專利名稱：麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗癌藥物的制備,尤其涉及ー種麻花究& -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高寒藏藥麻花究系龍膽科(Gentianaceae)、龍膽屬(Gentiana),主要分布于西 藏、青海、甘肅海拔2500-4700米的高寒地區(qū)，多年生草本，全草及根入藥，由于其分布散，生長期長，藥材收集極為困難，因而已成為瀕危物種。主治黃膽性肝炎，風濕關(guān)節(jié)痛、結(jié)核病潮熱、哮喘、抽搐、休克、過敏反應(yīng)。富含五環(huán)三萜類次生代謝物，P-amyrin(0-香樹素)是其中的ー類重要的三萜類化合物。^ -amyrin是植物中最常見的三職類化合物之一。它的五碳環(huán)骨架,折疊為椅式構(gòu)象，是由2, 3-氧化角S烯經(jīng)過一系列反應(yīng)在P-amyrin合成酶催化下形成的。而其合成酶是該途徑中非常重要的限速酶，控制著這些藥用成分前體合成的第一步反應(yīng)，因此對該基因的克隆具有極其重要的意義。齊墩果酸是該反應(yīng)中的最終產(chǎn)物，在龍膽科植物麻花艽中^ -amyrin合成酶基因?qū)τ诳垢窝子行С煞铸R墩果酸的積累具有很高的促進作用。到現(xiàn)在為止，已從許多雙子葉植物中分離到了 P-amyrin合成酶基因，如雙子葉人參中的PNY1，PNY2 ;干草中的GgbASl ;豌豆中的PSY ;還有截形苜蓿和白樺等單子葉植物燕麥中的AsbASl。并有文章報道對其功能的驗證。盡管麻花究中P-amyrin合成酶基因GsAS的克隆和功能驗證已有報道,但是,利用麻花究^ -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物制備抗肝癌藥物還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明要解決的問題是提供ー種麻花究0-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述麻花究^ -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用，其中所述肝癌細胞是HepG2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞；有效抑制H印G2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞生長的麻花艽P -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物濃度為I 25 ii g/mL,優(yōu)選濃度為10 V- g/mL。本發(fā)明提供的麻花究^ -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物為研制開發(fā)抗肝癌藥物奠定了基礎(chǔ)。為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì),下面用麻花究P-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物藥理實驗及結(jié)果來說明其在抗肝癌藥物制備中的應(yīng)用。本發(fā)明所述麻花究^ -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物的制備利用麻花艽cDNA為模板，克隆得到P -amyrin合成酶基因GsAS，構(gòu)建酵母表達載體pPICZA-GsAS，轉(zhuǎn)化酵母，酵母轉(zhuǎn)化后會形成甲醇誘導型(Mut+)和甲醇敏感型(Muts)菌株，在MM培養(yǎng)基上生長而在MD培養(yǎng)基上不生長的菌株為Muts型酵母菌株，而在兩種培養(yǎng)基上都能生長的為Mut+型酵母菌株。對比pPICZA-GsAS酵母轉(zhuǎn)化子在含MM (含甲醇培養(yǎng)基)和MD(無甲醇培養(yǎng)基)培養(yǎng)基上的生長情況，篩選出Mut+酵母轉(zhuǎn)化子。挑選Mut+酵母菌于25mL MGY培養(yǎng)基中28°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl = 2_6，轉(zhuǎn)接到100_200mL MM培養(yǎng)基中，使其OD6tltl=1.0。繼續(xù)28°C振蕩培養(yǎng)，每24小時加一次甲醇(終濃度0.5% )，震蕩培養(yǎng)4d，收集菌體備用。取甲醇誘導4天的酵母溶液加入50mL的離心管中，離心菌體，用液氮研磨菌體；カロ入3-4mL體積比為2 I的甲醇-氯仿(色譜純)，超聲波破壁30min ； IOOOOrpm,離心，上清液用氯仿萃取，并用水洗，重復(fù)操作。收集氯仿層溶液，水浴蒸餾濃縮，回收溶劑得浸膏。^ -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物的藥理實驗 正常組10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)上指數(shù)期正常貼壁生長的H印G2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞；對照組用溶劑甲醇作對照；實驗組浸膏用甲醇溶解，用于處理H印G2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞的濃度為0. 5,1, 5,10, 25, 50, 75,100 y g/mL。結(jié)果表明與正常組和溶劑對照組相比，處理72h后，1，5，10，25 U g/mL的處理組與對照組細胞形態(tài)相比均有變化，IOy g/mL處理組的細胞形態(tài)變化明顯(見附圖1)，其由之前的典型的貼壁生長的細胞出現(xiàn)變圓、脫落、壞死。而實驗組中的其他處理組的細胞形態(tài)變化相對較弱。GsAS的酵母表達產(chǎn)物處理對H印G2肝癌細胞和SMMC7721肝癌細胞的存活率有明顯影響。IfepG2肝癌細胞和SMMC7721肝癌細胞用不同濃度的麻花艽P-amyrin合成酶基因 GsAS 的酵母表達產(chǎn)物(0. 5，1，5，10，25，50，75，IOOii g/mL)處理 72h 后，1，5，10，25 u g/mL酵母表達產(chǎn)物處理下肝癌細胞H印G2肝癌細胞和SMMC7721肝癌細胞的存活率分別為72. 8%，67. 4%,52. 5%,49. 8% (見附圖 2)和 74%，68. 8%，49. 5%,47. 8% (見附圖3)?？偨Y(jié)麻花究P-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物對肝癌細胞生長的生長有抑制作用。有效抑制H印G2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞生長的麻花艽P-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物濃度為I 25 ii g/mL，優(yōu)選濃度為10 u g/mL。本發(fā)明用從中草藥中克隆得到的基因的酵母轉(zhuǎn)化子進行培養(yǎng)、誘導、提取，得到抗肝癌的五環(huán)三萜化合物，與從中草藥中直接提取的三萜化合物相比，產(chǎn)物較純，特定三萜化合物的獲得更方便，為抗肝癌藥物的制備提供了一種新的方法和資源。


圖I :顯微鏡下觀察到的H印G2肝癌細胞正常組，溶劑對照組和10 u g/mL處理組培養(yǎng)72h后的細胞形態(tài)。正常組和溶劑對照組細胞正常的貼壁生長，10 u g/mL處理組細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞出現(xiàn)變圓、脫落、壞死(SMMC7721肝癌細胞的結(jié)果類似)。圖2 :肝癌細胞H印G2在1，5，10，25 ii g/mL麻花艽P-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物處理條件下的存活率變化。數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實驗的平均值，利用t-test檢驗進行顯著性差異分析(*P < 0. 05，n = 3)。圖3 :肝癌細胞 SMMC7721 在 l，5，10，25ii g/mL 麻花艽 P-amyrin 合成酶基因 GsAS的酵母表達產(chǎn)物處理條件下的存活率變化。數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實驗的平均值，利用t-test檢驗進行顯著性差異分析(*P < 0. 05，n = 3)。
具體實施例方式實施例I、GsAS的克隆
I. I麻花艽總RNA的提取(I)麻花艽材料放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成均勻的粉末。注意研磨過程中要保證材料浸在液氮中。(2)待液氮揮發(fā)后將材料迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，每50_100mg組織材料加入ImL TRIZOL溶液，混勻后，于室溫放置5min，12000r/min, 2_8°C離心IOmin去沉淀。(3)每ImL TRIZOL溶液中加入0. 2mL氯仿，振蕩15sec充分混勻，于室溫放置5min, 12000r/min, 2_8°C離心 15min。
(4)取上清，每ImL TRIZOL加入0. 5mL的異丙醇，混勻，室溫放置10 20min。(5) 2-8°C 12000r/min 離心 IOmin,棄上清。(6)加ImL 75%こ醇洗漆沉淀2次,4°C不超過7500r/min離心5min,棄上清。(7)室溫放置晾干后，加入15uL DEPC處理的雙蒸水溶解RNA。I. 2逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA(I)0. 2mL Eppendorf 管中，加入下列成分用DNaseI 純化的上述總 RNA (0. I U g/ U L) 2. 0 U LOlige (dT) anchored primer (2 U M) 2. 0 U L(2)(TC水浴變性10分鐘，立即置于冰浴中。(3)在 IOii L 反應(yīng)體系中加入下列成分2. Oii L 5 X MMLV RT buffer ；1. Ou L250umol/L dNTP mix ；0. 25 u L Rnasin ;0. 5 y L(200u/y L)MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶；2 y L 上述 RNA變性液。42°C進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)Ihr。反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA用于后面的反應(yīng)。I. 3PCR以上述逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA為模板，PCR法擴增基因片段。(I)PCR引物由上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物PO : 5' -ATGTGGAGGCTAAAAATCGG-3'引物PlA' -CGTCTCCTACGGCACTTGCTTGCG-3'(2) PCR反應(yīng)體系
10XPCR buffer2|j L
MgC12(25mmol/L)I. 5|j L
dNTP (each 250|j mol/L)0. 2|j L
PO (10|j mol/L)l|j L
Pl (4|j mol/L)l|j L
逆轉(zhuǎn)錄第一鏈產(chǎn)物4jj L
Ex Taq0. 2|J L
無菌水10. 1|J L(3) PCR反應(yīng)程序94°C 5min ；94°C 30sec,50°C 30sec，72°C 2min，35 個循環(huán)；最后 72°C延伸 7min。PCR產(chǎn)物電泳如圖I所示。1.4 5' -RACE按照TaKaRa 5' -Full RACE Core Set說明書所示步驟操作。電泳5' -RACE產(chǎn)物。1.5目的片段的回收(I)用刀片切下上述電泳結(jié)果中含目的條帶的膠條置于I. 5mLEppendorf管中。(2)稱重，加入3-4倍體積的DR-I Buffer, 65°C加熱IOmin融化膠塊，每隔2min混勻一次保證膠塊能充分融化。(3)加入 DR-I Buffer 量的 1/2 體積的 DR-II Buffer，均勻混合。 (4)將 Spin Cloumn 安置于 Collection Tube 上,將上述溶液轉(zhuǎn)移至 Spin Column中，5000rpm離心lmin,棄濾液。(5)將 500 u L Rinse A 加入 Spin Column 中，5000rpm 離心 lmin,棄濾液。(6)將 700ii L Rinse B 加入 Spin Column 中，5000rpm 離心 lmin,棄濾液。(7)重復(fù)步驟6,然后12000rpm再離心lmin。(8)將Spin Cloumn安置于新的I. 5mL的離心管上,在Spin Cloumn膜的中央處加入預(yù)熱到60°C的25 ii L的水或洗脫緩沖液，室溫靜置lmin。(9) 12000rpm 離心 lmin 洗脫 DNA。(10)重復(fù)步驟9，2次，將所有洗脫液集中收集于一管內(nèi)，混勻，取少量電泳檢查回收效率，其余加入1/10體積的3mol/L NaAc (pH5. 3)和2倍體積的無水こ醇，_20°C沉淀Ihr0(11)然后4°C，WOOOrpm離心15min，用70%冷乙醇洗滌沉淀，棄盡液體，用40 u L無菌水溶解沉淀。回收的片段用于后面的連接反應(yīng)。I. 6 連接用上述的回收目的片段與PMD-18T載體(購自寶生物工程有限公司，下同)按摩爾比約I : I的比例進行連接，連接體系如下
目的片段7[JL
T-vectorIm l
10XT4 DNA Ligase Buffer1|J L
T4 DNA Ligase1|J L混勻并短暫離心，16°C連接過夜。得到重組質(zhì)粒PMD18T-AS1，用于后面的反應(yīng)。I. 7CaC12法制備感受態(tài)細胞(I)挑取DH10B單菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。(2)按I 100-1 50的比例，取ImL菌液接種于IOOmL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至菌液0D600為0. 3-0. 6。(3)將菌液冰浴IOmin, 4°C 4000rpm離心IOmin,收集菌體。(4)沉淀加IOmL預(yù)冷的0. IM CaCl2懸浮后，冰浴30min。(5) 4°C 4000rpm離心lOmin。沉淀重懸浮于ImL預(yù)冷的0. IM CaC12,混勻并冰水浴中保存，備用或加入15%的甘油置于_70°C中保存。
I. 8 熱擊法轉(zhuǎn)化 Ecoli DHlOB(I)在無菌條件下吸取100 U L感受態(tài)細胞,加入I. 5mL預(yù)冷的無菌Eppendorf管中，加入IOiiL連接產(chǎn)物(1.6中的重組質(zhì)粒)，輕輕混勻，立即置于冰上30min。(2)在42°C恒溫水浴中熱激90sec (準確記時)。(3)冰浴 3_5min。(4)加入800 u L不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，混勻，37°C振蕩培養(yǎng)45_60min。(5)短暫離心收集菌體,用150 ii L LB液體培養(yǎng)基重懸菌體,轉(zhuǎn)至含抗生素Amp、X-gal、IPTG的LB固體平板上，用無菌涂布棒涂布。(6)將平板于37°C正向放置15_30min至液體被吸收，倒置平板，于37°C培養(yǎng)12-16hr，觀察平板會有藍白斑。白斑用于后面的質(zhì)粒提取。I. 9堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒(I)挑取白色單菌落，接入含抗生素Amp(50mg/L)的3mL LB液體培養(yǎng)基中，同時也要保存所挑取的白色單菌落于含抗生素Amp (50mg/L)的固體LB平板中，37°C震蕩培養(yǎng)12-16h ；(2) 12000rpm離心30sec，收集培養(yǎng)物中的菌體，盡量棄盡上清；(3)加入IOOy L冰預(yù)冷的溶液I，在渦旋器上使菌體充分重懸；(4)加入200 u L溶液II，立即將離心管緩緩顛倒數(shù)次，冰浴5-lOmin ；(5)加入150ii L冰預(yù)冷的溶液III，緩緩顛倒離心管數(shù)次直至白色沉淀充分形成，冰浴 5-10min ；(6) 12000rpm離心3min，取上清轉(zhuǎn)入另一微量離心管中，加入2倍體積95%こ醇，混勻后，室溫靜置3min ；12000rpm離心3min,使質(zhì)粒DNA沉淀；(7)棄盡上清，取200 UL TE溶液溶解沉淀；(8)加入等體積冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量的RNA ； (9) 12000rpm,離心 3min ；(10)轉(zhuǎn)移上清到另ー離心管中，加入2倍體積的95%こ醇，混勻后于室溫靜置3min, 12000rpm離心3min使質(zhì)粒沉淀；(11)棄上清后用ImL 70%こ醇洗滌沉淀，棄盡液體；(12)室溫干燥后，取20 ii L含RNaseA(20 U g/mL)的TE溶液溶解沉淀，37°C水浴30 60min 消化 RNA。(13)為減少損失，可先用TE將總體積補充至200 U L，加入等體積的酚-氯仿-異戍醇，充分振蕩5-10min, 12000rpm離心5min ；(14)取上清，加入等體積的氯仿-異戊醇，重復(fù)以上操作；(15)取上清，加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉(pH5. 3)和2倍體積的無水こ醇，混勻后_20°C放置15min, 12000rpm離心3min使質(zhì)粒沉淀；(16)棄上清用ImL 70%こ醇洗滌沉淀，棄液體，用40 y L TE或無菌水溶解沉淀。質(zhì)粒用于后面的反應(yīng)。I. 10質(zhì)粒酶切驗證用EcoRI酶切上述質(zhì)粒,酶切反應(yīng)體系如下表所示重組質(zhì)粒pMD18T-ASl16 U L
EcoRI限制性內(nèi)切酶2iiLIOXBuffer2 U L將上述反應(yīng)體系混勻并5000rpm離心lmin，37°C水浴反應(yīng)過夜，然后進行I %的TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。I. IIDNA 測序挑取含有重組質(zhì)粒的陽性單菌落用含有Amp (50mg/L)的液體LB搖過夜，然后送上海博亞生物技術(shù)有限公司測序，得到測序結(jié)果 ，經(jīng)過NCBI blast分析，上述cDNA序列與人參的PNYl同源，證明實驗得到的是麻花艽的P-amyrin合成酶基因，命名為GsAS。實施例2、麻花艽P -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達載體構(gòu)建2. I酵母表達載體的構(gòu)建2. I. I目的基因的獲得(I)引物設(shè)計設(shè)計ー對PCR擴增帶EcoRI和XhoI酶切位點都GsAS基因。POl :5’ -GAATTCATGTGGAGGCTAAAAATCGG-3’EcoRIP12 :5’ -CTCGAGCGTCTCCTACGGCACTTGCTTGCG-3’XhoI(2) PCR 反應(yīng)體系
IOXPCR buffer2|j L
MgC12(25mmol/L)I. 5|j L
dNTP (each 250|j mol/L)0. 2|j L
POl (4|j mol/L)l|j L
P02 (4|j mol/L)l|j L
重組質(zhì)粒 PMD18T-AS1l|j L
rTaq (TaKaRa)0. 2|J L
無菌水13. l|j L(3) PCR反應(yīng)條件為94°C 5min ；94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 2min，35 個循環(huán)；最后 72で延伸 7min。PCR產(chǎn)物電泳回收后用于后面的反應(yīng)。2. I. 2表達載體的構(gòu)建步驟引入酵母表達載體pPICZA (購自寶生物工程有限公司)，該載體上含有中所含有EcoR和XhoI兩個酶切位點。將帶有EcoR和XhoI酶切位點的cDNA與質(zhì)粒分別進行EcoR和XhoI的雙酶切，再按照5 I的比例在T4連接酶的催化下進行連接16小時以上。反應(yīng)體系及條件如下(l)cDNA酶切反應(yīng)體系和條件cDNA /EcoR+XhoI6|j L
EcoRl|j L
XhoIl|j L
IOXH Buffer2|j L37 °C 16h ；
(2)質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系和條件
pPICZA 質(zhì)粒6|j L
EcoRl|j L
XhoIl|j L
IOXH Buffer2|J L37 °C 16h ；連接反應(yīng)用T4DNA Ligase進行，體系和條件同T載體的連接體系和條件。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從卡那霉素抗性的菌落中篩選出重組子，得到酵母表達載體pPICZA-GsAS0提取陽性克隆pPICZA-GsAS的質(zhì)粒進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，反應(yīng)體系和條件同鑒定重組子。2. 2DNA導入酵母(I)挑取酵母菌株(畢赤酵母)的單克隆，接種至IOmL液體YH)培養(yǎng)基[20g/L蛋白胨，10g/l酵母提取物，葡萄糖2% (單配單加)]，30°C，200rpm,培養(yǎng)2_3天；(2)按照I : 50的比例將菌液轉(zhuǎn)移至50mL YPD液體培養(yǎng)基中30°C，200rpm,培養(yǎng)3 5h，此時的菌液OD6tltl = 0. 4 0. 6。(3)將菌液分裝至IOmL無菌離心管中，姆管5mL ；(4)3000rpm離心5min,收集細胞。用2. 5mL無菌ddH20重懸菌體；(5) 3000rpm 離心 5min,收集細胞。用 0. ImL IOOmM(I X) LiAc/TE buffer 重懸菌體；(6)3000rpm離心I 2min沉淀細胞(僅需將菌體離心至離心管底即可)，用微量移液器小心吸走上清；(7)用50iiL IOOmM (I X) LiAc/TE buffer重懸菌體,將菌懸液移至滅菌的I. 5mLEppendorf 管中；(8)將ImL單鏈擔體DNA煮沸5min，快速在冰水中冷卻；(注無需每次使用時都煮沸擔體DNA，可分裝成小份凍存；凍融3 4次后應(yīng)再煮沸，取出后應(yīng)保持在冰上)(9)將步驟7準備的樣品，3000rpm離心I 2min沉淀細胞,用微量取樣器小心吸
走上清；(10)按下列順序加入240 ii L PEG(50% w/v)(加入后用槍頭上下吹打，盡量將菌體懸浮)；36iiL IM(IOX)LiAc ;25 y L單鏈擔體DNA(2. Omg/mL) 50 y L水和質(zhì)粒DNA(0. I 10 u g)( 一般情況下,質(zhì)粒加入10 40 y L即可)；(11)潤旋振蕩Eppendorf管lmin,直到細胞完全混勻，30°C水浴30min ；(12) 42 °C 水浴中熱激 20 25min ；(13) 5000rpm離心I 2min，用微量移液器除去轉(zhuǎn)化混合液；
(14)吸取0.2 I. OmL無菌水加到每個反應(yīng)管中，用移液器輕輕抽提以懸浮沉淀；(15)取50 ii L轉(zhuǎn)化液，均勻涂布在含卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)2 4d。用未轉(zhuǎn)化的酵母做對照。2. 3酵母重組子的鑒定2. 3. I菌落PCR鑒定初篩(I)平板上的菌落長到肉眼可見時。(2)將除了模板以外的其他PCR反應(yīng)液組分準備好，井分裝。(3)用ー根滅菌牙簽挑取菌落，在PCR管中測ー下，放入一個滅菌的I. 5ml離心管，對PCR管和I. 5ml離心管編號。 (4)PCR擴增，0.8%瓊脂糖凝膠電泳。對PCR擴增顯現(xiàn)特異性條帶的克隆，置于
I.5ml離心管中的半截牙簽扔到5mlYro培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)，24±1小時提取DNA，用DNA作為模板再進行PCR進ー步確定。PCR反應(yīng)體系及條件如下
10XPCR buffer2|j L
MgC12(25mmol/L)I. 5|j L
dNTP (each 250|j mol/L)0. 2|j L
PO (4|j mol/L)l|j L
Pl (4|j mol/L)l|j L
菌液IjJ l
rTaq (TaKaRa)0. 2|J L
無菌水13. l|j LPCR反應(yīng)條件為94°C 5min ；94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 2min，35 個循環(huán)；最后 72で延伸 7min。2. 3. 2酵母總DNA為模板進行二次鑒定酵母基因組的提取(I)接種重組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子于5ml YPD培養(yǎng)基，30°C，培養(yǎng)16-18小時；(2)室溫下，1500g離心5-10min收集菌體；(3) IOOuL TE (pH7. 0)重懸后 1500g 離心 5-lOmin 收集菌體；(4)用 2mL 的 SCED (PH7. 5)重懸；(5)加入 I 3mg 蝸牛酶，37°C, 50min ；(6)加入2ml I % SDS,輕搖混勻，然后置于冰上5min ；(7)加入I. 5mL 5M醋酸鉀，輕輕混勻；(8) IOOOOg 離心 5-lOmin,棄上清；(9)加入2倍體積無水こ醇,室溫放置15min ；(10) IOOOOg 離心 20min,棄上清；(11)加入 0. 7mLTE 緩沖液；(12)加入等體積的苯酚氯仿(I 1V/V)；
(13)加入1/2體積的7. 5M醋酸銨溶液；(14)加入2倍體積的無水こ醇，-20°C放置Ihr ；(15) IOOOOg 離心 20min ;(16)加入ImL 75%こ醇漂洗沉淀一次；

(17)干燥后，加入50ul的TE或H20溶解，-20°C備用。PCR反應(yīng)體系的組成和反應(yīng)條件同菌落PCR，PCR產(chǎn)物0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。實施例3、酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)，誘導表達及表達產(chǎn)物的提取。3. I酵母轉(zhuǎn)化子的表型篩選3. I. I篩選酵母表型的試劑匪培養(yǎng)基，MD培養(yǎng)基(I)MM 培養(yǎng)基1. 34% YNB 4X1(T5%生物素 0.5% 甲醇先將890mL水高溫滅菌，冷卻至60°C時加入100mL10XYNB，2mL500X生物素和IOmLlOOX甲醇，固體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉。(2)MD 培養(yǎng)基1. 34% YNB 4X1(T5%生物素 2%葡萄糖先將800mL水高溫滅菌20min，冷卻至60°C時加入IOOmL 10XYNB,2mL 500 X生物素，IOOmLlOX葡萄糖，固體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉。(3) 10XYNB(含硫酸銨不含氨基酸的酵母単元)134g YNB用IOOOmL溶解，充分溶解后過濾滅菌，4°C保存；(4) 500X生物素20mg生物素溶解在IOOmL水中，過濾滅菌，4°C保存；(5) 100X甲醇50mL甲醇與IOOmL水混勻，過濾滅菌，備用；(6) IOX葡萄糖；IOOOmL水中溶解200g葡萄糖,高溫滅菌15min或是過濾滅菌；3. I. 2酵母轉(zhuǎn)化子的表型篩選(I)酵母轉(zhuǎn)化后會形成甲醇誘導型(Mut+)和甲醇敏感型(Muts)菌株，在麗培養(yǎng)基(含甲醇培養(yǎng)基)上生長而在MD培養(yǎng)基(無甲醇培養(yǎng)基)上不生長的菌株為Muts型酵母菌株，而在兩種培養(yǎng)基上都能生長的為Mut+型酵母菌株；(2)將篩選出的陽性菌落按依次對應(yīng)的順序在點在MM培養(yǎng)基和MD培養(yǎng)基上，30°C條件下靜置培養(yǎng)2-3d ；(3)對比pPICZA-GsAS酵母轉(zhuǎn)化子在含MM和MD培養(yǎng)基上的生長情況，篩選出在兩種培養(yǎng)基上都能生長的Mut+型酵母菌株。3. 2酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)和誘導表達3. 2. I酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)和誘導表達的培養(yǎng)基和試劑(I)MGY 培養(yǎng)基IOX甘油IOOmL甘油同900mL水混勻，高溫滅菌或過濾滅菌，備用；MGY 培養(yǎng)基1. 34% YNB 1% 甘油 4 X 10-5% 生物素將800mL滅菌水同IOOmL 10XYNB,2mL 500X生物素和IOOmL IOX甘油混合，
4°C保存。(2) MM 培養(yǎng)基(3)甲醇3. 2. I酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)和誘導表達(I)挑選Mut+酵母菌，接種到含25mL MGY培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng)至 OD6tltl = 2-6 ；(2)將MGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)的均轉(zhuǎn)接到100-200mL MM培養(yǎng)基中，使其OD6tltl = I. 0 ；(3)麗培養(yǎng)基中的酵母菌繼續(xù)30°C振蕩培養(yǎng)，每24小時加一次甲醇(終濃度
0.5% )，震蕩培養(yǎng)4d；(4) 12，OOOrpm,離心 IOmin,收集菌體備用。3. 3表達產(chǎn)物提取
(I)Mut+型酵母轉(zhuǎn)化子誘導表達4d后，12，OOOrpm離心收集菌體,用液氮研磨菌體；(2)加入3-4mL體積比為2 I的甲醇-氯仿(色譜純)，超聲波破壁30min(超生15s，間隔IOs)；(3) 10，OOOrpm，離心；(4)上清液用氯仿萃取，并用水洗，重復(fù)操作3次；(5)收集氯仿層溶液，水浴蒸餾濃縮，回收溶劑得浸膏。實施例4、酵母轉(zhuǎn)化子表達產(chǎn)物抗癌活性檢測4. I酵母轉(zhuǎn)化子表達產(chǎn)物對HepG2肝癌細胞的藥理學作用檢測4. I. lHepG2肝癌細胞的培養(yǎng)H印G2肝癌細胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37°C、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3d傳代I次。4. I. 2對H印G2肝癌細胞的處理(I)取對數(shù)生長期的貼壁細胞，PBS沖洗并消化，用含10%小牛血清的培養(yǎng)基配制成2. 5 XlO4. mじ1的細胞懸液；(2)實施例3中獲得的酵母轉(zhuǎn)化子提取的浸膏用甲醇溶解；(3)將細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 U L ;分別加入用甲醇配制的酵母轉(zhuǎn)化子提取物，使提取物的終濃度為0. 5,1, 5,10, 25, 50, 75,100 ii g/mL ;加入甲醇的細胞組為對照組；正常生長的細胞組作空白組；每個濃度3組，實驗重復(fù)3次。4. I. 3HepG2肝癌細胞形態(tài)變化和存活率觀察分別在12h，24h，48h，72h在顯微鏡下觀察肝癌細胞的形態(tài)變化，統(tǒng)計其存活率。4. I. 4結(jié)果統(tǒng)計分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組和溶劑對照組相比，處理72h后，1，5，10，25 U g/mL的處理組與對照組HepG2肝癌細胞的細胞形態(tài)相比均有變化，10 u g/mL處理組的細胞形態(tài)變化明顯(見附圖I)，其由之前的典型的貼壁生長的細胞出現(xiàn)變圓、脫落、壞死。而實驗組中的其他處理組的細胞形態(tài)變化相對較弱。GsAS的酵母表達產(chǎn)物處理對H印G2肝癌細胞的存活率有明顯影響。I, 5,10, 25 ii g/mL麻花究P-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物處理72h后，肝癌細胞H印G2肝癌細胞存活率分別為72.8%，67.4%，52. 5%，49.8% (見附圖2)。GsAS的酵母表達產(chǎn)物處理對H印G2肝癌細胞的存活率的影響，在I 25 ii g/mL提取物處理下隨著濃度升高和時間的增長，提取物對H印G2肝癌細胞的存活率影響變大；5 u g/mL的提取物處理24h后，HepG2的細胞活性就發(fā)生明顯變化，細胞存活率明顯降低；5 u g/mL的提取物處理48h后，HepG2的細胞的存活率降低到約60% ;而處理72h后，I u g/mL的提取物處理條件下，HepG2細胞的生存力也發(fā)生明顯降低(如圖2)。
4. 2酵母轉(zhuǎn)化子表達產(chǎn)物對SMMC7721肝癌細胞的藥理學作用檢測4. I. 1SMMC7721肝癌細胞的培養(yǎng)SMMC7721肝癌細胞用含10 %小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 °C、飽和濕度、5 %CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3d傳代I次。4. I. 2對SMMC7721肝癌細胞的處理(I)取對數(shù)生長期的貼壁細胞，PBS沖洗并消化，用含10%小牛血清的培養(yǎng)基配制成2. 5 XlO4. mじ1的細胞懸液；(2)實施例3中獲得的酵母轉(zhuǎn)化子提取的浸膏用甲醇溶解，
(3)將細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 U L ;分別加入用甲醇配制的酵母轉(zhuǎn)化子提取物，使提取物的終濃度為0. 5,1, 5,10, 25, 50, 75,100 ii g/mL ;加入甲醇的細胞組為對照組；正常生長的細胞組作空白組；每個濃度3組，實驗重復(fù)3次。4. I. 3SMMC7721肝癌細胞形態(tài)變化和存活率觀察分別在12h，24h，48h，72h在顯微鏡下觀察肝癌細胞的形態(tài)變化，統(tǒng)計其存活率。4. I. 4結(jié)果統(tǒng)計分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組和溶劑對照組相比，GsAS的酵母表達產(chǎn)物的處理對SMMC7721肝癌細胞形態(tài)的影響與對HepG2肝癌細胞的形態(tài)影響類似，1,5,10, 25 u g/mL的處理組與對照組SMMC7721肝癌細胞的細胞形態(tài)相比有變化，10 u g/mL處理組的細胞形態(tài)變化明顯；GsAS的酵母表達產(chǎn)物處理對SMMC7721肝癌細胞的存活率也有明顯影響。1，5，10，25 y g/mL麻花艽P -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物處理72h后，SMMC7721肝癌細胞存活率分別為74%，68. 8%,49. 5%,47. 8% (見附圖 3)。
權(quán)利要求
1.麻花究^-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征是所述肝癌細胞是H印G2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞。
3.如權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其特征是有效抑制H印G2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞生長的麻花艽P -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物濃度為I 25 y g/mL。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是有效抑制H印G2肝癌細胞或SMMC7721肝癌細胞生長的麻花究^ -amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物的濃度為10 u g/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物在制備抗肝癌細胞藥物中的應(yīng)用；其中有效抑制肝癌細胞HepG2和SMMC7721生長的麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物的濃度為1～25μg/mL。本發(fā)明提供的麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表達產(chǎn)物與從中草藥中直接提取的三萜化合物相比，產(chǎn)物較純，特定三萜化合物的獲得更方便，為抗肝癌藥物的制備提供了一種新的方法和資源，為研發(fā)抗肝癌藥物奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號A61P35/00GK102657879SQ20121013243
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月28日
發(fā)明者劉艷玲, 向鳳寧, 呂欣, 李碩, 趙忠娟 申請人:山東大學