專利名稱：一種檢測間充質(zhì)干細(xì)胞分布的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測間充質(zhì)干細(xì)胞分布的方法，用于對(duì)外源性間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的存活、分布情況的研究。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，可以從成年個(gè)體的骨髓、脂肪、皮膚等組織中獲得，具有自我更新和多向分化能力，在體內(nèi)外特定的條件下能夠分化成為神經(jīng)細(xì)胞，心肌細(xì)胞，成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞等各種不同功能的細(xì)胞。研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞移植在臨床應(yīng)用中有著廣闊的前景，特別能對(duì)不具有再生能力的組織損傷進(jìn)行修復(fù)，對(duì)心肌梗死、創(chuàng)傷性腦損傷、糖尿病、肺損傷、肝損傷、癌癥可能具有重要的治療意義。要研究間充質(zhì)干細(xì)胞移植的治療效果，首先就要了解其在體內(nèi)分布的規(guī)律，例如系統(tǒng)性給予間充質(zhì)干細(xì)胞治療后其在各個(gè)臟器的分布，局部給予間充質(zhì)干細(xì)胞后的分布，在某些病理變化時(shí)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分布的影響，這些數(shù)據(jù)是開展間充質(zhì)干細(xì)胞治療研究的基礎(chǔ)?，F(xiàn)有技術(shù)中，用于跟蹤移植后間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)分布的方法主要有以下兩種: 熒光蛋白標(biāo)記法。熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)是利用基因載體將熒光蛋白基因?qū)氪龢?biāo)記
細(xì)胞，通過篩選獲得表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞，可通過熒光顯微鏡直接觀察，而不需反應(yīng)底物。突光蛋白為可自發(fā)產(chǎn)生突光的蛋白質(zhì)，主要包括綠色突光蛋白(green fluorescentprotein, GFP)和其衍生物黃色突光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)、藍(lán)色突光蛋白(bluefluorescent protein, BFP),以及紅色突光蛋白(red fluorescent protein,RFP)。YFP,BFP為GFP的突變體，熒光強(qiáng)度比野生型GFP高。綠色熒光蛋白基因具有高效、穩(wěn)定、無毒、易于檢測等特性，能在活細(xì)胞中直觀地觀察其表達(dá)，可較快篩選其修飾的細(xì)胞。這種技術(shù)主要的短處在 于:需要轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，價(jià)格較高；很多臟器組織帶有自發(fā)熒光成分，會(huì)干擾結(jié)果的觀察；只能在切片局部估計(jì)細(xì)胞的分布，很難在整體水平上定量細(xì)胞的分布。熒光染料標(biāo)記法。在分離細(xì)胞后，用一些親細(xì)胞的熒光活性染料染色細(xì)胞，再注射給動(dòng)物，通過組織學(xué)方法觀察染料的熒光，可以反映出細(xì)胞在體內(nèi)的分布。這種技術(shù)主要的短處在于:染色的效率不可能達(dá)到100%;染色會(huì)影響間充質(zhì)干細(xì)胞的功能；細(xì)胞的染色隨著時(shí)間的延長而丟失；染色細(xì)胞在分裂過程中染料會(huì)相應(yīng)分離到子代細(xì)胞中，導(dǎo)致熒光稀釋；臟器組織自發(fā)熒光的干擾；難以在整體水平上定量細(xì)胞的分布。所以需要開發(fā)更精確的檢測間充質(zhì)干細(xì)胞分布的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉的目的是提供一種簡單、精確的檢測間充質(zhì)干細(xì)胞分布的方法。本發(fā)明的原理是以雄性動(dòng)物作為供體，以雌性動(dòng)物作為受體，進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞移植，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增雄性細(xì)胞特異性的性別決定基因(SRY基因)中的片段，根據(jù)PCR產(chǎn)物的多少來測定雌性動(dòng)物體內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞的分布。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種檢測間充質(zhì)干細(xì)胞分布的方法，包括如下步驟:
(O將提取后的雄性動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞移植至雌性動(dòng)物體內(nèi)；
(2)細(xì)胞移植后提取組織基因組DNA并進(jìn)行定量:將樣本在組織消化液中45 55°C消化0.5 20小時(shí)；然后將消化液加入到同體積的氯仿中，震蕩,靜置5 10分鐘后離心分離，取上層液加入到同體積的異丙醇中，震蕩，靜置5 7分鐘后離心分離，棄上清，用75%的乙醇溶液洗滌沉淀；用紫外光分光光度計(jì)在260 nm處對(duì)洗滌后的沉淀進(jìn)行DNA定量；
(3)聚合酶鏈反應(yīng)及鑒定:以血紅蛋白β亞單位基因?yàn)閮?nèi)參基因，SRY基因?yàn)槟康幕?，分別設(shè)定引物，然后進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增；通過PCR產(chǎn)物的定量分析可以檢測間充質(zhì)干細(xì)胞在雌性動(dòng)物體內(nèi)的分布。上述技術(shù)方案中，所述雄性動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞來源于骨髓、脂肪或者皮膚組織；優(yōu)選為骨髓組織。上述技術(shù)方案中，組織消化液包括三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(TriS-HCl) 100mmol/L pH 8.0, NaCl 200 mmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA) 5 mmol/L，十二烷基硫酸鈉(SDS)2mg/ml,蛋白酶 K 0.lmg/ml。上述技術(shù)方案中，離心分離時(shí)的離心力為12000xg ;時(shí)間為lOmin。
本發(fā)明根據(jù)SRY基因的開放閱讀框堿基的序列以及定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物設(shè)計(jì)的規(guī)則，設(shè)計(jì)SRY基因引物一對(duì)，為SRY正向引物:TTGGAGTACAGGTGTGCAGC以及SRY反向引物:GCAGGTGGAAAAGCCTTACA，SRY基因擴(kuò)增片段為256 bp;同樣設(shè)計(jì)血紅蛋白β亞單位基因(HBBl)引物，為HBBl正向引物:GCTCCCTAGAATCGCTTCCC以及HBBl反向引物:TGAGCTCCACTGTGACAAGC, HBBl 基因擴(kuò)增片段為 138 bp。
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上述引物既可以用于常規(guī)PCR，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析；也可以用于基于SYBR Green方法的實(shí)時(shí)定量PCR。本發(fā)明中定量PCR的原理及數(shù)據(jù)分析方法已經(jīng)被J.H.Schefe公開(J.H.Schefe, K.E.Lehmann, 1.R.Buschmann, T.Unger, H.Funke-Kaiser, Quantitativereal-time RT-PCR data analysis: current concepts and the novel “geneexpression’s CT difference” formula, Journal of Molecular Medicine 2006 (84):901 - 910)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考。本發(fā)明中性別決定基因(Sex Determining Region Y, SRY)位于Y染色體上,是決定雄性發(fā)育的關(guān)鍵因子，只存在雄性哺乳動(dòng)物的基因組中，在哺乳動(dòng)物中高度保守，常常被用來作為性別鑒定的依據(jù)。聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一種在體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，主要由DNA變性、退火、延伸三個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)組成，通過設(shè)計(jì)特異性的引物，可以將目的DNA片段以指數(shù)形式擴(kuò)增，達(dá)到可以測定的水平，目前發(fā)展的實(shí)時(shí)定量PCR可以測定每個(gè)循環(huán)中DNA的量，從而更加精確地測定原始DNA的量。通過測定SRY基因PCR產(chǎn)物的量可以檢測間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)各組織間的分布。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明將來源于雄性供體含Y染色體的間充質(zhì)干細(xì)胞移植入雌性動(dòng)物體內(nèi)，并對(duì)Y染色體上的SRY基因進(jìn)行定量PCR，根據(jù)PCR產(chǎn)物的量可以檢測間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)各組織間的分布，移植前無需標(biāo)記，不受時(shí)間和細(xì)胞表型變化的影響，也不受組織類型的限定；2、本發(fā)明開發(fā)的檢測方法簡單，穩(wěn)定性好，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞、機(jī)體影響小，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，易于推廣應(yīng)用。


圖1是實(shí)施例一中雌性小鼠各個(gè)臟器中基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖和分析柱狀 圖2是實(shí)施例二中雌性小鼠各個(gè)臟器中基因的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果 圖3是實(shí)施例三中雌性小鼠血液中基因的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果 圖4是實(shí)施例四中雌性小鼠肺組織中基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖和分析柱狀圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述:
下述實(shí)例中PCR引物由invitrogen上海公司合成,用蒸懼水配置成20 μ mol/L ；PCR聚合酶采用寶生物大連公司的Taq酶；實(shí)時(shí)定量PCR試劑采用寶生物大連公司的SYBRPremix Ex Taq II，儀器采用ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀。實(shí)施例一檢測間充質(zhì)干細(xì)胞在各個(gè)臟器中的分布
(1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離和處理。雄性小鼠脫白處死，在無菌條件下取出股骨，用剪刀去除兩端使之貫通，用DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，離心獲得細(xì)胞，在含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將3 X IO5個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈注射給雌性小鼠；` (2)基因組DNA的提取。在注射I天后處死雌性小鼠，獲取腎、肺、脾、肝、心，將上述臟器充分剪碎，在組織消化液(Tris-HCl 100 mmol/L pH 8.0，NaCl 200 mmol/L, EDTA 5 mmol/L，SDS 2mg/ml，蛋白酶K 0.lmg/ml )55°C消化過夜，取0.5 ml消化液加0.5 ml氯仿，振蕩后靜置10分鐘，12000 Xg離心10分鐘，取0.4 ml上層液，加入0.4 ml異丙醇，振蕩后靜置5分鐘，12000 Xg離心10分鐘，棄上清，沉淀在I ml75%乙醇中洗滌一次。用紫外光分光光度計(jì)在260 nm處進(jìn)行DNA定量；
(3)PCR反應(yīng)及凝膠電泳鑒定。反應(yīng)體系為:Taq酶0.1 μ 1,10 X PCR緩沖液2 μ 1，dNTP 1.6 μ ，基因組DNA 0.2 μ g，正向反向引物各0.8 μ 1，用蒸餾水將體積補(bǔ)足至20μ I。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性2分鐘，變性94°C 30秒，退火60°C 30秒，延伸72°C 30秒，一共30個(gè)循環(huán)，之后72°C 7分鐘。配置2%的瓊脂糖凝膠，含0.1 μ g/ml的溴化乙錠，在100V電壓中電泳20至30分鐘,在紫外燈下觀察DNA條帶,用Photoshop軟件進(jìn)行條帶灰度分析。附圖1是上述雌性小鼠各個(gè)臟器中基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖和分析柱狀圖，其中A為SRY、HBB1基因的電泳圖，B為凝膠電泳分析結(jié)果，從中可以看出間充質(zhì)干細(xì)胞在各個(gè)臟器均有分布，并且分布從高到底分別是脾，肺，肝，腎，心。實(shí)施例二實(shí)時(shí)定量PCR檢測間充質(zhì)干細(xì)胞在各個(gè)臟器中的分布
(1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離和處理，基因組DNA的提取與定量，方法同實(shí)施例一；
(2)實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)體系為:SYBRPremix Ex Taq II 10 μ ，正向反向引物各0.4 μ I, ROX Reference Dye II 0.4 μ I,基因組DNA 0.1 μ g，用蒸懼水將體積補(bǔ)足至20μ 1，在ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，采用兩步法PCR反應(yīng)，條件為95°C預(yù)變性30秒，變性95°C 15秒，退火延伸60°C I分鐘，一共40個(gè)循環(huán)。融解曲線從55°C按照0.1°C /秒升至95 °C。用軟件分析Ct值和相對(duì)定量。附圖2是上述基因用實(shí)時(shí)定量PCR法測出的在雌性小鼠各個(gè)臟器中的相對(duì)定量結(jié)果圖，可以看出間充質(zhì)干細(xì)胞在各個(gè)臟器的分布從高到底分別是脾，肺，肝，腎，心，與實(shí)施
例一檢測結(jié)果一致。實(shí)施例三檢測間充質(zhì)干細(xì)胞在血液中的分布
(1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離和處理，方法同實(shí)施例一；
(2)血液基因組DNA的提取。在靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞后的不同時(shí)間處死小鼠，收集血液樣本0.2 ml,加入等體積的消化液(Tris-HCl 100 mmol/T, pH 8.0,NaCl 200 mmol/L,EDTA 5 mmol/L, SDS 2mg/ml，蛋白酶 K 0.lmg/ml )55°C消化 30 分鐘，之后加 0.4 ml 氯仿，振蕩后靜置10分鐘，12000 Xg離心10分鐘，取0.4 ml上層液，加入0.4 ml異丙醇，振蕩后靜置5分鐘，12000 Xg離心10分鐘，棄上清，沉淀在I ml75%乙醇中洗滌一次。用紫外光分光光度計(jì)在260 nm處進(jìn)行DNA定量；
(3)實(shí)時(shí)定量PCR，方法同實(shí)施例二；
附圖3為上述基因用實(shí)時(shí)定量PCR法測出在血液中不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)定量，可以看出間充質(zhì)干細(xì)胞隨著時(shí)間延長逐漸減少。實(shí)施例四檢測間充質(zhì)干細(xì)胞在肺組織中的分布
(1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離和處理，方法同實(shí)施例一； (2)肺組織基因組DNA的提取。在注射間充質(zhì)干細(xì)胞后不同時(shí)間內(nèi)處死小鼠，收取肺組織充分剪碎，按實(shí)施例一的方法提取基因組DNA并進(jìn)行定量；
(3)PCR反應(yīng)及凝膠電泳鑒定，方法同實(shí)施例一。附圖4為上述雌性小鼠不同時(shí)間肺組織中基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖與分析結(jié)果圖，其中A為電泳圖，B為凝膠電泳分析結(jié)果，從中可以看出間充質(zhì)干細(xì)胞第I天在肺組織含量最高，之后逐漸降低，到第7天后幾乎消失。
權(quán)利要求
1.一種檢測間充質(zhì)干細(xì)胞分布的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將提取后的雄性動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞移植至雌性動(dòng)物體內(nèi)； (2)細(xì)胞移植后提取組織基因組DNA并進(jìn)行定量:將樣本在組織消化液中45 55°C消化0.5 20小時(shí)；然后將消化 液加入到同體積的氯仿中，震蕩，靜置5 10分鐘后離心分離，取上層液加入到同體積的異丙醇中，震蕩，靜置5 7分鐘后離心分離，棄上清，用75%的乙醇溶液洗滌沉淀；用紫外光分光光度計(jì)在260 nm處對(duì)洗滌后的沉淀進(jìn)行DNA定量； (3)聚合酶鏈反應(yīng)及鑒定:以血紅蛋白β亞單位基因?yàn)閮?nèi)參基因，SRY基因?yàn)槟康幕?，分別設(shè)定引物，然后進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增；通過PCR產(chǎn)物的定量分析可以檢測間充質(zhì)干細(xì)胞在雌性動(dòng)物體內(nèi)的分布。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述雄性動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞來源于骨髓、脂肪或者皮膚組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述雄性動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞來源于骨髓組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述組織消化液包括三羥甲基氨基甲燒-鹽酸100 mmol/L pH 8.0, NaCl 200 mmol/L,乙二胺四乙酸5 mmol/L,十二燒基硫酸鈉2mg/ml 以及蛋白酶 K 0.lmg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述離心分離時(shí)的離心力為12000xg;時(shí)間為IOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測間充質(zhì)干細(xì)胞分布的方法，包括將雄性動(dòng)物間充質(zhì)干細(xì)胞移植至雌性動(dòng)物體內(nèi)；然后提取基因組DNA并進(jìn)行定量；以血紅蛋白β亞單位基因?yàn)閮?nèi)參基因，SRY基因?yàn)槟康幕?，分別設(shè)定引物，然后進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增；通過PCR產(chǎn)物的定量分析可以檢測間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的分布。本發(fā)明開發(fā)的檢測方法簡單，移植前無需標(biāo)記，不受時(shí)間和細(xì)胞表型變化的影響，也不受組織類型的限定；穩(wěn)定性好，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞、機(jī)體影響小，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，易于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103243169SQ201310189450
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月21日
發(fā)明者俞家華, 劉芬菊, 袁小鵬, 顧成, 王潔, 楊磊 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)