一種植物乳桿菌胞外多糖及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種植物乳桿菌胞外多糖，該多糖的分子結(jié)構(gòu)中的糖單位僅為木糖和半乳糖且半乳糖占比高達(dá)98％，屬全新結(jié)構(gòu)的植物乳桿菌胞外多糖。同時(shí)本發(fā)明提供了上述多糖的制備方法，該方法利用乙醇于植物乳桿菌發(fā)酵液中沉淀多糖，而后經(jīng)透析去除小分子，并先后利用酶解方法去除核酸及蛋白雜質(zhì)，再利用三氯乙酸沉淀雜蛋白，固液分離取上清后執(zhí)行透析，從而獲得純化的目標(biāo)多糖。該方法依據(jù)目標(biāo)多糖自身性質(zhì)以及植物乳桿菌發(fā)酵液的雜質(zhì)成分設(shè)計(jì)工藝參數(shù)，溫度和pH條件溫和，同時(shí)避免使用超濾等可能打斷多糖交聯(lián)鍵的純化方法，有效保證了多糖內(nèi)糖苷鍵及次級(jí)結(jié)構(gòu)的完整。本方法所制備的多糖純度好，收率高，為后續(xù)性能分析及產(chǎn)業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。CCTCCNO:M201417020140428
【專利說明】
_種植物乳桿菌胞外多糖及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物分離工程技術(shù)領(lǐng)域，進(jìn)一步涉及微生物發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化，具 體涉及一種植物乳桿菌胞外多糖及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸菌胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)，泛指乳酸菌代謝過程中分泌到細(xì)胞 外的糖類化合物。由于乳酸菌胞外多糖具有良好的流變性、而且能賦予發(fā)酵食品良好的口 感和風(fēng)味，因此可作為食品工業(yè)的膠凝劑、穩(wěn)定劑、保鮮劑和乳化劑等，目前已廣泛用于乳 制品、飲料、糕點(diǎn)、糖果、冰激凌等食品的生產(chǎn)。此外，有研究表明EPS具有抗致病菌、抗腫瘤、 降低膽固醇、延緩衰老、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用，因此EPS可能是 乳酸菌益生作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。
[0003] 多糖是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)。從微觀層 面來看，參與成鍵的單糖分子種類多樣，且數(shù)量及排列次序各不相同；多糖主鏈間通過氫鍵 作用可形成多種不同的構(gòu)象;在此基礎(chǔ)上，由于糖單位羥基、羧基、氨基以及硫酸基之間的 非工價(jià)相互作用，導(dǎo)致多糖分子存在更為復(fù)雜的構(gòu)象。因此多糖不是一種純粹的化學(xué)物質(zhì)， 而是聚合程度不同的混合物。為了探索乳酸菌胞外多糖的性質(zhì)，首先應(yīng)當(dāng)明確其物質(zhì)基礎(chǔ) 并予以確切的表征，因此，對(duì)EPS的純化及結(jié)構(gòu)分析尤為重要。
[0004] 植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，屬同型發(fā)酵乳酸菌，革蘭氏陽性，兼性 好氧。該菌株被證明具有耐酸、耐膽鹽、抗致病菌、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用，同時(shí)有研究表 明上述耐酸能力及益生作用可能與其胞外多糖有關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種植物乳桿菌胞外多糖，以解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏上述植物乳桿菌胞 外多糖的技術(shù)問題。
[0006] 本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中，植物乳桿菌胞外多糖作為一種多糖 混合物，其中成分不明確。
[0007] 本發(fā)明同時(shí)提供一種上述植物乳桿菌胞外多糖的制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中上 述植物乳桿菌胞外多糖難以制備的技術(shù)問題。
[0008] 本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是常規(guī)方法所制備的上述植物乳桿菌胞外多糖純 度較低。
[0009] 本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是常規(guī)方法所制備的上述植物乳桿菌胞外多糖產(chǎn) 率較低。
[0010] 本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是上述制備方法對(duì)核酸的去除不完全。
[0011] 本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是上述制備方法對(duì)蛋白的去除不完全。
[0012] 本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是上述制備方法所制備的植物乳桿菌胞外多糖用 于人類時(shí)存在安全風(fēng)險(xiǎn)。
[0013] 為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0014] -種植物乳桿菌胞外多糖，該植物乳桿菌胞外多糖由木糖和半乳糖以糖苷鍵連接 而成，其中半乳糖的摩爾含量不低于98%。也就是說，上述植物乳桿菌胞外多糖的糖單位僅 為木糖或半乳糖，各糖單位之間的連接鍵含有糖苷鍵，而在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步的次級(jí)結(jié)構(gòu)，并 不予以限定;此外，上述半乳糖的摩爾含量是指半乳糖的摩爾數(shù)在全部糖單位總摩爾數(shù)中 所占百分比(所述糖單位是指多糖分子鏈中的單糖）。
[0015] 作為優(yōu)選，該植物乳桿菌胞外多糖經(jīng)空間排阻色譜的洗脫峰數(shù)量為1個(gè)。此優(yōu)選技 術(shù)方案所限定的植物乳桿菌胞外多糖，由于在空間排阻色譜中僅有1個(gè)洗脫峰，因此其屬于 單一分子量的多糖，更有利于明確其物質(zhì)基礎(chǔ)及性質(zhì)分析。
[0016] -種上述植物乳桿菌胞外多糖的制備方法，包括以下步驟：
[0017] 1)取植物乳桿菌發(fā)酵液，固液分離取上清；
[0018] 2)向步驟1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分離取沉淀，以8~14KDa截留分子 量的透析袋透析，取透析袋內(nèi)容物干燥，即為粗多糖；
[0019] 3)以含有40~60mM Tris-HCl、5~15mM MgS〇4 ? 7H20的溶液作為粗多糖溶解液，溶 解步驟2)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至終濃度2~3yg/mL，水解；
[0020] 4)而后加入蛋白酶Pronase E至終濃度40~60iig/mL，酶解；
[0021] 5)而后加入三氯乙酸至終濃度10~15%(w/v)，20~40min后固液分離取上清，透 析，取透析袋內(nèi)容物即為所述植物乳桿菌胞外多糖。
[0022]作為優(yōu)選，步驟1)所述的發(fā)酵液是植物乳桿菌厭氧發(fā)酵22~26h時(shí)的發(fā)酵液;更 優(yōu)的，發(fā)酵時(shí)間是24h。
[0023]作為優(yōu)選，步驟2)中乙醇的加入量是所述上清液體積的1.5~2.5倍;更優(yōu)的，乙醇 加入量是所述上清液體積的2倍.
[0024]作為優(yōu)選，步驟3)中粗多糖的終濃度為4~6mg/L;更優(yōu)的，是5mg/L。
[0025]作為優(yōu)選，步驟3)所述水解是在35~39°C條件下持續(xù)4~8h;更優(yōu)的，是在37°C條 件下持續(xù)6h。
[0026]作為優(yōu)選，步驟4)所述酶解是在35~39°C條件下持續(xù)16~20h;更優(yōu)的，是在37°C 條件下持續(xù)18h。
[0027] 作為優(yōu)選，步驟5)透析前，先調(diào)節(jié)上清液pH至4~5,再透析;更優(yōu)的，調(diào)節(jié)pH至4.5; 最優(yōu)的，所述調(diào)節(jié)是利用l〇mol/L的NaOH溶液實(shí)現(xiàn)的。
[0028]在以上任一技術(shù)方案基礎(chǔ)上優(yōu)選的，步驟1)所述的植物乳桿菌，是保藏編號(hào)為 CCTCC M 2014170的植物乳桿菌。
[0029]在以上任一技術(shù)方案基礎(chǔ)上優(yōu)選的，所述的固液分離，是以10000~14000g的轉(zhuǎn)速 離心15~25min〇
[0030]在以上任一技術(shù)方案基礎(chǔ)上優(yōu)選的，透析的持續(xù)時(shí)間是60~84h;更優(yōu)的，透析的 持續(xù)時(shí)間是72h。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)選的，透析的過程中每天更換透析袋外的超純水2次。
[0031] 作為優(yōu)選，步驟1)所述的發(fā)酵液，是以MRS培養(yǎng)基發(fā)酵獲得的。
[0032] 作為優(yōu)選，步驟1)所述的發(fā)酵液，是在35~39°C條件下發(fā)酵獲得的；更優(yōu)的發(fā)酵溫 度為37°C。
[0033] 作為優(yōu)選，步驟2)所述的干燥是冷凍干燥。
[0034]作為優(yōu)選，步驟3)所述粗多糖溶解液的pH值為7.2~7.8;更優(yōu)的，其pH為7.5。
[0035]作為優(yōu)選，步驟5)中三氯乙酸加入后的終濃度為12% (w/v)，加入三氯乙酸后持續(xù) 30min再進(jìn)行固液分離。
[0036]在以上技術(shù)方案中，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M 2014170的生物材料的保藏單位是 "中國典型培養(yǎng)物保藏中心"，其地址為"中國武漢武漢大學(xué)"，該生物材料的保藏日期為 2014年4月28日，其分類命名是植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。
[0037] 本發(fā)明所提供的植物乳桿菌胞外多糖制備方法，是利用乙醇沉淀法直接于植物乳 桿菌發(fā)酵液中沉淀多糖，而后經(jīng)透析去除小分子雜質(zhì)，并先后利用酶解方法去除核酸及蛋 白雜質(zhì)，再利用三氯乙酸沉淀雜蛋白，固液分離取上清后執(zhí)行透析，從而獲得純化的目標(biāo)多 糖。以上方法依據(jù)目標(biāo)多糖自身性質(zhì)以及植物乳桿菌發(fā)酵液中的雜質(zhì)成分設(shè)計(jì)工藝參數(shù)， 溫度和pH條件溫和，同時(shí)避免使用超濾等可能打斷多糖交聯(lián)鍵的純化方法，有效保證了多 糖內(nèi)糖苷鍵及次級(jí)結(jié)構(gòu)的完整。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明結(jié)合純化效率和產(chǎn)物收率匹配了適宜 酶和反應(yīng)條件，使得多糖純度和收率得到顯著提升，為后續(xù)的胞外多糖分子量測定、單糖組 分分析、益生功能評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。
[0038] 與現(xiàn)有技術(shù)相比較，首先，本發(fā)明多糖的分子結(jié)構(gòu)中單糖組分極其簡單，僅含有木 糖和半乳糖，且半乳糖占比高達(dá)98 %，現(xiàn)有技術(shù)中未見報(bào)道;此外，本發(fā)明多糖經(jīng)高效排阻 液相色譜處理后的洗脫峰只有一個(gè)對(duì)稱的單峰，是單一分子量的多糖，區(qū)別于其他益生菌 含兩種分子量的胞外多糖，這也有助于該多糖的物質(zhì)定性及性質(zhì)分析；同時(shí)，本發(fā)明多糖可 利用酸豆角發(fā)酵液中的菌株(CCTCC M2014170)來制備，此時(shí)該多糖用于人體具有確切的安 全保證。方法層面，本發(fā)明方法所制備的多糖能夠完整去除核酸和蛋白雜質(zhì)，且純度可達(dá) 95.1 %，產(chǎn)量可達(dá)441.5 ± 7.8mg/L，純化效率突出。
【附圖說明】
[0039] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1所制備植物乳桿菌胞外多糖的全自動(dòng)掃描光譜（波長范圍 200~600nm)〇
[0040] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中以不同分子量的葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品、以高效阻液相色譜法繪 制的分子量-洗脫時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0041] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1所制備植物乳桿菌胞外多糖的高效阻液相色譜圖。
[0042] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中所選則的多種單糖標(biāo)品的氣質(zhì)聯(lián)用色譜圖。
[0043] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例1所制備植物乳桿菌胞外多糖的氣質(zhì)聯(lián)用色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 以下將對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在 以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0045] 以下實(shí)施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的 情況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用"大約"、"左右"等語言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn) 確數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，"大約"表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十（10%)的范 圍內(nèi)變化，比如，"大約100"表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在"大約第一數(shù)值 到第二數(shù)值"的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近似性語 言可能與測量儀器的精度有關(guān)。
[0046] 除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員普遍理解的相同含義。
[0047] 以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑;所述實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果 取平均值;以下實(shí)施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0048] 實(shí)施例1
[0049] 1.1植物乳桿菌胞外多糖的制備
[0050] (1)取保藏編號(hào)為CCTCC M 2014170的植物乳桿菌，在MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間 是24h，37°C厭氧培養(yǎng)；
[0051 ] (2)采用2倍體積無水乙醇沉淀發(fā)酵液上清48h，12000 Xg離心10min，棄上清，沉淀 采用截留分子量為8000-14000Da的透析袋透析3天，每天換超純水2次，冷凍干燥獲得粗胞 外多糖；
[0052] (3)用50mM Tris-HCl、10mM MgSCk ? 7H20對(duì)粗多糖進(jìn)行溶解，終濃度為5mg/mL，采 用終濃度為2.5yg/mL的核酸酶DNAse type-I在37°C對(duì)核酸進(jìn)行水解6h;
[OO53] (4)水解后的粗多糖采用終濃度為50yg/mL的蛋白酶Pronase E對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶 解，酶解的條件為37°C，18h;
[0054] (5)水解后用終濃度為12%的三氯乙酸處理30min，用10mol/L的NaOH調(diào)節(jié)上清pH 至4.0~5.0,進(jìn)行3天的透析；
[0055] 1.2純化的胞外多糖中核酸和蛋白質(zhì)含量的測定
[0056] 取lmg胞外多糖溶于lmL蒸餾水中，以蒸餾水作對(duì)照，進(jìn)行全波長自動(dòng)掃描分光光 度計(jì)測定200~600nm的吸收值。結(jié)果如圖1所示，光譜在260和280nm均無明顯吸收峰，說明 無核酸和蛋白存在。為了進(jìn)一步確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)施例采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定 蛋白的殘余，采用BioTek的Take3多體積板原位法測定核酸殘余，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上分光光度 法相同。
[0057] 1.3高效排阻液相色譜分析測定胞外多糖的分子量
[0058] (1)采用表1中葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，和多糖樣品各5mg分別溶于lmLO . 5mg/mL的 Na2S04溶液中；
[0059] (2)取樣量 100yL，所有樣品經(jīng)TSK-GEL G2000PWXL柱子（300mm*7.8mm)，設(shè)定柱溫 30°C，流速為0.5mL/min。
[0060] 表1葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的分子量分布
[0062] 如圖2所示，利用上述葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、在以上實(shí)驗(yàn)方法下所獲得的分子量-洗脫時(shí) 間標(biāo)準(zhǔn)曲線呈指數(shù)曲線形態(tài)，線性良好，可用于分子量的計(jì)算。如圖3所示，本實(shí)施例所制備 的植物乳桿菌胞外多糖的出峰時(shí)間是18.774min，只有一個(gè)對(duì)稱的單峰，說明該多糖是單一 分子量的物質(zhì)。
[0063] 1.4氣質(zhì)聯(lián)用法測定胞外多糖分子中單糖組分
[0064] (1)多糖水解:稱取5mg的胞外多糖樣品，加入2mL，0 ? 2mol/mL的三氟乙酸，80°C水 解30min;通風(fēng)廚干燥，干燥后用甲醇洗2-3次；
[0065] (2)等量稱取少量標(biāo)品(L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和D-半乳糖），混合后取5mg;
[0066] (3)單糖衍生化：水解干燥樣品和標(biāo)品均添加lmL吡啶，0.4mL六甲基二硅氮烷， 0 ? 2mL三甲基氯硅烷，80 °C衍生30min;
[0067] (4)獲得的衍生物用過濾器(0.22wn，W〇ndaDiSC NY針頭式過濾器），過濾至清亮 狀態(tài)；
[0068] (5)以Agilent出品的三重串聯(lián)四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀作為實(shí)驗(yàn)儀器，氣質(zhì)聯(lián)用儀運(yùn)行 的條件如下：柱溫最初為100°C，維持15min，5°C/min增加到150°C，維持5min，隨后增加到 240°C，維持 2min。
[0069]如圖4所示，圖譜中的峰分別對(duì)應(yīng)L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡 萄糖和D-半乳糖，各單糖標(biāo)品分別對(duì)應(yīng)一個(gè)洗脫時(shí)間。如圖5所示，本實(shí)施例所制備的植物 乳桿菌胞外多糖僅存在2個(gè)吸收峰，出峰時(shí)間分別對(duì)應(yīng)木糖和半乳糖，而且其中半乳糖含量 占據(jù)絕大部分，經(jīng)計(jì)算發(fā)現(xiàn)半乳糖的摩爾含量高達(dá)98%。
[0070] 實(shí)施例2
[0071 ] -種植物乳桿菌胞外多糖，該植物乳桿菌胞外多糖由木糖和半乳糖以糖苷鍵連接 而成，其中半乳糖的摩爾含量為98%。該植物乳桿菌胞外多糖經(jīng)空間排阻色譜的洗脫峰數(shù) 量為1個(gè)。
[0072]上述植物乳桿菌胞外多糖的制備方法，包括以下步驟：
[0073] 1)取植物乳桿菌發(fā)酵液，固液分離取上清；
[0074] 2)向步驟1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分離取沉淀，以8KDa截留分子量的 透析袋透析，取透析袋內(nèi)容物干燥，即為粗多糖；
[0075] 3)以含有40mM Tris-HCl、5mM MgS〇4 ? 7H20的溶液作為粗多糖溶解液，溶解步驟2) 所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至終濃度2yg/mL，水解；
[0076] 4)而后加入蛋白酶Pronase E至終濃度40yg/mL，酶解；
[0077] 5)而后加入三氯乙酸至終濃度10%(w/v)，20min后固液分離取上清，透析，取透析 袋內(nèi)容物即為所述植物乳桿菌胞外多糖。
[0078] 在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
[0079] 步驟1)所述的發(fā)酵液是植物乳桿菌厭氧發(fā)酵22h時(shí)的發(fā)酵液。步驟2)中乙醇的加 入量是所述上清液體積的1.5倍。步驟3)中粗多糖的終濃度為4mg/L。步驟3)所述水解是在 35 °C條件下持續(xù)4h。步驟4)所述酶解是在35 °C條件下持續(xù)16h。步驟5)透析前，先調(diào)節(jié)上清 液pH至4,再透析。
[0080] 實(shí)施例3
[0081 ] -種植物乳桿菌胞外多糖，該植物乳桿菌胞外多糖由木糖和半乳糖以糖苷鍵連接 而成，其中半乳糖的摩爾含量為98.3%。
[0082]上述植物乳桿菌胞外多糖的制備方法，包括以下步驟：
[0083] 1)取植物乳桿菌發(fā)酵液，固液分離取上清；
[0084] 2)向步驟1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分離取沉淀，以14KDa截留分子量 的透析袋透析，取透析袋內(nèi)容物干燥，即為粗多糖；
[0085] 3)以含有60mM Tris-HCl、15mM MgSCk ? 7H20的溶液作為粗多糖溶解液，溶解步驟 2)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至終濃度3yg/mL，水解；
[0086] 4)而后加入蛋白酶Pronase E至終濃度60iig/mL，酶解；
[0087] 5)而后加入三氯乙酸至終濃度15%(w/v)，40min后固液分離取上清，透析，取透析 袋內(nèi)容物即為所述植物乳桿菌胞外多糖。
[0088] 在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
[0089] 步驟1)所述的發(fā)酵液是植物乳桿菌厭氧發(fā)酵26h時(shí)的發(fā)酵液。步驟2)中乙醇的加 入量是所述上清液體積的2.5倍。步驟3)中粗多糖的終濃度為6mg/L。步驟3)所述水解是在 39°C條件下持續(xù)8h。步驟4)所述酶解是在39°C條件下持續(xù)20h。步驟5)透析前，先調(diào)節(jié)上清 液pH至5,再透析。
[0090] 實(shí)施例4
[0091 ] -種植物乳桿菌胞外多糖，該植物乳桿菌胞外多糖由木糖和半乳糖以糖苷鍵連接 而成，其中半乳糖的摩爾含量為98.3%。
[0092]上述植物乳桿菌胞外多糖的制備方法，包括以下步驟：
[0093] 1)取植物乳桿菌發(fā)酵液，固液分離取上清；
[0094] 2)向步驟1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分離取沉淀，以10~12KDa截留分 子量的透析袋透析，取透析袋內(nèi)容物干燥，即為粗多糖；
[0095] 3)以含有45mM Tris-HCl、8mM MgS〇4 ? 7H20的溶液作為粗多糖溶解液，溶解步驟2) 所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至終濃度2.5yg/mL，水解；
[0096] 4)而后加入蛋白酶Pronase E至終濃度45yg/mL，酶解；
[0097] 5)而后加入三氯乙酸至終濃度13%(w/v)，25min后固液分離取上清，透析，取透 析袋內(nèi)容物即為所述植物乳桿菌胞外多糖。
[0098]在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
[0099]步驟2)中乙醇的加入量是所述上清液體積的2.2倍。步驟3)所述水解是在38°C條 件下持續(xù)5h。步驟5)透析前，先調(diào)節(jié)上清液pH至4.7,再透析。步驟1)所述的植物乳桿菌，是 保藏編號(hào)為CCTCC M 2014170的植物乳桿菌。
[0100] 實(shí)施例5
[0101 ] -種植物乳桿菌胞外多糖，該植物乳桿菌胞外多糖由木糖和半乳糖以糖苷鍵連接 而成，其中半乳糖的摩爾含量為98.3%。該植物乳桿菌胞外多糖經(jīng)空間排阻色譜的洗脫峰 數(shù)量為1個(gè)。
[0102] 上述植物乳桿菌胞外多糖的制備方法，包括以下步驟：
[0103] 1)取植物乳桿菌發(fā)酵液，固液分離取上清；
[0104] 2)向步驟1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分離取沉淀，以lOKDa截留分子量 的透析袋透析，取透析袋內(nèi)容物干燥，即為粗多糖；
[0105] 3)以含有55mM Tris-HCl、13mM MgS〇4 ? 7H20的溶液作為粗多糖溶解液，溶解步驟 2)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至終濃度2.8iig/mL，水解；
[0106] 4)而后加入蛋白酶Pronase E至終濃度55yg/mL，酶解；
[0107] 5)而后加入三氯乙酸至終濃度14%(w/v)，35min后固液分離取上清，透析，取透析 袋內(nèi)容物即為所述植物乳桿菌胞外多糖。
[0108]以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例， 并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng) 包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種植物乳桿菌胞外多糖，其特征在于該植物乳桿菌胞外多糖由木糖和半乳糖以糖 苷鍵連接而成，其中半乳糖的摩爾含量不低于98%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌胞外多糖，其特征在于該植物乳桿菌胞外多糖經(jīng) 空間排阻色譜的洗脫峰數(shù)量為1個(gè)。3. -種權(quán)利要求1所述植物乳桿菌胞外多糖的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 取植物乳桿菌發(fā)酵液，固液分離取上清； 2) 向步驟1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分離取沉淀，以8~14KDa截留分子量的 透析袋透析，取透析袋內(nèi)容物干燥，即為粗多糖； 3) 以含有40~60mM Tris-HCl、5~15mM MgS〇4 · 7H20的溶液作為粗多糖溶解液，溶解步 驟2)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至終濃度2~3yg/mL，水解； 4) 而后加入蛋白酶Pronase E至終濃度40~60yg/mL，酶解； 5) 而后加入三氯乙酸至終濃度10~15% (w/v)，20~40min后固液分離取上清，透析，取 透析袋內(nèi)容物即為所述植物乳桿菌胞外多糖。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟1)所述的發(fā)酵液是植物乳桿菌厭 氧發(fā)酵22~26h時(shí)的發(fā)酵液。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟2)中乙醇的加入量是所述上清液 體積的1.5~2.5倍。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟3)中粗多糖的終濃度為4~6mg/L。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟3)所述水解是在35~39°C條件下 持續(xù)4~8h。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟4)所述酶解是在35~39°C條件下 持續(xù)16~20h。9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟5)透析前，先調(diào)節(jié)上清液pH至4~ 5,再透析。10. 根據(jù)權(quán)利要求3~9任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于步驟1)所述的植物乳桿菌， 是保藏編號(hào)為CCTCC Μ 2014170的植物乳桿菌。
【文檔編號(hào)】C12R1/25GK105821093SQ201610201385
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年4月5日
【發(fā)明人】魏華, 張志鴻, 陶雪瑩, 徐鋒, 夏慧玲, 許恒毅, 萬翠香
【申請(qǐng)人】南昌大學(xué)