一種癌癥早期基因診斷試劑盒及診斷方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及癌癥基因診斷和基因治療領(lǐng)域，尤其涉及一種癌癥早期基因診斷試劑 盒及診斷方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)研宄出關(guān)于癌癥發(fā)病的原理和病因，癌癥發(fā)病有以下步驟：1，致 病基因突變/擴(kuò)增；2,其調(diào)芐基因缺失/失活；3,癌變基因擴(kuò)增：骨髓等組織干細(xì)胞從只有 致病基因突變/擴(kuò)增的癌前干細(xì)胞，發(fā)展為擁有致病基因和癌變基因雙擴(kuò)增的癌干細(xì)胞； 4,癌干細(xì)胞表面多個(gè)生長(zhǎng)因子受體與其微環(huán)境中多種生長(zhǎng)因子間的互動(dòng)，推動(dòng)癌干細(xì)胞集 落向癌瘤發(fā)展；5,在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子及其受體等因素介導(dǎo)下發(fā)生癌瘤細(xì)胞侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，并形 成新部位的癌瘤。
[0003] 目前，國(guó)內(nèi)外流行的基因診斷多采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)技術(shù)。采用已知基因的 一對(duì)引物（primers)，以待測(cè)生物標(biāo)本DNA作模板，在特定的反應(yīng)系統(tǒng)中，經(jīng)過(guò)熱變性-退 火-延伸，數(shù)十個(gè)循環(huán)后，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物作聚丙烯酰胺電泳分析，觀察電泳帶型及其強(qiáng)度，判 斷待測(cè)基因擴(kuò)增與否，及其與疾病的關(guān)系。近10幾年來(lái)，在此基礎(chǔ)上作技術(shù)改進(jìn)，發(fā)明適時(shí) 定量PCR儀，克服了普通PCR儀的缺點(diǎn)，并使產(chǎn)物定量化，從而更適合臨床使用。
[0004] 為了徹底戰(zhàn)勝癌癥，本發(fā)明創(chuàng)作者經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期努力，在創(chuàng)立癌癥早期基因治療技術(shù) 并應(yīng)用于臨床的同時(shí)，開(kāi)發(fā)出癌癥早期基因診斷技術(shù)和晚期癌特定組合的靶向治療加基因 治療技術(shù)。這些都是前所未有的發(fā)明和創(chuàng)造。而非對(duì)某項(xiàng)技術(shù)的補(bǔ)充。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種癌癥早期基因診斷試劑盒及診斷方法，滿足癌癥早期 基因治療的需要。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種癌癥早期基因診斷試劑盒，試劑盒包含致病基 因和癌變基因兩對(duì)PCR引物；
[0007] 其中，V-erbB PCR引物序列如下：
[0008] Pl:5 'CAC TGT GTG AAG GCC TGC 3' ；
[0009] P2 :5 VTT ATA AAT AGT GCC AAA AGC 3,；
[0010] TS引物序列根據(jù)TS基因編碼區(qū)隨機(jī)設(shè)計(jì)。
[0011] 本發(fā)明還提供一種癌癥早期基因診斷試劑盒的診斷方法，采用聚合酶鏈反應(yīng)方 法，即針對(duì)上述兩基因設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，會(huì)同其它試劑組合而成基因診斷試劑盒；
[0012] 步驟a，骨髓細(xì)胞模板DNA的提取：用小刀將患者骨髓涂片上的細(xì)胞刮下來(lái)，收集 于 1.5ml EP 管內(nèi)，加入 TEN(15Mm Tris，15mM EDTA，15mM Nacl，PH8.0)液 500ul，10% SDS 75ul，蛋白酶K(2.0mg/ml)10ul，于55°C水浴中孵育5小時(shí)；
[0013] 步驟b，聚合酶鏈反應(yīng)條件：模板變性條件為97 °C，7分鐘，32個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中 變性條件為94°C 5分鐘，退火條件為52°C，1分鐘，延伸條件為72°C，2分鐘，最后一次循環(huán) 之后延伸時(shí)間為5分鐘，取出置于4°C保存。
[0014] 現(xiàn)將本基因診斷法產(chǎn)生之前的研發(fā)過(guò)程簡(jiǎn)述如下：
[0015] 1，吸收國(guó)外有關(guān)研宄成果即禽類原始紅細(xì)胞增多癥（Avian Erythroblastosis) 及其傳染性致病病毒（AEV-ES4)基因組所含癌基因 V-erbB和V-erbA。正是它們的協(xié)同作 用導(dǎo)致禽類紅白血病的發(fā)生。研宄證明，V-erbB產(chǎn)物與EGFR-TK，高度同源且EGFR在大多 數(shù)腫瘤高表達(dá)。針對(duì)EGFR的單抗和針對(duì)TK的小分子抑制劑治療腫瘤均有效。
[0016] 2,引進(jìn)上述病毒癌基因作探針和Southern blot雜交技術(shù)，對(duì)急性白血病，腫瘤， MDS，特別是家族性白血病和MDS，進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)和一系列分子生物學(xué)研宄。并最終證明， 內(nèi)源性V-erbB是白血病等癌癥共同致病基因。它的缺失或插入等突變并擴(kuò)增，導(dǎo)致白血病 等癌癥的發(fā)生。
[0017] 3,骨髓細(xì)胞姐妹染色單體分染和互換（S⑶/SCE)技術(shù)證明：1) S⑶陰性（細(xì)胞周 期成倍延長(zhǎng)）之MDS，轉(zhuǎn)白血病的機(jī)制在于骨髓造血細(xì)胞TS基因協(xié)同擴(kuò)增；2)骨髓細(xì)胞SCE 水平（SCE/Cell)愈高，其原始程度愈高。換言之，干細(xì)胞有最高水平SCE，說(shuō)明它最易于發(fā) 生突變。鑒于國(guó)外認(rèn)為癌癥是干細(xì)胞基因突變所致，我們因而認(rèn)為，上述內(nèi)源性V-erbB突 變最大可能發(fā)生于骨髓和組織干細(xì)胞。
[0018] 4,骨髓發(fā)生代賞性增生的機(jī)制在于骨髓干細(xì)胞發(fā)生EGFR，TS/TK等基因擴(kuò)增。此 間，已有V-erbB突變/擴(kuò)增的白前干細(xì)胞勢(shì)必發(fā)生上述代賞性增生和相應(yīng)的基因擴(kuò)增，從 而形成擁有雙重癌基因擴(kuò)增的癌干細(xì)胞。美國(guó)NIH證明，TS基因是個(gè)癌基因，我們則認(rèn)定 此基因?yàn)榘┳兓颉Ｒ驗(yàn)樗鼜?qiáng)化了癌前干細(xì)胞的增殖力，使骨髓原始和早幼粒細(xì)胞％增加， 同時(shí)染色體和細(xì)胞周期異常檢出率也增加。MDS患者轉(zhuǎn)白血病率也增加。因此，白血病等癌 癥發(fā)生的重大危險(xiǎn)在于癌干細(xì)胞生成及其癌克隆形成和隨后的發(fā)展。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的有益效果在于：本專利的目的在于對(duì)癌癥作早期基 因診斷，即同時(shí)檢測(cè)骨髓標(biāo)本是否有致病基因和癌變基因的擴(kuò)增，以便進(jìn)行基因治療和預(yù) 防，實(shí)現(xiàn)癌癥的治愈。而晚期癌治療很困難，費(fèi)用很高，死亡率也高。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為本發(fā)明的適應(yīng)癥MDS疾病發(fā)展演進(jìn)圖；
[0021] 圖2為本發(fā)明的PCR產(chǎn)物電泳圖A ;
[0022] 圖3為本發(fā)明的PCR產(chǎn)物電泳圖B ;
[0023] 圖4為本發(fā)明的圖B的光掃描圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 以下，對(duì)本發(fā)明上述的和另外的技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)作更詳細(xì)的說(shuō)明。
[0025] 本發(fā)明的試劑盒旨在早期發(fā)現(xiàn)和診斷白血病等癌癥，以便早期基因治療和預(yù)防。 從而避免發(fā)展到晚期，轉(zhuǎn)移和死亡。因此，本發(fā)明中的試劑盒將主要針對(duì)不同癌癥共同致病 基因和癌變基因的擴(kuò)增，采用PCR基因擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
[0026] 本發(fā)明的試劑盒的成分為：試劑盒包含致病基因和癌變基因兩對(duì)PCR引物；
[0027] 其中，V-erbB PCR引物序列如下：
[0028] Pl:5 'CAC TGT GTG AAG GCC TGC 3' ；
[0029] P2 :5 VTT ATA AAT AGT GCC AAA AGC 3' ；
[0030] TS引物序列根據(jù)TS基因編碼區(qū)隨機(jī)設(shè)計(jì)。
[0031] 本發(fā)明的試劑盒的使用方法：采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)方法，即針對(duì)上述兩基因 設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，會(huì)同此反應(yīng)的其它試劑組合而成基因診斷試劑盒；
[0032] 步驟1，骨髓細(xì)胞模板DNA的提取：用小刀將患者骨髓涂片上的細(xì)胞刮下來(lái)，收集 于 1.5ml EP 管內(nèi)，加入 TEN(15Mm Tris，15mM EDTA，15mM Nacl，ΡΗ8.0)液 500ul，10% SDS 75ul，蛋白酶K(2.0mg/ml)10ul，于55°C水浴中孵育5小時(shí)。
[0033] 步驟2,聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)條件：模板變性條件為97°C，7分鐘，32個(gè)循環(huán)，每個(gè) 循環(huán)中變性條件為94°C 5分鐘，退火條件為52°C，1分鐘，延伸條件為72°C，2分鐘，最后一 次循環(huán)之后延伸時(shí)間為5分鐘，取出置于4°C保存。
[0034] PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：1. 8%瓊脂糖凝膠電泳，每孔點(diǎn)樣品（PCR產(chǎn)物）IOul，60V，30mA， 電泳20-25分鐘，EB染色，紫外燈下觀察結(jié)果。
[0035] PCR檢測(cè)結(jié)果：
[0036] 對(duì)32例MDS和12例可疑MDS作PCR檢測(cè)結(jié)果如下：（I) RA和可疑RA有其特殊的 PCR產(chǎn)物電泳帶型即4條大小不同的條紋，如圖2所示，其為PCR產(chǎn)物電泳圖A，顯示RA和 RAEB，有4條帶紋；圖3為本發(fā)明的PCR產(chǎn)物電泳圖B，顯示AA (再障）無(wú)帶紋，其母親有兩 條較小的帶紋。
[0037] (2)典型再障（AA)和ITP均無(wú)帶紋；
[0038] (3)可疑AA有1-2條帶，與早期紅血病相似；
[0039] (4)少數(shù)ITP和溶貧（HA)有1-2條帶紋；
[0040] (5)正常人和巨幼貧（MA)無(wú)帶；其他貧血病和出血病均無(wú)此帶型。表明其高度的 特異性。
[0041] 表1 44例MDS和可疑MDS患者骨髓檢查結(jié)果
[0042]
[0043] 注：*含4例+8而PCR均陰性者，扣除此4例，其PCR陽(yáng)性率應(yīng)為87. 5%，表中少 數(shù)病例未做S⑶或核型分析。
[0044] 本發(fā)明的試劑盒的適應(yīng)癥：1，骨髓增生異常綜合癥（MDS) ;2,骨髓增殖性腫瘤 (MPN) ;3,急性白血病完全緩解（AL-CR) ;4,多種腫瘤早期（重度增生）。
[0045] 本發(fā)明試劑盒的規(guī)格：2ml和20ml兩種。具有10人份，50人份和100人份，三種。
[0046] 用法用量：
[0047] 靜脈注射：每公斤體重1-3單位，1次/日X3為一個(gè)療程；
[0048] 局部注射：每公分瘤體直徑1-2單位，1次/日X3為一個(gè)療程。
[0049] 試劑盒的保存期：冰箱（4°C )，保存3個(gè)月。采用玻璃安培包裝。
[0050] 結(jié)果判斷：
[0051] 1，對(duì)致病基因檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)且有高考貝數(shù)擴(kuò)增者，視為白血病前期或 MDS-RA (S)，或癌早期；
[0052] 2,對(duì)致病基因和癌變基因呈雙陽(yáng)性反應(yīng)且有高考貝數(shù)擴(kuò)增者，視為高危MDS或急 性白血病，或原位癌；
[0053] 3,對(duì)僅有癌變基因呈陽(yáng)性反應(yīng)者，應(yīng)除外白前和癌前。
[0054] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，對(duì)發(fā)明而言僅僅是說(shuō)明性的，而非限制性的。 本專業(yè)技術(shù)人員理解，在發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多改變，修改， 甚至等效，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種癌癥早期基因診斷試劑盒，其特征在于，試劑盒包含致病基因和癌變基因兩對(duì) PCR引物； 其中，V-erbBPCR引物序列如下： Pl:5'CACTGTGTGAAGGCCTGC3' ； P2 :5YTTATAAATAGTGCCAAAAGC3' ； TS引物序列根據(jù)TS基因編碼區(qū)隨機(jī)設(shè)計(jì)。2. -種癌癥早期基因診斷試劑盒的診斷方法，其特征在于，采用聚合酶鏈反應(yīng)方法，即 針對(duì)上述兩個(gè)癌基因設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，會(huì)同其它試劑組合而成基因診斷試劑盒； 步驟1，骨髓細(xì)胞模板DNA的提?。河眯〉秾⒒颊吖撬柰科系募?xì)胞刮下來(lái)，收集于 1.5mlEP管內(nèi)，加入TEN(15MmTris，15mMEDTA，15mMNacl，PH8.0)液 500ul，10%SDS 75ul，蛋白酶K(2.0mg/ml)10ul，于55°C水浴中孵育5小時(shí)。 步驟2,聚合酶鏈反應(yīng)條件：模板變性條件為97°C，7分鐘，32個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中變性 條件為94°C5分鐘，退火條件為52°C，1分鐘，延伸條件為72°C，2分鐘，最后一次循環(huán)之后 延伸時(shí)間為5分鐘，取出置于4°C保存。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種癌癥早期基因診斷試劑盒及診斷方法，使用檢測(cè)癌癥致病基因和癌變基因擴(kuò)增的兩對(duì)引物，以疑似MDS或癌癥早期的骨髓或癌組織DNA作模板，在定量PCR儀器上作PCR反應(yīng)。根據(jù)此PCR特異性陽(yáng)性反應(yīng)與否及強(qiáng)度，判斷該患者是否系MDS或早MDS，或癌前期。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN104928358
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510076089
【發(fā)明人】馮寶章
【申請(qǐng)人】馮寶章
【公開(kāi)日】2015年9月23日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日