壓力為0.01-0.08MPa。
上述方法中，步驟1)中，在所述脫脂處理前還包括如下步驟：將所述獼猴桃果皮粉碎過20目篩網(wǎng)后，收集過濾后產(chǎn)物。
上述方法中，所述有機(jī)溶劑為石油醚。
由上述的方法制備的獼猴桃果皮提取物也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
上述的獼猴桃果皮提取物在抑制脂肪酸合酶或制備抑制脂肪酸合酶產(chǎn)品或制備用于減肥產(chǎn)物或制備用于抗癌產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制脂肪酸合酶的產(chǎn)品。
本發(fā)明提供的抑制脂肪酸合酶的產(chǎn)品，其活性成分為上述的獼猴桃果皮提取物。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、本發(fā)明從獼猴桃果皮中可制取得到一種可以抑制脂肪酸合酶活性的提取物，是一種天然的、植物源的、無毒的脂肪酸合酶抑制劑；
2、本發(fā)明得到的獼猴桃果皮提取物可以顯著地抑制脂肪酸合酶的活性，其活性大小與目前已知的天然來源的脂肪酸合酶抑制劑，如EGCG等相當(dāng)；
3、由于脂肪酸合酶活性的強(qiáng)弱直接影響到生物細(xì)胞內(nèi)合成脂肪的多少和腫瘤細(xì)胞合成脂肪酸的能力，因此，抑制脂肪酸合酶的活性，一方面可以使生物細(xì)胞內(nèi)合成脂肪的過程弱化，脂肪含量即會得到控制甚至減少；另一方面可以使腫瘤細(xì)胞合成脂肪酸的能力下降，從而可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長；因此，以本發(fā)明的提取物作為活性成分制成各種劑型的減肥藥物或抗癌藥物具有功效活性顯著、作用機(jī)理清楚、靶點(diǎn)明確等特點(diǎn)，符合藥物制劑開發(fā)的要求；
4、由于獼猴桃是一種傳統(tǒng)的食用植物資源，用本發(fā)明從獼猴桃中制取的提取物作為原料制成減肥或抗腫瘤的保健食品、功能化妝品、普通食品等，符合國家對于保健食品及普通食品的原料的限定和法規(guī)要求，因此，本發(fā)明的具有抑制脂肪酸合酶活性的提取物具有更為廣闊的應(yīng)用開發(fā)前景。
總之，本發(fā)明不僅豐富了純天然脂肪酸合酶抑制劑的來源，也開拓了具有地域特色和資源優(yōu)勢的獼猴桃植物新的功效及應(yīng)用價值。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不意味著對本發(fā)明的任何限制。在不脫離本發(fā)明上述思想的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和常規(guī)手段做出的各種替換方式或變更，均包含在本發(fā)明之內(nèi)。
實(shí)施例1、獼猴桃果皮提取物的獲得及檢測
1、獼猴桃果皮提取物的獲得及檢測
1)將除去果肉的獼猴桃果皮粉碎過20目篩網(wǎng)后，收集過濾后細(xì)粉，再用石油醚在溫度30℃下回流提取(細(xì)粉和石油醚的配比為1g：10ml)7個小時進(jìn)行脫脂，過濾除去石油醚，得到經(jīng)過脫脂的獼猴桃果皮；
2)將步驟1)得到的脫脂后的獼猴桃果皮用體積百分含量為20％的乙醇水溶液浸泡，于常溫下(25℃)超聲提取(XH-2008DE超聲波萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)，超聲功率200W，依次超聲3次，每次超聲30min，超聲后的液體經(jīng)過濾紙過濾，收集并合并3次超聲的液體部分，作為提取物。(先后進(jìn)行3次超聲，每次超聲即是一次提取過程，共3次是為了讓提取更充分)，用濾紙過濾收集超聲產(chǎn)物的上清液(即超聲提取物，經(jīng)過過濾后的液體)，并于溫度為35℃、壓力為0.08MPa的條件下減壓濃縮至無醇味，得到粗提液；
3)向步驟2)得到的粗提液中加入4倍體積的乙酸乙酯，在室溫(25℃)下進(jìn)行萃取并靜止待自然分層，收集有機(jī)相，于溫度為35℃、壓力為0.08MPa的條件下減壓濃縮至揮盡溶劑，干燥至恒重，即得到獼猴桃果皮提取物A。
2、獼猴桃果皮提取物的檢測
1)、脂肪酸合酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)AS)的制備
脂肪酸合酶FAS的粗提：新鮮雞肝臟稱重后按1:1.8(g/mL)加入4℃的抽提緩沖液(0.1mol/L KH2PO4-K2HPO4，1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，0.07mol/L KHCO3，pH 8.0)，勻漿50秒。測量勻漿液體積后以8000r/min速度4℃下離心15min。上清液經(jīng)紗布過濾，測量體積后，再以35000r/min速度4℃下離心30min。上清液經(jīng)紗布過濾后分裝于耐低溫塑料瓶-20℃過夜，剩余置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
硫酸銨分步沉淀：將冷凍的高速離心上清液置水浴化凍，化凍后置于冰盒中，磁力攪拌狀態(tài)下按三分之一體積量滴加4℃的pH 7.0的飽和硫酸銨(含1mmol/L DTT)至25％飽和度。攪拌10min后用10000r/min速度4℃下離心15min，棄去沉淀。取樣測定上清液的FAS活性。
再于攪拌狀態(tài)下滴加上清液四分之一體積的4℃pH 7.0的飽和硫酸銨(含1mmol/L DTT)至40％飽和度，攪拌10min后用10000r/min離心15min。若測定上清中不含或只含很少FAS活性，棄去上清，保留沉淀。
離子交換層析：DEAE纖維素DE52經(jīng)處理后用4℃緩沖液A(5mmol/L KH2PO4-K2HPO4含1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，pH 7.0)平衡。上述沉淀控干后溶于適量4℃緩沖液A，測定電導(dǎo)值不大于5.5ms/cm即可上樣。上樣后用4℃緩沖液A洗滌至雜蛋白的吸收為0，再依次用4℃50mmol/L、160mmol/L、250mmol/L、1mol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液(皆含1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，pH 7.0)洗脫。分別收集洗脫峰，測量體積、蛋白含量及FAS活性。層析過程使用LKB蛋白監(jiān)測儀和記錄儀監(jiān)測。
親和層析：Blue Sepharose 6B樹脂用4℃緩沖液B(50mmol/L KH2PO4-K2HPO4含1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，pH 7.0)平衡。將DEAE層析的250mmol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液洗脫收集液上樣。上樣后用4℃緩沖液B洗滌，再依次用4℃含0.35mol/L、2mol/L NaCl緩沖液B洗脫。分別收集洗脫峰，測量體積、蛋白含量及FAS活性。
濃縮保存：攪拌狀態(tài)下按含有0.35mol/LNaCl緩沖液B洗脫收集液三分之二體積緩慢加入4℃飽和硫酸銨溶液至40％飽和度以沉淀FAS。攪拌10min后以10000r/min速度4℃下離心15min。棄去上清液，控干沉淀后溶于少量儲存緩沖液(0.1mol/L KH2PO4-K2HPO4，1mmol/L EDTA，10mmol/L DTT，20％甘油，pH 7.0)中，使FAS濃度在10mg/mL左右，取少量樣品測定蛋白濃度和FAS活性，其余分裝完畢后經(jīng)-20℃過夜后轉(zhuǎn)置-80℃冷凍保存?zhèn)溆?，得到脂肪酸合?FAS)。
以上分離提純過程的所有步驟均在4-8℃低溫下進(jìn)行。終樣品脂肪酸合酶經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測為單一條帶，分子量為270kD。
2)獼猴桃果皮提取物對脂肪酸合酶的抑制作用
取10mg由1得到的獼猴桃果皮提取物A溶于200mL DMSO中作為受試樣品溶液；然后稀釋為不同濃度的待測樣品溶液。
脂肪酸合酶活性采用乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A、NADPH為底物的標(biāo)準(zhǔn)測活方法進(jìn)行測定(W.X.Tian et al.,1985.J.Biol.Chem.,260(20):11375-11387；田維熙等,1996.不同生長期蛋雞的體脂水平和肝臟脂肪酸合酶活性的關(guān)系.生物化學(xué)雜志，12(2):234-236)。
將一定濃度的待測樣品溶液(濃度為1、2、5、10、20、50、100、200μg/mL)加入測活體系(配方為含有3mM乙酰輔酶A、10mM丙二酸單酰輔酶A、35mM NADPH，濃度為100mM pH為7.0的磷酸鹽緩沖液，總體積為2mL)中，37℃恒溫，然后加入一定量(單位酶活性為15U/mg)的由1)得到的脂肪酸合酶FAS啟動反應(yīng)，測得酶活性為Ai。加樣品溶劑對照測得的酶活性是A0，Ai/A0即為FAS的剩余活性(Remaining Activity，R.A.)。該值越小，則表明樣品對FAS的抑制能力越強(qiáng)。這種方法測定的抑制作用通常情況下是可逆的，即表示抑制劑與酶的結(jié)合是非共價結(jié)合。
脂肪酸合酶(FAS)活性被抑制的程度用IC50(半抑制濃度)來表示，其計算方法為：以底物中只加入相應(yīng)提取溶劑的為對照，測定其脂肪酸合酶活性值，該值用A0表示，并設(shè)定其為100％。底物中加入脂肪酸合酶抑制劑提取液的為實(shí)驗(yàn)組，測得其脂肪酸合酶活性的數(shù)值為A0的50％時，抑制劑的濃度為IC50值。該值越小，表明樣品對FAS的抑制能力越強(qiáng)。
在測活體系中分別加入濃度為1、2、5、10、20、50、100、200μg/mL獼猴桃果皮提取物后，所測定的脂肪酸合酶相對活性的數(shù)值分別為：99％、97％、87％、75％、66％、38％、21％、13％。
結(jié)果表明獼猴桃果皮提取物A對于脂肪酸合酶的半抑制濃度(IC50)為33.8μg/mL。
從上述結(jié)果可以表明，獼猴桃果皮提取物A對脂肪酸合酶的活性有較強(qiáng)的抑制作用，并且所需的有效劑量很低(小于50μg/mL)。
實(shí)施例2、獼猴桃果皮提取物的獲得及檢測
1、獼猴桃果皮提取物的獲得及檢測
1)將除去果肉的獼猴桃果皮粉碎過20目篩網(wǎng)后，收集過濾后細(xì)粉，再用石油醚在溫度90℃下回流提取(細(xì)粉和石油醚的配比為1g：15ml)3個小時脫脂，過濾除去石油醚，得到經(jīng)過脫脂的獼猴桃果皮；
2)將步驟1)得到的脫脂后的獼猴桃果皮用體積百分含量為95％的乙醇水溶液浸泡，于常溫下(25℃)超聲提取(XH-2008DE超聲波萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)，超聲功率200W，超聲功率200W，依次超聲3次，每次超聲30min，超聲后的液體經(jīng)過濾紙過濾，收集并合并3次超聲的液體部分，作為提取物。并于溫度為55℃、壓力為0.01MPa的條件下減壓濃縮至無醇味(除去乙醇)，得到粗提液；
3)向步驟2)得到的粗提液中加入1倍體積的乙酸乙酯，在室溫(25℃)下進(jìn)行萃取并靜止待自然分層，收集有機(jī)相，于溫度為55℃、壓力為0.01MPa的條件下減壓濃縮至揮盡溶劑，干燥至恒重，即得到獼猴桃果皮提取物B。
2、獼猴桃果皮提取物的檢測
1)、脂肪酸合酶(Fatty acid synthase)的制備
與實(shí)施例1的2的1)相同。
2)獼猴桃果皮提取物對脂肪酸合酶的抑制作用
方法與實(shí)施例1的2的2)相同，
結(jié)果表明獼猴桃果皮提取物B對于脂肪酸合酶的半抑制濃度(IC50)為34.0μg/mL。
在測活體系中分別加入濃度為1、2、5、10、20、50、100、200μg/mL獼猴桃果皮提取物后，所測定的脂肪酸合酶相對活性的數(shù)值分別為：98％、95％、90％、77％、62％、35％、17％、11％。
說明獼猴桃果皮提取物B對脂肪酸合酶的活性有強(qiáng)烈的抑制作用，并且所需的有效劑量很低(小于50μg/mL)。
實(shí)施例3、獼猴桃果皮提取物的獲得及檢測
1、獼猴桃果皮提取物的獲得及檢測
1)將除去果肉的獼猴桃果皮粉碎過20目篩網(wǎng)后，收集過濾后細(xì)粉，再用石油醚在溫度60℃下回流提取(細(xì)粉和石油醚的配比為1g：20ml)1個小時進(jìn)行脫脂，過濾除去石油醚，得到經(jīng)過脫脂的獼猴桃果皮；
2)將步驟1)得到的脫脂后的獼猴桃果皮用體積百分含量為50％的乙醇水溶液浸泡，于常溫(25℃)下超聲提取，超聲功率200W，依次超聲3次，每次超聲30min，超聲后的液體經(jīng)過濾紙過濾，收集并合并3次超聲的液體部分，作為提取物。并于溫度為55℃、壓力為0.1MPa的條件下減壓濃縮至無醇味，得到粗提液；
3)向步驟2)得到的粗提液中加入2倍體積的乙酸乙酯在室溫(25℃)下進(jìn)行萃取并靜止待自然分層，收集有機(jī)相，溫度為55℃、壓力為0.1MPa的條件下減壓濃縮至揮盡溶劑，干燥至恒重，經(jīng)干燥得到獼猴桃果皮提取物C。
2、獼猴桃果皮提取物的檢測
1)、脂肪酸合酶(Fatty acid synthase)的制備
與實(shí)施例1的2的1)相同。
2)獼猴桃果皮提取物對脂肪酸合酶的抑制作用
方法與實(shí)施例1的2的2)相同，
在測活體系中分別加入濃度為1、2、5、10、20、50、100、200μg/mL獼猴桃果皮提取物后，所測定的脂肪酸合酶相對活性的數(shù)值分別為：95％、94％、88％、73％、65％、33％、15％、12％。
結(jié)果表明獼猴桃果皮提取物C對于脂肪酸合酶的半抑制濃度(IC50)為35.7μg/mL。
說明獼猴桃果皮提取物C對脂肪酸合酶的活性有強(qiáng)烈的抑制作用，并且所需的有效劑量很低(小于50μg/mL)。
對照組：
將濃度分別為5、10、20、40、80、160μg/mL的EGCG加入含有乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A、NADPH的磷酸鹽緩沖液中，37℃恒溫，然后加入單位酶活性為10-15U/mg的FAS啟動反應(yīng)，測得酶活性為Ai。脂肪酸合酶(FAS)活性被抑制的程度用IC50(半抑制濃度)來表示，其計算方法為：以底物中只加入相應(yīng)提取溶劑的為對照，測定其脂肪酸合酶活性值，該值用A0表示，并設(shè)定其為100％。底物中加入脂肪酸合酶抑制劑提取液的為實(shí)驗(yàn)組，測得其脂肪酸合酶活性的數(shù)值為A0的50％時，抑制劑的濃度為IC50值。該值越小，表明樣品對FAS的抑制能力越強(qiáng)。
采用上述方法用脂肪酸合酶抑制劑EGCG(表沒食子兒茶素沒食子酸酯，購自Sigma公司)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，EGCG對于脂肪酸合酶的半抑制濃度(IC50)為25μg/mL。