專利名稱：致病性鰻弧菌的pcr快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)動(dòng)物疾病的診斷技術(shù)，特別是養(yǎng)殖動(dòng)物的致病性鰻弧菌的PCR快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
弧菌是海洋水環(huán)境微生態(tài)系的成員，在海水和海洋生物中廣泛存在。病原性弧菌能引起養(yǎng)殖生物流行病的爆發(fā)，導(dǎo)致死亡。鰻弧菌是其中一種非常重要的弧菌性病原，能夠引起養(yǎng)殖魚(yú)類的皮膚潰爛、肌體出血和死亡，危害十分巨大。對(duì)于致病性鰻弧菌的檢測(cè)方法，目前主要有生理生化鑒定技術(shù)、熒光抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和16srRNA基因探針雜交技術(shù)。但這些方法存在一些缺點(diǎn)和不足。生理生化檢測(cè)技術(shù)十分耗時(shí)耗力，并且結(jié)果不穩(wěn)定；熒光抗體技術(shù)需要較昂貴的儀器設(shè)備；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)敏感性不高，還易受干擾因素的影響；16srRNA基因在生物物種中非常保守，因此16srRNA基因探針雜交技術(shù)特異性不強(qiáng)。PCR是一種具有敏感性高、特異性強(qiáng)的靶DNA快速檢測(cè)方法，樣品中含有少量的細(xì)菌就能檢出。然而，采用PCR試劑盒對(duì)鰻弧菌的快速檢測(cè)目前未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種致病性鰻弧菌的PCR快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
本發(fā)明技術(shù)方案如下致病性鰻弧菌的PCR快速檢測(cè)試劑盒，包括提供兩對(duì)對(duì)致病性鰻弧菌DNA特異的引物對(duì)1和2、引物對(duì)3和4，以及提供一種使用該試劑盒快速測(cè)檢和監(jiān)測(cè)多種樣品中致病性鰻弧菌的方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)致病性鰻弧菌檢測(cè)的準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化，為健康養(yǎng)殖提供科學(xué)的依據(jù)。
本發(fā)明的主要原理為試劑A、B和C將樣品中的細(xì)菌進(jìn)行裂解，釋放出細(xì)菌DNA，PCR試劑管含多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑，通過(guò)加入致病性鰻弧菌特異DNA片段引物和Tag酶等成分，對(duì)樣品釋放出的DNA進(jìn)行特異性的擴(kuò)增。由于我們?cè)O(shè)計(jì)的引物為致病性鰻弧菌所特有，因此，如果樣品中含有致病性鰻弧菌，那么它的DNA的特異片段在經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后，濃度將達(dá)到108mol(克分子)以上，在電泳和溴化乙錠染色后，紫外光檢測(cè)就可以探測(cè)到一定分子量的目的條帶。如果沒(méi)有鰻弧菌，則不能擴(kuò)增到同樣分子量的目的條帶。
其中所述快速檢測(cè)鰻弧菌的PCR試劑盒的配方如下(1)DNA提取試劑含緩沖試劑A、細(xì)胞裂解試劑B和C；試劑ApH為8.0，含有三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)，它們的濃度分別為10～50mM、1～10mM；試劑BpH為8.0，含有蛋白酶、三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)，它們的濃度分別為1～10mg/ml、10～50mM、1～10mM；試劑C含有十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、氯化鈉，濃度分別為1～10g/ml、5～10M；(2)PCR試劑管成分為2.5～5.0μl 10×buffer(10×buffer為10倍濃度的緩沖溶液A)，2.0～4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度2.5mM)，25mM 2.0～4.0μl MgCl2，引物對(duì)10μM 0.5～1μl引物1和10μM 0.5～1μl引物2，引物對(duì)20μM 0.5～1μl引物3和20μM 0.5～1μl引物4，14～31μl滅菌去離子水；(3)Taq酶5～10μl，3U/μl；(4)普通瓊脂糖1～1.2g；可配制成1～1.2％的使用濃度；(5)5～10μg/μl溴化乙錠溶液0.5～1.0ml，可配制成為0.5～1.0μg/ml的使用濃度；(6)0.25～0.75％(g/ml)溴酚藍(lán)上樣緩沖液30～100μl；所述的引物對(duì)1和2、引物對(duì)3和4是DNA片段，堿基序列分別為5’TTCATGTACCGACGCGAGT3’和5’AAGATTTGAAAATGTCGCTC3’、5’CGTATTTCATTCAGATAGTGA3’和5’GTGGGTACTGATTGCGTAG3’；所述PCR試劑的最佳成份為5.0μl 10×buffer，3U/ul 1.0ul Taq酶，4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度2.5mM)，25mM4.0μl MgCl2，10μM 1μl引物1，10μM 1μl引物2，20μM 1μl引物3和20μM1μl引物4，31μl滅菌去離子水。
采用快速檢測(cè)鰻弧菌的PCR試劑盒的檢測(cè)方法如下(1)樣品處理取0.1～0.5g或0.1～0.5ml樣品，100～400μl試劑A懸浮樣品，并將樣品充分混勻；10000～12000g離心2～5分鐘；(2)DNA提取棄上清，用100～200μl試劑A懸浮沉淀，再加入20～50μl試劑B，或取上清，加入20～50μl試劑B；在55～65℃浴中保溫5～10分鐘，再加入10～50μl試劑C；55～65℃浴中保溫5～10分鐘，10000～12000g離心8～10分鐘，取上清并加入上清體積2倍的無(wú)水乙醇沉淀DNA；室溫放置5～10分鐘，10000-12000g離心5～10分鐘；去上清，70～75％乙醇洗滌沉淀1～2次，讓乙醇徹底揮發(fā)，將沉淀溶于10～50μl滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，2～8℃保存?zhèn)溆茫?3)多重PCR擴(kuò)增在一PCR試劑管內(nèi)加入0.5～1μl的DNA提取液，0.5～1.0μl 3U/μl Taq酶，3000～5000g離心2～5秒鐘混勻，置PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增；94～96℃解鏈2～5分鐘，然后94～96℃變性40秒～1分鐘，55～60℃復(fù)性30秒～1分鐘，72℃延伸40秒～1分鐘，如此進(jìn)行循環(huán)25～35次，最后72℃延伸6～10分鐘；(4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析取5～10μl擴(kuò)增后的樣品，與2-6μl 0.25～0.75％溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，在含有溴化乙錠濃度為0.5～1.0ug/ml的1.0～1.2％的瓊脂糖中進(jìn)行電泳和染色，在透射紫外燈下觀察，如果樣品孔有422bp和300bp核酸條帶，說(shuō)明樣品有致病性鰻弧菌感染或污染，反之則沒(méi)有。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明在設(shè)計(jì)特異引物并成功建立致病性鰻弧菌的多重PCR檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研制成簡(jiǎn)單快速敏感的PCR檢測(cè)試劑盒，與其它的弧菌病原檢測(cè)技術(shù)和其它的病原檢測(cè)技術(shù)相比，本發(fā)明方法的顯著的特點(diǎn)是1)檢測(cè)十分快速，3-6小時(shí)即可得知檢測(cè)結(jié)果，而其它方法則至少需要24小時(shí)或一個(gè)星期以上；2)檢測(cè)靈敏度極高，檢測(cè)下限低至10-100個(gè)左右的細(xì)菌，其它方法必須經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的純培養(yǎng)增殖達(dá)到105個(gè)細(xì)菌后才能進(jìn)行檢測(cè)；3)可以應(yīng)用于多種樣品的檢測(cè)，如可以檢測(cè)養(yǎng)殖動(dòng)物遭受鰻弧菌感染的情況，也可以監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖水體環(huán)境中鰻弧菌，還可以檢測(cè)養(yǎng)殖飼料和鮮活餌料是否遭受鰻弧菌污染。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1按以下配方制作快速檢測(cè)鰻弧菌的試劑盒試劑ApH為8.0，含10mM Tris、1mM EDTA；
試劑BpH為8.0，含10mg/ml蛋白酶、10mM Tris、1mM EDTA；試劑C含10g/ml CTAB、5M氯化鈉；PCR試劑管成份為5.0μl 10×buffer，4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度2.5mM)，25mM 4.0μl MgCl2，10μM 1μl引物1，10μM 1μl引物2，20μM 1μl引物3，20μM 1μl引物4，31μl滅菌去離子水；Taq酶10μl，3U/μl；(6)普通瓊脂糖1.2g；(7)10μg/μl溴化乙錠溶液0.5ml；(8)0.25％溴酚蘭上樣緩沖液100μl。
按照以下程序進(jìn)行檢測(cè)(1)樣品處理取0.5g魚(yú)組織，用400μl試劑A懸浮樣品，充分勻漿，12000g離心5分鐘；(2)DNA提取棄上清，用200μl試劑A懸浮沉淀，加入50μl試劑B，在65℃浴中保溫10分鐘，再加入試劑C 50μl，65℃浴中保溫10分鐘，12000g離心10分鐘，取上清并加入600μl的無(wú)水乙醇沉淀DNA；室溫放置5分鐘，12000g離心5分鐘，去上清，70％乙醇洗滌2次，讓乙醇徹底揮發(fā)，將沉淀溶于30μl滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，4℃保存?zhèn)溆茫?3)PCR擴(kuò)增在一PCR試劑管內(nèi)加入1μl DNA提取液、1.0μl 3U/ul Taq酶，3000g離心5秒鐘混勻，置PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增96℃解鏈5分鐘，然后96℃變性1分鐘，60℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸40秒，如此進(jìn)行循環(huán)30次，最后72℃延伸6分鐘；(4)擴(kuò)增產(chǎn)物分析取6μl擴(kuò)增后的樣品，與3μl 0.25％溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，在含有溴化乙錠濃度為0.5ug/ml的1.0％的瓊脂糖中進(jìn)行電泳和染色，在透射紫外燈下觀察，如果樣品孔有422bp和300bp核酸條帶，說(shuō)明樣品有致病性鰻弧菌感染或污染，反之則沒(méi)有。
其中電泳液組成、電泳方法及染色方法參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)，p307，p309-313，p314。
實(shí)施例2按以下配方制作快速檢測(cè)鰻弧菌的試劑盒試劑ApH為8.0，含25mM Tris、5mM EDTA；
試劑BpH為8.0，含5mg/ml蛋白酶、25mM Tris、5mM EDTA；試劑C5g/ml CTAB、7.5M氯化鈉；PCR試劑管成份為2.5μl 10×buffer，2.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度2.5mM)，25mM 2.0μl MgCl2，10μM 0.5ul引物1，10μM 0.5μl引物2，20μM 0.5μl引物3，20μM 0.5μl引物4，15μl滅菌去離子水；(5)Taq酶5μl，3U/μl；(6)普通瓊脂糖1.0g；(7)5μg/μl溴化乙錠溶液1.0ml；(8)0.5％溴酚蘭上樣緩沖液50μl。
按照以下程序進(jìn)行檢測(cè)(1)樣品處理取0.5g餌料，用200μl試劑A懸浮樣品，充分勻漿，11000g離心3分鐘；(2)DNA提取棄上清，用100μl試劑A懸浮沉淀，加入30μl試劑B，在60℃浴中保溫8分鐘，再加入試劑C 20μl，60℃浴中保溫8分鐘，12000g離心8分鐘，取上清并加入300ul的無(wú)水乙醇沉淀DNA；室溫放置8分鐘，12000g離心8分鐘，去上清，70％乙醇洗滌2次，讓乙醇徹底揮發(fā)，將沉淀溶于50μl滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，8℃保存?zhèn)溆茫?3)多重PCR擴(kuò)增在一PCR試劑管內(nèi)加入1μl DNA提取液，1.0μl 3U/μl Taq酶，4000g離心3秒鐘混勻，置PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，96℃解鏈5分鐘，然后96℃變性1分鐘，60℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸40秒，如此進(jìn)行循環(huán)30次，最后72℃延伸6分鐘；(4)擴(kuò)增產(chǎn)物分析取10μl擴(kuò)增后的樣品，與5μl 0.5％溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，在含有溴化乙錠濃度為0.8ug/ml的1.0％的瓊脂糖中進(jìn)行電泳和染色，在透射紫外燈下觀察，如果樣品孔有422bp和300bp核酸條帶，說(shuō)明樣品有鰻弧菌感染或污染，反之則沒(méi)有。
實(shí)施例3按以下配方制作快速檢測(cè)鰻弧菌的試劑盒(1)試劑ApH8.0，含50mM Tris、10mM EDTA；(2)試劑BpH8.0，含8mg/ml蛋白酶，50mM Tris、10mM EDTA；(3)試劑C1g/ml CTAB、10M氯化鈉；
(4)PCR試劑管成份為5.0μl 10×buffer，4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度2.5mM)，25mM 4.0μl MgCl2，10μM 1μl引物1，10μM 1μl引物2，20μM 1μl引物3，20μM 1μl引物4，31μl滅菌去離子水；(5)Taq酶8μl，3U/μl；(6)普通瓊脂糖1.1g；(7)8μg/μl溴化乙錠溶液0.8ml；(8)0.75％溴酚蘭上樣緩沖液30μl。
按照以下程序進(jìn)行檢測(cè)(1)樣品處理取0.1ml水樣，用100μl試劑A，充分混勻，10000g離心2分鐘；(2)DNA提取取上清，加入50μl試劑B，在55℃浴中保溫5分鐘，再加入試劑C 50μl，55℃浴中保溫5分鐘，12000g離心5分鐘，取上清并加入400ul的無(wú)水乙醇沉淀DNA；室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘，去上清，75％乙醇洗滌1次，讓乙醇徹底揮發(fā)，將沉淀溶于20μl滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，2℃保存?zhèn)溆茫?3)多重PCR擴(kuò)增在一PCR試劑管內(nèi)加入1μl DNA提取液、1.0μl 3U/μl Taq酶，5000g離心2秒鐘混勻，置PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增96℃解鏈5分鐘，然后96℃變性1分鐘，60℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸40秒，如此進(jìn)行循環(huán)30次，最后72℃延伸6分鐘；(4)擴(kuò)增產(chǎn)物分析取10μl擴(kuò)增后的樣品，與2μl 0.75％溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，在含有溴化乙錠濃度為1.0ug/ml的1.1％的瓊脂糖中進(jìn)行電泳和染色，在透射紫外燈下觀察，如果樣品孔有422bp和300bp核酸條帶，說(shuō)明樣品有鰻弧菌感染或污染，反之則沒(méi)有。
權(quán)利要求
1.一種致病性鰻弧菌的PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征是試劑包括1)DNA提取試劑含緩沖試劑A、細(xì)胞裂解試劑B和C；試劑ApH為8.0，含有三羥基甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸，它們的濃度分別為10～50mM、1～10mM；試劑BpH為8.0，含有蛋白酶、三羥基甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸，它們的濃度分別為1～10mg/ml、10～50mM、1～10mM；試劑C含有十六烷基三甲基溴化胺、氯化鈉，濃度分別為1～10g/ml、5～10M；2)PCR試劑管成分為2.5～5.0μl 10×buffer，2.0～4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度2.5mM)，25mM 2.0～4.0μl MgCl2，引物對(duì)10μM 0.5～1μl引物1和10μM 0.5～1μl引物2，引物對(duì)20μM 0.5～1μl引物3和20μM 0.5～1μl引物4，14～31μl滅菌去離子水；3)Taq酶5～10μl，3U/μl；4)普通瓊脂糖1～1.2g，可配制成1～1.2％的使用濃度；5)5～10μg/μl溴化乙錠溶液0.5～1.0ml，可配制成為0.5～1.0μg/ml的使用濃度；6)0.25～0.75％(g/ml)溴酚藍(lán)上樣緩沖液30～100μl。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述致病性鰻弧菌的PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的引物對(duì)1和2、引物對(duì)3和4是DNA片段，堿基序列分別為5’TTCATGTACCGACGCGAGT3’和5’AAGATTTGAAAATGTCGCTC3’、5’CGTATTTCATTCAGATAGTGA3’和5’GTGGGTACTGATTGCGTAG3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述致病性鰻弧菌的PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述PCR試劑的最佳成分為5.0μl 10×buffer，3U/ul 1.0ul Taq酶，4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每種濃度2.5mM)，25mM 4.0μl MgCl2，10μM 1μl引物1，10μM 1μl引物2，20μM 1μl引物3和20μM 1μl引物4，31μl滅菌去離子水。
4.一種使用致病性鰻弧菌的PCR快速檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于檢測(cè)程序如下
1)樣品處理取0.1～0.5g或0.1～0.5ml樣品，用100～400μl試劑A懸浮樣品，并將樣品充分混勻；10000～12000g離心2～5分鐘；2)DNA提取棄上清，用100～200μl試劑A懸浮沉淀，再加入20～50μl試劑B，或取上清，加入20～50μl試劑B；在55～65℃浴中保溫5～10分鐘，再加入10～50μl試劑C；55～65℃浴中保溫5～10分鐘，10000～12000g離心8～10分鐘，取上清并加入上清體積2倍的無(wú)水乙醇沉淀DNA；室溫放置5～10分鐘，10000～12000g離心5～10分鐘；去上清，70～75％乙醇洗滌沉淀1～2次，讓乙醇徹底揮發(fā)，將沉淀溶于10～50μl滅菌雙蒸水中，即為DNA提取液，2～8℃保存?zhèn)溆茫?)多重PCR擴(kuò)增在一PCR試劑管內(nèi)加入0.5～1μl的DNA提取液，0.5～1.0μl 3U/μl Taq酶，3000～5000g離心2～5秒鐘混勻，置PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增；94～96℃解鏈2～5分鐘，然后94～96℃變性40秒～1分鐘，55～60℃復(fù)性30秒～1分鐘，72℃延伸40秒～1分鐘，如此進(jìn)行循環(huán)25～35次，最后72℃延伸6～10分鐘；4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析取5～10μl擴(kuò)增后的樣品，與2-6μl 0.25～0.75％溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，在含有溴化乙錠濃度為0.5～1.0ug/ml的1.0～1.2％的瓊脂糖中進(jìn)行電泳和染色，在透射紫外燈下觀察，如果樣品孔有422bp和300bp核酸條帶，說(shuō)明樣品有致病性鰻弧菌感染或污染，反之則沒(méi)有。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種致病性鰻弧菌的PCR快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明的內(nèi)容包括由緩沖試劑A、細(xì)胞裂解試劑B和C、PCR試劑管、Taq酶、普通瓊脂糖、溴化乙錠溶液、溴酚藍(lán)上樣緩沖溶液組成的PCR檢測(cè)試劑盒以及一套檢測(cè)操作程序。本發(fā)明突出的優(yōu)點(diǎn)是建立多重PCR反應(yīng)，可快速、準(zhǔn)確、敏感地檢測(cè)出樣品中的致病性鰻弧菌，為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的疾病診斷提供簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確的方法，也可應(yīng)用于對(duì)養(yǎng)殖水體和飼料的質(zhì)量監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1595155SQ03133939
公開(kāi)日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2003年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月10日
發(fā)明者莫照蘭, 張培軍, 陳師勇, 鄒玉霞, 張振冬, 王春玲, 肖鵬, 徐永立 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所