一種核磁共振造影劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于腫瘤醫(yī)學(xué)成像的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種葡聚糖包覆AMnF3納米晶作為核磁共振成像造影劑。本發(fā)明提供正常組織細胞容易內(nèi)吞，而病變組織細胞不易吞噬造，從而提高病變組織影像對比度的磁共振造影劑。所述造影劑為納米核殼結(jié)構(gòu)。還提供了造影劑的合成方法與體外理化性能表征，細胞與組織相容性，血液相容性和血液保留時間。在原發(fā)性肝癌和結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移肝模型中，葡聚糖包覆AMnF3納米晶增強的磁共振成像可以明顯提高肝部腫瘤的可視度，最小辨別尺寸達到0.4mm。
【專利說明】一種核磁共振造影劑及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及磁共振造影劑的診斷藥物體內(nèi)成像，涉及一種新型磁共振造影劑，該造影劑通過被動靶向到正常肝、脾、淋巴等組織或細胞，從而獲得臟器病變區(qū)域的高對比度顯影成像。

【背景技術(shù)】
[0002]肝臟和脾臟是非常重要的器官，肝臟以代謝功能為主，同時起著去氧化，儲存肝糖，分泌性蛋白質(zhì)的合成等作用。另外也制造消化系統(tǒng)中之膽汁。而脾臟則是重要的淋巴器官，具有造血、濾血、清除衰老血細胞及參與免疫反應(yīng)等功能。這兩個器官的一個共同特征是都含有豐富的單核吞噬細胞。
[0003]肝、膽以及淋巴系統(tǒng)疾病發(fā)病率非常高，以肝癌為例，肝癌因惡性程度高，被稱為“癌中之王”。中國是肝癌高發(fā)國家，全世界50%以上的新發(fā)和死亡肝癌患者都在中國。肝癌分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，前者是肝臟本身的惡性腫瘤，后者為轉(zhuǎn)移性腫瘤。臨床上，肝癌起病隱匿，超過60%的肝癌患者在初次就診時已經(jīng)進入中晚期，失去根治機會，總體5年生存率只有7%左右。對于大多數(shù)肝癌早期患者來說，進行肝癌手術(shù)切除是能夠徹底診治的(生存期達到五年)。一般肝癌早期的診治手術(shù)切除的預(yù)后與切除時的大小有關(guān)。如2厘米小肝癌切除后的5年存活率為81.5%;而4.1-5.0厘米的肝癌，5年存活率降至59.5%。因此，加強肝癌的預(yù)防和高危人群的定期監(jiān)測，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是增大肝癌患者存活率的關(guān)鍵。而早期的發(fā)現(xiàn)與診斷的一個重要臨床途徑即是通過醫(yī)學(xué)影像手段直接觀察。
[0004]磁共振是目前公認的最安全的醫(yī)學(xué)成像技術(shù)，而在臨床的磁共振成像中，由于病變組織或者不同組織之間的影像對比度不夠大，而往往無法診斷，常用的方法是往患者體內(nèi)注射對比劑或稱造影劑，這些磁性的造影劑可以通過縮短所到之處的氫信號燈弛豫時間從而提高該部分的對比度，從影像上即是是所到部位亮度更亮或者更暗，前者成為Tl造影齊U，后者為T2造影劑，由于與體內(nèi)一些背景信號容易發(fā)生混淆，因此臨床上一般使用Tl造影劑。目前最廣泛使用的是馬根維顯。在其發(fā)現(xiàn)的二十多年里已經(jīng)受益于數(shù)千萬患者。
[0005]然而類似這樣的小分子造影劑缺乏靶向性，因此對于肝部腫瘤的診斷并無很大作用。亟需發(fā)展對肝部具有器官靶向性的造影劑。肝部有豐富的單核吞噬細胞，因此，在過去的幾年中，以實現(xiàn)提高肝臟病變的可視化為目標(biāo)，人們已經(jīng)集中于發(fā)展對單核吞噬細胞系統(tǒng)(MPS)具有靶向性的造影劑。而在體內(nèi)肝臟成像的二十多年間，磁性的納米粒子成為這一類造影劑的主要候選材料，而且數(shù)目仍在擴大。靶向單核吞噬細胞系統(tǒng)(MPS)核磁共振成像造影劑(MRI)主要有兩種材料:前面所述的SP1 (超順磁性氧化鐵納米顆粒)和包覆小分子造影劑的順磁性脂質(zhì)體。T2造影劑SP1靜脈注射后被單核吞噬細胞系統(tǒng)(MPS)吸收，主要被肝竇狀隙的巨噬細胞KupfTer細胞吸收，而不論是原發(fā)性的癌組織或是轉(zhuǎn)移肝部的癌組織都幾乎不含Kupffer細胞。肝癌變的檢測中，葡聚糖包覆的SP1注射液(菲立磁，F(xiàn)eridex )是該磁性材料系列產(chǎn)品中首個基于納米顆粒的造影劑。然而，近年來用于磁共振造影劑的SP1產(chǎn)品相繼在美國和歐洲市場撤下。
[0006]除了早期的原發(fā)性肝癌診斷，對更為常見的肝部轉(zhuǎn)移癌，發(fā)展具有肝部高度靶向的Tl造影劑對我們這個肝癌大國具有重要意義。與原發(fā)性肝癌相比，轉(zhuǎn)移肝部的癌組織由于尺寸小，分散性高，比正常組織血管化低，使得納米粒子很難進入轉(zhuǎn)移癌組織，從而使得肝轉(zhuǎn)移診斷面臨更大的挑戰(zhàn)。此外，這樣高效的造影劑對于肝部癌變治療(切除，化療，放療)后的恢復(fù)也可以及時得到反饋信息。
[0007]那么如何實現(xiàn)肝部的靶向性，目前的主動靶向主要通過靶向分子與體內(nèi)的靶標(biāo)通過特異性高度生物識別，但是他們在體內(nèi)循環(huán)時往往會失去靶向作用。而肝被動靶向成像，通過眾所周知的MPS效應(yīng)或稱RES效應(yīng)，即大分子或者納米尺寸材料非常容易被巨噬細胞吞噬。其原理和SP1作為肝部癌變造影劑是一樣的。
[0008]因此，主要被肝脾MPS系統(tǒng)吸收且具有高弛豫率的生物相容性的順磁納米粒子，可以作為潛在有效的T1肝造影劑。近來，一些順磁納米材料(如MnO，Gd2O3)是新發(fā)展的T1造影劑，然而，進入臨床應(yīng)用前需要徹底解決存在爭議的問題，比如未知的毒性，體內(nèi)弛豫效率，和藥代動力學(xué)。直至今日，特異性的T1肝脾納米造影劑還未報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于，提供一種適用于肝脾部特異性增強磁共振成像的納米晶造影劑及其制備方法。該方法簡單，易大規(guī)模制備。同時表征了該納米造影劑的理化性質(zhì)，產(chǎn)品穩(wěn)定性，生物相容性，以及藥代動力學(xué)。同時與現(xiàn)有特異性的肝細胞性MRI對比劑錳福地吡三鈉(MnDPDP)比較，在化學(xué)誘導(dǎo)肝癌和結(jié)直腸轉(zhuǎn)移肝癌兩種動物肝癌模型中驗證其增強效果，而且比MnDPDP更優(yōu)。同時與聚乙二醇包覆的AMnF3納米晶比較其成像效果，以上研究為臨床上早期發(fā)現(xiàn)和診斷肝部腫瘤提供數(shù)據(jù)和經(jīng)驗。
[0010]本發(fā)明采用了下述技術(shù)方案:
一種核磁共振造影劑，其特征在于，所述造影劑為納米核殼結(jié)構(gòu)，核部分為鈣鈦礦結(jié)構(gòu)的AMnF3納米晶，其中A代表鈉或者鉀離子；殼部分為葡聚糖。
[0011]其中，AMnF3納米晶優(yōu)選KMnF3納米晶。
[0012]其中，葡聚糖選自dextran40。
[0013]其中，葡聚糖選自羧基化的葡聚糖，且為在葡聚糖上引入羧甲基或者是通過氧化劑將葡聚糖的部分端基氧化為羧酸的形式。
[0014]一種核磁共振造影劑的制備方法，
(1)AMnF3納米晶由熱分解方法合成，得到的納米晶為油胺包覆的AMnF3納米晶；
(2)油胺包覆的AMnF3納米晶溶于溶劑(例如氯仿)中，與羧基化葡聚糖的溶液(例如，二甲基亞砜)混合攪拌12-36小時，得到懸浮液；
(3)將懸浮液離心得到沉淀物用乙醇洗數(shù)遍，干燥。
[0015]一種葡聚糖包覆AMnF3納米晶核磁共振造影劑藥物的用途，其特征在于，使用所述核磁共振造影劑進行體內(nèi)成像。
[0016]其中，體內(nèi)成像選自肝臟、脾臟、淋巴等臟器或組織。
[0017]其用于Tl核磁共振成像。
[0018]其中，所述制備核磁共振造影劑藥物的用途，優(yōu)選但不限于肝臟、脾臟、淋巴等臟器或組織，只要通過提高劑量使得組織富集足以成像劑量的造影劑即可。
[0019]本發(fā)明具有以下技術(shù)特點:
I)具有肝脾被動靶向性的Tl納米晶造影劑，尺寸在18-23納米之間，選擇具有高穩(wěn)定鈣鈦礦結(jié)構(gòu)的磁性AMnF3納米晶作為核結(jié)構(gòu)。
[0020]2)化學(xué)溶液法合成出的AMnF3納米晶是親油憎水的，必須將其表面從憎水轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水，我們采用配體交換法將親水的葡聚糖(分子量40KD，以下提及的葡聚糖均為該分子量)與原有的油胺交換。
[0021]3)應(yīng)用于肝脾共振造影劑的Tl納米晶造影劑特征在于，絕大部分注入體內(nèi)的造影劑被正常肝脾吸收，主要為肝脾的巨噬細胞，而相應(yīng)部位的癌變組織則不會吞噬。
[0022]4)本發(fā)明提供一種葡聚糖包覆AMnF3納米晶作為新的肝脾Tl核磁成像造影劑及其動物活體應(yīng)用。該納米探針采用溶液方法合成，步驟簡易可行。本發(fā)明納米晶水溶性良好，結(jié)晶度高，具有高的弛豫效率G1為12 mT1.S—1)。細胞納米毒性測試包括細胞增殖，氧化應(yīng)激，細胞膜完整性，結(jié)果表明葡聚糖修飾的AMnF3納米晶具有較高的生物相容性。器官分布測試表明該探針主要被肝脾吸收，在適當(dāng)?shù)臅r間之內(nèi)排出體外。組織病理學(xué)測試表明注射探針3天后沒有產(chǎn)生組織損傷。血液分析進一步表明該造影劑具有良好血液相容性。對原發(fā)性肝癌和結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移性肝癌模型中，肝腫瘤被清楚的辨別，最小辨別尺寸達到
0.4mm。
[0023]5)對照同樣錳劑量的MnDPDP，觀察其對上述兩種肝部腫瘤的造影效果。評估二者對病變部位成像的特點。
[0024]6)選擇不同的表面化學(xué)修飾，包括另外一種可注射的高分子材料聚乙二醇PEG1500包覆在晶核表面，觀察其在同樣劑量下對上述兩種肝部腫瘤的造影效果，評估其成像特點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1a為實施例一產(chǎn)物的透射電鏡測試結(jié)果。透射電鏡圖表明產(chǎn)物為正方體，邊長在18-23nm間，圖1b圖為實施例一產(chǎn)物的水化半徑的時間穩(wěn)定性。圖1c圖為實施例一產(chǎn)物的傅里葉紅外儀(FT-1R)結(jié)果，傅里葉轉(zhuǎn)換紅外譜圖證明本發(fā)明的葡聚糖被成功的修飾在納米立方體表面上，1080cm-1為葡聚糖的C-OH伸縮振動。d圖為實施例一產(chǎn)物的橫向弛豫效率，3T場強下測得造影劑的體外弛豫效率Γι為12 mT1.S—1。
[0026]圖2a為實施例一產(chǎn)物的細胞毒性，MTT法細胞毒性測試結(jié)果表明在0.1-1mM范圍內(nèi)，本發(fā)明的探針沒有對小鼠肝和腎細胞活力造成影響，細胞存活率達到95%以上，沒有表現(xiàn)出明顯細胞毒性，當(dāng)濃度高至1mM時，細胞存活率降至50%，表明僅當(dāng)錳含量高時才表現(xiàn)出毒性。圖2b為實施例一產(chǎn)物分別在生理鹽水，腎細胞，肝細胞，和過氧化水溶液處理下的熒光光譜，看出其基本上沒有引起氧化應(yīng)激。
[0027]圖3為用臺盼藍對細胞染色進一步驗證加入實施例一產(chǎn)物處理后細胞膜的完整性。臺盼藍染色進一步表明加入納米造影劑培養(yǎng)后細胞仍可維持膜完整性。
[0028]圖4a是實施例一產(chǎn)物按照劑量5mmol/kg注射小鼠后不同時間段收集老鼠的主要器官的錳含量分布圖，圖4b為相應(yīng)的血液中錳含量隨時間變化曲線。在主要器官肝，腎，脾，肺，心和腦分布隨時間0，0.5，2，12，48，96 h變化過程中，主要集中在肝和腎中，4天后基本從體內(nèi)排出。
[0029]圖5為實施例一產(chǎn)物按照劑量5mmol/kg注射小鼠后不同時間段肝，腎，脾，肺，心和腦組織的，蘇木精-伊紅染色圖，Oh為沒有注射探針的空白對照圖。
[0030]圖6為實施例一產(chǎn)物按照劑量5mmol/kg注射小鼠0.5h到3天的血液分析圖，包括紅細胞數(shù)目，白細胞數(shù)目，血紅蛋白濃度(MCHC)，平均紅細胞體積(MCV)，紅細胞平均血紅蛋白量(MCH)，平均血紅蛋白濃度，紅細胞體積分布寬度(RDW)，血小板數(shù)目(PLT)，血小板壓積(PCT)，血小板平均體積(MPV)，血小板分布寬度(PDW)。
[0031]圖7為實施例一產(chǎn)物按照劑量5mmol/kg注射小鼠0.5h到3天的與肝疾病相關(guān)的血化分析結(jié)果圖，包括谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，堿性磷酸酶(ALP)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)，直接膽紅素(DB)，總膽紅素(TB)，蛋白質(zhì)總量(TP)，血清白蛋白(ALB)。
[0032]圖8兩種腫瘤小鼠模型的切片顯微照片，顯示活體中腫瘤病樣的形成。
[0033]圖9實施例一產(chǎn)物按照劑量5mmol/kg注射小鼠即使觀察到的原發(fā)性肝癌和直腸癌肝轉(zhuǎn)移MRI成像圖，所有病變大小范圍從0.4毫米到I毫米(如白色箭頭指向的損傷點為0.8毫米)。通常轉(zhuǎn)移的病變形狀不規(guī)則，而相對于原發(fā)性病變?yōu)榍蛐巍Ｒ虼藢⒈景l(fā)明造影劑應(yīng)用于肝癌的核磁共振成像中，兩種肝癌模型原發(fā)性肝癌和結(jié)直腸轉(zhuǎn)移肝癌MRI顯影結(jié)果都清楚地顯示腫瘤病變位置與大小。與上述結(jié)果類似。
[0034]圖10實施例二中注射相同劑量(5mmolMn/kg)的肝造影劑MnDPDP作為對照組而獲得的兩種腫瘤小鼠的MRI。可以看出正常肝組織在注射MnDPDP亮度沒有明顯的提升，因此腫瘤組織沒有很清晰的顯現(xiàn)出來。
[0035]圖11對比例一 PEG-1500包覆的KMnF3納米晶電鏡圖與注射相同劑量(5mmolMn/kg)的PEG-1500包覆的KMnF3納米晶作為對照組而獲得的原發(fā)性腫瘤小鼠的MRI。
[0036]圖12葡聚糖、PEG-1500包覆的KMnF3納米晶、MnDPDP尺寸，蓄積，與成像效果對照總結(jié)表。其中，PEG包裹的KMnF3主要在腎臟富集并代謝，也富集于肝、脾但相比較于等量劑量下葡聚糖包覆的KMnF3納米晶，成像不明顯；MnDPDP對肝、脾有一定效果但不如葡聚糖包覆的KMnF3納米晶好。

【具體實施方式】
[0037]本發(fā)明所述核磁共振造影劑的具體制備和應(yīng)用實驗步驟如下:
【l]AMnF3納米晶由熱分解方法合成，通過油胺I毫升，油胺I毫升，1_十八碳烯8毫升，甲醇2毫升，油酸錳197.7毫克，氟化鉀或者氟化鈉1.2毫摩爾，氮氣保護反應(yīng)，得到的納米晶為油胺包覆的油溶性物質(zhì)。
[0038]【2】油溶性轉(zhuǎn)水溶性配體交換過程為，油胺包覆的AMnF3納米晶溶于氯仿中，與羧基化的葡聚糖(分子量40KD)的二甲基亞砜溶液混合，攪拌過夜，將懸浮液離心得到沉淀物用乙醇洗，干燥一部分，使用前分散在生理鹽水中。以表征其電子顯微相和水化半徑穩(wěn)定性。葡聚糖在最后的產(chǎn)物的質(zhì)量按照總量減去游離的量。
[0039]【3】粉末狀樣品直接進行傅立葉紅外吸收光譜(FTIR)表征以確定表面是否有葡聚糖或其衍生物，分散在無水乙醇當(dāng)中的樣品進行電子透射顯微鏡測試觀察AMnF3納米顆粒的形貌尺寸，取分散在去離子水中的樣品配成五份濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.8、lmM的溶液放在5ml的玻璃管中，進行縱向弛豫時間常數(shù)Tl的測定。
[0040][4]MTT法和臺盼藍染色，葡聚糖修飾AMnF3納米晶的體外細胞毒性測試由3_ (4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法測定。將新生老鼠抽取的肝和腎細胞培養(yǎng)在含有10ul DMEM培養(yǎng)基(10000個細胞)的96微孔板中，溫度保持37°C，培養(yǎng)24小時后，用100 ul含有納米探針的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞。納米探針的測定濃度為0.1，LlOmM Mn/L3個不同濃度樣品，對照組為不含納米粒子的培養(yǎng)基。37°C下培養(yǎng)24小時后，棄掉納米粒子懸浮液，用PBS緩沖液洗滌細胞兩次，然后加入1ul MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h至甲臜染料的形成，移除懸浮液后加入150ul DMSO溶液溶解紫色甲臜產(chǎn)物，最后用酶標(biāo)儀測量490nm處的光吸收。臺盼藍染色步驟遵循標(biāo)準方法操作為37°C下用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)肝和腎細胞(105/ml)24小時，最后加入樣品的濃度為ImM，然后用臺盼藍室溫下培養(yǎng)細胞1_2分鐘，記錄藍色的死細胞來測定細胞的存活率。
[0041]【5】氧化應(yīng)激測試。氧化應(yīng)激測試是通過檢測2',T -二氯熒光黃(DCF)的熒光強度增長來測定細胞內(nèi)活性氧ROS形成。不發(fā)光的熒光染料2' ,T 二氯氫化熒光素乙二脂(H2DCFDA)進入細胞后進行酯酶作用脫去二脂產(chǎn)生2' ,T 二氯氫化熒光素(H2DCF),H2DCF被ROS氧化生成發(fā)熒光的DCF。ROS的含量與DCF的熒光強度成正比，從而實現(xiàn)測定ROS的變化。將I X 14肝或腎細胞培養(yǎng)在含有10ul的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基(10000個細胞)的96微孔板中，24小時后，用PBS緩沖液洗滌細胞一次，加入含ImM Mn的納米晶樣品在無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時。用PBS緩沖液洗滌細胞，加入50 μ mo I/LH2DCFDA繼續(xù)培養(yǎng)40分鐘。用PBS洗去自由H2DCFDA,用HBSS平衡鹽溶液繼續(xù)培養(yǎng)I小時，530nm處測定熒光強度。
[0042]【6】器官分布和血液分析.所有動物實驗遵循美國國家衛(wèi)生研究院的指導(dǎo)方針和南昌大學(xué)實驗室動物保護和使用條例，購買的6周大ICR老鼠體重在20-22克范圍。老鼠隨機分為6組，按照錳含量計算，麻醉后尾靜脈注射5mmol/kg的納米造影劑，以生理鹽水為對照組。注射后不同時間段(0.5，2，12，48和96 h)，處死老鼠，灌注生理鹽水后收集肝，腎，脾，肺，心和腦組織，同時，在不同時間段通過肝素化毛細管從眶周取100 μ L的血液，然后用熱的高氯酸和硝酸混合酸加熱分解。用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)器官和血液中Mn2+的濃度。
[0043]【7】全血分析。按照錳含量計算，以劑量5mmol/kg注射多組老鼠納米探針或者生理鹽水，每組3只，采用HEMAVET 850FS動物血液分析儀(Drew Scientific)進行血液分析。血化分析過程如下，老鼠麻醉后，在不同時間段從眶周取0.SmL血液轉(zhuǎn)到含EDTA的聚丙烯微管中，然后處死老鼠。4小時后，樣品在3500轉(zhuǎn)離心15分鐘得到血清。所有血化指標(biāo)采用血化分析儀(TC6020)同時測定。
[0044]【8】組織病理學(xué)。病理學(xué)研究采用標(biāo)準伊紅染色法對納米造影劑進行潛在的器官毒性評估。將以上處死的小鼠不同器官樣品用福爾馬林固定嵌在石蠟里，以4um大小連續(xù)切片然后進行染色處理，用光學(xué)顯微鏡觀察病理參數(shù)。所有老鼠注射納米探針和生理鹽水后，從0.5小時到連續(xù)觀察3天，得到的6個組織切片染色后用光學(xué)顯微鏡觀察。
[0045]【9】腫瘤動物模型。I)原發(fā)性肝腫瘤模型。以劑量100mg/kg注射出生后2周的老鼠二乙基亞硝胺(DEN)，2周饑餓處理后以劑量20mg/kg注射2-乙酰氨基芴(2-AAF，橄欖油溶解)，2周后再次注射2-AAF。然后所有小鼠12h白天/黑夜循環(huán)，供給水和食物，正常條件培養(yǎng)。小鼠月齡6-7個月后觀察MRI成像，然后處死小鼠切除肝并立即在液態(tài)氮冷凍進行病理切片。2)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。37°C，5%的CO2條件下，用含有10%胎牛血清，100U/ml的盤尼西林和100 μ g/ml的鏈霉素的RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人結(jié)腸癌細胞SW480。脾臟內(nèi)注射結(jié)腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移過程如下，小鼠麻醉后，左側(cè)橫剖腹腔0.5cm，暴露脾臟，在脾臟末端進針，注射含5 X 15 SW480的50μ1 PBS細胞懸液，用醫(yī)用棉球按住針孔止血防止癌漏進腹腔。腹腔縫合和術(shù)后疼痛緩解處理如上所述，注射脾臟后不會引起死亡。
[0046]【10】體內(nèi)MRI和病理切片。采用西門子3特斯拉磁共振掃描儀進行體內(nèi)磁共振成像測試，以Tl自旋回波加權(quán)序列(TR/TE = 549/16 ms，層面厚度=0.6 mm，視場=24X49mm2，矩陣尺寸=192X384)測定，進行體內(nèi)造影效果評估。為了提高病變組織的可視化，層面厚度設(shè)置為最小值0.6mm。按照錳含量計算，將荷瘤小鼠麻醉后尾靜脈注射5mmol/kg的納米造影劑。MRI測試完后所有小鼠處死進行病理切片，遵照標(biāo)準蘇木精-伊紅染色法步驟。
[0047]【11】增加交換葡聚糖的量至3ml，與油胺包覆的AMnF3納米晶混合溶于氯仿中，與PEG1500的二甲基亞砜溶液混合，攪拌過夜，將懸浮液離心得到沉淀物用乙醇洗，干燥，使用前分散在生理鹽水中。
[0048]【12】以注射相同劑量(5mmolMn/kg)的肝造影劑MnDTO作為對照組。采用西門子3特斯拉磁共振掃描儀進行體內(nèi)磁共振成像測試，以Tl自旋回波加權(quán)序列(TR/TE = 549/16ms,層面厚度=0.6 mm,視場=24X49 mm2,矩陣尺寸=192X384)測定,進行體內(nèi)造影效果評估。為了提高病變組織的可視化，層面厚度設(shè)置為最小值0.6_。
[0049]【13】以同樣質(zhì)量的PEG1500替換葡聚糖40KD，油胺包覆的AMnF3納米晶溶于氯仿中，與PEG1500的二甲基亞砜溶液混合，攪拌過夜，將懸浮液離心得到沉淀物用乙醇洗，干燥，使用前分散在生理鹽水中。
[0050]【14】腫瘤模型建立與造影劑對比評估方法。為研究該新的錳類MRI造影劑作為肝脾病變判斷的有效性。通過小鼠模擬臨床的化學(xué)誘導(dǎo)肝癌和直腸癌轉(zhuǎn)移肝癌，前者一般在誘導(dǎo)5-6個月發(fā)病，解剖后有肉眼可見的腫瘤塊。而后者一般在一周左右時間即可有彌散于肝部的腫瘤塊。注射采取與臨床相同的注射方式，即靜脈注射，對小鼠易操作的靜脈注射為尾靜脈注射。以上納米造影劑注射量均按照MnDPDP說明書推薦的劑量5mmol/kg?？紤]有效性，每個造影劑至少測試三組小鼠，每組兩個小鼠，一個為原發(fā)肝癌一個為轉(zhuǎn)移肝癌。造影劑的效果主要觀察，I)在體內(nèi)的代謝，包括器官蓄積，血液半衰期等。按照FDA的要求，作為診斷試劑必須完全代謝出體外。這也是作為診斷試劑安全性的一個重要指標(biāo)。2)有效性，即觀察腫瘤與背景對比度在注射前后的增強效果。
[0051]實施例1:18-23nm大小的AMnF3納米晶由熱分解方法合成，通過油胺I毫升，油胺I毫升，1-十八碳烯8毫升，甲醇2毫升，油酸錳197.7毫克，氟化鉀或者氟化鈉1.2毫摩爾，290 V氮氣保護反應(yīng)90分鐘，得到的納米晶為油胺包覆的油溶性物質(zhì)。油溶性轉(zhuǎn)水溶性配體交換過程為，ImL油胺包覆的AMnF3納米晶溶于氯仿中(10 mg/mL),與ImL羧基化葡聚糖(40KD)的二甲基亞砜DMSO溶液(20 mg/mL)混合，攪拌過夜，將懸浮液離心得到沉淀物用乙醇洗3遍，一部分干燥，一部分干燥后分散在ImL生理鹽水中。按照標(biāo)準操作進行MRI增強。劑量5mmol/kg。注射量0.1暈升。
[0052]實施例2:購置的MnDPDP粉劑溶于生理鹽水中。按照標(biāo)準操作進行MRI增強。劑量5mmol/kg。注射量0.1暈升。
[0053]對比例1:PEG包覆的AMnF3納米晶，納米晶由熱分解方法合成，通過油酸油胺，1-十八碳烯，甲醇，油酸錳，氟化鉀或者氟化鈉體系下290°C氮氣保護反應(yīng)90分鐘，得到的納米晶為油胺包覆的油溶性物質(zhì)。ImL油胺包覆的AMnF3納米晶溶于氯仿中(10 mg/mL),與ImL聚乙二醇PEG (分子量1500)的二甲基亞砜DMSO溶液(20 mg/mL)混合，攪拌過夜，將懸浮液離心得到沉淀物用乙醇洗3遍，一部分干燥，一部分干燥后分散在ImL生理鹽水中。按照標(biāo)準操作進行MRI增強。劑量5mmol/kg。注射量0.1暈升。
[0054]對實施例1和實施例2所制備的核磁共振造影劑與對立例I按前述的方法作性能測試和對比分析，結(jié)果如圖1-12所示。
【權(quán)利要求】
1.一種核磁共振造影劑，其特征在于，所述造影劑為納米核殼結(jié)構(gòu)，核部分為鈣鈦礦結(jié)構(gòu)的八111？3納米晶，其中八代表鈉或者鉀離子；殼部分為葡聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核磁共振造影劑，其特征在于所述葡聚糖選自1^6X1:1^1140。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核磁共振造影劑，其特征在于所述葡聚糖選自羧基化的葡聚糖，且為在葡聚糖上引入羧甲基或者是通過氧化劑將葡聚糖的部分端基氧化為羧酸的形式。
4.一種權(quán)利要求1所述的核磁共振造影劑的制備方法，(1 納米晶由熱分解方法合成，得到的納米晶為油胺包覆的八111？3納米晶；(2)油胺包覆的八111？3納米晶溶于溶劑中，與葡聚糖的溶液混合攪拌12-36小時，得到懸浮液；(3)將懸浮液離心得到沉淀物用乙醇洗數(shù)遍，干燥。
5.一種權(quán)利要求1所述核磁共振造影劑的用途，其特征在于用作核磁共振造影劑進行體內(nèi)成像。
6.根據(jù)權(quán)利要求6所述核磁共振造影劑的用途，其特征是在于所述核磁共振造影劑用于肝臟、脾臟、淋巴成像。
7.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述核磁共振造影劑的用途，其特征在于用于II核磁共振成像。
【文檔編號】A61K49/12GK104306999SQ201410468026
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】唐群, 宋小霞, 萬紅平 申請人:南昌大學(xué)