一種滅活鰻弧菌疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種滅活鰻弧菌疫苗的制備方法。本發(fā)明首次揭示了包含滅活的鰻弧菌和殼寡糖的新型疫苗，其具有良好的免疫效果，且能達(dá)到持久有效的免疫保護(hù)效果，制備成本低廉，免疫方法簡(jiǎn)單易于實(shí)際操作。
【專利說(shuō)明】一種滅活鰻弧菌疫苗的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，本發(fā)明涉及一種滅活鰻弧菌的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，高密度養(yǎng)殖司空見(jiàn)慣，養(yǎng)殖病害的 大規(guī)模爆發(fā)在所難免。魚類傳染性疾病每年造成的損失占產(chǎn)量的20%以上，大規(guī)模爆發(fā)的 疾病已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)主要的障礙。
[0003] 造成魚類傳染性疾病的主要原因包括細(xì)菌、寄生蟲以及病毒?；【。╲ibriosis) 是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病?；【〉闹饕虏【皇泅牷【╒. anguillarum)， 它可以引起多種魚類出血性敗血癥，同時(shí)會(huì)感染甲殼類和雙殼類動(dòng)物。弧菌病具有流行廣 泛、發(fā)病率以及死亡率超高等特點(diǎn)，給海水養(yǎng)殖魚類帶來(lái)極大威脅。
[0004] 目前在海水養(yǎng)殖生產(chǎn)中一般都是通過(guò)化學(xué)合成的藥物或者抗生素來(lái)控制該病的 大規(guī)模爆發(fā)，但長(zhǎng)期的用藥出現(xiàn)很多弊端：1)魚類疾病有時(shí)病因復(fù)雜，大量用藥存在盲目 性，很多疾病目前沒(méi)有針對(duì)性的藥物可以治療；2)化學(xué)藥物預(yù)防作用很弱，生病的魚攝食 很差，無(wú)法攝取到有效的藥物劑量；3)魚體攝取的藥物往往會(huì)殘留其中，危害人類健康，且 長(zhǎng)期用藥會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染，并導(dǎo)致大量微生物抗藥性的出現(xiàn)。
[0005] 此外，在長(zhǎng)期藥物的維持下，大量本該淘汰的抗病能力弱的個(gè)體存活下來(lái)不僅影 響魚肉的品質(zhì)，而且會(huì)使整個(gè)群體抗病能力下降，嚴(yán)重影響海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。
[0006] 因此，應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)開(kāi)發(fā)魚用疫苗預(yù)防魚類細(xì)菌性疾病已成為世界各國(guó)研究者 關(guān)注的重要內(nèi)容。目前弧菌病的防治主要依靠弧菌疫苗，其中滅活鰻弧菌疫苗、鰻弧菌減毒 活疫苗以及抗鰻弧菌多價(jià)疫苗研究較多，免疫效果參差不齊。并且，還存在一定的毒副作 用，例如有些疫苗佐劑發(fā)現(xiàn)會(huì)殘留在魚體內(nèi)（如內(nèi)臟中），威脅了人們食用的安全性。
[0007] 綜上，本領(lǐng)域迫切需要研究和開(kāi)發(fā)新型的效果良好的免疫疫苗，使得養(yǎng)殖魚類具 備良好的對(duì)抗鰻弧菌的免疫能力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種滅活鰻弧菌的制備方法。
[0009] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種用于魚類免疫的疫苗，該疫苗包括：滅活的鰻弧菌 和殼寡糖；所述滅活的鰻弧菌的終濃度為5X 106?3X 108cfu/ml ;所述殼寡糖的終濃度為 0. 05_50mg/mL。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述疫苗中，所述滅活的鰻弧菌的終濃度為1X107? 1. 5X108cfu/ml ;更佳地為 2X107 ?8X107cfu/ml。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述疫苗中，所述殼寡糖的終濃度為〇. 1-lOmg/mL ;更佳地為 0· 5_5mg/mL〇
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的殼寡糖平均分子量在2000左右，脫乙酰度超過(guò)90%。
[0013] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的鰻弧菌的保藏號(hào)為CGMCC8644。
[0014] 在本發(fā)明的另一方面，提供制備所述的疫苗的方法，所述方法包括：將滅活的 鰻弧菌和殼寡糖混合，獲得所述的疫苗；其中，所述滅活的鰻弧菌的終濃度為5X10 6? 3X 108cfu/ml ;所述殼寡糖的終濃度為0. 05-50mg/mL。
[0015] 在一個(gè)優(yōu)選例中，在制備時(shí)，配制所述殼寡糖的終濃度為0. 1-lOmg/mL ;更佳地為 0. 5-5mg/mL ;和/或配制所述滅活的鰻弧菌的終濃度為5X 106?3X 108cfu/ml ;較佳地為 1 X 107 ?1. 5 X 108cfu/ml ;更佳地為 2 X 107 ?8 X 107cfu/ml。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，使用甲醛（較佳地甲醛終濃度不超過(guò)0.5% )將鰻弧菌滅活，用 生理海水稀釋，然后與殼寡糖溶液混合。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的生理海水包括：NaC120g/L ;MgCl2 · 6H204. 8g/L ; MgS04 · 7Η203· 5g/L ;KC10. 7g/L ;NaHC030. llg/L ;CaCl2 · 2Η201· 21g/L。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，鰻弧菌滅活的方法包括：平板培養(yǎng)鰻弧菌，挑取黃色單克隆于 LB20液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)12h ;之后以按照體積1%接種量接種于LB20液體培養(yǎng)基，28°C 培養(yǎng)14h，加入終濃度為0. 5%的甲醛，28°C滅活48h。
[0019] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的疫苗的用途，用于制備預(yù)防魚類致病菌感染的 組合物。
[0020] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的致病菌包括：鰻弧菌，溶藻弧菌，哈氏弧菌。
[0021] 在本發(fā)明的另一方面，提供殼寡糖的用途，用于與鰻弧菌混合制備魚類免疫用的 疫苗。
[0022] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于魚類免疫的藥盒，所述藥盒中包括所述的疫 苗。
[0023] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1、單獨(dú)殼寡糖的免疫增強(qiáng)效果分析。
[0025] 圖2、滅活鰻弧菌以及殼寡糖各免疫組注射免疫斑馬魚1個(gè)月對(duì)野生鰻弧菌的相 對(duì)免疫保護(hù)力。
[0026] 圖3、滅活鰻弧菌以及殼寡糖各免疫組注射免疫大菱鲆4、8和12周對(duì)野生鰻弧菌 的相對(duì)免疫保護(hù)力。
[0027] 圖4、滅活鰻弧菌以及殼寡糖各免疫組注射免疫大菱鲆4、8和12周血清抗體水平 以及交叉免疫分析。
[0028] 圖5、滅活鰻弧菌與佐劑混合免疫3個(gè)月后，免疫組以及對(duì)照組佐劑殘留情況。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究，首次揭示了包含滅活的鰻弧菌和殼寡糖的新型疫苗。 將鰻弧菌和殼寡糖以合理的比例制備成的疫苗，經(jīng)過(guò)針對(duì)多種魚類的試驗(yàn)，證實(shí)其具有良 好的免疫效果，能達(dá)到持久有效的免疫保護(hù)效果，并且在魚體內(nèi)沒(méi)有殘留、易于給藥，制備 成本低廉，免疫方法簡(jiǎn)單易于實(shí)際操作。
[0030] 殼寡糖
[0031] 本發(fā)明人長(zhǎng)期致力于魚類免疫疫苗的研究，在深入研究中發(fā)現(xiàn)，制備疫苗的過(guò)程 中，免疫佐劑的選擇是非常重要的因素。有些免疫佐劑盡管具有促進(jìn)免疫原的免疫原性的 作用，但是其會(huì)發(fā)生一些毒副作用，例如殘留在魚肉中或內(nèi)臟中。有些佐劑因?yàn)閯┬完P(guān)系 (如為油性佐劑），注射給藥困難，不適用于大規(guī)模養(yǎng)殖魚類的給藥。因此，本發(fā)明人進(jìn)行了 大量的篩選研究，最終提供了一種包含滅活的鰻弧菌和殼寡糖的新型疫苗，其中鰻弧菌和 殼寡糖以合理的比例混合。該疫苗在體內(nèi)殘留少，易于給藥且免疫效果良好。
[0032] 殼寡糖又叫殼聚寡糖、低聚殼聚糖，是將殼聚糖經(jīng)降解技術(shù)（例如藉由生物酶技 術(shù)或微波降解技術(shù)）降解得到的一種聚合度在2?20之間寡糖產(chǎn)品。其水溶性較好。
[0033] 現(xiàn)有技術(shù)中，一般將殼寡糖應(yīng)用于食品添加劑、飼料添加劑、日用化工等領(lǐng)域。而 在藥學(xué)或獸藥學(xué)領(lǐng)域中，并沒(méi)有將之作為免疫佐劑的先例。
[0034] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述殼寡糖的平均分子量在2000左右，脫乙酰度超過(guò) 90 %，易溶于水。在制備時(shí)，可將殼寡糖用生理海水配成的溶液用0.22 μ m的濾膜過(guò)濾除 菌，備用。
[0035] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，將殼寡糖與滅活的鰻弧菌混合來(lái)制備的疫苗，免疫效果 特別理想，對(duì)于體液免疫有良好的促進(jìn)效果。
[0036] 鰻弧菌抗原
[0037] 鰻弧菌為本領(lǐng)域已知的造成魚類傳染性疾病的菌。本發(fā)明中，所述的"滅活鰻弧 菌"還包括"減毒鰻弧菌"。
[0038] 可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備滅活的鰻弧菌或減毒的鰻弧菌。作為本發(fā)明的 優(yōu)選方式，使用甲醛（較佳地甲醛終濃度不超過(guò)0.5%)將鰻弧菌滅活，用生理海水稀釋， 然后與殼寡糖溶液混合。更具體地，鰻弧菌滅活的方法包括：平板培養(yǎng)鰻弧菌，挑取黃色單 克隆于LB20液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)12h ;之后以按照體積1%接種量接種于LB20液體培養(yǎng) 基，28°C培養(yǎng)14h，加入終濃度為0. 5%的甲醛，28°C滅活48h。
[0039] 疫苗及其制備
[0040] 本發(fā)明還提供一種組合物，優(yōu)選的是組合物是疫苗，所述的疫苗是指將本發(fā)明的 滅活鰻弧菌和藥學(xué)上可接受的載體混合后獲得的可用于預(yù)防致病菌感染的疫苗。所述的藥 學(xué)上可接受的載體是殼寡糖。所述的疫苗可用于魚類，通?？芍瞥勺⑸鋭┑男问健?br> [0041] 本發(fā)明中，所述的"致病菌"是指感染魚類的一類細(xì)菌。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式， 所述的致病菌包括但不限于：鰻弧菌（V. anguillarum)，溶藻弧菌（V. alginolyticus)，哈 氏弧菌（V. harveyi)。
[0042] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的疫苗可以包括：滅活鰻弧菌和有效量的殼寡糖作 為免疫佐劑。
[0043] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述疫苗中，所述滅活的鰻弧菌的終濃度為5X106? 3X10 8cfu/ml ;較佳地為 1X107 ?1. 5X108cfu/ml ;更佳地為 2X107 ?8X107cfu/ml ;所 述殼寡糖的終濃度為〇· 02-100mg/mL ;較佳地為0· 05-50mg/mL ;更佳地為0· 1-lOmg/mL(進(jìn) 一步更佳地為0. 5-5mg/mL)。上述濃度下具有較好的給藥效果，能夠在魚體內(nèi)產(chǎn)生很高效價(jià) 的抗體。
[0044] 本發(fā)明制備鰻弧菌的方法免疫效果顯著，在斑馬魚以及大菱鲆上均得到證實(shí)，免 疫以后的大菱鲆血清抗體效價(jià)明顯提高，并對(duì)溶藻弧菌和哈氏弧菌具有一定交叉免疫保護(hù) 效果。
[0045] 在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，用滅過(guò)菌的生理海水稀釋至所需注射斑馬魚以及大菱 鲆的濃度備用。在斑馬魚上，將滅活鰻弧菌按照上述方法將終濃度控制在8X 107cfu/ml， 2mg/ml殼寡糖等體積混合，5 μ 1/尾注射斑馬魚，免疫一個(gè)月，免疫保護(hù)效果可以達(dá)到90% 左右；在大菱鲆上，將滅活鰻弧菌按照上述方法將終濃度控制在4 X 108cfu/ml，殼寡糖用生 理海水配成2mg/ml，等體積混合，0. lml/尾注射大菱鲆，三個(gè)月的免疫保護(hù)效果可以達(dá)到 100 %。殼寡糖的加入，血清抗體水平明顯提高，增強(qiáng)了宿主的體液免疫效果。
[0046] 本發(fā)明的疫苗，可以被制備成藥盒或試劑盒的形式，以便于本領(lǐng)域技術(shù)人員使用。 可選地在其中還包括使用說(shuō)明書。
[0047] 本發(fā)明的技術(shù)方案的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0048] (1)應(yīng)用殼寡糖與鰻弧菌以合適的比例混合，可顯著地提高免疫保護(hù)力，魚體內(nèi)可 獲得高效價(jià)的抗體，且能達(dá)到持久有效的免疫保護(hù)效果。
[0049] (2)殼寡糖可以溶解于水性溶劑中，給藥方便，有利于大規(guī)模應(yīng)用。
[0050] (3)殼寡糖易于被魚類吸收代謝，在魚體內(nèi)沒(méi)有殘留。
[0051] (4)本發(fā)明的疫苗制備成本低廉，免疫方法簡(jiǎn)單易于實(shí)際操作。
[0052] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0053] 實(shí)施例1、滅活鰻弧菌的制備
[0054] 首先，滅活鰻弧菌（保藏號(hào)CGMCC8644)的制備方法：從-80°C拿出原始菌液，在 TCBS平板上劃線，24-36h后挑取黃色單克隆于5ml LB20液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)12h，1% (v/ v)接種量接種于50ml LB20液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)14h，加入終濃度為0. 5% (v/v)的甲醛 (實(shí)驗(yàn)室所用甲醛溶液為37?40%，即50ml培養(yǎng)物中加入0. 63ml實(shí)驗(yàn)室所用的甲醛溶 液），28°C滅活48h，分別取0. lml涂TCBS平板和LB20平板。次日平板沒(méi)長(zhǎng)出菌，表示滅活 徹底。用分光光度計(jì)測(cè)定0D600,用滅過(guò)菌的生理海水稀釋至所需濃度備用。
[0055] 其次，與合適濃度的殼寡糖（購(gòu)自青島博智匯力生物有限公司）混合，殼寡糖終濃 度為lmg/ml時(shí)較適宜。為達(dá)到此要求，先用滅過(guò)菌的生理海水將殼寡糖配成2mg/ml，將殼 寡糖溶液用〇. 22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌備用。
[0056] 其中生理海水配方如下（各組分溶于去離子水）：
[0057] NaCl 20g/L ；
[0058] MgCl2 · 6H20 4. 8g/L ；
[0059] MgS04 · 7H20 3. 5g/L ；
[0060] KC1 0. 7g/L ；
[0061] NaHC03 0. llg/L ；
[0062] CaCl2 · 2H20 1. 21g/L ；
[0063] 配制后在121 °C下，滅菌20分鐘，備用。
[0064] 實(shí)施例2、單獨(dú)殼寡糖的免疫增強(qiáng)作用研究
[0065] 用滅過(guò)菌的生理海水作為對(duì)照組（Control)，將殼寡糖用生理海水配制成lmg/ ml，用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌作為免疫組（COS)，每組20尾大菱鲆，腹腔注射0. lml，免疫 后1個(gè)月，用野生鰻弧菌MVM425肌肉注射攻毒，攻毒后14天觀察累計(jì)死亡情況，結(jié)果見(jiàn)圖 1〇
[0066] 結(jié)果顯示，C0S組比對(duì)照組死亡率稍低，顯示出一定的免疫增強(qiáng)效果，但這種增強(qiáng) 效果對(duì)于野生鰻弧菌的抵抗作用很弱，免疫保護(hù)力在10%左右。
[0067] 實(shí)施例3、注射免疫斑馬魚
[0068] 將滅活鰻弧菌（保藏號(hào)CGMCC8644)按照上述方法將終濃度控制在8 X 107cfu/ml， 為了比較免疫保護(hù)效果，免疫組設(shè)定如下：
[0069] 1)滅活鰻弧菌組（V. anguillarum) :8X 107cfu/ml鰻弧菌與生理海水等體積混 合；
[0070] 2)滅活鰻弧菌 + 殼寡糖（V. anguillarum+COS) (10mg/ml) :8X 107cfu/ml 鰻弧菌與 20mg/ml殼寡糖等體積混合；
[0071] 3)滅活鰻弧菌 + 殼寡糖（V. anguillarum+COS) (lmg/ml) :8X 107cfu/ml 鰻弧菌與 2mg/ml殼寡糖等體積混合；
[0072] 4)滅活鰻弧菌 + 殼寡糖（V. anguillarum+COS) (0· lmg/ml) :8X 107cfu/ml 鰻弧菌 與0. 2mg/ml殼寡糖等體積混合。
[0073] 殼寡糖用生理海水配制成相應(yīng)濃度，然后用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌，備用。實(shí)驗(yàn) 組與對(duì)照組每組均30尾，設(shè)定3個(gè)平行組。免疫組同樣5 μ 1/尾注射斑馬魚，每個(gè)免疫組 中滅活鰻弧菌的劑量均為2Χ 105cfu/尾，免疫后一個(gè)月利用野生株鰻弧菌MVM425進(jìn)行攻 毒，觀察攻毒后兩周累計(jì)死亡情況，并計(jì)算各免疫組的免疫保護(hù)力（RPS)。
[0074]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于魚類免疫的疫苗，其特征在于，該疫苗包括：滅活的鰻弧菌和殼寡糖； 其中，所述滅活的鰻弧菌的終濃度為5X10 6?3X108cfu/ml ;所述殼寡糖的終濃度為 0. 05_50mg/mL。
2. 如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中，所述滅活的鰻弧菌的終濃度為 1 X 107 ?1. 5 X 108cfu/ml ;更佳地為 2 X 107 ?8 X 107cfu/ml。
3. 如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中，所述殼寡糖的終濃度為 0· 1-lOmg/mL ;更佳地為 0· 5_5mg/mL。
4. 如權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的殼寡糖平均分子量在2000左右，脫乙 酰度超過(guò)90%。
5. 制備權(quán)利要求1所述的疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括：將滅活的鰻弧菌和 殼寡糖混合，獲得所述的疫苗；其中，所述滅活的鰻弧菌的終濃度為5X10 6?3X108cfu/ ml ;所述殼寡糖的終濃度為0. 05-50mg/mL。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在制備時(shí)，配制所述殼寡糖的終濃度為 0·1-lOmg/mL ;和 / 或 配制所述滅活的鰻弧菌的終濃度為5X 106?3X 108cfu/ml。
7. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，使用甲醛將鰻弧菌滅活，用生理海水稀釋， 然后與殼寡糖溶液混合。
8. 權(quán)利要求1-4任一所述的疫苗的用途，用于制備預(yù)防魚類致病菌感染的組合物。
9. 殼寡糖的用途，其特征在于，用于與鰻弧菌混合制備魚類免疫用的疫苗。
10. -種用于魚類免疫的藥盒，其特征在于，所述藥盒中包括權(quán)利要求1-4任一所述的 疫苗。
【文檔編號(hào)】A61K39/39GK104208672SQ201410201335
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】吳海珍, 高原, 王啟要, 劉琴, 張?jiān)d 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)