Smc的應(yīng)用及用于防治阿爾茨海默病的藥物和保健品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開SMC的應(yīng)用及用于防治阿爾茨海默病的藥物和保健品，其中，將SMC用于制備防治阿爾茨海默病的藥物或保健品。SMC是一個(gè)具有很好的抗氧化、抗炎癥、抗惡性細(xì)胞增殖的作用的化合物，同時(shí)具有低毒性，結(jié)構(gòu)明確，含量穩(wěn)定、人體內(nèi)代謝機(jī)理清晰等優(yōu)點(diǎn)。因此，SMC能用于開發(fā)一種新型治療和預(yù)防AD的藥物或保健品。
【專利說明】SMC的應(yīng)用及用于防治阿爾茨海默病的藥物和保健品
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)療保健領(lǐng)域，尤其涉及一種SMC的應(yīng)用及用于防治阿爾茨海默病的藥物和保健品。
【背景技術(shù)】
[0002]阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease, AD)是一組病因尚未明確的原發(fā)性退行性腦變性疾病。目前全球已經(jīng)有超過3500萬的AD患者。隨著社會(huì)人口老齡化逐步加劇，AD發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，65歲人群中發(fā)病率大約為10%，而85歲人群中這一比例可高達(dá)50%。中國這方面情況更為嚴(yán)重，目前60歲以上的人口已達(dá)1.78億，預(yù)測(cè)到2050年將達(dá)到
4.37億，屆時(shí)AD將成為老年人的第一殺手。由于AD的致殘率較高，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重危害。同時(shí)，對(duì)AD的醫(yī)療和照料還耗費(fèi)了大量人力和財(cái)力，因此AD已成為除心腦血管病、糖尿病、癌癥外嚴(yán)重影響人類健康的第4號(hào)殺手，成為一個(gè)棘手的社會(huì)和醫(yī)療衛(wèi)生問題。AD的病理特征主要包括兩方面:一是神經(jīng)細(xì)胞外以淀粉樣蛋白(Αβ)沉積為核心形成老年斑(senile plaques, SP), SP 是 A β 前體(amyloid precursor protein, APP)異常降解形成的不溶解性Αβ 42斑塊，對(duì)神經(jīng)元有毒性作用；另一方面則是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié) (NFT)。AD的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜，可能是多種因素相互作用的結(jié)果，迄今為止其確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。
[0003]近年來對(duì)AD的治療研究已取得一定的進(jìn)展，研發(fā)出不少新的藥物，歸納目前臨床上常用的藥物主要有以下幾類:影響膽堿系統(tǒng)功能藥物(包括膽堿酯酶抑制劑、Ach受體激動(dòng)劑)；腦血循環(huán)改善劑；腦代謝激活劑；糾正鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、抗氧化、抗炎藥物；神經(jīng)營養(yǎng)因子等。這些藥物多存在療效不確切或毒副作用大、口服吸收差的缺點(diǎn)，并且它們均是依據(jù)相應(yīng)發(fā)病機(jī)理假說而進(jìn)行的嘗試，都是一些“治標(biāo)”的方法，不能有效防止AD的迅速發(fā)展。正處于臨床研究中的具有防治AD作用的降脂藥、激素類物質(zhì)則由于特異性不強(qiáng)或不易透過血腦屏障而預(yù)測(cè)不到良好的應(yīng)用前景。
[0004]硒作為一種微量元素，其抗癌作用已被廣泛研究。硒在自然界以有機(jī)硒和無機(jī)硒兩種形式存在。實(shí)驗(yàn)證明，無機(jī)硒化合物具有蓄積性毒性和致突變作用，而有機(jī)硒化合物因?yàn)槠浣?jīng)過甲基化等脫毒過程，不但能夠更好地發(fā)揮硒的抗癌作用，而且在激發(fā)免疫反應(yīng)上也比無機(jī)硒顯著。L-硒-甲基硒代半胱氨酸(L-Se-methylselenocysteine, SMC)屬于天然有機(jī)硒化物，廣泛存在于多種食物中，能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡，并能抑制多種癌基因的表達(dá)，因而是一較好的腫瘤化學(xué)預(yù)防劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種SMC的應(yīng)用及用于防治阿爾茨海默病的藥物和保健品，旨在提供一種新的防治阿爾茨海默病的藥物和保健品。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
SMC的應(yīng)用，其中，將SMC用于制備防治阿爾茨海默病的藥物或保健品。[0007]—種用于防治阿爾茨海默病的藥物，其中，所述用于防治阿爾茨海默病的藥物的組成成分包括SMC。
[0008]所述的用于防治阿爾茨海默病的藥物，其中，所述用于防治阿爾茨海默病的藥物將SMC和藥學(xué)上可接受的載體制成片劑、注射劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、微丸、散劑、滴丸劑、湯劑、糖漿劑、合劑、煎膏劑或浸膏劑劑型的藥物。
[0009]一種用于防治阿爾茨海默病的保健品，其中，所述用于防治阿爾茨海默病的保健品的組成成分包括SMC。
[0010]有益效果:本發(fā)明所提供一種SMC的應(yīng)用及用于防治阿爾茨海默病的藥物和保健品，在本發(fā)明中，將SMC用于防治AD疾病的開發(fā)與研究，并在原代神經(jīng)細(xì)胞和AD模型鼠兩個(gè)水平上驗(yàn)證了 SMC對(duì)AD的預(yù)防和治療效果。因此，本發(fā)明中提供一種SMC的新應(yīng)用，將SMC用于制備防治阿爾茨海默病的藥物或保健品。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中以CCK-8法檢測(cè)SMC對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活力的影響的結(jié)果。
[0012]圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中SMC抑制神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)水平的結(jié)果。
[0013]圖3是本發(fā)明實(shí)施例3中SMC促進(jìn)原代神經(jīng)細(xì)胞生長的結(jié)果。
[0014]圖4是本發(fā)明實(shí)施例3中SMC促進(jìn)原代神經(jīng)細(xì)胞突觸后蛋白的表達(dá)水平的結(jié)果。 [0015]圖5是本發(fā)明實(shí)施例3中SMC促進(jìn)原代神經(jīng)細(xì)胞突觸前蛋白的表達(dá)水平的結(jié)果。
[0016]圖6是本發(fā)明實(shí)施例3中SMC抑制原代神經(jīng)細(xì)胞tau蛋白磷酸化(PS404)水平的結(jié)果。
[0017]圖7是本發(fā)明實(shí)施例4中SMC抑制原代神經(jīng)細(xì)胞tau蛋白磷酸化(PS396)水平的免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0018]圖8是本發(fā)明實(shí)施例4中SMC抑制原代神經(jīng)細(xì)胞tau蛋白磷酸化(PS396)水平的
定量結(jié)果。
[0019]圖9是本發(fā)明實(shí)施例4中SMC抑制原代神經(jīng)細(xì)胞APP蛋白水平的免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)
果O
[0020]圖10是本發(fā)明實(shí)施例4中SMC抑制原代神經(jīng)細(xì)胞APP蛋白水平的定量結(jié)果。
[0021]圖11是本發(fā)明實(shí)施例5中SMC提高AD模型小鼠的空間探索和記憶能力的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0022]本發(fā)明提供一種SMC的應(yīng)用及用于防治阿爾茨海默病的藥物和保健品，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0023]AD作為公認(rèn)的發(fā)病率及危害性最高的老年性疾病之一，目前尚無有效的治療藥物。L-硒-甲基硒代半胱氨酸(L-Se-methylselenocysteine, SMC)是一種新型硒源類的食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑，與無機(jī)硒相比具有更低的生物毒性，而與其它有機(jī)硒相比，具有結(jié)構(gòu)明確，含量穩(wěn)定、人體內(nèi)代謝機(jī)理清晰等優(yōu)點(diǎn)。富硒酵母、硒化卡拉膠、硒蛋白、富硒食用菌粉等產(chǎn)品中硒的含量不是固定的，因?yàn)槲挠行аa(bǔ)充劑量與中毒計(jì)量比較接近，所以富硒酵母、硒化卡拉膠、硒蛋白、富硒食用菌粉的食用安全性存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。SMC與硒代蛋氨酸是自然界僅有的兩種含硒氨基酸，與硒代蛋氨酸相比，SMC具有較高的食用安全性。SMC在過去一直作為抗癌藥物作為研究以及開發(fā)。
[0024]而本發(fā)明中，則將SMC用于防治AD疾病的開發(fā)與研究。在原代神經(jīng)細(xì)胞和AD模型鼠兩個(gè)水平上驗(yàn)證了 SMC對(duì)AD的預(yù)防和治療效果。發(fā)現(xiàn):(I) SMC促進(jìn)原代神經(jīng)細(xì)胞生長，并降低細(xì)胞內(nèi)的氧化壓力；(2)SMC提高突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)水平；(3)SMC抑制tau蛋白的磷酸化；(4) SMC降低APP的蛋白水平；(5) SMC提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。因此，SMC可在多靶點(diǎn)抑制AD的發(fā)生，發(fā)展，有望成為一種穩(wěn)定、安全、有效的AD治療藥物。因此，本發(fā)明中提供一種SMC的新應(yīng)用，將SMC用于制備防治阿爾茨海默病的藥物或保健品。
[0025]本發(fā)明中還提供一種用于防治阿爾茨海默病的藥物，所述用于防治阿爾茨海默病的藥物的組成成分包括硒甲基硒代半胱氨酸。所述用于防治阿爾茨海默病的藥物可以將硒甲基硒代半胱氨酸和藥學(xué)上可接受的載體制成片劑、注射劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、微丸、散劑、滴丸劑、湯劑、糖漿劑、合劑、煎膏劑或浸膏劑劑型的藥物。
[0026]本發(fā)明中還提供一種用于防治阿爾茨海默病的保健品，所述用于防治阿爾茨海默病的保健品的組成成分包括硒甲基硒代半胱氨酸。
[0027]以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0028]實(shí)施例1:以CCK-8法(細(xì)胞活性與增殖檢測(cè)試劑盒)檢測(cè)SMC對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活力的影響
CCK-8試劑中含水溶性四唑鹽-WST-8，它在電子載體1-Methoxy PMS存在的情況下能夠被還原成水溶性的甲臜染料，該物質(zhì)生成量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深，細(xì)胞毒 性越大，則顏色越淺。因此可直接用于細(xì)胞增殖和毒性分析，具體步驟如下:
(1)取對(duì)數(shù)生長期N2A細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5X IOVmL,按每孔100UL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h ；
(2)棄去舊的培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)基重復(fù)洗三次，再分別加入200UL含有各藥物濃度梯度的無血清DMEM培養(yǎng)基，使SMC終濃度分別為O μ mol/L、l μ mol/L、3 μ mol/L、5 μ mol/L、7 μ mol/L、10 μ mol/L，每組3個(gè)復(fù)孔。不含PBS無血清DMEM培養(yǎng)基作為對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h ；
(3)每孔加20μ L的CCK-8試劑，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-4 h (分別在0.5、1、2、4 h檢測(cè))后，用酶標(biāo)儀于波長為450 nm及650 nm測(cè)定各孔吸光度值(OD)；
(4)細(xì)胞活力定義:以450nm的光吸收值/650 nm的光吸收值，作為細(xì)胞活力。
[0029]檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，檢測(cè)范圍內(nèi)的各濃度SMC對(duì)細(xì)胞的存活率均有一定的促進(jìn)作用，其中以3 μ mol/L的作用效果最好。說明SMC對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長具有一定的促進(jìn)作用。
[0030]實(shí)施例2:以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)SMC對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)水平的影響 活性氧檢測(cè)試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一種利用突光探針
DCFH-DA來進(jìn)行活性氧的檢測(cè)的試劑盒。DCFH-DA探針本身是不能發(fā)熒光的，但是可以自由穿過細(xì)胞膜。而細(xì)胞內(nèi)的酯酶能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)DCFH-DA探針?biāo)馍蒁CFH。產(chǎn)生的DCFH不能自由透過細(xì)胞膜，因此該探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。而在細(xì)胞內(nèi)，ROS可以將無熒光的DCFH氧化生成有熒光的DCF。因此可以通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。具體操作步驟如下:
(1)取對(duì)數(shù) 生長期的N2a細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2.5 X 105/mL,按每孔2 mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ;
(2)棄去舊的培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)基重復(fù)洗三次，再分別加入2mL含有各藥物濃度梯度的無血清DMEM培養(yǎng)基，使SMC終濃度分別為O μ mol/L、I μ mol/L,3 μ mol/L,5 μ mol/L、7 μ mol/L、10 μ mol/L每組3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h ；
(3)用無血清DMEM培養(yǎng)基按照1:1000比例稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10μ m/L。去除培養(yǎng)皿里的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入2 mL稀釋好的DCFH-DA。然后在37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育20 min,再用無血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA ；
(4)胰酶消化后收集細(xì)胞，1000rpm，4°C離心3 min，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗滌3次。用PBS重懸細(xì)胞，400目細(xì)胞篩過濾，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長。
[0031]檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，以檢測(cè)范圍內(nèi)的各濃度SMC處理N2a細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平均明顯降低，說明SMC具有顯著抑制神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的作用。
[0032]實(shí)施例3:以免疫熒光檢測(cè)SMC對(duì)原代神經(jīng)細(xì)胞各AD相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響
a、原代細(xì)胞培養(yǎng)
本發(fā)明中所用的原代神經(jīng)細(xì)胞取自3XTg AD模型小鼠，該小鼠轉(zhuǎn)入APPswe、PSlM146V和TauP301L三種AD相關(guān)基因，表現(xiàn)出典型的AD病理特征。
[0033]從出生一天的3XTg AD胎鼠大腦中分別獲取上皮層組織，經(jīng)過木瓜酶消化吹打后得到原代神經(jīng)細(xì)胞，培養(yǎng)在放有細(xì)胞爬片的24孔板中。細(xì)胞培養(yǎng)到第七天后以終濃度為3μΜ的SMC處理24小時(shí)后進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。以相同培養(yǎng)條件下無SMC處理的原代神經(jīng)細(xì)胞作為對(duì)照組。
[0034]實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作:制備4%PFA、0.2%Triton、10%山羊血清封閉液、DAP1、封片劑(甘油/PBS)、指甲油、Timer，PBS預(yù)冷，準(zhǔn)備冰盒與冰袋。具體操作步驟如下:
(1)提前半小時(shí)將4%PFA解凍，60°C水浴溶解；
(2)加4%PFA固定15min，每孔1ml，冰上進(jìn)行；
(3)預(yù)冷PBS洗3次,每孔lml，分別洗5min、10 min、15 min,冰上進(jìn)行；
(4)0.2%Triton 透膜 lOmin，每孔 500 μ 1，冰上進(jìn)行；
(5)封閉液封閉Ih以上，每孔300μ 1，置于4°C冰箱/冰上；
(6)加一抗4°C過夜，母液300μ I封閉液；
(7)一抗回收，PBS洗3次，每孔I ml，每次5min，冰上進(jìn)行；
(8)加二抗1:200，母液300 μ I封閉液，常溫下避光放置Ih以上；
(9)回收二抗，？83洗3次，分別洗511^11、101^11、151^11，在冰上避光進(jìn)行；
(10)5μ g/mlDAPI染色2min (1:500)，每孔500 μ 1，在冰上避光進(jìn)行；
(11)PBS洗3次，分別洗5min、IOmin、15min,在冰上避光進(jìn)行；
(12)甘油/PBS封片，指甲油固定；
(13)避光4°C保存，待拍片；
(14)最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。
[0035]b.SMC對(duì)原代神經(jīng)細(xì)胞生長狀況的影響以DAPI (4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)染細(xì)胞核，以抗MAP-2抗體染神經(jīng)細(xì)胞骨架，結(jié)果如圖3所示，該圖為紅色通道的顯微鏡下觀察的黑白示意圖，其只顯示MAP-2，而在顯微鏡下觀察的細(xì)胞為紅色，從圖3可以看出，原代神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)SMC處理后，細(xì)胞絲更多更長，表明SMC促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞的生長和神經(jīng)絲的發(fā)育。
[0036]c.SMC提高原代神經(jīng)細(xì)胞突觸蛋白的表達(dá)水平
突觸功能障礙及缺失是AD的重要神經(jīng)病理改變之一，是與認(rèn)知能力下降關(guān)系最為密切的病理變化。突觸前膜囊泡蛋白突觸素(synapsin)和突觸后膜蛋白PSD-95是突觸的代表性蛋白。突觸蛋白在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及參與神經(jīng)元早期發(fā)育等方面起著重要的作用。在AD中，突觸蛋白表達(dá)水平降低，突觸傳遞和突觸可塑性受損。免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，以SMC處理后，細(xì)胞的突觸后膜蛋白PSD-95 (如圖4，其為綠色通道的顯微鏡下觀察的黑白示意圖，只顯示PSD-95，而在顯微鏡下觀察的細(xì)胞為綠色)和突觸素(如圖5所示，該圖為綠色通道的顯微鏡觀察的黑白示意圖，只顯示突觸素，而在顯微鏡下觀察的細(xì)胞為綠色)表達(dá)水平均明顯升高，表明SMC可抑制突觸損傷，提高神經(jīng)突觸地可塑性。
[0037]d.SMC抑制原代神經(jīng)細(xì)胞tau蛋白磷酸化(PS404)水平
微管結(jié)合蛋白tau的結(jié)構(gòu)功能異常是誘發(fā)阿爾茨海默癥的一個(gè)重要因素。微管系統(tǒng)是神經(jīng)細(xì)胞骨架的主要成分，在維持細(xì)胞功能上起了重要作用，微管由α、β微管蛋白和微管相關(guān)蛋白組成。tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，可與微管相結(jié)合并保持微管的穩(wěn)定性。AD病例狀態(tài)下，tau過度磷酸化，并與其它的tau蛋白纖維配對(duì)結(jié)合。這種過度結(jié)合最終會(huì)在神經(jīng)細(xì)胞胞體內(nèi)形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞微管骨架系統(tǒng)瓦解。這不但會(huì)影響神經(jīng)細(xì)胞間正常的信號(hào)傳導(dǎo)，最終必然還會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞的死亡。關(guān)于AD病理狀態(tài)下，微管結(jié)合蛋白tau的細(xì)胞毒性的機(jī)理，目前主要有兩種觀點(diǎn)。一種認(rèn)為是由于過度磷酸化的tau與微管骨架分離從而 失去其生理功能；另一種認(rèn)為過度磷酸化tau組成的神經(jīng)纖維纏結(jié)會(huì)破壞正常tau蛋白的生理功能，并直接成為胞漿運(yùn)輸?shù)恼系K。因此抑制tau蛋白的過度磷酸化，是抑制AD發(fā)展的一個(gè)重要策略。
[0038]從圖6 (該圖為綠色通道的顯微鏡下觀察的黑白示意圖，只顯示PS404，而在顯微鏡下觀察的細(xì)胞為綠色)中可以看出，SMC處理后，原代神經(jīng)細(xì)胞tau蛋白在其Ser404位點(diǎn)的磷酸化水平顯著降低，表明SMC可抑制tau蛋白在該位點(diǎn)的過度磷酸化，抑制神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成，維護(hù)神經(jīng)細(xì)胞微管骨架的穩(wěn)定性，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。
[0039]實(shí)施例4:以免疫印跡(western blot)檢測(cè)SMC對(duì)原代神經(jīng)細(xì)胞各AD相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響
蛋白質(zhì)印跡法即Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測(cè)三個(gè)部分組成。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測(cè)樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纖維素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移，它又有半干法和濕法之分，現(xiàn)在大多用濕法。第二步是用特異性的抗體檢測(cè)出已經(jīng)印跡在膜上的所要研究的相應(yīng)抗原。免疫檢測(cè)的方法可以是直接的和間接的?，F(xiàn)在多用間接免疫酶標(biāo)的方法，在用特異性的第一抗體雜交結(jié)合后，再用酶標(biāo)的第二抗體(堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗第一抗的抗體)雜交結(jié)合，再加酶的底物顯示或者通過膜上的顏色或X光底片上暴光的條帶來顯示抗原的存在。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)中。具體步驟如下:
1、組織蛋白樣品的制備:
I)以濃度為3 μ M的SMC處理24小時(shí)后的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，以無SMC處理的細(xì)胞為對(duì)照
組；
2)提蛋白，按一定比例加入RIPA裂解液，并加入蛋白酶及磷酸酶抑制劑；
3)超聲破碎細(xì)胞，按照超聲IS停1S，超聲2min；
4)4°C、12000rpm離心lh，取上清蛋白，分裝其余樣品凍存置_80°C冰箱；
5)在蛋白中加入適量蛋白4Xloading buffer,沸水煮5min使蛋白變性。樣品制好后，保存于_20°C備用。
[0040]2、蛋白定量:
1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:取一塊酶標(biāo)板，按下表加入試劑 表2-5:蛋白的濃度梯度
【權(quán)利要求】
1.SMC的應(yīng)用，其特征在于，將SMC用于制備防治阿爾茨海默病的藥物或保健品。
2.一種用于防治阿爾茨海默病的藥物，其特征在于，所述用于防治阿爾茨海默病的藥物的組成成分包括SMC。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于防治阿爾茨海默病的藥物，其特征在于，所述用于防治阿爾茨海默病 的藥物將SMC和藥學(xué)上可接受的載體制成片劑、注射劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、微丸、散劑、滴丸劑、湯劑、糖漿劑、合劑、煎膏劑或浸膏劑劑型的藥物。
4.一種用于防治阿爾茨海默病的保健品，其特征在于，所述用于防治阿爾茨海默病的保健品的組成成分包括SMC。
【文檔編號(hào)】A61P25/28GK103976991SQ201410207086
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】都秀波, 鄭友標(biāo), 劉瓊 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)