一種治療ii型糖尿病或代謝綜合征的復(fù)方藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種治療II型糖尿病或代謝綜合征的復(fù)方藥物組合物，更具體地，公開(kāi)了一種5-羥色胺2受體拮抗劑沙格雷酯和5-羥色胺合成抑制劑組合的復(fù)方藥物組合物，本發(fā)明的復(fù)方藥物組合物可用于改善胰島素抵抗從而治療II型糖尿病和代謝綜合征。
【專利說(shuō)明】一種治療11型糖尿病或代謝綜合征的復(fù)方藥物組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及5-羥色胺2受體拮抗劑沙格雷酯和5-羥色胺合成抑制劑組合的復(fù)方藥物組合物，本發(fā)明的復(fù)方藥物組合物可用于改善胰島素抵抗從而治療II型糖尿病和代謝綜合征。
【背景技術(shù)】
[0002]胰島素抵抗(Insulin resistance, IR)是指“各種原因使胰島素促進(jìn)細(xì)胞攝取和利用葡萄糖的效率下降，機(jī)體代償性的分泌過(guò)多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥，以維持血糖的穩(wěn)定”這種現(xiàn)象。一個(gè)具有正常代謝的人，胰島素是在進(jìn)食后由胰腺內(nèi)的胰島β細(xì)胞分泌的，它傳遞信號(hào)給體內(nèi)的胰島素感應(yīng)組織，使細(xì)胞膜表面產(chǎn)生葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(Glucosetransporter, GLUT)吸收葡萄糖從而降低血糖濃度。IR的主要發(fā)生組織為肝臟、脂肪組織和骨骼肌。細(xì)胞發(fā)生IR時(shí)，正常水平的胰島素?zé)o法誘導(dǎo)這些細(xì)胞產(chǎn)生足夠的GLUT，從而完成正常的葡萄糖吸收功能。為了對(duì)此進(jìn)行補(bǔ)償，胰島需釋放更多的胰島素，以使足夠的細(xì)胞GLUT被激發(fā)來(lái)吸收葡萄糖。因此IR的主要原因是“細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性降低，胰島素誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)GLUT轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上從而增加葡萄糖吸收的能力下降”。其病變的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)的，某種原因使細(xì)胞GLUT表達(dá)能力下降，GLUT基因或蛋白表達(dá)下降，從而降低了細(xì)胞在胰島素刺激下吸收利用葡萄糖的能力，從而出現(xiàn)IR。
[0003]多種原因可導(dǎo)致IR，如肥胖、長(zhǎng)期高血糖、高游離脂肪酸血癥、高糖皮質(zhì)素血癥、妊娠和體內(nèi)胰島素拮抗激素增多等。但公認(rèn)的，肥胖是導(dǎo)致IR最主要的原因，尤其是向中性肥胖；而高糖皮質(zhì)素血癥、高游離脂肪酸血癥可能是肥胖導(dǎo)致IR的直接原因。與IR直接相關(guān)的疾病主要有兩種:2型糖尿病(Diabetes mellitus type2, DM-1I)和代謝綜合征metabolic syndrome, MS) ? DM-1I占糖尿病患者90%以上,病人的主要表現(xiàn)就是肥胖和IR,機(jī)體胰島素相對(duì)缺乏，只有病情惡化、后期的DM-1I病人才因?yàn)橐葝u被破壞出現(xiàn)胰島素的絕對(duì)缺乏。MS為多種代謝成分異常聚集的病理狀態(tài)，是一組復(fù)雜的代謝紊亂癥候群，是導(dǎo)致糖尿病、心腦血管疾病(動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)、冠心病)的危險(xiǎn)因素，目前認(rèn)為其集簇發(fā)生的核心是IR。臨床上，診斷MS的主要標(biāo)準(zhǔn)有:腹型肥胖(即向中性肥胖)、IR、高脂血癥(高甘油三酯血癥、高低密度脂蛋白及低高密度脂蛋白血癥)。因此，改善機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，降低IR成為治療DM-11、MS的首選。雙胍類(如二甲雙胍)和噻唑烷二酮類(如羅格列酮和吡格列酮)是臨床常用的增加胰島素敏感性、改善IR的藥物。
[0004]IR檢測(cè)的最常用方法:
[0005]1.HOMA-1R指數(shù)HOMA-1R指數(shù)全稱為“穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)”，這是衡量機(jī)體IR最常用的方法，方法簡(jiǎn)單、結(jié)論可靠。測(cè)量空腹血糖和空腹胰島素濃度，計(jì)算HOMA-1R指數(shù)(H0MA-1R =空腹血糖X空腹胰島素+22.5)，實(shí)驗(yàn)時(shí)通過(guò)與正常對(duì)照組比較來(lái)確定IR ；
[0006] I1.尿糖量測(cè)定如果血糖濃度足夠高(超過(guò)腎糖閾)，可在尿液中檢測(cè)到葡萄糖(這是糖尿病名稱的來(lái)由)。單位時(shí)間內(nèi)人或動(dòng)物排出的尿液中葡萄糖含量的多少，可反映IR及糖尿病的嚴(yán)重程度，尿糖量越高表明IR及糖尿病越嚴(yán)重。[0007]IR實(shí)際上是細(xì)胞代謝紊亂的一種表現(xiàn)。IR時(shí)，機(jī)體細(xì)胞的糖代謝、脂代謝都出現(xiàn)紊亂，尤其在脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞，這種能量代謝的紊亂特別明顯，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞分泌一些激素樣因子紊亂(如瘦素、抵抗素分泌增加，脂聯(lián)素分泌減少)，肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積、炎癥因子產(chǎn)生增加等，骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用效率降低等。但導(dǎo)致IR的本質(zhì)原因目前是不清楚的，雖然發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)素、游離脂肪酸、一些炎癥因子(如腫瘤壞死因子α)可直接導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生IR、抑制GLUT的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，但它們是通過(guò)什么途徑、怎樣改變細(xì)胞內(nèi)的代謝通路及信號(hào)通路從而導(dǎo)致IR的？是否存在一種共同的作用特點(diǎn)？目前并未弄清。我們的研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)素、游離脂肪酸導(dǎo)致IR時(shí)存在共同的作用特點(diǎn):引起肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及骨骼肌細(xì)胞5-羥色胺合成或受體表達(dá)發(fā)生改變；通過(guò)逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的5-HT系統(tǒng)改變能夠阻斷這些因素導(dǎo)致的IR。
[0008]5-輕色胺(5-hydroxy tryptamine, 5-HT)也叫血清素,是一種存在于外周和中樞的小分子物質(zhì)，5-HT的生理功能復(fù)雜，至今未完全弄清。
[0009]1.5-HT的合成分兩步，第一步:色氨酸在色氨酸輕化酶(tryptophanhydroxylase, TPH)的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥色氨酸(TPH可分為兩個(gè)亞型:TPH1和TPH2，TPH1存在于外周，TPH2存在于中樞)；第二步:5_羥色氨酸在芳香族氨基酸脫羧酶(aromaticaminoacid decarboxylase, AADC)的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)?-HT。因此,可分別通過(guò)抑制TPH或AADC實(shí)現(xiàn)對(duì)5-HT合成的抑制。
[0010]對(duì)氯苯丙氨酸(parachlorophenylalanine或 p-chlorophenylalanine, pCPA),別名:DL-4-氯苯丙氨酸、DL-對(duì)氯苯丙氨酸等，分子式=C9HltlClNO2，是TPH抑制劑，無(wú)臨床應(yīng)用報(bào)導(dǎo)。
[0011]卡比多巴(Cabidoba,Q)P),分子式=CltlH14N2O4。
[0012]節(jié)絲肼(Benserazide, BSA),別名:三羥基絲氨酰肼、色拉肼、絲氯酰肼、輕節(jié)絲肼，分子式:C10H15N3O5ο
[0013]⑶P和BSA都是AADC抑制劑，臨床用于帕金森氏病的輔助治療，它們的共同作用特點(diǎn)是外周脫羧酶抑制劑，不易進(jìn)入中樞，僅抑制外周左旋多巴轉(zhuǎn)化為多巴胺，使循環(huán)中左旋多巴含量增加，也可抑制5-羥色氨酸轉(zhuǎn)化為5-HT，使合成5-HT的細(xì)胞產(chǎn)生5-HT減少。CDP和BSA也沒(méi)有用于改善IR，從而治療DM-1I或MS的研究報(bào)導(dǎo)。
[0014]I1.5-HT受體5-HT受體(5-HT receptor, 5-HTR)存在于細(xì)胞膜上，屬于膜受體，5-HT受體亞型復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有7大類受體存在，即S-HIV7Rj-HTu5R主要分布在中樞，5_HT2，3，6，7R主要分布在外周。這7類受體又被進(jìn)一步分為若干個(gè)亞型。5-肌21?可被分為5-HT2AR、5-HT2BR和5-HT2eR。外周和中樞均有分布的是5_HT2A，2BR，5-HT2CR主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，肝臟、骨骼肌、內(nèi)臟脂肪組織分布有5-HT2A，2BR。具有選擇性阻斷5-HT2R的藥物不多，已知沙格雷酯屬于選擇性5-HT2R拮抗劑。
[0015] 沙格雷酯(Sarpogrelate，SAR)是一種專一性5_HT2R 阻斷劑，分子:C24H31N06。臨床應(yīng)用中，SAR可抑制由5-HT增強(qiáng)的血小板凝集及抑制血管收縮作用等，臨床用于改善慢性動(dòng)脈閉塞癥所引起的潰瘍、疼痛以及冷感等缺血性諸癥狀。雖然臨床有SAR治療糖尿病性并發(fā)癥下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的報(bào)導(dǎo)，但沒(méi)有可以改善IR的研究報(bào)導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0016]本發(fā)明公開(kāi)了一種5-羥色胺2受體拮抗劑沙格雷酯和5-羥色胺合成抑制劑組合的復(fù)方藥物組合物，該組合物具有協(xié)同改善胰島素抵抗從而可用于治療II型糖尿病和代謝綜合征。
[0017]所述的5-羥色胺合成抑制劑優(yōu)選對(duì)氯苯丙氨酸、卡比多巴或芐絲肼。
[0018]沙格雷酯和5-羥色胺合成抑制劑的重量比優(yōu)選15:1~1:15。
[0019]沙格雷酯和對(duì)氯苯丙氨酸的重量比更優(yōu)選為12:1~1:2。
[0020]沙格雷酯和卡比多巴的重量比更優(yōu)選為9:1~1:2。
[0021]沙格雷酯和芐絲肼的重量比更優(yōu)選為8:1~1:3。
[0022]我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn):
[0023]1.肝細(xì)胞及脂肪細(xì)胞均存在5-HT合成系統(tǒng)(TPH1，AADC)。糖皮質(zhì)激素類藥物一地塞米松(dexamethasone, DEX)或脂肪酸(油酸,oleic acid, 0A)刺激在導(dǎo)致肝細(xì)胞產(chǎn)生IR時(shí)(GLUT受體表達(dá)被下調(diào))，同時(shí)也存在5-HT合成系統(tǒng)被上調(diào)、細(xì)胞內(nèi)5-HT含量增加^DEX導(dǎo)致大鼠發(fā)生IR的實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)觀察到肝臟及內(nèi)臟脂肪TPHl、AADC表達(dá)被上調(diào)、5-HT含量升高，即兩種組織中5-HT合成增加；
[0024]I1.肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及骨骼肌細(xì)胞均存在5_HT2A，2BR表達(dá)，體外培養(yǎng)肝細(xì)胞用DEX或OA刺激，或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用DEX刺激建立IR動(dòng)物模型時(shí)，三種組織5-HT2A，2B受體表達(dá)均被明顯上調(diào)，并同步地出現(xiàn)IR癥狀。
[0025]II1.體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)，用DEX或OA刺激建立肝細(xì)胞IR模型，5_HT合成抑制
5-HT2R阻斷劑一SAR均可明顯抑制DEX或OA導(dǎo)致的GLUT基因表達(dá)被下調(diào)，而SAR與pCPA或CDP或BSA聯(lián)用，則使GLUT被進(jìn)一步上調(diào)，顯示出協(xié)同效應(yīng)。
[0026]IV.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，用DEX刺激建立IR動(dòng)物模型，用SAR+pCPA、SAR+⑶P、SAR+BSA按兩種藥物不同的重量配比組成不同的復(fù)方對(duì)模型進(jìn)行治療。結(jié)果表明，DEX導(dǎo)致的IR(高血糖、高血胰島素濃度，HOMA-1R指數(shù)升高，明顯的尿糖含量)被明顯逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為:血糖、血胰島素濃度降低，HOMA-1R指數(shù)減小，尿液中葡萄糖含量減少。并且，SAR+pCPA、SAR+⑶P、SAR+BSA三種復(fù)方按藥物一定的重量配比，對(duì)治療IR顯示出明顯的協(xié)同作用，聯(lián)合用藥能明顯提高藥物療效。其中，SAR+pCPA復(fù)方產(chǎn)生協(xié)同作用療效的藥物重量比為:12:1~1:2時(shí)效果更佳；SAR+⑶P復(fù)方產(chǎn)生協(xié)同作用療效的藥物重量比為:9:1~1:2時(shí)效果更佳；SAR+BSA復(fù)方產(chǎn)生協(xié)同作用療效的藥物重量比為:8:1~1:3時(shí)效果更佳。并且，所選SAR+pCPA復(fù)方，以重量配比為4:1的復(fù)方療效最好；所選SAR+⑶P復(fù)方，以重量配比為3:1的復(fù)方療效最好；所選SAR+BSA復(fù)方，以重量配比為2:1的復(fù)方療效最好。
[0027]綜上所述，用沙格雷酯與5-羥色胺合成抑制劑如對(duì)氯苯丙氨酸或卡比多巴或芐絲肼在一定的重量比范圍內(nèi)組成復(fù)方，對(duì)改善胰島素抵抗有明顯的協(xié)同作用，可用于因胰島素抵抗引起的2型糖尿病或代謝綜合征的治療。
[0028]本發(fā)明的復(fù)方藥物組合物通過(guò)添加藥學(xué)上可接受的載體制備成適合臨床使用的劑型，如片劑、膠囊、液體制劑等。所述藥學(xué)上可接受的載體如崩解劑、稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑等。
[0029]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的復(fù)方藥物組合物做進(jìn)一步的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的闡述?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】[0030]圖1是DEX或OA對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞TPH1、AADC、5-HT2AR、5_HT2BR基因表達(dá)的影響(A)及DEX或OA刺激對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞5-HT含量的影響⑶(χ± SDs N = 3)
[0031]圖2是在DEX導(dǎo)致的體外培養(yǎng)肝細(xì)胞GLUT2基因表達(dá)下調(diào)模型，SAR、pCPA、⑶P、BSA治療可逆轉(zhuǎn)這種下調(diào)，而SAR與pCPA、⑶P、BSA聯(lián)合用藥則進(jìn)一步加大這種逆轉(zhuǎn)效應(yīng)
(A)，在OA導(dǎo)致的肝細(xì)胞GLUT2基因表達(dá)下調(diào)模型，這種效應(yīng)也存在(B) ( J± SD, N = 3)
[0032]圖3是在DEX導(dǎo)致肝細(xì)胞5-HT含量升高時(shí)，用pCPA、⑶P、BSA治療可明顯抑制這種效應(yīng)，而SAR沒(méi)有抑制作用，且SAR與pCPA、CDP、BSA聯(lián)合給藥也沒(méi)有協(xié)同作用(A)，在OA導(dǎo)致肝細(xì)胞5-HT含量升高時(shí)，也存在這種效應(yīng)(B) ( X± SD, N= 3)
[0033]圖4是大鼠連續(xù)給DEX15天后肝臟、脂肪組織TPH1、AADC蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(骨骼肌未見(jiàn)TPH1、AADC表達(dá))(A)及大鼠連續(xù)給DEX15天后肝臟、脂肪組織5-HT含量明顯升
高，而用pCPA、CDP、BSA治療時(shí)則5-HT含量明顯降低⑶(歹± SD9 N = 6)
[0034]圖5是大鼠連續(xù)給DEX15天后肝臟、脂肪組織、骨骼肌5-HT2AR、5_HT2BR基因表達(dá)明顯上調(diào)
[0035]圖6是大鼠連續(xù)給DEX15天后肝臟GLUT2、脂肪組織及骨骼肌GLUT4基因表達(dá)明顯下調(diào)，用SAR、pCPA、CDP、BSA治療明顯上調(diào)GLUT2、GLUT4基因表達(dá)
【具體實(shí)施方式】
[0036]實(shí)施例1
[0037]肝細(xì)胞體外細(xì)胞培養(yǎng)研究
[0038] “肝細(xì)胞5-HT合成系統(tǒng)、5-HT2A，2B受體基因表達(dá)、GLUT基因表達(dá)，在DEX或OA刺激時(shí)的改變；及抑制5-HT合成或阻斷5-HT2A，2B受體(5-HT2A，2BR)時(shí)對(duì)DEX或OA導(dǎo)致的IR的改善作用”研究結(jié)果。
[0039]1.1實(shí)驗(yàn)方法
[0040](I)細(xì)胞培養(yǎng)
[0041]大鼠BRL-3A肝細(xì)胞株體外培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞傳代之10_20代時(shí)完成。細(xì)胞培養(yǎng)在37°C、含5% CO2的培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的PRM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并用青霉素/蓮霉素聯(lián)合抗菌。細(xì)胞接種濃度5 X IO5個(gè)/瓶，培養(yǎng)24小時(shí)后待細(xì)胞增殖達(dá)到70-80%瓶底面積時(shí)可進(jìn)行給藥。分別用地塞米松(DEX)或油酸(OA)刺激建立IR細(xì)胞模型。DEX刺激IR模型給藥分組:對(duì)照組一正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，DEX刺激模型組一培養(yǎng)基中加入30 μ M/LDEX, pCPA組一培養(yǎng)基中加入30 μ M/L DEX及25 μ M/L pCPA, CDP組-培養(yǎng)基中加入30 μ M/L DEX 及 25 μ M/LCDP，BSA 組-培養(yǎng)基中加入 30 μ M/L DEX 及 25 μ M/L BSA, SAR 治療組一培養(yǎng)基中加入30 μ M/LDEX及25 μ M/L SAR, SAR與pCPA聯(lián)合給藥組一培養(yǎng)基中加入30 μ M/LDEX及25 μ M/LSAR+25 μ M/L pCPA, SAR與CDP聯(lián)合給藥組一培養(yǎng)基中加入30 μ M/L DEX及25 μ M/LSAR+25 μ M/L CDP，SAR 與 BSA 聯(lián)合給藥組一培養(yǎng)基中加入 30 μ M/L DEX 及 25 μ M/LSAR+25 μ M/L BSA ；0Α刺激IR模型給藥分組:對(duì)照組一正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，OA刺激模型組一培養(yǎng)基中加入200 μ M/L 0A, pCPA組—培養(yǎng)基中加入200 μ M/L OA及25 μ M/L pCPA, CDP組-培養(yǎng)基中加入200 μ M/L OA及25 μ M/L CDP，BSA組-培養(yǎng)基中加入200 μ M/L OA及25 μ M/LBSA, SAR 治療組—培養(yǎng)基中加入 200 μ M/L OA 及 25 μ M/L SAR, SAR 與 pCPA 聯(lián)合給藥組一培養(yǎng)基中加入200 μ M/L OA及25 μ M/L SAR+25 μ M/L pCPA, SAR與CDP聯(lián)合給藥組一培養(yǎng)基中加入200 μ M/L OA及25 μ M/L SAR+25 μ M/L CDP，SAR與BSA聯(lián)合給藥組一培養(yǎng)基中加入200 μ M/L OA及25 μ M/L SAR+25 μ M/L BSA。所有實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)48小時(shí)后用裂解液裂解細(xì)胞，所得溶液可進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，用于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)含量檢測(cè)及PCR試驗(yàn)。
[0042](2)給藥劑量
[0043]地塞米松(DEX)—30 μ M/L
[0044]對(duì)氯苯丙氨酸(pCPA)—25 μ M/L
[0045]卡比多巴(CDP)—25 μ M/L
[0046]芐絲肼(BSA)—25 μ M/L
[0047]沙格雷酯(SAR)—25 μ M/L
[0048]油酸(OA)—200 μ M/L
[0049]1.2實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)方法
[0050](I)細(xì)胞5-HT含量檢測(cè)
[0051]酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)5-HT含量。
[0052](2) TPH1、AADC、5-HT2A，2B 受體、GLUT2 基因表達(dá)檢測(cè)
[0053]肝細(xì)胞相關(guān)因子基因表達(dá):逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測(cè)TPHl、AADC、5-HT2A，2B受體(5-HT2AR，5-HT2BR)、GLUT2 基因(mRNA)表達(dá)。其中，肝細(xì)胞 GLUT 為 GLUT2。引物:
[0054]THPI 上游引物 5’ ACTGCGACATCAACCGAGAA3’
[0055]下游引物5’ GGCTAACCCTGACAGGAAAT3’
[0056]AADC 上游引物 5 ’ AGAACTGACCTAACCGAAGC3 ’
[0057]下游引物5 ’ CAGACCAACCCGAGGATGAC3，
[0058]5-HT2AR 上游引物 5’ GGATTTACCTGGATGTGC3’
[0059]下游引物5’ TGGATGGACCGTTGGAAG3’
[0060]5-HT2BR 上游引物 5，CAGCAGCAGAGGAAATGA3，
[0061]下游引物5’ ATCCAGGGAAATGGCACA3’
[0062]GLUT2 上游引物 5’ GGTGTTGCTGGATAAGTTCA3’
[0063]下游引物5’ AGGATTCGAGTTAAGAGGGA3’
[0064]內(nèi)參GAPDH 上游引物 5’ TATCGGACGCCTGGTTAC3’
[0065]下游引物5’TGCTGACAATCTTGAGGGA3’ ；
[0066]1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0067]所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)用組間Student-t檢測(cè)，p〈0.05表示有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p〈0.01表示有非常明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。下列所有圖中數(shù)據(jù)用均值土標(biāo)準(zhǔn)差(I士 SD)表示，N=3 ;*ρ〈0.05，**ρ〈0.01與對(duì)照組比較；$ρ<0.05，$$ρ〈0.01與DEX或OA刺激模型組比較；#p<0.05, ##p<0.01聯(lián)合用藥與SAR單用藥比較；&ρ〈(λ 05，&&ρ〈(λ OI聯(lián)合用藥與pCPC或CDP或BSA單用藥比較。
[0068](I) DEX刺激或OA刺激導(dǎo)致肝細(xì)胞IR時(shí)存在明顯的5-HT合成增加及5-HT2A，2BR表達(dá)上調(diào)
[0069]結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，正常肝細(xì)胞存在5-HT合成酶TPHl、AADC基因表達(dá)，并且檢測(cè)到5-HT含量，還檢測(cè)到5-HT2A，2BR基因表達(dá)；DEX刺激或OA刺激后，肝細(xì)胞5-HT合成增加一5-HT含量增加、TPHU AADC、5-HT2A，2BR基因表達(dá)被上調(diào)。提示肝細(xì)胞在DEX或OA刺激時(shí)，5-HT合成系統(tǒng)被激活、5-HT2A，2BR被上調(diào)。
[0070](2) SAR與pCPA、⑶P、BSA聯(lián)用對(duì)改善DEX或OA導(dǎo)致的肝細(xì)胞IR具有協(xié)同作用
[0071]SAR、pCPA、CDP、BSA單獨(dú)給藥均可明顯逆轉(zhuǎn)DEX或OA刺激導(dǎo)致的肝細(xì)胞GLUT2基因表達(dá)下調(diào)；SAR與pCPAXDP、BSA聯(lián)合用藥的療效更加明顯，顯示出明顯的協(xié)同增效作用，GLUT2的基因表達(dá)相對(duì)量已接近對(duì)照組。結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0072]對(duì)DEX或OA導(dǎo)致的肝細(xì)胞5_HT含量升高，pCPA、⑶P、BSA均有抑制作用，使肝細(xì)胞內(nèi)5-HT含量下降。SAR沒(méi)有這種作用，且SAR與pCPA、⑶P、BSA聯(lián)合給藥也沒(méi)有協(xié)同作用。結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0073]結(jié)果表明，肝細(xì)胞5-HT合成增加及5_HT2A，2BR表達(dá)上調(diào)是DEX或OA導(dǎo)致肝細(xì)胞IR時(shí)的共同特點(diǎn)，可能是導(dǎo)致IR的共同原因；通過(guò)抑制細(xì)胞的5-HT合成，或通過(guò)阻斷5-HT2A，2B受體，可獨(dú)立地改善DEX或OA導(dǎo)致的肝細(xì)胞IR ;當(dāng)同時(shí)抑制5-HT合成及阻斷_HT2A，2B受體時(shí)，則對(duì)DEX或OA導(dǎo)致的肝細(xì)胞IR的改善效應(yīng)有協(xié)同作用。
[0074]實(shí)施例2
[0075]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究一DEX導(dǎo)致的大鼠IR及糖尿病模型
[0076]比較SAR與pCPA、⑶P、BSA聯(lián)合給藥，及各自單獨(dú)給藥對(duì)DEX致大鼠IR及糖尿病模型的治療作用，從而驗(yàn)證SAR與pCPA、CDP、BSA聯(lián)合給藥對(duì)IR及糖尿病治療的協(xié)同效應(yīng)。
[0077]2.1實(shí)驗(yàn)方法
[0078](I)動(dòng) 物處理
[0079]108只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為18組(每組6只):對(duì)照組，IR模型組，IR模型SAR治療組，IR模型SAR+pCPA復(fù)方治療組(SAR:pCPA按不同重量配比的4種復(fù)方)，IR模型pCPA治療組，IR模型SAR+⑶P復(fù)方治療組(SARfDP按不同重量配比的4種復(fù)方)，IR模型⑶P治療組，IR模型SAR+BSA復(fù)方治療組(SAR:BSA按不同重量配比的4種復(fù)方)，IR模型BSA治療組。動(dòng)物籠養(yǎng)于普通鼠籠，保持室溫24±2°C、光照控制保證12h明、暗條件，普通水喂養(yǎng),連續(xù)給藥15天。
[0080]實(shí)驗(yàn)中，SAR+pCPA復(fù)方按不同重量配比的四種復(fù)方為:
[0081]SAR+pCPA-1—SAR:pCPA = 12:1 ； SAR+pCPA-2— SAR:pCPA = 4:1;
[0082]SAR+pCPA-3— SAR: pCPA =1:1; SAR+pCPA-4— SAR: pCPA =1:2。
[0083]實(shí)驗(yàn)中，SAR+⑶P復(fù)方按不同重量配比的四種復(fù)方為:
[0084]SAR+CDP-1—SAR:CDP = 9:1; SAR+CDP-2 — SAR: CDP = 3:1;
[0085]SAR+CDP-3 — SAR: CDP = 1:1 ; SAR+CDP-4— SAR: CDP = 1:2。
[0086]實(shí)驗(yàn)中，SAR+BSA復(fù)方按不同重量配比的四種復(fù)方為:
[0087]SAR+BSA-1—SAR:BSA = 8:1; SAR+BSA-2—SAR:BSA = 2:1;
[0088]SAR+BSA-3— SAR: BSA = 1:1 ; SAR+BSA-4— SAR: BSA = 1:3。
[0089](2)給藥劑量
[0090]對(duì)照組一皮下注射(s.c.)生理鹽水0.50ml/kg/次，并經(jīng)口給藥(p.0.)0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液5.0ml/kg/次；
[0091]IR 模型組一s.c.DEX0.75mg/kg/ 次，并同時(shí) p.0.CMC_Na5.0ml/kg/ 次；
[0092]IR模型藥物治療組一s.c.DEX0.75mg/kg/次，并同時(shí)ρ.ο.各組藥物，所有給藥組給藥劑量均相同為:20.0mg/kg/次。
[0093]各藥物用0.5 % CMC-Na混懸，濃度相同均為:4.0mg/ml ；DEX s.c.給藥容積為
0.50ml/kg/次,各組藥物p.ο.給藥容積為5.0ml/kg/次；每天給藥兩次,上下午各給藥一次。
[0094](3) HOMA-1R 指數(shù)計(jì)算
[0095]連續(xù)給藥第15天，各組動(dòng)物首先禁食(不禁水)12小時(shí)，然后取血，測(cè)空腹血糖、空腹胰島素濃度，計(jì)算HOMA-1R指數(shù)(H0MA-1R =空腹血糖X空腹胰島素+22.5)。
[0096](4)尿糖含量檢測(cè)
[0097]連續(xù)給藥第15天，最后一次給藥前禁食約7小時(shí)，然后各組按要求分別給以DEX及相應(yīng)藥物，給藥后迅速將動(dòng)物放入代謝籠中，自由飲水，收集給藥后5小時(shí)內(nèi)尿量，測(cè)量尿液中葡萄糖濃度，計(jì)算5小時(shí)內(nèi)尿液中葡萄糖含量。
[0098]連續(xù)給藥15天后動(dòng)物禁食12小時(shí)，麻醉，取血、取肝臟、取內(nèi)臟脂肪組織及取大腿部骨骼肌，以檢測(cè)血清及組織相關(guān)生化指標(biāo)。
[0099]2.2實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)方法
[0100](I)血清及組織生化指標(biāo)檢測(cè)
[0101]ELISA法檢測(cè)血清、肝臟、脂肪組織5-HT水平，ELISA法檢測(cè)血清胰島素濃度，分光光度法檢測(cè)血糖濃度、尿糖含量。
[0102] (2) GLUT2、GLUT4、5-HT2A, 2B 受體基因表達(dá)檢測(cè)
[0103]肝臟、脂肪組織及骨骼肌相關(guān)因子基因表達(dá):逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測(cè)GLUT2、GLUT4基因(mRNA)表達(dá)。其中，GLUT2存在于肝細(xì)胞，GLUT4存在于脂肪細(xì)胞及骨骼肌。5_HT2AR、
5-HT2BR、GLUT2、內(nèi)參GAPDH引物物同細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，GLUT4引物如下:
[0104]GLUT4 上游引物 5’ TCCAGGATGAAGGAAACAGC3’
[0105]下游引物5’ GCGAGGCAAGGCTAGAITTT3’。
[0106](3) TPHl、AADC蛋白表達(dá)檢測(cè)
[0107]肝臟、脂肪組織及骨骼肌TPHl、AADC蛋白表達(dá)檢測(cè)=Western blot法。采用細(xì)胞膜蛋白抽提試劑盒提取細(xì)胞膜蛋白，通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)不同分子量大小的蛋白進(jìn)行分離后，電轉(zhuǎn)將所需分子量的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后對(duì)膜進(jìn)行封閉2小時(shí)。取出PVDF膜，分別用TPH1、AADC、ATP1A1蛋白抗體(一抗)孵育PVDF膜，于4°C過(guò)夜；再用對(duì)應(yīng)的辣根酶標(biāo)記二抗對(duì)PVDF膜進(jìn)行孵育2小時(shí)。加入化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)后，將PVDF膜放入Tanon5200成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影檢測(cè)。
[0108]2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0109]所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)用組間Student-t檢測(cè)，p〈0.05表示有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p〈0.01表示有非常明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。下列所有圖中數(shù)據(jù)用均值土標(biāo)準(zhǔn)差(歹士 Sm表示，N = 6 ;*ρ〈0.05，**ρ〈0.01 與對(duì)照組比較；$ρ<0.05，$$ρ〈0.01 與 DEX 模型組比較;#ρ<0.05，##ρ<0.01聯(lián)合用藥與SAR單用藥比較；&ρ〈0.05，&&p〈0.01聯(lián)合用藥與pCPC或CDP或BSA單用藥比較。
[0110](I) DEX致大鼠IR模型中，肝臟、內(nèi)臟脂肪及骨骼肌5-HT合成系統(tǒng)一TPHl ,AADC蛋白表達(dá)的改變
[0111]結(jié)果見(jiàn)圖4?？梢?jiàn)，正常大鼠肝臟、內(nèi)臟脂肪存在TPHUAADC蛋白表達(dá)，但骨骼肌未見(jiàn)表達(dá)；在DEX導(dǎo)致大鼠IR及糖尿病時(shí)，肝臟及脂肪組織兩種酶的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。相應(yīng)地檢測(cè)到兩種組織中5-HT含量明顯升高，用pCPA或CDP或BSA抑制5-HT合成后5-HT含量明顯降低。
[0112](2) DEX致大鼠IR模型中，肝臟、內(nèi)臟脂肪及骨骼肌5_HT2A，2BR基因表達(dá)的改變
[0113]結(jié)果見(jiàn)圖5。正常大鼠肝臟、內(nèi)臟脂肪及骨骼肌存在5_HT2A，2BR基因表達(dá)；在DEX導(dǎo)致大鼠IR時(shí)，三種組織5-HT2A，2BR基因表達(dá)明顯上調(diào)。
[0114](3)抑制5-HT合成或阻斷5-HT2A，2BR,對(duì)DEX致大鼠IR模型肝臟、內(nèi)臟脂肪及骨骼肌GLUT基因表達(dá)的影響
[0115]結(jié)果見(jiàn)圖6。在DEX致大鼠IR模型中，肝臟GLUT2，內(nèi)臟脂肪及骨骼肌GLUT4基因表達(dá)明顯下調(diào)；用SAR、pCPA、CDP、BSA治療明顯上調(diào)GLUT2、GLUT4。
[0116](4) SAR+pCPA復(fù)方對(duì)DEX導(dǎo)致的IR的治療作用研究結(jié)果
[0117]結(jié)果見(jiàn)表1。DEX致IR模型中，動(dòng)物空腹血糖濃度、空腹血胰島素濃度均明顯升高，HOMA-1R指數(shù)明顯升高，且收集5小時(shí)內(nèi)排出的尿液可檢測(cè)到大量葡萄糖含量，提示出現(xiàn)嚴(yán)重的IR及糖尿病癥狀。用相同給藥劑量的SAR，pCPA，SAR+pCPA四種復(fù)方:SAR+pCPA_l、SAR+pCPA-2、SAR+pCPA-3、SAR+pCPA-4對(duì)DEX導(dǎo)致的IR進(jìn)行治療，均能明顯降低血糖濃度、血胰島素濃度及HOMA-1R指數(shù)，并且明顯減少5小時(shí)內(nèi)排出的尿糖量；復(fù)方SAR+pCPA-2、SAR+pCPA-3治療均顯示其降血糖、降血胰島素、減小HOMA-1R指數(shù)及減少尿糖量作用明顯好于SAR或pCPA單獨(dú)治療，提示產(chǎn)生明顯的協(xié)同效應(yīng)；復(fù)方SAR+pCPA-Ι治療的降血糖、降血胰島素、減小HOMA-1R指數(shù)及減少尿糖量作用明顯好于pCPA治療，與SAR治療比較雖然沒(méi)有差異但也有更好的療效趨勢(shì)；復(fù)方SAR+pCPA-4治療的降血胰島素及減少尿糖量作用明顯好于PCPA治療，降血糖、減小HOMA-1R指數(shù)作用也顯示出比pCPA治療有更好的療效趨勢(shì)，且其療效與SAR治療相當(dāng)。結(jié)果提示，SAR與pCPA組成一定比例的復(fù)方，對(duì)治療IR有明顯的協(xié)同作用，按重量配比，SAR:pCPA的比例范圍為:12:1~1:2，本實(shí)驗(yàn)中以4:1復(fù)方(SAR+pCPA-2)療效最好。
[0118]表1大鼠連續(xù)給DEX15天后，以及用SAR、SAR+pCPA四種復(fù)方、pCPA治療后，空腹血糖濃度、空腹胰島素濃度、HOMA-1R指數(shù)及5小時(shí)內(nèi)尿糖量檢測(cè)結(jié)果
[0119]
【權(quán)利要求】
1.一種復(fù)方藥物組合物，含有藥物活性成分和藥學(xué)上可接受的載體，其中藥物活性成分由沙格雷酯和5-羥色胺合成抑制劑組成。
2.權(quán)利要求1的復(fù)方藥物組合物，其中5-羥色胺合成抑制劑為對(duì)氯苯丙氨酸、卡比多巴或芐絲肼。
3.權(quán)利要求1的復(fù)方藥物組合物，其中沙格雷酯和5-羥色胺合成抑制劑的重量比為15:1 ~1:15。
4.權(quán)利要求2的復(fù)方藥物組合物，其中沙格雷酯和對(duì)氯苯丙氨酸的重量比為12:1~1:2。
5.權(quán)利要求4的復(fù)方藥物組合物，其中沙格雷酯和對(duì)氯苯丙氨酸的重量比為4:1。
6.權(quán)利要求2的復(fù)方藥物組合物，其中沙格雷酯和卡比多巴的重量比為9:1~1:2。
7.權(quán)利要求6的復(fù)方藥物組合物，其中沙格雷酯和卡比多巴的重量比為3:1。
8.權(quán)利要求2的復(fù)方藥物組合物，其中沙格雷酯和芐絲肼的重量比為8:1~1:3。
9.權(quán)利要求8的復(fù)方藥物組合物，其中沙格雷酯和芐絲肼的重量比為2:1。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的復(fù)方藥物組合物用于制備治療II型糖尿病或代謝綜合征的藥物的用途。
【文檔編號(hào)】A61K31/225GK104001177SQ201410271356
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月17日
【發(fā)明者】傅繼華, 李濤, 郭可可, 曲偉, 李鑫, 安閃閃, 馬少欣 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)