本發(fā)明涉及藥物，具體涉及制備新適應(yīng)證的藥物，尤其涉及氯化兩面針堿（Nitidine Chloride）在制備抗骨質(zhì)疏松癥和骨丟失藥物中的應(yīng)用。。

背景技術(shù)：

骨質(zhì)疏松癥是多種原因引起的一組骨病，骨組織有正常的鈣化，鈣鹽與基質(zhì)呈正常比例，以單位體積內(nèi)骨組織量減少為特點的代謝性骨病變。在多數(shù)骨質(zhì)疏松中，骨組織的減少主要由于骨質(zhì)吸收增多所致。以骨骼疼痛、易于骨折為特征。

破骨細(xì)胞(osteoclast)是骨組織成分的一種，行使骨吸收的功能。破骨細(xì)胞起源于骨髓造血干細(xì)胞/單核細(xì)胞系統(tǒng)，是一種高度分化的多核細(xì)胞，其分化主要依賴于 RANKL 的刺激。 RANKL 屬于腫瘤壞死因子超家族成員，由成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞與骨細(xì)胞分泌而來。在骨微環(huán)境中，RANKL 與前破骨細(xì)胞表面受體 RANK 結(jié)合，募集 RANK 信號傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)接蛋白 TRAF6，啟動下游信號通路包括 NF-κB，MAPK，NFAT，AKT 以及鈣離子通道，促進破骨細(xì)胞分化成熟。其中 NF-κB 是破骨細(xì)胞分化成熟的關(guān)鍵信號，而 NFAT 介導(dǎo)細(xì)胞融合和破骨細(xì)胞分化，是破骨細(xì)胞終端分化的轉(zhuǎn)錄因子。同時，RANKL 還需要免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM）介導(dǎo)的信號通路（其中包括破骨細(xì)胞相關(guān)受體（OSCAR），髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-2（TREM2），F(xiàn)c受體共同γ鏈（FcRγ），以及DNAX活化蛋白12（DAP12）），來共同激活 NFAT，致使破骨細(xì)胞分化，發(fā)揮細(xì)胞功能。

當(dāng)前，治療骨丟失疾病的方法多采用以下幾種：一、骨吸收抑制劑治療，例如雙磷酸鹽；二、激素替代療法。但是，研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用激素替代療法，女性患乳腺癌的風(fēng)險增大，并且抑制骨吸收的磷酸鹽制劑也在臨床應(yīng)用中出現(xiàn)了較大的不良反應(yīng)，這極大限制了臨床推廣。因此，尋找可以防治骨丟失疾病的藥物一直是人們夢寐以求的愿望。近幾年，中草藥的治療骨丟失疾病的研究逐漸開展起來。由于中草藥治療效果明顯且安全性較好，目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)部分中草藥單體具有抑制破骨細(xì)胞的作用，例如芒果苷，柚皮苷等。兩面針為蕓香科植物兩面針 Zanthorμlum nitidum(Roxb.)DC. 的干燥根，性味苦、辛，具有跌打損傷、活血化瘀等功效，是廣西特有中草藥。氯化兩面針堿是兩面針主要活性成分之一。既往的研究主要集中在抗腫瘤以及抗炎的治療。目前對破骨細(xì)胞形成的作用尚未有報道。

申請人研究氯化兩面針堿對骨質(zhì)疏松癥的調(diào)控作用，通過TARcP 染色發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿呈劑量依賴性抑制 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成與骨吸收作用； 同時還發(fā)現(xiàn) 1 μM 氯化兩面針堿也能夠干預(yù)人外周血單個核細(xì)胞體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞成熟分化。從作用機制上顯示，氯化兩面針堿是通過抑制 RANKL 激活的 NF-κB 與 NFATc1 信號通路來發(fā)揮作用，并下調(diào)了破骨細(xì)胞成熟分化標(biāo)志基因（cathepsin K， D2， calcitonin receptor， NFATc1， TRAcP， OSCAR， FcRγ， TREM2， DAP12）的表達(dá)。再通過建立去卵巢小鼠的骨質(zhì)疏松癥模型表明氯化兩面針堿可以保護卵巢切除導(dǎo)致的骨丟失。從 HE 染色及組織病理學(xué)結(jié)果分析，與去卵巢小鼠組相比，氯化兩面針堿治療組明顯降低了骨組織中破骨細(xì)胞的數(shù)量。

基于上述藥理作用，可擬開發(fā)氯化兩面針堿為制備治療骨質(zhì)疏松癥和骨丟失的藥物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于研究氯化兩面針堿對破骨細(xì)胞的調(diào)控作用，設(shè)計在抗骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了氯化兩面針堿在制備康骨質(zhì)疏松癥藥物中的應(yīng)用。

申請人首次研究發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿劑量依賴性抑制破骨細(xì)胞形成和骨吸收功能；發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿通過干預(yù) RANKL 激活的 NF-κB 和 NFAT 信號通路發(fā)揮其抑制破骨細(xì)胞的作用。為了進一步證明氯化兩面針堿對破骨細(xì)胞的作用，建立了小鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型。結(jié)果表明，氯化兩面針堿給藥組能夠防治去卵巢誘發(fā)的骨丟失。綜上所述，氯化兩面針堿通過下調(diào) RANKL 激活的 NF-κB 和 NFAT 來干預(yù)破骨細(xì)胞分化功能。

附圖說明

圖1兩面針堿對 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成以及破骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響

（A：兩面針堿化學(xué)結(jié)構(gòu)。B： BMMs 在含有 100 ng/mL 的 M-CSF，100 ng/mL 的RANKL 以及不同濃度的兩面針堿的細(xì)胞分化液中培養(yǎng) 5 天，然后進行 TRAcP 染色。光學(xué)顯微鏡下觀察兩面針堿呈劑量依賴性的抑制 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。 C： 對 TRAcP 染色陽性多核細(xì)胞進行計數(shù)，對于細(xì)胞核 ≥3 歸為破骨細(xì)胞；

D：利用 Annexin V 凋亡試劑盒檢測不同濃度兩面針堿對破骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的影響；E：利用 MTS 考察兩面針堿對 BMMs 孵育 48 小時后，藥物對細(xì)胞增殖的影響。*p＜0.05， **p＜0.005 ， ***p＜0.001）

圖2兩面針堿對 RANKL 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分泌的特異性基因的影響

（BMMs 在含有 100 ng/mL 的 M-CSF，100 ng/mL 的RANKL 以及不同濃度的兩面針堿（0，0.125，0.25，0.5 以及 1 μM）的細(xì)胞分化液中培養(yǎng) 7 天。利用 RT-PCR 檢測相關(guān)基因的 mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果用 Image J 分析各條帶的灰度值，計算目的基因灰度值與 GAPDH 灰度值的比值，即為各自 mRNA 的相對表達(dá)水平，分析各組之間的差異）

圖3兩面針堿對骨吸收功能的影響

（經(jīng) RANKL 誘導(dǎo) BMMs 分化后的破骨樣細(xì)胞，按照相同的數(shù)目接種于骨板上，并加入含有 RANKL 以及不同濃度的兩面針堿的完全培養(yǎng)基進行孵育 48 h； 對照組只含有 RANKL 的完全培養(yǎng)基。A： 通過 SEM 觀察各組的骨吸收面積（黑色箭頭標(biāo)示）B：對骨吸收面積進行定量分析。*p＜0.05， **p＜0.005 ， ***p＜0.001)

圖4兩面針堿對 RANKL 誘導(dǎo)的人外周血提取單核細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)以及骨吸收功能作用

（A： 通過定量 PCR 比較，與只含有 RANKL 的完全培養(yǎng)基處理的陽性對照組比較， 1 μM 兩面針堿藥物處理組對 RANKL 誘導(dǎo)的人外周血提取單核細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)情況的影響 ；每個目的基因與相應(yīng)的 GAPDH，進行比較循環(huán)閾值對目的基因進行計算；B：RANKL 誘導(dǎo)的人外周血提取單核細(xì)胞分化后的破骨樣細(xì)胞，按照相同的數(shù)目種于骨板上，并加入含有 RANKL 以及不同濃度的兩面針堿進行孵育 48 h；對照組只含有 RANKL 的完全培養(yǎng)基。通過 SEM 觀察各組的骨吸收面積；C：對骨吸收面積進行定量分析。*p＜0.05， **p＜0.005 ， ***p＜0.001）

圖5兩面針對 RANKL 引起的 IκBα 降解的影響

（采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 3κB-Luc-SV40 熒光素酶報告基因的 Raw 264.7，檢測硫酸小檗堿對 RANKL 活化 NF-κB 的影響。A： RAW 264.7 細(xì)胞分為3組， 陰性對照組含有完全培養(yǎng)基； 陽性對照組含有 100 ng/mL RANKL 完全培養(yǎng)基； 給藥組含有 100 ng/mL RANKL 與不同濃度的兩面針堿（0.5uM 和 1uM）的完全培養(yǎng)基。將各組數(shù)據(jù)進行比較，分析各組中各組中NF-κB 蛋白的表達(dá)情況。B：兩面針堿對BMMs進行預(yù)孵育 1h，然后按照時間點加入100ng/ml的RANKL 進行刺激。將 β-actin 最為內(nèi)參，Western-blot 定量分析 IκBα 的表達(dá)。*p＜0.05， **p＜0.005 ， ***p＜0.001）

圖6兩面針堿對 RANKL 活化的 NFATc1 的作用

（采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pNFATc1-TA-Luc 熒光素酶報告基因的 Raw 264.7，檢測硫酸小檗堿對 RANKL 活化 NFATc 的影響。A：RAW 264.7 細(xì)胞分為3組，陰性對照組-含有完全培養(yǎng)基；陽性對照組-含有 100 ng/ml 的RANKL的完全培養(yǎng)基； 給藥組-含有 100ng/ml 的RANKL和不同濃度的兩面針堿（0.5uM 和 1uM）的完全培養(yǎng)基。將各組數(shù)據(jù)進行比較，分析各組中 NFATc 蛋白的表達(dá)情況。 B：BMMs 在含有 100 ng/mL RANKL 與不同濃度的兩面針堿的完全培養(yǎng)基孵育 7 天；將 β-actin 最為內(nèi)參，Western-blot 定量分析 NFATc1 與 d2 的表達(dá)。C：BMMs 預(yù)孵育兩面針堿（1uM） 1 h 后，按照時間點加入 100 ng/mL RANKL 與兩面針堿共孵育。將 β-actin 最為內(nèi)參，Western-blot 定量分析 NFATc1 與 d2 的表達(dá)。*p＜0.05， **p＜0.005 ， ***p＜0.001）

圖7兩面針堿對去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松（OVX）引起的骨丟失的影響

（A：通過 Micro-CT 掃描形態(tài)測定分析小鼠脛骨近端干骺端骨小梁微結(jié)構(gòu)的分析。 B： 脛骨標(biāo)本分為 sham 組-假手術(shù)組，給藥組（兩面針堿 3 mg/kg 以及 6 mg/kg 腹腔注射 OVX 模型小鼠）以及雌激素組（50 ng/kg 腹腔注射 OVX 模型小鼠）。通過各組數(shù)據(jù)進行比較，分析各組小鼠骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁間距（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb/Th）；實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；C：利用 HE 和 TRAcP 染色對骨小梁進行骨組織病理學(xué)檢測，分析各組骨小梁中骨吸收參數(shù)，例如破骨細(xì)胞表面積（OcS/BS）， 破骨細(xì)胞數(shù)量 N.Oc/BS（n=3）。*p＜0.05， **p＜0.005 ， ***p＜0.001）。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍，若未特別說明，所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)手段。

實施例1

一、材料與方法

試劑

氯化兩面針堿購自中國藥品生物制品檢定所（北京，中國）。RAW 264.7購自American Type Culture Collection（馬里蘭州，美國）。鼠源 MCSF 購自 R&D Systems （明尼阿波利斯，美國）。ɑ-MEM 購自 Thermo Fisher，胎牛血清（FBS）購自 TRACE （悉尼，澳大利亞）。重組 GST-rRANKL為本實驗室純化。人外周血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)所需重組人源 M-CSF 購自 Chemicon （加尼福利亞洲，美國），胎牛血清，青鏈霉素和 L-谷氨酰胺購自 Invitrogen （加尼福利亞洲，美國）。 IκBα 和 NFATc1 抗體購自 Santa Cruz Biotechnology Com. （加尼福利亞洲，美國）。 V-ATPase d2 抗體來自本實驗室合成純化。

體外骨髓巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化

骨髓巨噬細(xì)胞由C57BL/6J小鼠的骨髓中分離獲取。實驗方法已經(jīng)獲得西澳大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn) （approval RA/3/100/1244）。骨髓巨噬細(xì)胞用含10% 胎牛血清，5 μg/mL青霉素，50 U/mL鏈霉素，2 mM L-谷氨酰胺以及10 ng/mL MCSF 的 ɑ-MEM 完全培養(yǎng)基，于 37℃ 含 5% CO₂ 培養(yǎng)箱孵育。

細(xì)胞長滿后，將BMMs（8×10³）接種于96孔板，分為陰性對照組，陽性對照組，給藥組。其中陰性對照組不加 RANKL， 陽性對照組只加RANKL，給藥組加 RANKL 以及含不同濃度的氯化兩面針堿。每 2 天換液 1 次。7 天后，4% 的多聚甲醛固定細(xì)胞 20 分鐘，加入 TRAcP 染色液進行染色 1小時。光學(xué)顯微鏡下觀察 TRAcP 染色陽性多核細(xì)胞中細(xì)胞核 ≥3 個的細(xì)胞定義為破骨細(xì)胞，并進行計數(shù)。

）體外人外周血單個核細(xì)胞分離、培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化

從澳大利亞紅十字會（阿德萊德，南澳大利亞）健康志愿者中采血。用預(yù)熱的HANK平衡液沖洗全血中的白膜層，并從聚蔗糖柱分理出人外周血單核細(xì)胞。實驗方法已經(jīng)獲得西澳大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。用含有10% 胎牛血清，5 μg/mL青霉素，50 U/mL鏈霉素，2mM L-谷氨酰胺以及25 ng/mL MCSF 的 ɑ-MEM 完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。并將細(xì)胞接種于12孔板用于mRNA檢測，以及含有骨板的 96 孔板用于骨吸收功能的檢測。次日，加入RANKL刺激分化并加入不同濃度的氯化兩面針堿。對照組加入 0.01% DMSO 進行培養(yǎng)。細(xì)胞孵育 7 天，每隔 2 天換 1 次液。

法測定氯化兩面針堿對破骨細(xì)胞前體增殖的影響

BMMs（6×10³）接種于96孔板中培養(yǎng)過夜。更換培養(yǎng)基（含有不同濃度的氯化兩面針堿0.1，0.5，1， 5， 10 μM）孵育48小時。然后每孔加入 MTS 孵育2小時，最后進行酶標(biāo)儀檢測。

雙染檢測凋亡

選用生長狀態(tài)良好的RAW 264.7細(xì)胞（1×10⁶）接種于6孔板中培養(yǎng)過夜。更換培養(yǎng)基（含有不同濃度的氯化兩面針堿）進行孵育24小時后，用胰酶消化，收集細(xì)胞，用 PBS 沖洗1次，將細(xì)胞用 1× Binding緩沖液重懸（1×10⁷ /mL），加入Ａnnexin V-PI液染色。流式細(xì)胞儀進行分析，計算凋亡細(xì)胞的百分率。

反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

BMMs（1×10⁵）接種于 6 孔板中培養(yǎng)過夜。更換培養(yǎng)基（含有不同濃度的氯化兩面針堿 0.5 和 1 μM）孵育 7 天。用 Trizol 裂解細(xì)胞并提取總 RNA。用含有oligo-dT 引物的反轉(zhuǎn)錄酶對 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。然后加入不同基因的引物對 cDNA 進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增。18sRNA 作為內(nèi)參。以下是不同基因引物序列：

18sRNA(Forward：ACCATAAACGATGCCGACT；Reverse：TGTCAATCCTGTCCGTGTC)，

Calcitonin Receptor(Forward：TGGTTGAGGTTGTGCCCA；Reverse：CTCGTGGGTTTGCCTCATC)，

cathepsin K (Forward：GGGAGAAAAACCTGAAGC；Reverse：ATTCTGGGGACTCAGAGC)，

V-ATPase d2 (D2) (Forward：GGATCCGAATTCATGCTTGAGACTGCAGAG；Reverse：GGTCTAGATTATAAAATTGGAATGTAGCTC)，

NFATc1 (mouse NFATc1) (Forward：CAACGCCCTGACCACCGATAG； Reverse：GGCTGCCTTCCGTCTCATAGT)，

TRAcP (Forward：TGTGGCCATCTTTATGCT；Reverse：GTCATTTCTTTGGGGCTT)。

熒光定量PCR

將人外周血單個核細(xì)胞種于 12 孔板中并誘導(dǎo)分化 7 天后，Trizol 裂解細(xì)胞提取總 RNA。含有 oligo-dT 引物的反轉(zhuǎn)錄酶對 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。將 cDNA 用 SYBR GREEN qPCR SuperMix-UDG 試劑在 Rotor-Gene 3000 擴增出目的基因 hARP，cathepsin K，NFATc1，OSCAR，F(xiàn)cRγ，TREM2，DAP12。所有樣本設(shè)三個副孔。擴增完成后，通過 Rotor-Gene Series 1.7 軟件按照 ddCT 法對目的基因變化進行相對變量。

熒光素酶報告基因

通過 2-二乙氨乙基葡聚糖將 pNFATc1-TA-Luc 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 RAW 264.7。轉(zhuǎn)染的 RAW 264.7 細(xì)胞接種于 24 孔板過夜后，預(yù)孵育氯化兩面針堿 1 小時，加入100ng/mL RANKL刺激24小時。加入熒光素酶裂解緩沖液，移至白板，加入熒光素酶報告基因底物，熒光酶標(biāo)儀檢測。

κB熒光素酶報告基因

通過 2-二乙氨乙基葡聚糖將 3κB-Luc-SV40 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 RAW264.7。轉(zhuǎn)染的RAW 264.7 細(xì)胞接種于 24 孔板過夜后，預(yù)孵育氯化兩面針堿 1 小時，加入100ng/mL RANKL刺激8小時。加入熒光素酶裂解緩沖液，移至白板，加入熒光素酶報告基因底物，熒光酶標(biāo)儀檢測。

骨吸收檢測

將 BMMs 接種于 6 孔板內(nèi)，每孔加入含有 100ng/mL RANKL 和 10ng/mL mMCSF的完全培養(yǎng)基孵育3天。當(dāng)破骨細(xì)胞形成，加入胰酶將細(xì)胞分離出來，并按照 1×10³/well濃度種有 0.75mm 厚度骨板的96孔板內(nèi)孵育過夜。加入氯化兩面針堿孵育48小時。其中一部分骨片用 4% 多聚甲醛固定，加入 TRAcP 染色液進行染色 1小時。光學(xué)顯微鏡下觀察 TRAcP 染色陽性多核細(xì)胞中細(xì)胞核 ≥3 個的細(xì)胞定義為破骨細(xì)胞，并進行計數(shù)。同時清洗另一部分骨片，晾干后，用 Philips XL30 掃描電鏡檢測骨吸收陷窩，并用Scion Image software計算骨吸收面積百分比。

牙本質(zhì)片吸收陷窩形成的檢測

人外周血單個核細(xì)胞接種在置有牙本質(zhì)片的96孔板內(nèi)，加入 RANKL 刺激10天。加入胰酶消化細(xì)胞，并清洗牙本質(zhì)片。晾干后，用掃描電鏡在150倍下檢測牙本質(zhì)骨吸收陷窩，分別取三處，每處各照1張。用 Image J 計算骨吸收面積。

蛋白免疫印跡法

將 BMMs 接種于 6 孔板內(nèi)過夜。對于短效蛋白（iκB -ɑ），加入氯化兩面針堿預(yù)孵育 1 小時，并加入 RANKL 按照0，10，20，30，60，120 分鐘時間點刺激；對于長效蛋白（NFATc1，D2），加入氯化兩面針堿與RANKL按照0，4，24，72，120，168 小時刺激。在檢測時間點后加入細(xì)胞裂解液，收集蛋白。

隨后配置 SDS-PAGE 凝膠，蛋白上樣，轉(zhuǎn)膜。用 5% 脫脂奶粉室溫封閉 1 小時后，TBST 洗膜，接下來分別孵育 iκB -ɑ 和 NFATc1，D2 抗體，最后 ECL 發(fā)光顯影。

構(gòu)建去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松癥模型

C57BL/6J 小鼠實驗獲得西澳大學(xué)倫理委員會與廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(SCXK - (JUN) 2012-0004,Beijing, China)。 30 只 6-8 周齡的雌性小鼠隨機分為 5 組（即假手術(shù)組，對照組，藥物低劑量組，藥物高劑量組，雌激素組），每組各6只。除假手術(shù)組，每只老鼠腹腔注射 10% 水合氯醛后，雙側(cè)卵巢被摘除。術(shù)后恢復(fù)一周后，隔天給藥。根據(jù)體重和分組，進行腹腔注射。假手術(shù)組合對照組注射 1% DMSO，藥物低劑量組和高劑量組分別注射氯化兩面針堿（3mg/kg和 6mg/kg），雌激素組注射雌激素（50ng/kg）。給藥 6 周后，處死小鼠，并取其脛骨。脛骨用 4%多聚甲醛固定 24 小時后，用micro-CT掃描檢測。

分析

用 1×PBS 洗小鼠脛骨三次，裝入試管內(nèi)掃描。應(yīng)用 Bruker 1176 micro-CT 進行掃描，掃描條件為 50 KV-550 μA，0.5mm 鋁制濾波器，空間分辨率為 9 μM。用 NRecron 對數(shù)據(jù)進行重建 CT 圖；CTAn 分析軟件對樣品校準(zhǔn)霍式值和密度。重用 CTAn 軟件（Bruker 公司）建后的樣本進行分析。以下是參數(shù)分析的方法：骨小梁和骨皮質(zhì)的研究區(qū)是基于從生長板的底端來劃定。骨小梁的研究區(qū)是從生長板底端往下 0.5 毫米到 1.5 毫米區(qū)域。具有代表性的骨小梁研究區(qū)被通過畫曲線的方式從外圍的皮質(zhì)骨中勾畫出來。骨小梁研究區(qū)通過恒定閾值被二元化，從而通過 CTAn 軟件進行量化分析。

骨組織形態(tài)學(xué)分析

用 4% 多聚甲醛固定脛骨 24 小時，1×PBS 沖洗 3 次。加入 14% EDTA 脫鈣 7 天。用石蠟包埋樣本，HE 染色或者 TRAcP 染色。通過 BIOQUANT OSTEO 軟件進行定量分析，獲取 OcS/BS 和 N.Oc/BS 等數(shù)據(jù)

統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均重復(fù) 3 次。對于人外周血單個核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中骨吸收功能實驗，結(jié)果按照均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x± SE）表示。通過 Excel 2003 軟件對各參數(shù)結(jié)果值進行處理分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± SEM）表示；假設(shè)檢驗設(shè) P＜0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、實驗結(jié)果

1）氯化兩面針堿對破骨細(xì)胞形成及前破骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡的影響

選用來源于野生型小鼠的長骨骨髓中分離獲取的 BMMs 作為前破骨細(xì)胞，通過 RANKL（100ng/mL）和 M-CSF（10ng/mL）刺激誘導(dǎo)分化破骨細(xì)胞形成。RANKL（+） 為陽性對照組，RANKL（-）為空白組，其余加入不同濃度的氯化兩面針堿的進行培養(yǎng)（見圖 1-A）。通過 TRAcP 染色觀察，空白組無明顯破骨細(xì)胞形成，陽性對照組可見形態(tài)巨大、多核的破骨細(xì)胞。然而，氯化兩面針堿加入誘導(dǎo)體系中，隨著其濃度升高，對破骨細(xì)胞分化的抑制增強（見圖 1-B）。與陽性對照組相比，尤其在0.125 μM 到1 μM的氯化兩面針堿的作用下， 破骨細(xì)胞數(shù)顯著降低（見圖 1-C）。當(dāng)藥物作用濃度超過 0.5 μM 時，幾乎完全沒有破骨細(xì)胞的形成。結(jié)果表明，氯化兩面針堿能夠抑制 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成，且具有濃度依賴性。

為了證明氯化兩面針堿對破骨細(xì)胞形成的抑制作用不是通過對其凋亡而實現(xiàn)的，采用 Annexin V-FITC/PI 雙染色法，測定了不同濃度的氯化兩面針堿對前破骨細(xì)胞 RAW264.7 細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，不同濃度的氯化兩面針堿均沒有引起細(xì)胞的凋亡（見圖 1-D）。同時，采用 MTS 檢測氯化兩面針堿對前破骨細(xì)胞 BMMs 的增殖情況。結(jié)果顯示氯化兩面針堿作用濃度不超過 5 μM 時，對細(xì)胞的存活率沒有影響（見圖 1-E）。

2）氯化兩面針堿對RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響

采用 Real-Time PCR 檢測不同濃度氯化兩面針堿對 RANKL 誘導(dǎo)的BMMs 向破骨細(xì)胞分化 7 天后，相關(guān)基因 calcitonin receptor，cathepsin K，TRAcP，NFATc1，D2 表達(dá)。結(jié)果顯示，氯化兩面針堿能夠劑量依賴性的下調(diào)calcitonin receptor，cathepsin K，TRAcP，NFATc1，D2 mRNA 的表達(dá)（見圖 2）。結(jié)果在分子水平上證明了氯化兩面針堿對破骨細(xì)胞分化的抑制。

3）氯化兩面針堿對破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響

破骨細(xì)胞是體內(nèi)唯一具有骨吸收活性的細(xì)胞，頻繁過度的骨吸收活動是導(dǎo)致骨溶解疾病的根本原因。申請人將破骨樣細(xì)胞接種于骨板內(nèi)，觀察氯化兩面針堿（0.5μM 和 1μM ）對成熟破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響。通過 TRAcP 染色觀察，與對照組相比，藥物沒有抑制已成熟破骨細(xì)胞的數(shù)量（見圖 3-A，B）；然后觀察骨板，對照組可見大面積骨吸收陷窩；但是 1μM 氯化兩面針堿組可見少量骨吸收陷窩，且面積顯著減少（見圖 3-A，C）。結(jié)果表明氯化兩面針堿能夠抑制破骨細(xì)胞骨吸收功能。

4）氯化兩面針堿對誘導(dǎo)人外周血單個核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)以及牙本質(zhì)骨吸收功能的影響

選用人外周血單個核細(xì)胞作為破骨細(xì)胞前體，通過 hMCSF 與 hRANKL 共同誘導(dǎo)向破骨細(xì)胞分化。同時加入 1 μM 氯化兩面針堿進行孵育，考察其對人源破骨細(xì)胞的形成是否與鼠源破骨細(xì)胞形成的作用一致。 通過 TRAcP 染色發(fā)現(xiàn)，氯化兩面針堿顯著抑制成熟破骨細(xì)胞的標(biāo)志物，cathepsin K，NFATc1，OSCAR， FcRγ， TREM2，DAP12 的基因表達(dá)（見圖 4-A）。

另外申請人還考察了氯化兩面針堿對人外周血單個核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過程中骨吸收功能的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比較，氯化兩面針堿（0.5 μM 和 1 μM）能夠顯著減少骨吸收陷窩面積。這與前文中發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿抑制鼠源破骨細(xì)胞活性結(jié)果一致（見圖 4-B，C）。

5）氯化兩面針堿對 RANKL 誘導(dǎo)的 NF-κB 活化的影響以及相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控

為了進一步探討氯化兩面針堿影響 RANKL 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的機制，申請人采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 3kB-Luc-SV40 熒光素酶報告基因的 Raw 264.7，檢測氯化兩面針堿對 RANKL 活化 NF-κB 的影響。結(jié)果顯示，100 ng/mL RANKL 能夠在 8 小時提高 NF-κB 的表達(dá)，提示 RANKL 能夠在體系中刺激 NF-κB 活化。并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入一系列濃度梯度的氯化兩面針堿時，能夠顯著降低 RANKL 誘導(dǎo)的 NF-κB 報告基因的表達(dá)，并且是隨著藥物濃度升高，抑制效果越明顯（見圖 5-A）。提示氯化兩面針堿有可能通過調(diào)控 NF-κB 的信號通路來影響破骨細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程。

為了進一步闡明氯化兩面針堿對 NF-κB 信號通路作用，我們通過 Western-blot 檢測 NF-κB 活化的抑制因子 iκB -ɑ的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，RANKL 誘導(dǎo)對照組能夠降低iκB -ɑ的蛋白表達(dá)，釋放 NF-κB 發(fā)揮作用。但是，氯化兩面針堿對 RANKL 刺激導(dǎo)致的 iκB -ɑ 蛋白降解沒有影響（見圖 5-B），提示氯化兩面針堿可能通過調(diào)控 iκB -ɑ 下游蛋白實現(xiàn)抑制 NF-κB 的信號通路。

6）氯化兩面針堿對 RANKL 誘導(dǎo)的 NFATc1 活化的影響以及相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控

NFATc1 目前被認(rèn)為是破骨細(xì)胞關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化，影響 calcitonin receptor，cathepsin K，TRAcP 等基因的表達(dá)。通過上述研究可知，氯化兩面針堿能夠下調(diào)上述基因 mRNA 的表達(dá)。因此，申請人通過熒光素酶報告基因與 Western-blot 考察了氯化兩面針堿對 RANKL 刺激 NFATc1 活化的影響。熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，100 ng/mL RANKL 能夠在 24 小時顯著提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 pNFATc1-TA-Luc 的 Raw264.7 中 NFATc1 的表達(dá)，提示 RANKL 能夠在這個體系中活化 NFATc1。當(dāng)加入一系列濃度梯度的氯化兩面針堿時，顯著抑制了 RANKL 誘導(dǎo)的 NFATc1 報告基因表達(dá)的上升（見圖 6-A）。

Western-blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RANKL 誘導(dǎo)的 NFATc1，D2 蛋白水平顯著提高，加入氯化兩面針堿干預(yù)后，呈劑量依賴性降低 NFATc1 和 D2 的表達(dá)（見圖 6-B）。尤其在 1 μM 氯化兩面針堿干預(yù)下，不同時間點的 NFATc1 和 D2 的表達(dá)均被抑制（見圖 6-C）。提示氯化兩面針堿通過抑制轉(zhuǎn)錄因子 NFATc1 的表達(dá)，繼而調(diào)控其下游基因的表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞的分化和功能。

7）氯化兩面針堿保護去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨丟失

申請人已經(jīng)通過體外 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞體系發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿能夠抑制破骨細(xì)胞的形成和骨吸收功能。為了進一步證實氯化兩面針堿對破骨細(xì)胞的影響，申請人通過建立去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松癥模型，考察氯化兩面針堿對雌激素丟失引發(fā)過度骨吸收活動和破骨細(xì)胞的影響。通過 micro-CT 掃描檢測發(fā)現(xiàn)，建立去卵巢小鼠模型組 6 周后，出現(xiàn)明顯的骨丟失現(xiàn)象（見圖 7-A），骨小梁分離度明顯增加，骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、以及骨小量數(shù)明顯降低（見圖 7-B）。從去卵巢小鼠骨頭組織形態(tài)學(xué)中發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞表面積/骨表面積與破骨細(xì)胞數(shù)目均降低（見圖 7-C）。而氯化兩面針堿高、低濃度劑量給藥組能夠有效的防止去卵巢小鼠導(dǎo)致的骨丟失（見圖 7-A），提升骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、以及骨小量數(shù)，降低骨小梁分離度等骨靜態(tài)參數(shù)（見圖 7-B,C），其中高劑量給藥組（6mg/kg）的治療效果能夠類同于雌激素給藥組的功效（圖 7）。

三、討論

破骨細(xì)胞異?；钴S的分化增殖和骨吸收功能容易引起骨丟失疾病，例如絕經(jīng)性的骨質(zhì)疏松癥，變形性骨炎，自身免疫性關(guān)節(jié)炎，牙周炎。這一過程通常是由 RANKL過度表達(dá)所致。RANKL 對破骨細(xì)胞前體啟動多種有關(guān)破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄基因的胞內(nèi)信號級聯(lián)放大，從而實現(xiàn)破骨細(xì)胞的分化與成熟。因此，靶標(biāo) RANKL 誘發(fā)的信號通路是治療骨丟失疾病的關(guān)注點。

通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，氯化兩面針堿可以劑量依賴性抑制 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成以及骨吸收功能作用。因此，詳細(xì)闡明氯化兩面針堿對破骨細(xì)胞的分子機制很有必要。破骨細(xì)胞前體向成熟的破骨細(xì)胞分化，需要多種細(xì)胞因子參與激活胞內(nèi)信號通路。其中有兩個條件最為重要：一、MCSF，它是維持破骨細(xì)胞生長；二、RANKL，它是促進破骨細(xì)胞分化、成熟。目前，RANKL 引發(fā)的一系列變化與骨溶解疾病的發(fā)生發(fā)展緊密聯(lián)系。RANKL 聯(lián)合 RANK 作用于前破骨細(xì)胞，募集形成 TRAF6 與 c-src 復(fù)合蛋白體，并活化 IKK 激酶。IKK 通過降解 iκB-ɑ 來釋放 NF-κB 入核，與相應(yīng)的 DNA 的啟動子結(jié)合，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。我們發(fā)現(xiàn)，利用 NF-κB 熒光素酶報告基因，氯化兩面針堿劑量依賴性抑制 NF-κB 的表達(dá)。提示氯化兩面針堿可以通過 RANKL 誘導(dǎo)的 NF-κB 通路來抑制破骨細(xì)胞的形成及功能。但從蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，氯化兩面針堿不能干預(yù) RANKL 引起的 iκB-ɑ 降解，這說明氯化兩面針堿可能通過 iκB-ɑ 下游基因來抑制 NF-κB的活化。

RANKL 不僅能夠激活 NF-κB，還能夠通過 TRAF6 誘導(dǎo)活化轉(zhuǎn)錄因子 NFATc1 從而介導(dǎo)破骨細(xì)胞的成熟分化。通過 NFATc1 熒光素酶報告基因與蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn)，氯化兩面針堿也能夠抑制 NFATc1 的表達(dá)，從而影響破骨細(xì)胞的分化。并且下調(diào)了破骨細(xì)胞分化基因的表達(dá)；例如 cathepsin K，OSCAR，TREM2，F(xiàn)cRγ，DAP12 等。

為了進一步在體內(nèi)證實氯化兩面針堿對破骨細(xì)胞的影響，通過建立去卵巢骨質(zhì)疏松癥小鼠模型發(fā)現(xiàn)，氯化兩面針堿能夠保護去卵巢小鼠的骨丟失。與我們體外的研究結(jié)果一致。

綜上所述，氯化兩面針堿是未來防治破骨細(xì)胞引起的骨丟失疾病的一個理想藥物。