用于心臟組織保護的干細胞的組合物和方法【專利摘要】本公開內(nèi)容描述了通過在含有溶血磷脂酸，優(yōu)選還含有凝膠即，仿生凝膠的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞來增強造血干細胞，優(yōu)選來源于人臍帶或外周血的CD34+在低氧和去血清條件下的存活的方法和組合物。所述方法和組合物可用于醫(yī)學或化妝品應用，特別地，用于治療心臟組織和/或心臟病，和/或用于治療傷口愈合即糖尿病傷口愈合。【專利說明】用于心臟組織保護的干細胞的組合物和方法【
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】[0001]本公開內(nèi)容涉及利用溶血磷脂酸處理的人造血干細胞的組合物和方法，所述組合物和方法增強在低氧和去血清條件下的存活并且在心肌梗塞后保護心臟組織。[0002]背景[0003]心臟病是發(fā)達國家和發(fā)展中國家中死亡和失能的首要原因，約占全部人死亡數(shù)目的40%。許多存活的患者患上被稱為充血性心力衰竭（CHF)的心臟病的慢性形式，該疾病形式與心肌的進行性退化、瘢痕形成、LV(左心室）擴張和機能障礙相關。具有嚴重缺血性心力衰竭的患者具有高發(fā)病率和死亡率，而心臟移植是唯一可用的決定性療法。[0004]最近，在經(jīng)歷MI(心肌梗塞）的人患者中已測試了不同來源的干細胞，包括成人外周血干細胞（APBSC)和骨髓來源的干細胞（BMDSC)(Losordo,D.W.，等人,IntramyocardialtransplantationofautologousCD34+stemcellsforintractableangina:aphaseI/IIadouble-blind,randomizedcontrolledtrial.Circulation,2007.115(25):p.3165-72；Schachinger,V.,等人,Intracoronarybonemarrow-derivedprogenitorcellsinacutemyocardialinfarction.NEnglJMed，2006.355(12):p.1210-21)。已在大部分試驗中報導了LV射血分數(shù)的改善(Schachinger,V.,等人，Intracoronarybonemarrow-derivedprogenitorcellsinacutemyocardialinfarction.NEnglJMed,2006.355(12):p.1210-21；Passier,R.,L.ff.vanLaake,andC.L.Mummery,Stem-cell-basedtherapyandlessonsfromtheheart.Nature,2008.453(7193):p.322-9);然而，功能性改善仍然不明顯（射血分數(shù)低于5%)。因此，需要替代的方法以（i)增強干細胞的治療作用和（ii)治療擁有具有削弱的生物活性的成體干細胞的老年患者（例如糖尿病患者，等）（Passier,R.，L.ff.vanLaake和C.L.Mummery,Stem-cell-basedtherapyandlessonsfromtheheart.Nature,2008.453(7193):p.322-9)。[0005]從人臍帶血分離的⑶34+細胞可以是用于心臟再生的有前景的細胞療法。這些干細胞可被自體地使用，可在體外或體內(nèi)分化成血管細胞（LeRicousse_Roussanne，S.，等人，Exvivodifferentiatedendothelialandsmoothmusclecellsfromhumancordbloodprogenitorshometotheangiogenictumorvasculature.CardiovascRes，2004.62(l):p.176-84)并且在心肌缺血的動物模型中增強新生血管形成（Ma，N.，等A,HumancordbloodcellsinduceangiogenesisfollowingmyocardialinfarctioninNOD/scid-mice.CardiovascRes,2005.66(1):p.45-54；Hirata,Y.,等人,Humancordbloodbloodcellsimprovecardiacfunctionaftermyocardialinfarction.BiochemBiophysResCommun,2005.327(2):p.609-14)。從人胳帶血分離的CD34+細胞相較于APBSC和BMDSC具有幾個有利方面，包括更高的增生率、相對低的在體內(nèi)產(chǎn)生不想要的細胞的風險（與對于BMDSC所描述的風險相反）以及用于經(jīng)歷MI并且具有功能受損的人外周血CD34+細胞的患者的適當?shù)募毎煼╗5,10]。為了獲得臨床功效，干細胞或其后代必須存活和移植入宿主組織。不幸地，許多細胞在遞送后數(shù)天死亡（Ma，N.，等A,HumancordbloodcellsinduceangiogenesisfollowingmyocardialinfarctioninNOD/scid-mice.CardiovascRes,2005.66(1):p.45-54；Hirata,Y.,等人，Humancordbloodbloodcellsimprovecardiacfunctionaftermyocardialinfarction.BiochemBiophysResCommun，2005.327(2):p.609-14;Henning，R.J·，等人，Humancordbloodprogenitorcellsareattractedtoinfarctedmyocardiumandsignificantlyreducemyocardialinfarctionsize.CellTransplant,2006.15(7):p.647-58)〇[0006]一般描述[0007]本公開內(nèi)容的一個方面描述了通過在含有溶血磷脂酸，優(yōu)選還含有凝膠（即，仿生凝膠）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞來增加造血干細胞，優(yōu)選來源于人臍帶或外周血的CD34+細胞在低氧和去血清條件下的存活的方法。[0008]該組合令人驚訝地增加了低氧和去血清條件下的存活，并且在心肌梗塞后保護心臟組織。該混合物，特別地在血纖蛋白中利用溶血磷脂酸處理的來源于人臍帶血的⑶34+，顯示改善的結果。[0009]在公開的方法的實施方案中，仿生凝膠可以是下列物質的至少一種：血纖蛋白、透明質酸、藻酸鹽、瓊脂糖、膠原、PEG衍生物及其混合物。優(yōu)選地血纖蛋白凝膠，更優(yōu)選地血纖蛋白凝膠以l-l〇〇mg/ml的終濃度包含血纖蛋白原以及以l-500U/ml的終濃度包含凝血酶。更優(yōu)選，血纖蛋白凝膠以10_30mg/ml的終濃度包含血纖蛋白原和以2-50U/ml的終濃度包含凝血酶。[0010]在公開的方法的實施方案中，溶血磷脂酸的濃度在1至1000μΜ之間變化，優(yōu)選為100μm〇toon]本公開內(nèi)容的一個方面描述了組合物，所述組合物包含：造血干細胞，優(yōu)選來源于人臍帶或外周血的⑶34+;以及溶血磷脂酸，優(yōu)選還包含凝膠，即仿生凝膠。[0012]該組合令人驚訝地增加低氧和去血清條件下的存活，并且在心肌梗塞后保護心臟組織。該混合物，特別地血纖蛋白中利用溶血磷脂酸處理的人臍帶血的⑶34+，顯示改善的結果。[0013]在公開的組合物的實施方案中，仿生凝膠可以是下列物質的至少一種：血纖蛋白、透明質酸、藻酸鹽、瓊脂糖、膠原、PEG衍生物及其混合物。優(yōu)選地血纖蛋白凝膠，更優(yōu)選地血纖蛋白凝膠以l-l〇〇mg/ml的終濃度包含血纖蛋白原以及以l-500U/ml的終濃度包含凝血酶。更優(yōu)選，血纖蛋白凝膠以10_30mg/ml的終濃度包含血纖蛋白原和以2-50U/ml的終濃度包含凝血酶。[0014]在公開的組合物的實施方案中，溶血磷脂酸的濃度在1與1000μΜ之間變化，優(yōu)選為100μΜ。[0015]公開的組合物的實施方案可包含IX105-1Χ106個⑶34+細胞和1-100μΜ的溶血磷脂酸，以及100_200mL的仿生凝膠。[0016]在其它方面，公開的組合物可用于醫(yī)學或化妝品應用，即藥物組合物、醫(yī)藥組合物或化妝品組合物，即對于Cd34+細胞和LPA，先前的組分以治療有效量存在，并且還可包含足夠量的賦形劑。具體地，在心臟組織和/或心臟病的治療中，和/或在傷口愈合即糖尿病傷口愈合的治療中。[0017]在實施方案中，本公開內(nèi)容的組合物可以是可注射制劑。[0018]在本公開內(nèi)容中，顯示了利用溶血磷脂酸（LPA)處理的并且在低氧和去血清條件下培養(yǎng)的造血干細胞即CD34+細胞使它們的存活相對于未處理的細胞加倍。令人驚訝地，細胞增殖并且相較于對照，分泌高水平的細胞因子例如IL-4、IL-8和TNF-α。最后，LPA-處理的細胞在心肌梗塞后保護心臟功能但未處理的細胞不保護。[0019]附圖概述[0020]下列附圖提供了優(yōu)選實施方案來舉例說明本說明書，并且不應當被看作限定本發(fā)明的范圍。[0021]圖1-LPA的化學結構。在具有或不具有藥物的無血清培養(yǎng)基中于低氧中培養(yǎng)24h的⑶34+細胞的存活、細胞凋亡和壞死。結果為平均值土SEM(η=2-13)。[0022]圖2-LPA增加在低氧和去血清條件下培養(yǎng)的細胞中的CD34+細胞存活。（Α)在常氧、低氧以及低氧和LPA處理中于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h的CD34+細胞的存活、細胞凋亡和壞死。（B)LPA濃度對在低氧或常氧中于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h的CD34+細胞的存活的作用。（C)LPA對在低氧中培養(yǎng)1(H1)或3天（H3)，在低氧中培養(yǎng)1天并在常氧中培養(yǎng)3天（H1+N3)，或在常氧中培養(yǎng)1(N1)或4天（N4)的細胞的存活的作用。在所有圖中，用或不用LPA(lOOyM)培養(yǎng)細胞。結果為平均值土SEM(n=4-50)。在所有圖中，*表示統(tǒng)計顯著性：*Ρ〈0·05,**Ρ〈0·01，***Ρ〈0·001。[0023]圖3-LPA影響細胞增殖并且對低氧和去血清條件下的細胞分化具有最低限度的影響。（A)在于低氧中培養(yǎng)1天和于常氧中培養(yǎng)3或6天后的細胞總數(shù)。（B)通過流式細胞術測量的細胞分化（n=1)。將細胞在低氧中培養(yǎng)1天，隨后在常氧中培養(yǎng)6天或不培養(yǎng)6天。在所有圖中，用或不用LPA(100μΜ)培養(yǎng)細胞。[0024]圖4-LPA影響被封裝在血纖蛋白凝膠中并且在低氧和去血清條件下培養(yǎng)的⑶34+細胞的細胞存活。（A.1)在具有或不具有LPAdOOyM)的無血清培養(yǎng)基中于低氧中培養(yǎng)細胞1天。（A.2)在具有或不具有LPAdOOyM)的無血清培養(yǎng)基中于低氧中培養(yǎng)細胞3天。在所有圖中，結果為平均值土SEM(n=3-6)。在所有圖中，*表示統(tǒng)計顯著性：*P〈0.05,#P〈0.01，#*P〈0.001。[0025]圖5-LPA主要通過過氧化物酶體增殖物激活物受體（PPAR)誘導⑶34+細胞存活。將細胞在具有LPA的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在于低氧和包含LPA(100μM)的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時之前，利用Rho激酶抑制劑（Υ-2762,50μΜ)、分裂原活化蛋白激酶（ΜΑΡΚ)抑制劑（PD98059,60μM)、LPA1-和LPA3-特異性抑制劑（Kil6425,10μΜ)或過氧化物酶體增殖物激活受體g(PPARg)抑制劑（GW9662,50μΜ)預處理細胞1小時。將無任何預處理并且在具有或不具有LPA的無血清培養(yǎng)基中于低氧中培養(yǎng)24h的細胞分別用作陽性和陰性對照。結果為平均值土SEM(n=3-6)。*表示統(tǒng)計顯著性：*P〈0.05,#P〈0.01，*#P〈0.001。[0026]圖6-LPA-處理的⑶34+細胞在心肌梗塞后保護心臟功能。通過冠狀動脈左前降支（LAD)的永久性結扎誘發(fā)心肌梗塞。（A)具有（假處理組（sham)、凝膠+⑶34+細胞、凝膠+LPA-處理的CD34+細胞）或不具有LAD結扎（正常）的動物的心臟縮短分數(shù)。在LPA-處理的⑶34細胞中，在移植前l(fā)h利用100μΜ的LPA處理細胞。將細胞（lxlO6個細胞）于血纖蛋白凝膠前體溶液（100mL)中遞送入裸大鼠的梗塞的心臟。（B)針對第1周標準化的第3周的心臟縮短分數(shù)。在所有圖中，結果為平均值土SEM(η=6-10)。*表示統(tǒng)計顯著性：*Ρ〈0.05,#Ρ〈0.01，*#Ρ〈0.001。[0027]發(fā)明詳述[0028]在本公開內(nèi)容中，顯示了造血干細胞，即在低氧和去血清條件下培養(yǎng)的利用溶血磷脂酸（LPA)處理的CD34+細胞，令人驚訝地使它們的存活相對于未處理的細胞加倍。優(yōu)選，細胞增殖并且相較于對照分泌高水平的細胞因子例如IL-4、IL-8和TNF-α。結果顯示CD34+細胞存活主要通過過氧化物酶體增殖物激活物受體介導。最后，本公開內(nèi)容顯示LPA處理的細胞在心肌梗塞后保護心臟功能但未處理的細胞不保護。[0029]本發(fā)明使得造血干細胞（即CD34+細胞）的存活、（在數(shù)量和量級上）細胞增殖和對組織再生的治療作用能夠令人驚訝地增強，并且維持溶血磷脂酸的作用。[0030]在低氧和去血清條件下意外地觀察到該作用，并且還令人驚訝地觀察到干細胞，具體地⑶34+細胞表達LPAR(LPA-受體），并且上文所列的作用可通過用溶血磷脂酸（LPA)處理⑶34+來實現(xiàn)。[0031]實施方案[0032]從UCB分離CD34+細胞。在實施方案中，從依照葡萄牙法律簽訂知情同意書的供體采集所有人臍帶血（UCB)。采集被MaternidadeDanieldeMatos的倫理委員會批準。樣品被貯存在裝有35mL檸檬酸鹽-磷酸鹽-葡萄糖抗凝劑溶液的無菌袋中。從在Ficoll(優(yōu)選地，Histopaque_1077HybriMax;優(yōu)選地，Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)密度梯度分離后獲自UCB樣品的單核細胞分離⑶34+細胞。按照制造商的推薦，使用mini-MACS免疫磁化分離系統(tǒng)（優(yōu)選地，MiltenyiBiotec,BergischGladbach,Germany,http://www.miltenyibiotec.com)陽性選擇（2次）0)34+細胞。將⑶34+細胞立即用于細胞封裝研究或體內(nèi)實驗而無需進一步處理。分離的細胞對于⑶34抗原的純度高于95%，如通過FACS確認的。這些細胞是CD34+CD45+CD31+KDR-vWF-CD14-(Pedroso，D.C.，等人，Improvedsurvival,vasculardifferentiationandwoundhealingpotentialofstemcellsco-culturedwithendothelialcells.PLoSOne,2011.6(1):p.el6114)〇[0033]細胞處理。在實施方案中，將UCB⑶34+細胞（IX106個細胞/mL)在藥理學藥物存在或不存在的情況下在低氧室（〇.5%的02和5%的C02)中于X-Vivo培養(yǎng)基（Lonza)中溫育24h，以分別通過膜聯(lián)蛋白V和PI的表達的FACS分析進一步評估細胞存活/凋亡和壞死。優(yōu)選地，在進行低氧培養(yǎng)前用各自藥物預處理細胞1小時，在低氧培養(yǎng)過程中維持處理。[0034]免疫染色。在實施方案中，用4%(v/v)多聚甲醛（優(yōu)選地，EMS，Hatfield,USA)在室溫固定細胞15-20分鐘。在用1%(w/v)牛血清白蛋白（BSA)溶液（優(yōu)選，Sigma-Aldrich)封閉30分鐘后，用抗人單克隆抗體PPARY和CD34對細胞染色lh。在每一個免疫熒光實驗中，使用同種型匹配的IgG對照。利用抗小鼠IgGCy3綴合物（優(yōu)選地，Sigma-Aldrich)檢測一抗對特定細胞的結合。利用4'，6_二脒基-2-苯基吲哚（優(yōu)選地，DAPI;Sigma-Aldrich)對細胞的核進行染色。在間接標記后，優(yōu)選用Zeiss突光顯微鏡檢查細胞。[0035]流式細胞術。在實施方案中，在FACSCalibur細胞計數(shù)器（優(yōu)選地，BectonDickinson)上進行祖細胞和干細胞分型的多色分析。用APC或太平洋藍抗人⑶45(優(yōu)選地，e-Bioscience)、FITC抗小鼠CD45(優(yōu)選地，-Bioscience)、PeCy7抗人CD33(優(yōu)選地，BDBioscience)、PE抗人CDllb(優(yōu)選地，BDBioscience)、FITC抗人CD19(優(yōu)選地，BDBioscience)、PeCy7抗人CD3(優(yōu)選地，BDBioscience)、PE抗人GlycophorinA(優(yōu)選地，BDBioscience)、FITC抗人CD41(優(yōu)選地，e-bioscience)和PeCy7抗人CD56(優(yōu)選地，BDBioscience)對細胞染色lh，用染色培養(yǎng)基進行洗滌，隨后進行分析。[0036]血纖蛋白凝膠的制備。在實施方案中，通過在凝血酶存在的情況下交聯(lián)血纖蛋白原（兩者都來自Sigma-Aldrich)形成血纖蛋白凝膠。通過將人血纖蛋白原溶解于Tris緩沖鹽溶液（TBS)(優(yōu)選地，Sigma-Aldrich)，pH7.4(20mg/mL)中，隨后通過經(jīng)過0.22μm注射器式濾器（Acrodisc，Pall，NY，USA)的過濾進行滅菌來制備血纖蛋白原溶液。通過將人凝血酶以50U/mL的濃度溶解于pH7.4的TBS來制備新鮮凝血酶溶液。通過將3種不同的組分：血纖蛋白原（10mg/mL)、CaCl2(優(yōu)選地，Merck,NJ，USA)(2.5μM)和凝血酶（0·2U/mL)混合來制備血纖蛋白凝膠（200μL，除非另有所述）。使該溶液在37°C和100%相對濕度膠化。[0037]血纖蛋白凝膠的降解。在實施方案中，通過將AlexaFluor?488人血纖蛋白原綴合物（優(yōu)選地，Invitrogen)(0.156mg)與未標記血纖蛋白原（9.844mg)在lmL的TBS中混合來制備凝膠前體溶液。通過它們的熒光的減少來間接評估隨時間過去具有或不具有細胞的血纖蛋白凝膠的降解速率。在〇時間點和期望的時間點上立即測量它們的熒光。通過在37°C利用200μL的TBS中的人纖溶酶（優(yōu)選地，Sigma-Aldrich)(0·006U/凝膠）溶液溫育過夜來誘導凝膠的完全降解。離心后，在SPECTRAmaxGeminiEM熒光微量板讀數(shù)器（優(yōu)選地,MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA,www.moleculardevices.com)中于520nm測量上清液級分的熒光。[0038]細胞因子分泌分析。在實施方案中，按照制造商的說明書，在Bio-Plex200系統(tǒng)(Bio-Rad,www.bio-rad.com)中，使用Bio-PlexProHumanCytokine17-PlexPanel測定（優(yōu)選地，Bio-Rad,Hercules,CA，USA)評價細胞培養(yǎng)上清液的細胞因子的存在和濃度。人組I17-PlexPanel由下列分析物組成：白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8;IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、粒細胞集落刺激因子（G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)、干擾素-γ(IFN-γ)、單核細胞趨化蛋白（單核細胞趨化活化因子[MCP-l(MCAF)]、巨噬細胞炎癥蛋白-β(MIP-Ιβ)和腫瘤壞死因子-a(TNF-α)。收集上清液培養(yǎng)基樣品，離心以除去沉淀，隨后冷凍。使用〇.2至3,200pg/mL的標準范圍。將樣品和對照以一式三份運行，將標準和空白對照以一式兩份運行。[0039]定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應（qRT-PCR)分析。在實施方案中，按照制造商的說明書，使用RNeasyMini試劑盒（優(yōu)選地，Qiagen,Valencia,USA)提取細胞的總RNA。首先離心細胞，將其在Trizol中勻化。在所有情況下，使用Taqman逆轉錄試劑（優(yōu)選地，AppliedBiosystems,FosterCity,USA)從1μg總RNA制備cDNA。使用PowerSYBRGreenPCRMasterMix(優(yōu)選地，AppliedBiosystems)進行定量PCR(qPCR)，在7500FastReal-TimePCR系統(tǒng)（優(yōu)選地，AppliedBiosystems,www.appliedbiosystems.com)中進行檢測。相對于參照（人或小鼠，取決于分析的細胞類型）GAPDH基因進行靶基因的定量：相對表達=2[_(Ct樣品-CtGADPH)]。從4個獨立反應計算平均最小循環(huán)閾值（Ct)。將引物序列公布為支持信息（表S1)。[0040]心肌梗塞動物模型。在實施方案中，用氯胺酮（75mg/kg，IP)和右美托咪啶(0.375mg/kg，IP)麻醉裸大鼠。提供利用平衡氧中2-3%的異氟醚的麻醉。用聚維酮碘擦洗腹部和前胸，隨后用70%乙醇擦拭（進行數(shù)輪聚維酮碘擦洗、隨后進行乙醇漂洗和施用聚維酮碘溶液的循環(huán)）。通過在動物的背部輕輕地在軟毛巾上展開下的橫向剖腹術（隔肌切口）或側向地通過肋間隙4-5抵達心臟。利用高壓滅菌器對儀器進行消毒。產(chǎn)生小的隔肌切口以產(chǎn)生心包開窗。利用11-0解剖刀在心包中產(chǎn)生5_切口。通過在動脈起端下2-3mm用6-OProline縫線永久性結扎冠狀動脈左前降支來誘發(fā)心肌梗塞。左心室的蒼白和局部室壁運動異常確認阻塞。讓心包打開，或取出心包以避免填塞。在縫合胸膜腔后，利用18-規(guī)格的消毒針和3-ml注射器抽空胸膜腔。用Vicryl4-0縫合腹壁和皮下組織，隨后用Vicryl4-0進行表皮下縫合。給動物拔管，隨后讓其恢復。在手術過程中維持每一只動物，讓其在溫暖的墊子下恢復直至蘇醒和能夠走動。在從該過程恢復后2天，動物在氯胺酮/咪達唑侖麻醉下經(jīng)歷超聲心動圖評估。將滿足超聲心動圖納入標準（低于50%的縮短分數(shù)）的動物分層至4組之一。隨后將大鼠經(jīng)歷第二胸廓切開術，隨后使用漢密爾頓氏注射器（優(yōu)選地HamiltonCompany)和30-規(guī)格的針直接注射100μL治療劑。在第二天中，通過超聲心動描記術監(jiān)控動物。在植入后2周，再次通過超聲心動描記術分析存活的大鼠。在第3周，通過無痛致死術處死動物。收集心臟和各種器官，將其在甲基Carnoy溶液中固定，處理，以進行組織學分析。[0041]LPA在低氧和去血清條件下誘導⑶34+細胞存活[0042]在優(yōu)選實施方案中，為了鑒定在低氧和去血清條件下促進CD34+細胞存活的分子，我們開發(fā)了使用懸浮于X;ivo培養(yǎng)基（用于臨床試驗（Schachinger,V.，等人,Intracoronarybonemarrow-derivedprogenitorcellsinacutemyocardialinfarction.NEnglJMed,2006.355(12):p.1210-21))中并在0.5%02,37°C下于低氧室中溫育24h的人臍帶血來源的⑶34+細胞（2X105個細胞/96孔板的孔）的測定。一些選擇的藥物已被FDA批準用于治療心血管疾?。ɡ鏝ebivololLombardo，R.M.，等人,Effectsofnebivololversuscarvedilolonleftventricularfunctioninpatientswithchronicheartfailureandreducedleftventricularsystolicfunction.AmJCardiovascDrugs,2006.6(4):p.259-63；IbersatanMassie,B.M.,等人，Irbesartaninpatientswithheartfailureandpreservedejectionfraction.NEnglJMed,2008.359(23):p.2456-67)，其它選擇的藥物正就改善具有心力衰竭的患者/模型的心臟功能在臨床前/臨床測定中接受評價（例如IN01001(Szabo，G.，等A,IN0-1001anovelpoly(ADP-ribose)polymerase(PARP)inhibitorimprovescardiacandpulmonaryfunctionaftercrystalloidcardioplegiaandextracorporalcirculation.Shock,2004.21(5):p.426-32);紅細胞生成素（Belonje,A.M·,等A,Effectsoferythropoietinafteranacutemyocardialinfarction:rationaleandstudydesignofaprospective,randomized,clinicaltrial(HEBEIII)〇AmHeartJ,2008.155(5):p.817-22);裡黑激素（Chen,Z·,等人，Protectiveeffectofmelatoninonmyocardialinfarction.AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2003.284(5):p.H1618-24);VX_702(Ma，X.L·，等人，Inhibitionofp38mitogen_activatedproteinkinasedecreasescardiomyocyteapoptosisandimprovescardiacfunctionaftermyocardialischemiaandreperfusion.Circulation,1999.99(13):p.1685-91)),其它選擇的藥物是在人體中發(fā)現(xiàn)的天然物質（LPA)。使用膜聯(lián)蛋白V/普羅匹定碘化物（PI)染色，通過流式細胞術評價細胞活力。膜聯(lián)蛋白V是具有針對磷脂酰絲氨酸的特異性的磷脂結合蛋白，其為至細胞凋亡狀態(tài)的細胞轉變的最早標志物之一。該磷脂被從質膜的內(nèi)葉轉移至外葉（Koopman，G·，等人，AnnexinVforflowcytometricdetectionofphosphatidylserineexpressiononBcellsundergoingapoptosis.Blood，1994.84(5):p.1415-20.)。PI進入壞死細胞并結合雙鏈核酸，但被從具有正常完整性的細胞排除[20]。根據(jù)圖1，未處理的⑶34+細胞顯示極差的存活，僅?31%的存活細胞，?31%的凋亡細胞（膜聯(lián)蛋白V+/PI-)，大部分細胞?39%處于壞死階段（PI+)。在10種測試的藥物中，LPA、前列腺素E2(PGE2)和紅細胞生成素顯著（P〈0.001)增加細胞存活。LPA(10μM)是具有最高促存活作用的（?69%的活細胞）的藥物，從而對其進行進一步研究（圖1和2Α)。令人驚訝地，LPA通過逆轉（特別地在低氧和去血清條件下）⑶34+細胞的壞死和凋亡增加細胞存活。[0043]LPA的促存活作用是濃度依賴性的（從1至100μΜ)，在1μΜ的LPA上⑶34+細胞的存活相較于對照（未處理的細胞）已經(jīng)在統(tǒng)計上是顯著的（Ρ〈〇·001，η=6)(圖2Β)。重要地，在利用1μMLPA處理并且在低氧條件下培養(yǎng)的⑶34+中活細胞的百分比與在常氧條件下培養(yǎng)的未處理的細胞相似。LPA的促存活作用按低氧時間的函數(shù)減?。▓D2C)。在LPA處理的⑶34+細胞中活細胞的百分比從第1天的78%下降至第3天的40%。綜上所述，獲得的結果令人驚訝地表明LPA是CD34+細胞的促存活分子并且其作用是時間和濃度依賴性的。[0044]LPA誘導細胞增殖而無需早期多能祖細胞的擴增[0045]LPA對于靜止細胞是高度促有絲分裂的[21]。LPA的促有絲分裂作用牽涉百日咳毒素不敏感性G蛋白的激活和隨后的Ca2+動員以及蛋白激酶C的刺激，花生四烯酸以GTP依賴性方式的釋放，和介導腺苷酸環(huán)化酶的抑制的百日咳毒素敏感性Gi蛋白的激活（vanCorven，E.J·，等人，Lysophosphatidate-inducedcellproliferation:identificationanddissectionofsignalingpathwaysmediatedbyGproteins.Cell,1989.59(1):p.45-54)。為了確定LPA是否可誘導CD34+細胞的增殖，將未處理的或LPA處理的細胞的懸浮液（2X105個細胞于200μL的X-vivo培養(yǎng)基中）暴露于低氧24h，隨后在常氧條件下培養(yǎng)另外6天。LPA處理的細胞在7天的時間中使其數(shù)目增加約3倍，然而未處理的細胞減少至它們初始數(shù)目的一半（圖3A)。[0046]為了檢查LPA在⑶34+細胞自我更新/分化中的作用，將未處理的和LPA處理的CD34+細胞在低氧條件下于X-vivo培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，隨后于常氧中培養(yǎng)6天或不進行所述常氧培養(yǎng)，最后通過FACS進行表征。在1天的低氧后，未處理的或LPA處理的⑶34+細胞都開始分化成肥大細胞（14至17%)和嗜中性粒細胞（5至8%)(圖3B)。僅78%和72%的未處理的或LPA處理的⑶34+細胞表達⑶34標志物。⑶34表達在已暴露于低氧的細胞中比常氧條件中的細胞更高，因為僅6%的在常氧條件下培養(yǎng)24h的細胞表達CD34標志物。在低氧中培養(yǎng)1天，隨后在常氧中培養(yǎng)6天的細胞進一步分化成數(shù)個細胞譜系，包括樹突細胞（DC)、嗜堿性粒細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞和肥大細胞。對于未處理的和LPA處理的細胞觀察到相似的分化特征譜。[0047]LPA在于血纖蛋白凝膠中封裝的且在低氧和去血清條件下培養(yǎng)的細胞中誘導⑶34+細胞存活[0048]可注射支架是非常有前景的遞送干細胞以用于再生醫(yī)學的媒介物，因為它們?yōu)榧毎婊詈驮鲋程峁┝擞欣慕Y構支持（Pedroso,D.C.，等人，Improvedsurvival，vasculardifferentiationandwoundhealingpotentialofstemcellsco-culturedwithendothelialcells.PLoSOne,2011.6(1):p.el6114；Kraehenbuehl,T.P.,R.Langer和LS.Ferreira，Three-dimensionalbiomaterialsforthestudyofhumanpluripotentstemcells.NatMethods，2011.8(9):p.731-6;Nakamuta，J.S·，等人，Celltherapyattenuatescardiacdysfunctionpostmyocardialinfarction:effectoftiming,routesofinjectionandafibrinscaffold.PLoSOne,2009.4(6):p.e6005.)。幾個研究已顯示通過支架移植入心臟裝置的細胞增加細胞存活，誘導血管生成以及在梗塞后保護心臟功能（Nakamuta，J.S.，等人，Celltherapyattenuatescardiacdysfunctionpostmyocardialinfarction:effectoftiming,routesofinjectionandafibrinscaffold.PLoS0ne，2009.4(6):p.e6005;Christman，K.L·，等人，F(xiàn)ibringluealoneandskeletalmyoblastsinafibrinscaffoldpreservecardiacfunctionaftermyocardialinfarction.TissueEng,2004.10(3-4):p.403-9；Kraehenbuehl,T.P.，等人，Humanembryonicstemcell-derivedmicrovasculargraftsforcardiactissuepreservationaftermyocardialinfarction.Biomaterials,2011.32(4):p.1102-9;Kutschka，I.，等人，Collagenmatricesenhancesurvivaloftransplantedcardiomyoblastsandcontributetofunctionalimprovementofischemicrathearts.Circulation，2006.114(lSuppl):ρ·1167-73)。最近，我們顯示CD34+細胞對血纖蛋白凝膠相較于對聚苯乙烯皿、膠原和纖連蛋白具有更大的初始附著力（Pedroso,D.C.，等人，Improvedsurvival,vasculardifferentiationandwoundhealingpotentialofstemcellsc〇-culturedwithendothelialcells.PLoSOne，201L6(1):p.el6114)〇此外，顯示了血纖蛋白凝膠支持CD34+細胞存活至少10天，并且凝膠抗金屬蛋白酶的降角軍(Pedroso,D.C.,等人，Improvedsurvival,vasculardifferentiationandwoundhealingpotentialofstemcellsco-culturedwithendothelialcells.PLoSOne，2011.6(1):p.el6114)。在優(yōu)選實施方案中，為了檢查血纖蛋白凝膠是否支持⑶34+細胞在低氧和去血清條件下的存活，將未處理的或LPA處理的細胞（2X105個）封裝在血纖蛋白凝膠（200μL)中，并在0.5%02,37°C于低氧室中溫育1和3天。使用膜聯(lián)蛋白V/普羅匹定碘化物（PI)染色，通過流式細胞術評價細胞活力。未處理的CD34+細胞在血纖蛋白凝膠具有差的存活（23.2±2.8%的活細胞，η=3,第1天；12.6±1.2%的活細胞，η=5，第3天），這顯示了單獨的基質不具有任何促存活作用（圖4)。相反地，封裝于血纖蛋白凝膠中的LPA處理的CD34+細胞顯示可與在未封裝于血纖蛋白凝膠中的LPA處理的細胞中觀察到的值相當?shù)母叽婊睿ǖ?天：69.0±0.7%對76.7±1.5%，分別地對于封裝的和未封裝的；第3天：51.1±0.8%對37.2±6.6%，分別地對于封裝的和未封裝的）。[0049]LPA主要通過過氧化物酶體增殖物激活物受體（PPAR)誘導⑶34+細胞存活[0050]LPA的生物作用是多樣的，包括發(fā)育、生理和病理生理作用（Lin，Μ.E.，D.R.Heir和J.Chun，Lysophosphatidicacid(LPA)receptors:signalingpropertiesanddiseaserelevance.ProstaglandinsOtherLipidMediat，2010.91(3-4):p.130-8)。迄今為止已鑒定了達到5種LPA受體（LPAR):LPA1_LPA5(Choi，J.W.，等人，LPAreceptors:subtypesandbiologicalactions.AnnuRevPharmacolToxicol，2010.50:p.157-86)〇受體為G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)并且可在多個組織中發(fā)現(xiàn)它們的存在。LPA1、LPA2和LPA3廣泛地在大多數(shù)組織中表達（Ishii,I.，等人，F(xiàn)unctionalcomparisonsofthelysophosphatidicacidreceptors,LP(Al)/VZG-l/EDG-2,LP(A2)/EDG-4,andLP(A3)/EDG-7inneuronalcelllinesusingaretrovirusexpressionsystem.MolPharmacol,2000.58(5):p.895-902)。LP4在特定器官例如胰腺、卵巢和胸腺中表達（Lee,C.W.,等人，LPA(4)/GPR23isalysophosphatidicacid(LPA)receptorutilizingG(s)-,G(q)/G(i)-mediatedcalciumsignalingandG(12/13)-mediatedRhoactivation.JBiolChem,2007·282(7):ρ·4310-7)。LPA5以低水平在多個組織中表達（Lee,C.W·，等人，GPR92asanewG12/13_andGq-coupledlysophosphatidicacidreceptorthatincreasescAMP,LPA5.JBiolChem,2006.281(33):p.23589-97)〇為了鑒定介導LPA(100μM)的促存活作用的受體，使用LPA1-和LPA3-特異性拮抗劑Kil6425(10μM)和過氧化物酶體增殖物激活物受體γ(PPARγ)的拮抗劑GW9662(50μM)。研究表明LPA對后一種受體具有高親和力（McIntyre,Τ·Μ.，等人，Identificationofanintracellularreceptorforlysophosphatidicacid(LPA):LPAisatranscellularPPARgammaagonist.ProcNatlAcadSciUSA,2003.100(1):p.131-6；Gustin,C.,M.VanSteenbrugge和M.Raes,LPAmodulatesmonocytemigrationdirectlyandviaLPA-stimulatedendothelialcells.AmJPhysiolCellPhysiol,2008.295(4):p.C905-14)。該方法通過使用Υ-2762(50μΜ)和Η)98059(60μΜ)拮抗劑分別抑制受體的下游靶包括Rho激酶和分裂原活化蛋白激酶（ΜΑΡΚ)來補充。已知所有LPAR偶聯(lián)G蛋白并激活其，這進而激活MAPK(LPA1、LPA2、LPA3和LPA4)和Rho激酶（LPA1、LPA2、LPA4和LPA5)(Choi,J.W.,等人，LPAreceptors:subtypesandbiologicalactions.AnnuRevPharmacolToxicol,2010.50:p.157-86)。將細胞在包含特定拮抗劑的X-Vivo培養(yǎng)基中處理lh，隨后在低氧條件下培養(yǎng)24h。在膜聯(lián)蛋白V/PI染色后，通過FACS分析評估細胞存活。結果表明在測試條件下，PPARY主要介導LPA的促存活作用（圖5B)。PPARY的拮抗劑顯著減少（P〈〇.〇〇1，η=11)LPA誘導的活細胞的數(shù)目，從?77%降至?53%;然而，其沒有完全阻斷LPA的促存活作用，因為無LPA的細胞具有39%的存活率（Ρ〈0.01)。Kil6425對LPA1和LPA3的抑制在CD34+細胞的存活中具有相對小的作用（圖5B)。活細胞的數(shù)目從77%(+LPA)降至67%(P〈0.01，n=19)。重要地，MAPK信號轉導途徑的抑制以比Rho激酶信號轉導途徑的抑制更高的水平抑制LPA的促存活作用。因為兩個信號轉導途徑是不同LPAR的下游靶（參見上文），這可能表明LPAR在⑶34+細胞的存活中的不同貢獻。綜上所述，數(shù)據(jù)顯示LPA能夠主要通過PPARY的激活在低氧和去血清條件下促進⑶34+細胞存活。[0051]LPA調(diào)節(jié)⑶34+細胞的細胞因子釋放[0052]為了測定LPA在CD34+細胞釋放信號轉導細胞因子和生長因子中的作用，使用細胞因子珠粒陣列。將細胞在LPA(100μM)存在或不存在的情況下，在常氧或低氧條件下于無血清培養(yǎng)基X-Vivo中溫育24h。常氧中未處理的⑶34+細胞表達高水平（>100pg/mL)的IL-8和MIP-lb，中等水平（100至lpg/mL)的IL-6、TNF-α和GM-CSF，以及低水平（〈lpg/mL)的IL-1β、IL-4和IL-17(圖5C)。低氧和去血清條件下培養(yǎng)的CD34+細胞比在常氧條件下表達顯著更高的水平的IL-1β(?8倍）、IL-4(?2倍）、IL-6(?1.2倍）、IL-8(?10倍）、IL-17(?4倍）和GM-CSF(?2倍）。有趣地，在低氧和去血清條件下但在LPA存在的情況下培養(yǎng)的CD34+細胞相較于在相同條件下但在LPA不存在的情況下培養(yǎng)的細胞增加IL-4(從?0·9至?2.7pg/mL)、IL-8(從?10,000至?17,OOOpg/mL)和TNF-α(從?3至?15pg/mL)的分泌，和減少IL-1β(從?9至?2pg/mL)、IL-6(從?4至?2pg/mL)和GM-CSF(從?4至?lpg/mL)的分泌。[0053]LPA處理的⑶34+細胞在心肌梗塞后保護心臟功能[0054]已顯示梗塞后人⑶34+細胞在心臟中的移植改善了左心室射血分數(shù)并且保護心臟組織。為了評價LPA處理的⑶34+細胞的治療潛能，將利用LPA(100μM)處理的細胞(1Χ106個細胞）于血纖蛋白凝膠前體溶液（ιοομυ中遞送至裸大鼠的梗塞的心臟。通過冠狀動脈左前降支（LAD)的永久性結扎誘發(fā)心肌梗塞。將無任何處理的（假處理組）或利用懸浮于血纖蛋白凝膠前體溶液中的⑶34+細胞處理的梗塞的心臟用作對照。植入后2周，通過超聲心動描記術評價心臟的功能性質。對照大鼠的左心室在第1天和第2周分別具有42.7±1.6(η=10)和41.6±3.8(η=10)的平均縮短分數(shù)；利用封裝在血纖蛋白凝膠前體溶液中的CD34+細胞處理的大鼠在第1天和第2周分別具有36.7±3.4(η=6)和44.5±3.0(η=6)的平均縮短分數(shù)；最后利用LPA處理的并且封裝在血纖蛋白凝膠前體溶液中的⑶34+細胞處理的大鼠在第1天和第2周分別具有37.5±1.2(η=6)和47.0±2.0(η=6)的平均縮短分數(shù)（圖6Α)。因為初始縮短分數(shù)在實驗組間是不同的，因此使用第2周和第1天的縮短分數(shù)之差來比較處理的治療功效（圖6Β)。在LPA處理的細胞+凝膠組和假處理組中縮短分數(shù)的差異的中位數(shù)分別為7.5和2.6,差異在統(tǒng)計上是顯著的（Ρ〈0.05)。在利用⑶34+細胞與假處理處理的心臟之間未觀察到統(tǒng)計差異（Ρ>0.05)。綜上所述，LPA處理的⑶34+細胞至梗塞的心臟內(nèi)的遞送改善了心臟縮短分數(shù)，并且作用優(yōu)于未處理的⑶34+細胞。[0055]本發(fā)明當然絕不以任何方式限定于上述實施方案，本領域普通技術人員將預見其修飾的許多可能性而不背離所附權利要求中定義的本發(fā)明的基本概念。[0056]下列權利要求顯示了本發(fā)明的特定實施方案?！緳嗬蟆?.一種通過在包含溶血磷脂酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)造血干細胞來增強造血干細胞在低氧和去血清條件下的存活的方法。2.權利要求1的方法，其中所述造血干細胞為⑶34+細胞。3.權利要求2的方法，所述造血干細胞為從臍帶血或外周血分離的⑶34+。4.前述權利要求的方法，其中所述溶血磷脂酸的濃度在1至1000μΜ之間變化。5.前述權利要求的方法，其中所述溶血磷脂酸的濃度為100μΜ。6.-種包含造血干細胞和溶血磷脂酸的組合物。7.權利要求6的組合物，其中所述造血干細胞為⑶34+細胞。8.權利要求7的組合物，其中所述造血干細胞為從臍帶血或外周血分離的⑶34+。9.權利要求6-8的任一項的組合物，其中所述溶血磷脂酸的濃度在1至1000μΜ之間變化。10.權利要求9的組合物，其中所述溶血磷脂酸的濃度為100μΜ。11.權利要求6-10的任一項的組合物，其還包含凝膠，特別是仿生凝膠。12.權利要求6-11的任一項的組合物，其包含IX105-1Χ106個⑶34+細胞，和1-100μΜ的溶血磷脂酸，以及100-200mL的仿生凝膠。13.權利要求6-12的任一項的組合物，其中所述凝膠為下列物質的至少一種：血纖蛋白、透明質酸、藻酸鹽、瓊脂糖、膠原或PEG衍生物。14.權利要求6-13的任一項的組合物，其中所述凝膠為血纖蛋白。15.權利要求6-14的任一項中描述的組合物，其中所述組合物為藥物組合物、醫(yī)藥組合物或化妝品組合物。16.權利要求6-14的任一項的組合物，其中先前的組分以治療有效量存在。17.權利要求6-16的任一項中描述的組合物，其用于藥劑或化妝品。18.權利要求17的組合物，其用于細胞療法，即用于心臟組織。19.權利要求17的組合物，其用于治療心臟病。20.權利要求17的組合物，其用于治療傷口愈合。21.權利要求17的組合物，其用于治療糖尿病傷口愈合。22.前述權利要求的任一項的組合物，其還包含足夠量的賦形劑。23.前述權利要求的任一項的組合物，其中所述組合物是可注射制劑?！疚臋n編號】A61P17/02GK104254602SQ201380021644【公開日】2014年12月31日申請日期:2013年4月24日優(yōu)先權日:2012年4月24日【發(fā)明者】L·達席爾瓦費雷拉,I·M·費達爾戈多斯桑托斯席爾瓦卡瓦爾霍申請人:克瑞奧埃斯塔麥諾健康與技術股份有限公司