專利名稱：核-殼型三模態(tài)納米造影劑、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多模態(tài)影像技術(shù)，具體涉及ー種MRI/NIR/CT三模態(tài)納米造影剤、其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是威脅人類健康的重要疾病之一，腫瘤的早期診斷和治療是提高患者生存質(zhì)量和治愈率的關(guān)鍵。目前，應(yīng)用于腫瘤的分子顯像技術(shù)有光學(xué)成像技木、CT(電腦斷層掃描)成像技術(shù)、MRI (磁共振成像)分子成像技術(shù)、超聲分子影像技術(shù)、SPECT技術(shù)、PET技術(shù)以及NIR (近紅外熒光成像)技木。但是，単一分子影像技術(shù)存在著自身難以克服的缺陷，如熒光成像在人體尤其深部組織很難獲得定量信息，CT成像技術(shù)缺乏特異性靶向?qū)Ρ葎暢上穹直媛实偷?。単一的成像方式不足以充分的獲取腫瘤信息，聯(lián)合使用多種分子成像技術(shù)可實(shí)現(xiàn)彼此優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，為明確診斷提供更加精確全面的信息。 多模態(tài)分子影像技術(shù)將同時(shí)具有多種現(xiàn)象功能的分子探針注入機(jī)體，通過(guò)多種成像技術(shù)的檢測(cè)，獲取病變部位多種信息，而多模態(tài)分子影像探針合成是多模態(tài)分子影像技術(shù)的核心。納米技術(shù)的發(fā)展為多模態(tài)分子影像探針的研究提供了良好的平臺(tái)，通過(guò)納米載體結(jié)合多種影像功能，應(yīng)用于腫瘤早期的檢測(cè)和診斷?，F(xiàn)有技術(shù)中，大量基于納米技術(shù)的分子影像探針得到開發(fā)，如量子點(diǎn)、磁性納米粒子、近紅外熒光染料及放射性標(biāo)記分子，但仍不能很好的解決腫瘤靶向性低的問(wèn)題和生物毒性的問(wèn)題。人血清白蛋白是血漿中含量最高的蛋白質(zhì)，現(xiàn)有技術(shù)中出現(xiàn)了以人血清白蛋白作為載體的納米藥物，該納米藥物具有良好的生物相容性和腫瘤靶向性，原因在于腫瘤細(xì)胞對(duì)人血清白蛋白作為載體的納米藥物具有選擇吞噬性，腫瘤細(xì)胞代謝旺盛，會(huì)主動(dòng)攝取納米藥物中的人血清白蛋白，為自身能量來(lái)源，而正常細(xì)胞無(wú)上述效應(yīng)，因此，以人血清白蛋白為載體的納米粒子在解決多模態(tài)納米影像探針的腫瘤靶向性問(wèn)題上具有潛在的價(jià)值。另外，直徑大于20nm的納米粒子易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)吞噬，導(dǎo)致其效率和靈敏度降低。直徑小于IOnm的納米粒子易被體內(nèi)的淋巴系統(tǒng)所清理，生物毒性降低。同吋，直徑小于IOnm的納米粒子更易利用腫瘤組織內(nèi)血管系統(tǒng)的高滲透性，實(shí)現(xiàn)腫瘤直接靶向，不僅能進(jìn)入病變器官或組織，還能進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部。因此，直徑小于IOnm的多模態(tài)納米影像探針在解決腫瘤靶向性問(wèn)題及生物毒性問(wèn)題上均有潛在的價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明g在解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明一方面提出ー種核-売型三模態(tài)納米造影剤，包括金屬納米簇內(nèi)核，所述金屬納米簇內(nèi)核包括金屬，以及組裝在金屬外作為保護(hù)基團(tuán)的人血清白蛋白；包裹所述金屬納米內(nèi)核的順磁性金屬離子配合物外売，所述外殼包括通過(guò)酰胺鍵與人血清蛋白共價(jià)連接的螯合劑，及配位結(jié)合于螯合劑上的順磁性金屬離子。優(yōu)選地，所述核-殼型納米造影剤直徑小于10nm。
優(yōu)選地,所述的金屬納米簇為人血清蛋白-金納米簇或人血清蛋白-銀納米簇。優(yōu)選地，所述的螯合劑為こニ胺四こ酸(EDTA)或ニこ三胺五こ酸(DTPA)。優(yōu)選地，所述的順磁性金屬離子為錳離子、鐵離子或鑭系稀土元素的三價(jià)離子。優(yōu)選地，所述的順磁性金屬離子為Gd3+。本發(fā)明另一方面提供了 制備所述的核-殼型納米造影剤的方法，包括金屬納米簇制備金屬離子與人血清白蛋白混合，得到第一混合液，將第一混合液的PH值調(diào)至10. 0-14. 0，反應(yīng)得到金屬納米簇溶液；螯合劑與金屬納米簇共價(jià)結(jié)合于所得金屬納米簇溶液中加入緩沖液，得到第二混合溶液，于第二混合溶液中加入螯合剤，得到第三混合溶液，將第三混合溶液的PH值調(diào)至6. 0-14. 0，反應(yīng)得到螯合劑-金屬納米簇溶液；螯合劑-金屬納米簇與順磁性金屬離子配位結(jié)合于酸性溶液中，將順磁性金屬離子溶解，得到第四混合液，將第四混合液與螯合剤-金屬納米簇溶液混合，得到第五混合液，將第五混合溶液的PH值調(diào)至6. 0-8. 0，反應(yīng)，得到核-殼型納米造影剤溶液。優(yōu)選地，所述制備方法還包括將核-殼型納米造影剤溶液置于透析袋，分別于緩沖液及雙蒸水中透析。優(yōu)選地，所述金屬納米簇制備中金屬的物質(zhì)的量與人血清白蛋白的質(zhì)量比為(5-10) u mo1:(25-50) mg。優(yōu)選地，所述螯合劑與金屬納米簇共價(jià)結(jié)合中人血清白蛋白與螯合劑質(zhì)量比為(100-200):(28-50)。本發(fā)明提供的核-殼型三模態(tài)納米造影剤因含有具有在近紅外光區(qū)具有熒光效應(yīng)的金屬納米簇內(nèi)核，可用于NIR成像；本發(fā)明的造影剤的外殼中含有具有核磁共振效應(yīng)的順磁性金屬離子，所述造影劑還可用于MRI成像；本發(fā)明的造影剤的金屬納米簇內(nèi)核中通常含有高原子序數(shù)的金或銀，X射線的吸收率高，本發(fā)明的造影剤具有納米尺寸小，更易進(jìn)入組織或器官，改變組織或器官對(duì)X射線的吸收，因此所述造影劑還可用于CT成像。本發(fā)明的有益效果在干，結(jié)合納米技木，以人血清白蛋白為載體連接順磁性金屬離子，實(shí)現(xiàn)了 NIR、CT和MRI三模態(tài)成像，提高了腫瘤靶向性；所制備的核-殼型納米造影剤粒徑小，生物毒性低；制備方法簡(jiǎn)單。


圖1是實(shí)施例1中制備的核-殼型納米造影剤的透射電鏡圖。
具體實(shí)施例方式為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本申請(qǐng)的技術(shù)方案，下面將結(jié)合本申請(qǐng)實(shí)施例中的附圖，對(duì)本申請(qǐng)實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。本發(fā)明綜合了納米技術(shù)、人血清白蛋白的腫瘤靶向性與順磁性物質(zhì)的MRI造影功能三者，發(fā)明了ー種造影剤，有效實(shí)現(xiàn)了 NIR、CT和MRI三模態(tài)成像。本發(fā)明的造影劑為核-殼型納米造影剤，其內(nèi)核為金屬納米簇，由金屬和人血清白蛋白構(gòu)成，是ー種由金屬的幾個(gè)至幾十個(gè)原子組成核心，人血清白蛋白作為保護(hù)基團(tuán)組裝而成的分子級(jí)聚集體。例如，本發(fā)明中的金屬納米簇可為人血清蛋白-金納米簇或人血清蛋白-銀納米簇。金屬納米簇是具有熒光的水溶性分子聚集體，其特有的量子尺寸效應(yīng)使其熒光發(fā)射光譜在可見光到近紅外光區(qū)范圍內(nèi)可諧調(diào)。同吋，良好的生物相容性和光穩(wěn)定性使其成為高性能的生物標(biāo)記物。核-殼型納米造影剤的外殼由順磁性金屬離子配合物構(gòu)成，包括通過(guò)酰胺鍵與內(nèi)核中人血清蛋白共價(jià)連接的螯合劑，及配位結(jié)合于螯合劑上的順磁性金屬離子。通過(guò)在金屬納米簇內(nèi)核上引入順磁性物質(zhì)使本發(fā)明的造影剤具有MRI成像功能。例如，螯合劑可為こニ胺四こ酸(EDTA)或ニこ三胺五こ酸(DTPA)，但不排除其他可用的螯合剤。順磁性金屬離子選用錳離子、鐵離子或鑭系稀土元素的三價(jià)離子。順磁性金屬離子優(yōu)選為Gd3+、Eu3+、Fe3+或Mn2+，更優(yōu)選為Gd3+或Mn2+，最優(yōu)選為Gd3+。本發(fā)明還提供制備該核-殼型納米造影剤的方法，主要包括以下步驟首先，制備金屬納米簇。金屬納米簇中包含金屬與人血清白蛋白，用于形成核-殼 型納米造影剤內(nèi)核部分的組成。將金屬離子與人血清白蛋白混合，得到第一混合液，將第一混合液的PH值調(diào)至10. 0-14. 0，反應(yīng)得到金屬納米簇溶液。制備第一混合液時(shí)可通過(guò)攪拌、震蕩、超聲等方式來(lái)幫助均勻混合。調(diào)節(jié)第一混合液PH值可選用NaOH溶液或KOH溶液。反應(yīng)條件優(yōu)選為溫育，更優(yōu)選為37°C溫育，伴隨溫和攪拌或置于搖床上輕微震蕩。所述金屬納米簇制備中金屬的物質(zhì)的量與人血清白蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為(5-10) u mo1:(25-50)mg,更優(yōu)選為 I U mo1:1Omg-1 u mo 1: 5mg,最優(yōu)選為 I U mo1:1Omg 或 I ii mo 1: 5mg。然后，制備螯合劑與金屬納米簇共價(jià)結(jié)合物(螯合劑-金屬納米簇)。于所得金屬納米簇溶液中加入緩沖液，得到第二混合溶液，于第二混合溶液中加入螯合劑，得到第三混合溶液，將第三混合溶液的PH值調(diào)至6. 0-14. 0，反應(yīng)得到螯合劑-金屬納米簇溶液。所加緩沖液優(yōu)選為PH6-14的PBS溶液，制備第二混合液或第三混合液時(shí)可通過(guò)攪拌、震蕩等方式來(lái)幫助均勻混合。通過(guò)滴加NaOH溶液或KOH溶液調(diào)節(jié)第三混合液pH值。反應(yīng)溫度優(yōu)選為室溫，伴隨溫和攪拌或置于搖床上輕微震蕩。所述螯合劑與金屬納米簇共價(jià)結(jié)合中人血清白蛋白與螯合劑質(zhì)量比優(yōu)選為為(100-200) :(28-50)，更優(yōu)選為100:25-100:32，最優(yōu)選為 100:28,125:40 或 200:50。接著，制備含有順磁性金屬離子的酸性溶液，并與上述螯合劑-金屬納米簇溶液混合制備核-殼型納米造影剤。于酸性溶液中，將順磁性金屬離子溶解，得到第四混合液，將第四混合液與螯合劑-金屬納米簇溶液混合，得到第五混合液，將第五混合溶液的PH值調(diào)至6. 0-8. 0，反應(yīng)，得到核-殼型納米造影剤溶液。通過(guò)滴加NaOH溶液或KOH溶液調(diào)節(jié)第五混合液PH值。反應(yīng)溫度優(yōu)選為室溫，伴隨溫和攪拌或置于搖床上輕微震蕩。形成在溶液中的核-殼型納米造影剤可以進(jìn)ー步純化。將核-殼型納米造影剤溶液置于透析袋，分別于緩沖液及雙蒸水中透析。透析的目的是去除無(wú)機(jī)小分子。所述緩沖液優(yōu)選為PBS溶液。將核-殼型納米造影剤溶液置于透析袋，首先于PBS溶液中透析l-300h，每l_12h更換PBS溶液；再置于雙蒸水內(nèi)透析l_12h。以下為實(shí)施例。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。原料與試劑氯金酸溶液；HAS (人血清白蛋白)溶液；DTPACA (ニこ三胺五こ酸環(huán)酐)；PBS (磷酸鹽緩沖液)溶液；NaOH溶液；HC1溶液；GdCl3. 6H20 ;雙蒸水。實(shí)施例1a、金納米簇的制備將lOmmol/L氯金酸溶液和50mg/mL HSA溶液于37°C下溫浴，使上述兩種溶液恒溫至37°C，將0. 5mL氯金酸溶液加入到0. 5mL HSA溶液中，混合均勻，再加入lmol/L NaOH溶液0. 05mL,調(diào)節(jié)pH值為強(qiáng)堿性(pH10. 0-14. 0)，將所得混合液置于37°C搖床溫育12h，形成金屬納米簇溶液。
b、螯合劑與金屬納米簇共價(jià)結(jié)合取上述金屬納米簇溶液4ml，加入0. 2mL PBS溶液(2mol/L，pH=9)，混合，向上述混合溶液中加入28mg DTPACA粉末，用5mol/L NaOH溶液滴定，調(diào)整pH值至6. 0-8. 0，室溫下置于搖床反應(yīng)2h，得到螯合劑-金屬納米簇溶液。C、螯合劑-金屬納米簇與順磁性金屬離子配位結(jié)合稱取30mg GdCl3. 6H20溶于lmLlmol/L HCl中，得到Gd3+酸性溶液，將Gd3+酸性溶液倒入所得螯合剤-金屬納米簇溶液中，用5mol/LNa0H溶液滴定，調(diào)整pH值至6. 0-8. 0，室溫下置于搖床反應(yīng)2h，得到核-殼型納米造影剤溶液。d、核-殼型納米造影劑純化將所得核-殼型納米造影剤溶液移入透析袋，室溫下，將透析袋置于500ml PBS緩沖液內(nèi)透析16h，每8h換液新的PBS緩沖液，后將透析袋置于500ml雙蒸水內(nèi)透析8h，除去溶液中無(wú)機(jī)小分子。圖1是本實(shí)施例中制備的核-殼型納米造影剤的透射電鏡圖，由圖1可知，本發(fā)明的核-殼型納米造影剤粒徑小(直徑小于10nm)，分散性好，懸浮穩(wěn)定性好。實(shí)施例2a、金納米簇的制備將10mmol/L氯金酸溶液和50mg/mL HSA溶液于37°C下溫浴，使上述兩種溶液恒溫至37°C，將ImL氯金酸溶液加入到ImL HSA溶液中，混合均勻，再加入lmol/L NaOH溶液0. 05mL，調(diào)節(jié)pH值為強(qiáng)堿性(pH10. 0-14. 0)，將所得混合液置于37°C搖床溫育24h，形成金屬納米簇溶液。b、螯合劑與金屬納米簇共價(jià)結(jié)合取上述金屬納米簇溶液5ml，加入0. 2mL PBS溶液(4mol/L，pH=9)，混合，向上述混合溶液中加入40mg DTPACA粉末，用5mol/LNa0H溶液滴定，調(diào)整pH值至9. 0，室溫下置于搖床反應(yīng)Ih,得到螯合劑-金屬納米簇溶液。C、螯合劑-金屬納米簇與順磁性金屬離子配位結(jié)合稱取50mg GdCl3. 6H20 溶于 0. 05mLlmol/L HCl 中，得到 GcT 酸性溶液，將 GcT 酸性溶液倒入所得螯合剤-金屬納米簇溶液中，用3mol/L NaOH溶液滴定，調(diào)整pH值至10. 0，室溫下置于搖床反應(yīng)lh，得到核-殼型納米造影剤溶液。d、核-殼型納米造影劑純化將所得核-殼型納米造影剤溶液移入透析袋，室溫下，將透析袋置于500ml PBS緩沖液內(nèi)透析16h，每8h換液新的PBS緩沖液，后將透析袋置于500ml雙蒸水內(nèi)透析8h，除去溶液中無(wú)機(jī)小分子。
實(shí)施例3a、金納米簇的制備將20mmol/L氯金酸溶液和100mg/mL HSA溶液于37°C下溫浴，使上述兩種溶液恒溫至37°C，將0. 5mL氯金酸溶液加入到0. 5mL HSA溶液中，混合均勻，再加入lmol/L NaOH溶液0.1mL,調(diào)節(jié)pH值為強(qiáng)堿性(pH10. 0-14. 0)，將所得混合液置于37°C搖床溫育20h，形成金屬納米簇溶液。b、螯合劑與金屬納米簇共價(jià)結(jié)合取上述金屬納米簇溶液4ml,加入0.1mL PBS溶液(3mol/L,pH=9),混合，向上述混合溶液中加入50mg DTPACA粉末，用3mol/LNa0H溶液滴定，調(diào)整pH值至10. 0，室溫下置于 搖床反應(yīng)3h,得到螯合劑-金屬納米簇溶液。C、螯合劑-金屬納米簇與順磁性金屬離子配位結(jié)合稱取 70mg GdCl3. 6H20 溶于 3mL0. 5mol/L HCl 中，得到 Gd3+ 酸性溶液，將 Gd3+ 酸性溶液倒入所得螯合剤-金屬納米簇溶液中，用6mol/LNa0H溶液滴定，調(diào)整pH值至9. 0，室溫下置于搖床反應(yīng)3h，得到核-殼型納米造影剤溶液。d、核-殼型納米造影劑純化將所得核-殼型納米造影剤溶液移入透析袋，室溫下，將透析袋置于500ml PBS緩沖液內(nèi)透析32h，每8h換液新的PBS緩沖液，后將透析袋置于500ml雙蒸水內(nèi)透析8h，除去溶液中無(wú)機(jī)小分子。以上所述的本發(fā)明實(shí)施方式，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種核-殼型二模態(tài)納米造影劑，包括金屬納米簇內(nèi)核，所述金屬納米簇內(nèi)核包括金屬，以及組裝在金屬外作為保護(hù)基團(tuán)的人血清白蛋白；和包裹所述金屬納米內(nèi)核的順磁性金屬離子配合物外殼，所述外殼包括通過(guò)酰胺鍵與人血清蛋白共價(jià)連接的螯合劑，及配位結(jié)合于螯合劑上的順磁性金屬離子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核-殼型三模態(tài)納米造影劑，其特征在于，直徑小于10nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核-殼型三模態(tài)納米造影劑，其特征在于，所述的金屬納米簇為人血清蛋白-金納米簇或人血清蛋白-銀納米簇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核-殼型三模態(tài)納米造影劑，其特征在于，所述的螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)或二乙三胺五乙酸(DTPA)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核-殼型三模態(tài)納米造影劑，其特征在于，所述的順磁性金屬離子為錳離子、鐵離子或鑭系稀土元素的三價(jià)離子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的核-殼型三模態(tài)納米造影劑，其特征在于，所述的順磁性金屬離子為Gd3+。
7.制備權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的核-殼型納米三模態(tài)造影劑的方法，包括金屬納米簇制備金屬離子與人血清白蛋白混合，得到第一混合液，將第一混合液的 PH值調(diào)至10. 0-14. O,反應(yīng)得到金屬納米簇溶液；螯合劑與金屬納米簇共價(jià)結(jié)合于所得金屬納米簇溶液中加入緩沖液，得到第二混合溶液，于第二混合溶液中加入螯合劑，得到第三混合溶液，將第三混合溶液的PH值調(diào)至6.0-14. O,反應(yīng)得到螯合劑-金屬納米簇溶液；螯合劑-金屬納米簇與順磁性金屬離子配位結(jié)合于酸性溶液中，將順磁性金屬離子溶解，得到第四混合液，將第四混合液與螯合劑-金屬納米簇溶液混合，得到第五混合液， 將第五混合溶液的PH值調(diào)至6. 0-8. 0，反應(yīng)，得到核-殼型納米造影劑溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，還包括將核-殼型三模態(tài)納米造影劑溶液置于透析袋，分別于緩沖液及雙蒸水中透析。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述金屬納米簇制備中金屬的物質(zhì)的量與人血清白蛋白的質(zhì)量比為(5-10) μ mo1:(25-50) mg。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述螯合劑與金屬納米簇共價(jià)結(jié)合中人血清白蛋白與螯合劑質(zhì)量比為(100-200) (28-50)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種核-殼型三模態(tài)納米造影劑，包括金屬納米簇內(nèi)核，所述金屬納米簇內(nèi)核包括金屬，以及組裝在金屬外作為保護(hù)基團(tuán)的人血清白蛋白；包裹所述金屬納米內(nèi)核的順磁性金屬離子配合物外殼，所述外殼包括通過(guò)酰胺鍵與人血清蛋白共價(jià)連接的螯合劑，及配位結(jié)合于螯合劑上的順磁性金屬離子。本發(fā)明還提供了上述核-殼型三模態(tài)納米造影劑的制備方法。
文檔編號(hào)A61K49/14GK103007303SQ20121055326
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者蔡林濤, 胡德紅, 盛宗海, 龔萍, 高篤陽(yáng), 張鵬飛 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院