余甘子多糖的制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種余甘子多糖的制備方法，其制備步驟包括余甘子多糖的提取分離和余甘子粗多糖的脫色工藝研究，其特征在于余甘子粗多糖采用不溶性殼聚糖為脫色劑脫色精制，它解決了傳統(tǒng)脫色精制中或脫色率低或多糖含量低的缺點(diǎn)，采用該方法制備的余甘子多糖，對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的抑制率和食管癌細(xì)胞株EC109的抑制率均強(qiáng)于5-氟尿嘧啶（5-FU）。
【專利說明】余甘子多糖的制備和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及余甘子多糖的制備和應(yīng)用，尤其涉及一種具有抗消化道腫瘤活性的潮 汕余甘子多糖的制備和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 余甘子Phyllanthus emblica L.又名山油柑、油甘子、余甘果等，為大戟科葉下珠 屬植物余甘子的成熟果實(shí)。余甘子是潮汕地區(qū)的優(yōu)良種質(zhì)資源之一，余甘子不僅具有豐富 的營養(yǎng)價(jià)值，而且具有抗炎抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物活性。目前研究表明，余甘 子的主要活性成分為：多糖類物質(zhì),黃酮類化合物,抗壞血酸，SOD酶和多酚類化合物，其生 物學(xué)功能是多種有效成分協(xié)同作用的結(jié)果。其中，余甘子多糖(粗多糖)具有清除自由基、抗 氧化和抗腫瘤等作用，引起了各國學(xué)者的興趣。
[0003] 在多糖的提取、分離、純化以及結(jié)構(gòu)研究中，脫色是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。目前，脫色主 要采用雙氧水法和活性炭吸附法，用活性炭脫色的脫色率最低，多糖的含量最高；過氧化氫 的脫色率較活性炭的好，但多糖含量較低。目前缺乏一種快速、簡單、高效的脫色方法，既保 證高的脫色率的同時(shí)，確保有高的多糖保留率。
[0004] 同時(shí)對(duì)余甘子多糖的抗消化道腫瘤活性的研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種余甘子多糖的制備方法，特別是粗余甘子多糖的脫色精 制方法，它解決了傳統(tǒng)脫色精制中或脫色率低或多糖含量低的缺點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)步驟實(shí)現(xiàn)的，它是以余甘子為原料，按照以下步驟進(jìn)行制 備： (1) 余甘子去核，用50?80°C熱水浸泡10?60 min，然后打漿，將漿液加熱回流1? 5h后，熱提液趁熱過濾； (2) 將所得濾液濃縮至原體積20?30%，用95%食用酒精調(diào)至溶液乙醇含量為70? 85%，靜置8?15hr，過濾，沉淀依次用適量80%乙醇、無水乙醇洗1?3遍； (3) 沉淀經(jīng)過濾、冷凍干燥得余甘子粗多糖。
[0007] (4)以水為溶劑，將余甘子粗多糖配成0? 2?0? 8 mg/ml溶液，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH 至3.0?4.0,按每100 ml溶液加入2.0?2.5 g不溶性殼聚糖，于水浴中使溫度在40 ?50 °C，攪拌45?60 min脫色，過濾除去殘漁。
[0008] (5)將所得濾液濃縮至原體積20?30%，靜置12-24hr，過濾，沉淀經(jīng)冷凍干燥得 余甘子多糖。
[0009] 本發(fā)明技術(shù)步驟（1)中余甘子與熱水的比值為1:5?1:10。
[0010] 本發(fā)明技術(shù)步驟（2)中濾液濃縮可采用常壓濃縮，也可采用減壓濃縮。
[0011] 本發(fā)明技術(shù)步驟（2)中過濾可采用離心過濾。
[0012] 本發(fā)明技術(shù)步驟（2)或步驟（5)中冷凍溫度為-4 °C?-20 °C。
[0013] 本發(fā)明技術(shù)步驟（4)中最好將PH調(diào)為3. 0?4. 0。
[0014] 本發(fā)明技術(shù)步驟（4)中攪拌脫色溫度為40 °C?50°C。
[0015] 本發(fā)明技術(shù)步驟（4)中攪拌脫色時(shí)間為45min?60min。
[0016] 本發(fā)明脫色率和多糖保留率的測(cè)定方法如下： 1.脫色率測(cè)定方法 配制0.5 mg /ml余甘子多糖樣品溶液，對(duì)余甘子粗多糖溶液進(jìn)行了可見光400?600 nm掃描，確定其吸收光譜。余甘子粗多糖溶液無最大吸收峰，由余甘子多糖溶液脫色前為 橙黃色，根據(jù)互補(bǔ)色原理可知，溶液主要吸收藍(lán)色波段（446?464nm)可見光，故選擇450 nm為檢測(cè)波長。
[0017]取適量的脫色前后待測(cè)液在450 nm處測(cè)定吸光度，并按下式（1)計(jì)算脫色率： 脫色率（％) =(A脫色前一A脫色后）/ A脫色前X 100%。
[0018] 注：A為吸光度。
[0019] 2.多糖保留率測(cè)定方法 配制0.5 mg /ml余甘子多糖樣品溶液，取脫色前后待測(cè)液各2. 00 ml，加質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為6%的重蒸苯酚1.0 ml及濃硫酸5.0 ml,迅速搖勻后，靜置10 min,沸水水浴加熱 15min，冷卻至室溫，于490 nm波長處測(cè)吸收度A值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖溶液中的葡萄糖 含量和多糖保留率。
[0020] 多糖保留率（％) = CXD/W 式中：W為余甘子多糖質(zhì)量（mg) ; C為多糖溶液中的葡萄糖質(zhì)量濃度（mg /ml); D為多糖的稀釋倍數(shù)。
[0021] 本發(fā)明對(duì)抗腫瘤活性具有很好的抑制作用。 實(shí)施例
[0022] 將H印G2，EC109細(xì)胞株消化制成5 X 10-4個(gè)/L的細(xì)胞懸液，每孔100 ii L的 量接種于96孔培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置37 °C、5% C02細(xì)胞培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，按照實(shí)驗(yàn)分組要求培養(yǎng)后，每孔加入20iiL MTT (5mg/mL)溶液，在 37 °C繼續(xù)孵育4 h后吸出上清液，每孔加入150 ii L DMS0，用平板搖床搖勻，用酶標(biāo) 儀在490 nm波長處檢測(cè)每孔的吸光度（A值）。以5-氟尿嘧啶（5-FU)為對(duì)比，對(duì)肝癌細(xì) 胞株H印G2細(xì)胞的抑制率和食管癌細(xì)胞株EC109的抑制率結(jié)果分別見表1和表2。其對(duì)肝 癌細(xì)胞株H印G2細(xì)胞和食管癌細(xì)胞株EC109的抑制率均強(qiáng)于5-FU。
[0023] 表1對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的抑制率

【權(quán)利要求】
1. 一種余甘子多糖的制備方法，其步驟包括： (1) 余甘子去核，用50?80°C熱水浸泡10?60 min，然后打漿，將漿液加熱回流1? 5h后，熱提液趁熱過濾； (2) 將所得濾液濃縮至原體積20?30%，用95%食用酒精調(diào)至溶液乙醇含量為70? 85%，靜置8?15hr，過濾，沉淀依次用適量80%乙醇、無水乙醇洗1?3遍，沉淀 經(jīng)冷凍干燥得余甘子粗多糖； (3) 將余甘子粗多糖配成0.2?0.8mg/ml水溶液，用檸檬酸調(diào)節(jié)PH至3.0?4.0， 脫色溫度控制在40?50 °C，經(jīng)45?60 min，溶液加人殼聚糖2.0?2.5 g進(jìn)行脫 色； (4) 將所得濾液濃縮、沉淀、過濾，經(jīng)冷凍干燥得余甘子多糖， 其特征在于：步驟（3)中的脫色工藝是先將余甘子粗多糖配成0.2?0.8mg/ml水溶 液，用檸檬酸調(diào)節(jié)PH至3?4,脫色溫度控制在40?50 °C，經(jīng)45?60 min，溶液加 入殼聚糖2. 0?2. 5 g進(jìn)行脫色。
2. 按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：步驟（1)中余甘子與熱水的比值為1:5? 1:10。
3. 按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：步驟（2)中濾液濃縮可采用冷凍干燥，也可 米用減壓濃縮干燥。
4. 按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：步驟（2)中過濾可采用離心過濾。
5. 按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：步驟（2)和步驟（4)中冷凍溫度 為-4V ?-20V。
6. 按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：余甘子粗多糖溶液脫色前最好將PH調(diào)為 3. 0 ?4. 0〇
7. 按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：余甘子粗多糖溶液攪拌脫色溫度為40? 50。。。
8. 按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：余甘子粗多糖溶液攪拌脫色時(shí)間為45? 60 min〇
9. 按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：每100 ml余甘子粗多糖溶液加入的殼聚 糖量為2.0?2.5 g。
10. 按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：所制備的余甘子粗多糖溶液對(duì)消化道腫 瘤細(xì)胞株Η印G2, EC109的具有抑制活性，比5-FU強(qiáng)。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104262504SQ201410574230
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】李春泉, 陳一村, 陳潮升, 陳秀英 申請(qǐng)人:廣東匯群中藥飲片有限公司