專利名稱：新型肝素實(shí)體及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及滅菌后保持其生物活性的具有固定的生物活性實(shí)體的醫(yī)用底物。具體地，本發(fā)明涉及新的肝素實(shí)體及其使用方法。
背景技術(shù)：
用作機(jī)體內(nèi)和機(jī)體上的替代血管、合成人工晶體、電極、導(dǎo)尿管等的醫(yī)療裝置或用作連接機(jī)體以輔助手術(shù)或透析的體外裝置的醫(yī)療裝置是眾所周知的。但是，在醫(yī)療裝置中使用生物材料會(huì)引起不良機(jī)體反應(yīng)，包括迅速形成血栓作用。各種血漿蛋白對(duì)在生物材料 表面上引發(fā)血小板和纖維蛋白沉積起作用。這些作用導(dǎo)致阻礙血液流動(dòng)的血管收縮，隨之而來(lái)的炎性反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致醫(yī)療裝置功能的喪失。對(duì)血液接觸裝置而言，人們特別感興趣的是能減少或抑制在生物材料和/或覆蓋材料的表面上形成血栓的生物活性實(shí)體。糖胺聚糖(glycosaminoglycan)通常是優(yōu)選的抗血栓劑；特別優(yōu)選肝素、肝素類似物和衍生物。已對(duì)在生物材料上固定的糖胺多糖，如肝素，作出廣泛研究來(lái)改進(jìn)生物相容性和血相容性。肝素化材料在降低形成血栓中的機(jī)理被認(rèn)為在于肝素通過(guò)抗凝血酶III (ATIII)加速絲氨酸蛋白酶(凝血酶)失活的能力。該方法中，ATIII與肝素中定義明確的五糖序列形成絡(luò)合物，進(jìn)行構(gòu)象變化，從而提高ATIII與絲氨酸蛋白酶如凝血酶的活性位點(diǎn)形成共價(jià)鍵的能力。形成的絲氨酸蛋白酶-ATIII絡(luò)合物再?gòu)母嗡刂嗅尫?，留下所述肝素?jīng)過(guò)催化過(guò)程經(jīng)歷后續(xù)循環(huán)失活。使生物活性實(shí)體，如肝素，以生物活性形式固定在底物上涉及對(duì)這些實(shí)體和生物材料的化學(xué)特性的了解。在醫(yī)療裝置領(lǐng)域，陶瓷、聚合物和/或金屬材料是常見(jiàn)的生物材料。這些材料可用于可植入裝置、診斷裝置或體外裝置。常常需要改性生物材料的化學(xué)組成以使生物活性實(shí)體固定在底物上。通常這樣進(jìn)行這種改性處理生物材料表面以產(chǎn)生一群化學(xué)活性部分或基團(tuán)，然后用合適的方法固定這些生物活性實(shí)體。對(duì)于其它生物材料，用其中摻有反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)的材料覆蓋或涂覆生物材料的表面。然后通過(guò)覆蓋材料的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)將生物活性實(shí)體固定在生物材料上。已經(jīng)記載過(guò)各種用于覆蓋或涂覆生物材料的方案。固定到帶有覆蓋物或涂覆物的生物材料上的生物活性實(shí)體的代表性例子參見(jiàn)美國(guó)專利 4，810，784 ;5，213，898 ;5，897，955 ;5，914，182 ;5，916，585 ;和 6，461，665。當(dāng)生物活性化合物、組合物或?qū)嶓w被固定時(shí)，固定過(guò)程可能對(duì)這些“生物制劑”的生物活性造成負(fù)面影響。許多生物制劑的生物學(xué)活性取決于該生物制劑在其固定狀態(tài)下的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)(即伯、仲、叔等)。除了仔細(xì)選擇固定過(guò)程外，可能還需要對(duì)生物制劑進(jìn)行化學(xué)改變才能將生物制劑以特定的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)摻入覆蓋材料中，所述的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)使所述的生物制劑具有足夠高的生物學(xué)活性來(lái)實(shí)現(xiàn)所需功能。盡管有優(yōu)化的覆蓋和固定方案，但其它處理如滅菌可能降低固定的生物制劑的生物學(xué)活性。在可移植醫(yī)療裝置中，需要在臨用前進(jìn)行滅菌。也可能需要對(duì)具有污染物敏感性的體外診斷裝置進(jìn)行滅菌。這類裝置的滅菌通常需要使裝置暴露于升高的溫度、壓力和濕度，通常是若干循環(huán)。在一些情況下，滅菌過(guò)程中包括抗微生物殺菌劑，如環(huán)氧乙烷氣體(EtO)或過(guò)氧化氫蒸汽。除滅菌外，機(jī)械壓縮和膨脹，或長(zhǎng)期儲(chǔ)存固定的生物制劑會(huì)降低該生物制劑的活性。需要其上固定有生物活性實(shí)體的醫(yī)療裝置，可以在不顯著降低生物活性的前提下對(duì)醫(yī)療裝置進(jìn)行滅菌、機(jī)械壓縮和膨脹和/或儲(chǔ)存。這類醫(yī)療裝置包括生物相容性組合物或化合物與固定的生物實(shí)體，以便最大程度減少滅菌、機(jī)械壓縮和膨脹和/或儲(chǔ)存期間該實(shí)體生物學(xué)活性的降低。在一些情況下，額外的生物相容性組合物或化合物可提高一些生物活性實(shí)體在滅菌后的生物學(xué)活性。發(fā)明概述因此，本發(fā)明包括醫(yī)療底物，所述醫(yī)療底物包括固定在底物上的肝素實(shí)體。與其他涂覆的醫(yī)療底物相比，本發(fā)明的肝素實(shí)體在固定、滅菌、機(jī)械壓縮和膨脹、和/或儲(chǔ)存之后保持明顯的生物學(xué)活性。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括醫(yī)療底物，所述醫(yī)療底物包括通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上的肝素實(shí)體，所述結(jié)合的肝素實(shí)體對(duì)肝素酶敏感。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述底物選自聚乙烯、聚氨酯、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、膨脹型聚四氟乙烯、含氟聚合物、聚烯烴、陶瓷和生物相容性金屬。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述底物是膨脹型聚四氟乙烯。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物相容性金屬是鎳-鈦合金，如鎳鈦諾(Nitinol)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述底物是醫(yī)療裝置的組件。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子(Plug)、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管、心臟起搏器導(dǎo)線、氣囊和留置脈管濾器。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在肝素酶處理之后，所述底物上檢測(cè)不到肝素或其片段。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括肝素實(shí)體，所述肝素實(shí)體包括至少一個(gè)肝素分子和至少一個(gè)核心分子，當(dāng)所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上時(shí)，所述肝素實(shí)體對(duì)肝素酶敏感。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核心分子選自蛋白質(zhì)(包括多肽)、烴、氨基糖苷、多糖和聚合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)端點(diǎn)連接與所述底物相連。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)環(huán)狀連接(loopattachment)與所述底物相連。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括ATIII結(jié)合實(shí)體，其包括核心分子、連接在所述核心分子上的至少一個(gè)多糖鏈和所述多糖鏈上的至少一個(gè)游離末端醛部分(moiety)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多糖鏈?zhǔn)歉嗡鼗蚋嗡仄巍Ｔ诹硪粋€(gè)實(shí)施方式中，所述核心分子選自蛋白質(zhì)(包括多肽)、烴、氨基糖苷(aminoglycoside)、多糖和聚合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中,所述底物選自聚乙烯、聚氨酯、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、膨脹型聚四氟乙烯、含氟聚合物、聚烯烴、陶瓷和生物相容性金屬。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述ATIII結(jié)合實(shí)體通過(guò)端點(diǎn)連接或環(huán)狀連接結(jié)合到底物上。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述底物是醫(yī)療裝置的組件。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括確定結(jié)合在底物上的肝素實(shí)體結(jié)構(gòu)的方法，其包括以下步驟提供包含肝素實(shí)體的底物，解聚所述肝素實(shí)體以生成可溶性肝素片段的混合物，采用柱色譜在所述混合物中檢測(cè)各可溶性肝素片段，確定來(lái)自上述步驟的各檢測(cè)肝素片段 的身份特征(identity)，以及從檢測(cè)到的肝素片段的身份特征得出所述肝素實(shí)體的結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述解聚通過(guò)肝素酶解聚進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述柱色譜是強(qiáng)陰離子交換高效液相色譜(SAX-HPLC)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括用于確定與底物結(jié)合的肝素實(shí)體結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括解聚溶液、標(biāo)記試劑溶液和檢測(cè)器。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述解聚溶液包含肝素酶。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述標(biāo)記試劑溶液包含甲苯胺藍(lán)和三(4-甲硫基)苯甲酸鋱。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述檢測(cè)器包括SAX-HPLC、表面熒光(印ifluoroscent)顯微鏡和吸收分光儀。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖I示出本發(fā)明的幾種肝素實(shí)體和所述肝素實(shí)體與底物的連接類型。圖2示出各種偶聯(lián)(conjugated)到膨脹型聚四氟乙烯(ePTFE)上并進(jìn)行多次EtO滅菌的含醛肝素實(shí)體的ATIII結(jié)合能力。含醛肝素實(shí)體根據(jù)合成所述肝素實(shí)體時(shí)使用的核心分子進(jìn)行分類。因此，實(shí)施例I中作為核心的是硫酸粘菌素(colistin sulfate),實(shí)施例2中的是新霉素，實(shí)施例4中的是聚-L-賴氨酸，實(shí)施例3中的是卷曲霉素，實(shí)施例5中的是聚乙烯亞胺(PEI)，實(shí)施例6中的是乙二胺(EDA)。所有的柱狀物表示樣品數(shù)的平均值，標(biāo)出相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)偏差的誤差線。圖3A和B示出通過(guò)單端點(diǎn)連接方法固定在ePTFE底物上的包含游離末端醛的肝素實(shí)體用肝素酶-I處理并且用甲苯胺藍(lán)染色之前(3A)和之后(3B)的光學(xué)顯微圖。圖B與圖A相比未著色，證明通過(guò)單端點(diǎn)連接方法固定在ePTFE底物上的包含游離末端醛的肝素實(shí)體在肝素酶-I處理之后基本上從所述底物上解聚。圖3C示出通過(guò)端點(diǎn)醛連接和多點(diǎn)連接固定的肝素、包含通過(guò)端點(diǎn)連接和多點(diǎn)連接固定的新霉素核心和至少一個(gè)肝素分子的肝素實(shí)體和通過(guò)多點(diǎn)連接固定的USP肝素用肝素酶-I處理之前和之后的亮度歸一化變化(normalized change)。對(duì)于所有多點(diǎn)連接到所述底物上的肝素端點(diǎn)醛、具有端點(diǎn)醛的包含肝素和新霉素核心的肝素實(shí)體和USP肝素，亮度值的歸一化變化小，表示表面對(duì)肝素酶-I不敏感，在所述表面上仍存在大量肝素。圖4A-C示出通過(guò)單端點(diǎn)連接方法固定在ePTFE底物上的包含肝素和EDA核心的肝素實(shí)體用肝素酶-I處理并且用甲苯胺藍(lán)染色之前(4A和4B)和之后(4C)的光學(xué)顯微圖。染色樣品證明存在肝素實(shí)體。樣品4B和4C進(jìn)行一輪滅菌，在滅菌后僅用去離子水清洗。經(jīng)過(guò)滅菌和肝素酶-I處理之后的圖4C的顏色表明肝素酶-I不能識(shí)別表面上的肝素實(shí)體。圖4D和E示出通過(guò)單端點(diǎn)連接方法固定在ePTFE底物上的包含肝素和EDA核心的肝素實(shí)體用肝素酶-I處理并且用甲苯胺藍(lán)染色之前(4D)和之后(4E)的光學(xué)顯微圖。這些樣品進(jìn)行一輪滅菌并在滅菌后用去離子水和硼酸清洗。經(jīng)過(guò)滅菌之后的圖4E沒(méi)有顏色表明肝素酶-I能識(shí)別所述表面上的肝素實(shí)體并將其解聚。圖5A-C示出由肝素酶-I解聚(A)USP肝素、(B)由肝素和硫酸粘菌素構(gòu)成的肝素實(shí)體和(C)由肝素和硫酸新霉素構(gòu)成的肝素實(shí)體得到的SAX-HPLC色譜。圖6A和B示出由肝素酶-I解聚ePTFE表面固定的(a)通過(guò)游離末端醛結(jié)合的USP 肝素和(b)通過(guò)游離末端醛結(jié)合的由肝素和硫酸粘菌素構(gòu)成的肝素實(shí)體得到的SAX-HPLC色譜。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明包括醫(yī)療底物，所述醫(yī)療底物包括固定到底物上的肝素實(shí)體。與其他涂覆的醫(yī)療底物相比，本發(fā)明的肝素實(shí)體在固定和滅菌之后保持顯著的生物學(xué)活性。在本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容中，使用了一些術(shù)語(yǔ)。給出以下定義。本文和所附權(quán)利要求書所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)含義，除非上下文另有明確說(shuō)明。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“肝素實(shí)體”表示共價(jià)連接在核心分子上的肝素分子。所述肝素分子可以通過(guò)端點(diǎn)連接(如下所述和基本如美國(guó)專利第4，613，665號(hào)所述，其通過(guò)引用結(jié)合入本文用于所有目的)或本領(lǐng)域已知的其他方法(參見(jiàn)例如GT Hermanson，《生物偶聯(lián)技術(shù)》Bioconjugate Techniques),學(xué)術(shù)出版社，1996 ；HG Garg等,肝素和硫酸肝素的化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)(Chemistry and Biology of Heparin and Heparan Sulfate), Elsevier,2005)連接到所述核心分子上。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“核心分子”表示其上連接肝素的多官能分子。出于本發(fā)明的目的，所述核心分子和底物不相同，雖然核心分子和底物可以由同樣的材料制成。在本文中，術(shù)語(yǔ)“基本純的”表示目標(biāo)物質(zhì)是存在的主要物質(zhì)(即與組合物中的任意其他獨(dú)立的物質(zhì)相比，其摩爾基準(zhǔn)更大)，優(yōu)選基本純的餾分是目標(biāo)物質(zhì)構(gòu)成存在的所有大分子物質(zhì)的至少約50% (摩爾基準(zhǔn))的組合物。通常，基本上純的組合物包含存在于所述組合物中的大于約80 %至約90 %的所有大分子物質(zhì)。更優(yōu)選地，所述目標(biāo)物質(zhì)純化成基本均勻(通過(guò)常規(guī)檢測(cè)方法在組合物中無(wú)法檢測(cè)到污染物質(zhì))，其中所述組合物基本上由單一的大分子物質(zhì)構(gòu)成。在本文中，術(shù)語(yǔ)“肝素酶”表示解聚(即消化)肝素的任何酶反應(yīng)。肝素酶的例子包括但不限于能解聚肝素的肝素酶-I、肝素酶-2、肝素酶-3、類肝素酶(heparanase)、外硫酸酯酶(exosulphatase)、細(xì)菌外酶和糖苷酶。在本文中，術(shù)語(yǔ)“對(duì)肝素酶敏感”表示用肝素酶處理包含肝素實(shí)體的底物并且用甲苯胺藍(lán)染色所述底物之后，所述底物未觀察到染色(基本如圖3B和圖4E所示)。該術(shù)語(yǔ)還表示可忽略量的甲苯胺藍(lán)與殘余肝素或其片段結(jié)合，能測(cè)量底物上甲苯胺藍(lán)(或其他標(biāo)記物)量的檢測(cè)器，如分光光度計(jì)、亮度計(jì)、密度計(jì)、液體閃爍計(jì)數(shù)器、或Y計(jì)數(shù)器等的讀數(shù)約為背景水平，或者與不含肝素實(shí)體并用甲苯胺藍(lán)染色的底物相比時(shí)與背景水平?jīng)]有明顯不同，或者與未經(jīng)肝素酶處理的包含肝素實(shí)體并用甲苯胺藍(lán)染色的底物相比時(shí)低于所述檢測(cè)器的靈敏度。該術(shù)語(yǔ)還表示在用肝素酶處理包含肝素實(shí)體的底物之后，與肝素或其片段結(jié)合的標(biāo)記物不能檢測(cè)到明顯量的肝素或其片段。在本文中，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”、“連接”和“偶聯(lián)”和其派生詞涉及肝素實(shí)體和/或肝素時(shí)表示共價(jià)結(jié)合，除非另外說(shuō)明。參照

圖1A-C，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括醫(yī)療底物，所述醫(yī)療底物包括通過(guò)至少一個(gè)肝素分子104結(jié)合到底物106上的肝素實(shí)體100，所述結(jié)合的肝素實(shí)體對(duì)肝素酶敏感。用于固定或結(jié)合所述肝素實(shí)體的合適的底物材料包括聚合物，例如但不限于聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、聚烯烴、聚苯乙烯、聚氨酯、聚(醚氨酯)、聚氯乙烯、硅酮、聚乙烯、聚丙烯、聚異戊二烯、聚四氟乙烯和膨脹型聚四氟乙烯(ePTFE，如U. S專利第4，187，390號(hào)所述)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述底物是膨脹型或多孔聚四氟乙烯(ePTFE)。其他的底物包括但不限于疏水性底物，如聚四氟乙烯、膨脹型聚四氟乙烯、多孔聚四氟乙烯、氟化乙烯-丙烯、六氟丙烯、聚乙烯、聚丙烯、尼龍、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚氨酯、橡膠、娃酮橡膠、聚苯乙烯、聚砜、聚酯、聚輕基酸(polyhydroxyacid)、聚碳酸酯、聚酰亞胺、聚酰胺、聚氨基酸、再生纖維素和蛋白質(zhì)如絲、羊毛和皮革。制備多孔聚四氟乙烯材料的方法如美國(guó)專利第3，953，566和4，187，390號(hào)所述，它們各自通過(guò)引用納入本文。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述ePTFE可以用至少一種已知的化合物浸潰、填充、浸潤(rùn)(imbibe)或涂覆來(lái)引起生物活性應(yīng)答。引起生物活性應(yīng)答的化合物包括抗微生物劑(例如抗菌劑和抗病毒劑)、抗炎劑(例如地塞米松和潑尼松)、抗增殖劑(例如紫杉酚、紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(docetaxel))和抗聚結(jié)劑(例如阿昔單抗(abciximab)、依替巴肽(eptifibatide)和替羅非班(tirofibran))。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗炎劑是類固醇。在另一實(shí)施方式中，所述類固醇是地塞米松。涂覆底物的方法為本領(lǐng)域熟知。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述底物包括本發(fā)明的肝素實(shí)體和涂層，所述涂層包含引起生物活性應(yīng)答的化合物。所述底物包括以上和以下所述的材料。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述底物是ePTFE。 其他合適的底物包括但不限于纖維質(zhì)材料、瓊脂糖、藻酸鹽、聚羥基乙基甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚烯丙基胺、聚烯丙基醇、聚丙烯酰胺和聚丙烯酸。此外，某些金屬和陶瓷可以用作本發(fā)明的底物。合適的金屬包括但不限于例如鈦、不銹鋼、金、銀、銠、鋅、鉬、銣和銅。合適的合金包括鈷-鉻合金如L-605、MP35N、埃爾吉洛伊耐蝕游絲合金(Elgiloy),鎳-鉻合金(如鎳鈦諾(Nitinol)),和銀合金如Nb-I % Zr等。用于陶瓷底物的合適的材料包括但不限于氧化硅(silicone oxide)、氧化鋁、鋁土、娃土、輕基磷灰石(hydroxyapapitite)、玻璃、氧化韓、聚娃燒醇(polysilanol)和氧化磷。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用基于蛋白質(zhì)的底物，如膠原。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用基于多糖的底物，如纖維素。一些底物可以具有大量反應(yīng)活性化學(xué)基團(tuán)，增加至少一部分其上可結(jié)合本發(fā)明肝素實(shí)體的表面。本發(fā)明的所述肝素實(shí)體通過(guò)所述反應(yīng)活性化學(xué)基團(tuán)與底物材料共價(jià)結(jié)合。所述底物的表面可以是光滑、粗糙、多孔、彎曲、平坦、有角、不規(guī)則的表面或其組合。在一些實(shí)施方式中，具有表面孔隙的底物含有由該材料多孔表面延伸到材料本體內(nèi)的內(nèi)部孔隙空間。這些多孔性底物的內(nèi)部底物材料約束了這些孔隙，常常提供適合固定生物活性實(shí)體的表面。無(wú)論是否具多孔性，底物都可以是細(xì)絲、薄膜、片層、管狀、網(wǎng)狀、織物、無(wú)紡織物和其組合。表面上缺少反應(yīng)活性化學(xué)基團(tuán)(或缺少適當(dāng)反應(yīng)活性的化學(xué)基團(tuán))的底物可以至少部分用聚合物覆蓋材料覆蓋，所述覆蓋材料上具有可以與所述肝素實(shí)體結(jié)合的大量反應(yīng)活性基團(tuán)。聚合物底物也可以使用多種方法沿其表面或沿其聚合物主鏈進(jìn)行改性，這些方法包括水解、氨解、光解、蝕刻、等離子體改性、等離子體聚合、碳烯插入、氮烯插入(nitreneinsertion)等。所述肝素實(shí)體通過(guò)覆蓋材料的反應(yīng)活性化學(xué)基團(tuán)與聚合物覆蓋材料共價(jià)連接或結(jié)合，或者直接與已改性的底物共價(jià)連接或結(jié)合。所述聚合物覆蓋材料可以在至少一部分底物上形成至少一層。有多種其他的表面改性方法，例如美國(guó)專利第4，600, 652和6，642，242號(hào)所述，這些方法基于可以通過(guò)共價(jià)連接將具有聚氨酯脲層的底物與通過(guò)亞硝酸或高碘酸鹽氧化來(lái)包含醛基的改性肝素結(jié)合而作出。類似的技術(shù)如美國(guó)專利第5，032，666號(hào)所述，其中底物表面在用抗血栓形成劑(如醛活化的肝素)固定之前，用富胺的氟化聚氨酯脲涂覆。公開(kāi)出版物W087/07156中描述的是另一種可能提及的抗血栓形成的表面改性方法。裝置的表面通過(guò)用溶菌酶或其衍生物層涂覆其上粘附有肝素的表面進(jìn)行改性。制備抗血栓形成制品的另一種表面改性方法如美國(guó)專利第4，326，532號(hào)所述。在這種情況下，層狀抗血栓形成表面包括聚合物底物、與所述聚合物底物結(jié)合的殼聚糖和與所述殼聚糖涂層結(jié)合的抗血栓形成劑。其他文獻(xiàn)報(bào)道了也使用殼聚糖層來(lái)結(jié)合肝素的抗血栓形成的血濾器(hemofilter)。制備抗血栓形成表面的另一種方法如W097/07834所述，其中肝素與足量高碘酸鹽混合，從而不會(huì)以超過(guò)每肝素分子兩個(gè)糖單位(2糖單位/肝素分子)進(jìn)行反應(yīng)。將該混合物加入醫(yī)療裝置的表面改性底物中，所述表面改性包含氨基。以上列出的向底物添加反應(yīng)活性基團(tuán)的方法僅僅是如何將其實(shí)現(xiàn)的小例子。以上列舉沒(méi)有窮盡。此外，應(yīng)清楚用來(lái)向底物添加反應(yīng)活性化學(xué)基團(tuán)的方法取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)底物性質(zhì)的認(rèn)識(shí)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)至少一個(gè)肝素分子包含所述結(jié)合的肝素實(shí)體的醫(yī)療底物是醫(yī)療裝置的組件。醫(yī)療裝置包括但不限于移植物、人造血管、支架、 支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物!貼片(hernia patch)、_塞(hernia plugs)、牙周移植物(periodontal graft)、手術(shù)用織物、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管、心臟導(dǎo)線氣囊(cardiac leads balloon)和留置濾器。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述支架可以用于心臟、外周或神經(jīng)學(xué)應(yīng)用中。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述支架-移植物可以用于心臟、夕卜周或神經(jīng)學(xué)應(yīng)用中。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括一種肝素實(shí)體，所述肝素實(shí)體包含至少一個(gè)肝素分子和至少一個(gè)核心分子。如圖I所示，核心分子102是肝素實(shí)體100的“骨架”，肝素分子104結(jié)合在核心分子上。所述核心分子102可以是環(huán)狀(102a，圖IA和1C)、直線狀(102b，圖1B)、支鏈狀、樹(shù)枝狀、“Y”形、“T”形或“星”形，如Freudenberg, U.，《生物材料》，30，5049-5060，2009 和 Yamaguchi，N.，《生物大分子》，6，1921-1930，2005 中所述。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核心分子選自蛋白質(zhì)(包括多肽)、烴、脂質(zhì)、氨基糖苷、多糖和聚合物。蛋白質(zhì)包括但不限于抗體、酶、受體、生長(zhǎng)因子、激素、絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)和任意球蛋白。特定的蛋白質(zhì)和多肽包括但不限于白蛋白、粘菌素、膠原、聚賴氨酸、抗凝血酶III、纖維蛋白、纖維蛋白原、凝血酶、層連蛋白(Iaminin)、和角蛋白等。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述核心分子可以是多肽。所述多肽無(wú)需很長(zhǎng)，可以包括一種或多種氨基酸的重復(fù)，例如絲氨酸、甘氨酸(例如Ser-Gly-Gly-Ser-Gly)、賴氨酸或鳥(niǎo)氨酸殘基的重復(fù)?；蛘呖梢允褂闷渌陌被嵝蛄校缯尘?、聚賴氨酸和多粘菌素。多糖的例子包括但不限于中性多糖如纖維素、淀粉、瓊脂糖、羧甲基纖維素、硝基纖維素和右旋糖苷，陰離子型多糖如藻酸鹽、肝素、硫酸肝素、硫酸右旋糖酐、黃原膠、透明質(zhì)酸、角叉菜膠、阿拉伯膠、黃蓍膠(tragacanth)、阿拉伯半乳聚糖和果膠；大環(huán)多糖如環(huán)糊精和羥丙基環(huán)糊精；和多陽(yáng)離子型多糖如殼多糖和殼聚糖。合成聚合物的例子包括但不限于聚乙二醇(PEG) 200，300，400，600，1000，1450，3350，4000，6000，8000和20000、聚四氟乙烯、聚丙二醇、聚(乙二醇-共-丙二醇)、聚乙
二醇的共聚物、聚丙二醇的共聚物、四氟乙烯與乙酸乙烯酯和乙烯醇的共聚物、乙烯與乙酸乙烯酯和乙烯醇的共聚物、聚乙烯醇、聚乙烯亞胺、聚丙烯酸；多元醇如聚乙烯醇和聚烯丙基醇；聚陰離子如丙烯酸和聚(甲基丙烯酸)。聚陽(yáng)離子共聚物包括聚(烯丙胺)、聚(乙烯亞胺)、聚(胍)、聚(乙烯胺)、聚乙二醇-二胺、乙二胺和聚(季胺)；聚丙烯腈如水解聚丙烯腈、聚(丙烯酰胺-共-丙烯腈)和它們的共聚物。其他共聚物包括氟化共聚物，所述氟化共聚物包括四氟乙烯與乙烯醇、乙酸乙烯酯、乙烯甲酰胺、丙烯酰胺和乙烯胺的共聚物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述核心分子可以是氨基糖苷，包括但不限于丁胺卡那霉素、阿貝卡星(arbekacin)、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、乙基西梭霉素、巴龍霉素、紅鏈霉素(rhodostreptomycin)、鏈霉素、妥布霉素和阿普拉霉素。肝素是從豬腸或牛肺中分離的粘多糖，其分子大小和化學(xué)結(jié)構(gòu)是不均勻的。肝素由交替的葡糖醛酸和葡糖胺單元構(gòu)成。葡糖醛酸單元由D-葡糖醛酸和L-艾杜糖醛酸組成。分別是D-和L-(l，4)_結(jié)合至D-葡糖胺單元。較大比例的L-艾杜糖醛酸殘基在2-位被硫酸化。D-葡糖胺單元為N-硫酸化，在6-位被硫酸化，a-(1，4)_結(jié)合到糖醛酸殘基上。一些D-葡糖胺單元也在3-位被硫酸化。肝素包含分子量約為6，000-30, 000道爾頓的材料。通過(guò)硫酸化和乙?；圆煌某潭妊苌闪u基和胺基。肝素中產(chǎn)生抗凝血性質(zhì)的活性序列是與配體抗凝血酶III (ATIII)結(jié)合的獨(dú)特五糖序列。該序列由三個(gè)D-葡糖胺和兩個(gè) 糖醛酸殘基組成。肝素分子也可以根據(jù)其五糖含量進(jìn)行分類。約三分之一的肝素包含具有對(duì)ATIII有高親和性的一個(gè)拷貝的獨(dú)特五糖序列的鏈(參見(jiàn)Choay，血栓和止血研討會(huì)(Seminars in Thrombosis and Hemostasis) 11 :81-85 (1985),其通過(guò)引用納入本文)，而較小的比例(估計(jì)約為總肝素的1% )由含超過(guò)一個(gè)拷貝的高親和性五糖的鏈組成(參見(jiàn)Rosenberg 等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 86 :1319-1324(1979)，其通過(guò)引用納入本文)。剩余的肝素(約66%)不包含五糖序列。因此，所謂的“標(biāo)準(zhǔn)肝素”由以下三種物質(zhì)的混合物構(gòu)成“高親和性”肝素，其富含含有至少一個(gè)拷貝的五糖的物質(zhì)，“極高親和性”肝素表示大約I %的分子包含超過(guò)一個(gè)拷貝的五糖序列。這三種物質(zhì)可以使用常規(guī)色譜法彼此分離，例如在抗凝血酶親和柱上進(jìn)行色譜(例如Sepharose-AT ;參見(jiàn),例如Lam等，Biochem.Biophys. Res. Comm. 69 :570-577(1976)和 Horner Biochem. J. 262 :953-958 (1989)，其通過(guò)引用納入本文)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述肝素來(lái)自動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肝素來(lái)自?；蜇i。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肝素是合成肝素，即非動(dòng)物來(lái)源(例如磺達(dá)肝素(fondaparinux)或依諾肝素(enoxaparin))。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的肝素實(shí)體包括濃縮的肝素，并且包含基本上純的“高親和性”肝素。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的肝素實(shí)體包括濃縮的肝素，并且包含基本上純的“極高親和性”肝素。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的肝素實(shí)體包括濃縮的肝素，并且包含基本上純的“高親和性”和“極高親和性”肝素的組合。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括通過(guò)至少一個(gè)肝素分子將所述肝素實(shí)體與醫(yī)療底物結(jié)合。如圖I所示，本發(fā)明的肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子與所述底物結(jié)合。這樣，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)端點(diǎn)連接與所述底物相連(如圖IA和IB所示)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)端點(diǎn)醛與所述底物相連。這可以基本上如美國(guó)專利第4，613，665號(hào)(其全文內(nèi)容通過(guò)引用納入本文)所述并且如以下所述完成。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)環(huán)狀連接(loop attachment)與所述底物相連。如圖IC所示,環(huán)狀連接是所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素連接的連接方式，其中所述肝素在少量位置上與所述底物松散地連接，從而使得相當(dāng)部分的結(jié)合肝素與肝素酶相接觸(與將肝素緊密地連接在大量位置上的更常見(jiàn)的方法相反)。將肝素與底物偶聯(lián)的更常見(jiàn)的方法包括使大部分沿肝素分子長(zhǎng)度無(wú)規(guī)定位的官能團(tuán)反應(yīng)(例如使用偶聯(lián)劑如碳二亞胺、環(huán)氧化物和聚醛)。這些方法使得所述活性序列(上述獨(dú)特的五糖序列)有很大的可能與所述底物結(jié)合，得到降低的活性和/或喪失活性。在肝素的環(huán)狀連接中，只有肝素上的一些官能團(tuán)反應(yīng)并與所述底物結(jié)合。因此，很可能連接的肝素中的活性序列未與所述底物相結(jié)合，從而使得所述活性序列與其配體結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括與所述底物有多種連接方式的肝素實(shí)體，其中所述活性序列未與所述底物結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)環(huán)狀連接與所述底物相連。如上所述，端點(diǎn)連接和環(huán)狀連接使得至少一個(gè)肝素分子中的相當(dāng)部分(在肝素實(shí)體中)未與底物結(jié)合。本文中，術(shù)語(yǔ)“相當(dāng)部分”表示約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%的肝素分子未與所述底物結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該術(shù)語(yǔ)還表示與所述底物結(jié)合的所述至少一個(gè)肝素分子(在肝素實(shí)體中)不通過(guò)其活性序列與底物結(jié)合。因此，由于所述活性序列未與所述底物的表面結(jié)合，所述活性序列與其配體相互作用的可能性較高。換言之，如果所述活性序列與所述底物的表面結(jié)合，則肝素與其配體結(jié)合的機(jī)會(huì)就小。但是，由于所述肝素實(shí)體通過(guò)端點(diǎn)連接和/或環(huán)狀連接由肝素相連，所述肝素對(duì)肝素酶敏感。因此，在肝素酶處理之后，在所述底物的表面上有極少(如果有的話)的肝素或其片段。相反，一些更常見(jiàn)的將肝素與底物表面相連的方法(如上所述，其沿肝素分子的長(zhǎng)度包含多個(gè)鍵)在肝素酶處理之后，將仍有大量肝素或其片段與所述底物表面相連。因此，在肝素酶處理之后，可以在所述底物表面上檢測(cè)到肝素或其片段。不限于任何具體理論，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了結(jié)合肝素或肝素實(shí)體對(duì)肝素酶越敏感，所述結(jié)合肝素或肝素實(shí)體的生物活性越高。這可能是因?yàn)榻Y(jié)合肝素或肝素實(shí)體的活性序列不與底物的表面相連，因此所述結(jié)合肝素或肝素實(shí)體與其配體結(jié)合的機(jī)會(huì)更大。肝素必須具有完整的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)來(lái)被ATIII識(shí)別，如果所述構(gòu)象和結(jié)構(gòu)損失，肝素將表現(xiàn)出很差的活性。此外，所述構(gòu)象和結(jié)構(gòu)損失導(dǎo)致其他蛋白質(zhì)如肝素酶-I的識(shí)別性差，使得損失肝素難以解聚。例如，用碳二亞胺改性可溶性肝素以不再被肝素酶-I識(shí)別的方式改變所述可溶性肝素結(jié)構(gòu)，改性的可溶性肝素具有降低的全血抗凝血活性(參見(jiàn)Olivera, G. B.，生物材料(Biomaterials)，24，4777-4783，2003)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)連接的肝素或肝素實(shí)體的肝素酶敏感性可通過(guò)所述連接肝素或肝素實(shí)體的ATIII結(jié)合活性來(lái)預(yù)測(cè)。不希望受限于任何具體理論，如果連接的肝素或肝素實(shí)體保持對(duì)特定酶如肝素酶-I的特異性(specificity)，則所述連接的肝素或肝素實(shí)體保持對(duì)其基本上足夠的初級(jí)/二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)，也具有對(duì)ATIII的特異性。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)連接的肝素或肝素實(shí)體被肝素酶-I識(shí)別時(shí)，所述連接的肝素或肝素實(shí)體也被ATIII識(shí)別，即具有高結(jié)合活性。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)硼酸清洗能恢復(fù)失活的連接肝素或肝素實(shí)體(例如通過(guò)滅菌、機(jī)械壓縮和膨脹或長(zhǎng)期儲(chǔ)存失活)對(duì)肝素酶敏感性。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括一種恢復(fù)結(jié)合在底物上的肝素或肝素實(shí)體的肝素酶敏感性的方法，其包括在硼酸溶液中清洗所述底物。在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)所述底物進(jìn)行滅菌循環(huán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)所述底物進(jìn)行降低肝素酶-I活性的機(jī)械處理。 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，在用肝素酶對(duì)具有本發(fā)明的結(jié)合肝素實(shí)體的醫(yī)療底物進(jìn)行處理之后，在所述底物上檢測(cè)不到肝素或其片段。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在用肝素酶對(duì)具有本發(fā)明的結(jié)合肝素實(shí)體的醫(yī)療底物進(jìn)行處理之后，與肝素酶處理之前相比，檢測(cè)到的肝素或其片段水平明顯更低。明顯更低水平的檢測(cè)包括對(duì)肝素染色和/或標(biāo)記之后的極少檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肝素或其片段在染色或標(biāo)記之后視覺(jué)上(宏觀上)觀察不到。肝素或其片段可以通過(guò)直接或間接與肝素或其片段結(jié)合的標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方式中，與肝素或其片段結(jié)合的所述標(biāo)記物選自染料、抗體和蛋白。標(biāo)記物的例子包括但不限于蛋白，包括抗肝素抗體(多克隆或單克隆)和ATIII ;異染性染料，包括甲苯胺藍(lán)、天青 A(azure A)、阿辛藍(lán)(alcian blue)、維多利亞藍(lán) 4R(victoria blue 4R)、夜藍(lán)(night blue)、亞甲藍(lán)；放射性碘化標(biāo)記物，包括放射性碘化甲苯胺藍(lán)、放射性碘化亞甲藍(lán)、放射性碘化肝素抗體、放射性碘化ATIII ;氚化標(biāo)記物，包括氚化甲苯胺藍(lán)、氚化天青A、氚化阿辛藍(lán)、氚化維多利亞藍(lán)4R、氚化夜藍(lán)、氚化亞甲藍(lán)；碳-14標(biāo)記物，包括14C-甲苯胺藍(lán)、14C-天青A、14C-阿辛藍(lán)、14C-維多利亞藍(lán)4R、14C-夜藍(lán)、14C-亞甲藍(lán)；熒光標(biāo)記物，包括若丹明(rhodamine)標(biāo)記的肝素抗體、突光素標(biāo)記的肝素抗體、若丹明標(biāo)記的ATIII、突光素標(biāo)記的ATIII。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述染料是甲苯胺藍(lán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍(lán)與肝素或其片段結(jié)合，但在所述底物上目測(cè)檢測(cè)不到(基本上如圖3B和4E所示)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍(lán)與殘余的肝素或其片段結(jié)合，能測(cè)量底物上甲苯胺藍(lán)(或上述其他標(biāo)記物)量的檢測(cè)器(例如分光光度計(jì)、亮度計(jì)、密度計(jì)、液體閃爍計(jì)數(shù)器、或Y計(jì)數(shù)器等)的讀數(shù)約為背景水平，或者與不含肝素實(shí)體的底物相比時(shí)與背景水平?jīng)]有明顯差別。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在肝素酶處理之后，能測(cè)量底物上甲苯胺藍(lán)(或上述其他標(biāo)記物)量的檢測(cè)器讀數(shù)與未經(jīng)肝素酶處理的包含肝素實(shí)體并用甲苯胺藍(lán)染色的底物相比時(shí)明顯不同。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括肝素實(shí)體，所述肝素實(shí)體包括至少一個(gè)與核心分子相連的肝素分子，其中所述實(shí)體通過(guò)肝素分子與底物結(jié)合，在與肝素酶和甲苯胺藍(lán)接觸之后，所述底物宏觀上顯示其表面上基本上無(wú)甲苯胺藍(lán)(如圖3B和4E所示)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括肝素實(shí)體，所述肝素實(shí)體包括至少一個(gè)肝素分子和至少一個(gè)核心分子，當(dāng)所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上時(shí)，所述肝素實(shí)體對(duì)肝素酶敏感。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述底物選自聚乙烯、聚氨酯、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、膨脹型聚四氟乙烯、生物相容性金屬、陶瓷、蛋白質(zhì)、多糖和任意上述底物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述底物是膨脹型聚四氟乙烯。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述底物是醫(yī)療裝置的組件。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子(Plug)、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管和心臟導(dǎo)線。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述支架可以用于心臟、外周或神經(jīng)學(xué)應(yīng)用中。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述支架-移植物可以用于心臟、外周或神經(jīng)學(xué)應(yīng)用中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述醫(yī)療裝置可以用于矯形外科、皮膚科或婦科應(yīng)用中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述核心分子包括環(huán)形、直鏈、支鏈、樹(shù)枝狀、“Y”、“T”或星狀分子結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述核心分子選自蛋白質(zhì)、多肽、烴、多糖、氨基糖苷、聚合物和含氟聚合物。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)與肝素或其片段結(jié)合的標(biāo)記物檢測(cè)肝素或其片段。在另一個(gè)實(shí)施方式中，與肝素或其片段結(jié)合的所述標(biāo)記物選自染料、多克隆抗體和蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述染料是甲苯胺藍(lán)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍(lán)與殘余肝素或其片段結(jié)合，在所述底物上目測(cè)檢測(cè)不到。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍(lán)與殘余的肝素或其片段結(jié)合，能測(cè)量底物上甲苯胺藍(lán)(或上述其他標(biāo)記物)量的檢測(cè)器(例如分光光度計(jì)、亮度計(jì)、密度計(jì)、液體閃爍計(jì)數(shù)器、或Y計(jì)數(shù)器等)的讀數(shù)約為背景水平，或者與不含肝素實(shí)體的底物相比時(shí)與背景水平?jīng)]有明顯差別。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在肝素酶處理之后，能測(cè)量底物上甲苯胺藍(lán)(或上述其他標(biāo)記物)量的檢測(cè)器讀數(shù)與未經(jīng)肝素酶處理的包含肝素實(shí)體并用甲苯胺藍(lán)染色的底物相比時(shí)明顯不同。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合在底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)端點(diǎn)連接與所述底物相連。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合在底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)端點(diǎn)醛與所述底物相連。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合在底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)環(huán)狀連接(loop attachment)與所述底物相連。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合在底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)醛 沿所述肝素長(zhǎng)度與所述底物相連。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括ATIII結(jié)合實(shí)體，其包括核心分子、與所述核心分子相連的多糖鏈和在所述多糖鏈上的游離末端醛部分。該ATIII結(jié)合實(shí)體則可以通過(guò)末端醛與底物相連。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括ATIII結(jié)合實(shí)體，其包括核心分子、與所述核心分子相連的多糖鏈和沿所述多糖鏈長(zhǎng)度的游離末端醛部分。該ATIII結(jié)合實(shí)體則可以通過(guò)醛沿著所述多糖鏈的長(zhǎng)度與底物環(huán)狀連接。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述多糖鏈?zhǔn)歉嗡亍Ｔ诹硪粋€(gè)實(shí)施方式中，所述核心分子選自蛋白質(zhì)(包括多肽)、烴、氨基糖苷、多糖、聚合物、含氟聚合物或本文所述的任意核心分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，肝素通過(guò)端點(diǎn)連接結(jié)合在所述核心分子上。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述底物選自聚乙烯、聚氨酯、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、膨脹型聚四氟乙烯、生物相容性金屬或本文所述的任意底物。在另一實(shí)施方式中，所述生物相容性金屬是鎳鈦諾(Nitinol)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述底物是膨脹型聚四氟乙烯。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述底物是醫(yī)療裝置的組件。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子(Plug)、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管和心臟導(dǎo)線。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述醫(yī)療裝置可以用于心臟、外周、神經(jīng)學(xué)、矯形外科、皮膚科或婦科應(yīng)用中。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括可植入的醫(yī)療裝置，所述醫(yī)療裝置包括醫(yī)療底物、所述醫(yī)療底物包括通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合在底物上的肝素實(shí)體，所述結(jié)合的肝素實(shí)體對(duì)肝素酶敏感。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子(Plug)、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管和心臟導(dǎo)線。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述支架可以用于心臟、外周或神經(jīng)學(xué)應(yīng)用中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述支架可以是可擴(kuò)張氣囊的和/或自膨脹型支架。所述支架可以由任意生物相容性材料制備，所述生物相容性材料包括上述任意聚合物或金屬。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述支架由鎳鈦諾和/或不銹鋼制成。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述支架包括移植物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述移植物和/或支架包括本發(fā)明的肝素實(shí)體。與其他涂覆的醫(yī)療底物相比，本發(fā)明的肝素實(shí)體在固定和滅菌之后保持明顯的生物學(xué)活性。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述金屬底物包括通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上的肝素實(shí)體，所述結(jié)合的肝素實(shí)體對(duì)肝素酶敏感，其ATIII活性約為300皮摩爾/平方厘米。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述ATIII活性約為250皮摩爾/平方厘米、約200皮摩爾/平方厘米、約150皮摩爾/平方厘米、約100皮摩爾/平方厘米、約50皮摩爾/平方厘米、約40皮摩爾/平方厘米、約30皮摩爾/平方厘米、約20皮摩爾/平方厘米、約10皮摩爾/平方厘米或約5皮摩爾/平方厘米。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在第一輪滅菌之后，所述醫(yī)療底物的ATIII活性約為250皮摩爾/平方厘米、約200皮摩爾/平方厘米、約150皮摩爾/平方厘米、約100皮摩爾/平方厘米、約50皮摩爾/平方厘米、約40皮摩爾/平方厘米、約30皮摩爾/平方厘米、約20皮摩爾/平方厘米、約10皮摩爾/平方厘米或約5皮摩爾/平方厘米。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在第二輪滅菌之后，所述醫(yī)療底物的ATIII活性約為100皮摩爾/平方厘米、約90皮摩爾/平方厘米、約80皮摩爾/平方厘米、約70皮摩爾/平方厘米、約60皮摩爾/平方厘米、約50皮摩爾/平方厘米、約40皮摩爾/平方厘米、約30皮摩爾/平方厘米、約20皮摩爾/平方厘米、約10皮摩爾/平方厘米或約5皮摩爾/平方厘米。在另 一個(gè)實(shí)施方式中，在第三輪滅菌之后，所述醫(yī)療底物的ATIII活性高于約50皮摩爾/平方厘米、或者約為70皮摩爾/平方厘米、約60皮摩爾/平方厘米、約50皮摩爾/平方厘米、約40皮摩爾/平方厘米、約30皮摩爾/平方厘米、約20皮摩爾/平方厘米、約10皮摩爾/平方厘米或約5皮摩爾/平方厘米。ATIII活性鑒定方法是本領(lǐng)域熟知的，至少一種如下所述。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述肝素實(shí)體在壓縮和膨脹醫(yī)療裝置之后保持明顯的生物活性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述肝素實(shí)體在經(jīng)過(guò)醫(yī)療裝置的壓縮和/或膨脹狀態(tài)下的儲(chǔ)存條件之后保持明顯的生物活性。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括確定與底物結(jié)合的肝素實(shí)體結(jié)構(gòu)的方法。確定與底物結(jié)合的肝素實(shí)體結(jié)構(gòu)的一種方法包括以下步驟提供包含肝素實(shí)體的底物，解聚所述肝素實(shí)體以產(chǎn)生可溶性肝素片段的混合物，用柱色譜檢測(cè)所述混合物中的各可溶性肝素片段，確定以上檢測(cè)到的可溶性肝素片段的身份特征，和從所述檢測(cè)到的可溶性肝素片段的身份特征得到所述肝素實(shí)體的結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述解聚通過(guò)肝素酶-I進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方式中，柱色譜是強(qiáng)陰離子交換高效液相色譜或SAX-HPLC。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括可植入的醫(yī)療裝置，所述醫(yī)療裝置包括醫(yī)療底物、所述醫(yī)療底物包括通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合在底物上的肝素實(shí)體，所述結(jié)合的肝素實(shí)體對(duì)肝素酶敏感。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子(Plug)、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管、心臟導(dǎo)線、氣囊和留置濾器。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述支架可以用于心臟、外周或神經(jīng)學(xué)應(yīng)用中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述支架可以是可擴(kuò)張氣囊的和/或自膨脹型支架。所述支架可以由任意生物相容性材料制備，所述生物相容性材料包括上述任意聚合物或金屬。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述支架由鎳鈦諾和/或不銹鋼制成。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述支架包括移植物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述移植物和/或支架包括本發(fā)明的肝素實(shí)體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括確定與底物結(jié)合的肝素實(shí)體的空間分布的方法。確定與底物結(jié)合的肝素實(shí)體的空間分布的一種方法包括以下步驟提供包含肝素實(shí)體的底物，解聚所述肝素實(shí)體以產(chǎn)生包含表面結(jié)合的不飽和肝素片段的表面，使所述表面與標(biāo)記試劑反應(yīng)，所述標(biāo)記試劑向所述表面結(jié)合的不飽和肝素片段引入可檢測(cè)組分，通過(guò)所述可檢測(cè)組分檢測(cè)所述表面結(jié)合的不飽和肝素片段，以及從存在的表面結(jié)合的不飽和肝素片段得到所述肝素實(shí)體的空間分布。在一個(gè)實(shí)施方式中，解聚通過(guò)肝素酶-I進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述肝素試劑是鑭系邁克爾類加成有機(jī)絡(luò)合物(lanthanoid Michael-Iikeaddition organo-complex)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述標(biāo)記試劑是三(4-甲硫基)苯甲酸鋱。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述有機(jī)絡(luò)合物包含化學(xué)吸收的金納米顆粒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述檢測(cè)通過(guò)表面熒光顯微鏡或透射電子顯微鏡進(jìn)行。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式包括用于確定與底物結(jié)合的肝素實(shí)體結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括解聚溶液、標(biāo)記試劑溶液和檢測(cè)器。系統(tǒng)是用來(lái)檢測(cè)與底物結(jié)合的肝素實(shí)體結(jié)構(gòu)和類型的試劑和設(shè)備的組合件。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述解聚溶液包括肝素酶-I。在另一個(gè) 實(shí)施方式中，所述標(biāo)記試劑溶液包含甲苯胺藍(lán)和三(4-甲硫基)苯甲酸鋱。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述檢測(cè)器包括SAX-HPLC、表面熒光(印ifluoroscent)顯微鏡和吸收分光儀。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑的組合件可以是試劑盒。在對(duì)端點(diǎn)連接的肝素和/或肝素實(shí)體進(jìn)行酶促肝素酶-I解聚之后，留在表面上的肝素片段是不飽和的，即它們包含碳碳雙鍵(“殘根(nub)”)。酶促肝素酶解聚涉及將非還原性末端糖醛酸殘基切割成4，5-不飽和衍生物。這得到與底物結(jié)合的剩余表面結(jié)合的不飽和肝素片段，所述肝素片段包括碳碳雙鍵。因此，所述剩余表面結(jié)合的不飽和肝素片段結(jié)構(gòu)是不飽和的，可以與各種檢測(cè)分子反應(yīng)，這些檢測(cè)分子包括邁克爾類加成絡(luò)合物，如含硫醇的化合物和含硫醇的熒光化合物，如三(4-甲硫基)苯甲酸鋱。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)端點(diǎn)連接的肝素實(shí)體進(jìn)行酶促肝素酶-I解聚之后，檢測(cè)到與底物結(jié)合的所述剩余表面結(jié)合的不飽和肝素片段包含碳碳雙鍵。該方法可以確定肝素和/或肝素實(shí)體是否與底物端點(diǎn)連接。在另一個(gè)實(shí)施方式中，殘根檢測(cè)與任一種上述檢測(cè)和/或標(biāo)準(zhǔn)方法組合使用。通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)解釋為具有限制性。所有附圖和參考文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)參考結(jié)合于此。實(shí)施例實(shí)施例I本實(shí)施例描述包含肝素和硫酸粘菌素作為核心的肝素實(shí)體的構(gòu)造。該肝素實(shí)體包含可用于連接底物表面的游離末端醛。將硫酸粘菌素(0. 10g, Alpharma股份有限公司(Alpharma, Inc.))溶解在300毫升含MES緩沖液(pH 4. 7, BupH 熱科學(xué)公司(Thermo Scientific))的去離子(DI)水中。向其中加入10克USP肝素、4克N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS，熱科學(xué)公司)和4克I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(鹽酸EDC，密蘇里州圣路易斯的西格瑪-艾爾德里奇公司(EDC hydrochloride, Sigma-Aldrich, St. Louis,MO))。使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行 4小時(shí)，接著用50,000 MWCO膜(Spectra/p0r )透析過(guò)夜。將滯留物(從500毫升得到約350毫升)轉(zhuǎn)移至燒杯中，冷卻至0°C。加入亞硝酸鈉(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反應(yīng)在0°C進(jìn)行I小時(shí)。用50，000MWC0膜進(jìn)行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析過(guò)夜。冷凍并凍干滯留物，得到細(xì)粉末。實(shí)施例2本實(shí)施例描述包含肝素和硫酸新霉素作為核心的肝素實(shí)體的構(gòu)造。該肝素實(shí)體包含可用于連接底物表面的游離末端醛。將硫酸新霉素(0. 0646克，光譜化學(xué)公司(Spectrum Chemical))溶解在300毫升含MES緩沖液(pH 4. 7, BupH 熱科學(xué)公司(Thermo Scientific))的去離子(DI)水中。向其中加入10克USP肝素、4克N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)和4克鹽酸EDC。使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行4小時(shí)，接著用50,000 MWCO膜(Spectra/por )透析過(guò)夜。將滯留物(從505毫升得到約400毫升)轉(zhuǎn)移至燒杯中，冷卻至0°C。加入亞硝酸鈉(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反應(yīng)在0°C進(jìn)行I小時(shí)。用50，000MWC0膜進(jìn)行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析過(guò)夜。使用20微米、0. 00079英寸的美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試篩(A. S. T. M. E. -11第635號(hào)說(shuō)明)過(guò)濾透析滯留物兩次，以去除小顆粒。冷凍滯留物并凍干，得到細(xì)粉末。實(shí)施例3
本實(shí)施例描述包含肝素和硫酸卷曲霉素作為核心的肝素實(shí)體的構(gòu)造。該肝素實(shí)體包含可用于連接底物表面的游離末端醛。將硫酸卷曲霉素(0. 0501克，密蘇里州圣路易斯的西格瑪-艾爾德里奇公司)溶解在300毫升含MES緩沖液(pH 4. 7, BupH 熱科學(xué)公司(Thermo Scientific))的去離子(DI)水中。向其中加入10克USP肝素、4克N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)和4克鹽酸EDC。使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行4小時(shí)。使用20微米、0. 00079英寸的美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試篩(A. S. T. M. E. -11第635號(hào)說(shuō)明)過(guò)濾反應(yīng)混合物一次，以去除小顆粒，并用50，000MWC0膜(Spectra/ por )透析濾液過(guò)夜。將滯留物(從515毫升得到約400毫升)轉(zhuǎn)移至燒杯中，冷卻至0°C。加入亞硝酸鈉(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反應(yīng)在0°C進(jìn)行I小時(shí)。用50，000MWC0膜進(jìn)行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析過(guò)夜。使用20微米、0. 00079英寸的美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試篩(A. S. T. M. E. -11第635號(hào)說(shuō)明)過(guò)濾滯留物兩次，以去除小顆粒。冷凍滯留物并凍干，得到細(xì)粉末。實(shí)施例4本實(shí)施例描述包含肝素和聚-L-賴氨酸作為核心的肝素實(shí)體的構(gòu)造。該肝素實(shí)體包含可用于連接底物表面的游離末端醛。將聚-L-賴氨酸(0. 1776克，西格瑪-艾爾德里奇公司，分子量為1，000-5, 000克/摩爾)溶解在300毫升含MES緩沖液(pH 4. 7，BupH 熱科學(xué)公司(Thermo Scientific))的去離子(DI)水中。向其中加入10克USP肝素、4克N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)和4克鹽酸EDC。使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行4小時(shí)，接著用50，000MWC0膜(Spectra/ Por )透析過(guò)夜。將滯留物(從505毫升得到約400毫升)轉(zhuǎn)移至燒杯中，冷卻至(TC。加入亞硝酸鈉(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反應(yīng)在0°C進(jìn)行I小時(shí)。用50，000MWC0膜進(jìn)行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析過(guò)夜。冷凍滯留物并凍干，得到細(xì)粉末。實(shí)施例5本實(shí)施例描述包含肝素和聚乙烯亞胺(PEI)作為核心的肝素實(shí)體的構(gòu)造。該肝素實(shí)體包含可用于連接底物表面的游離末端醛。將PEI (Lupasol，BASF，I. 7756 克)溶解在 300 毫升含 MES 緩沖液(pH 4. 7, BupH 熱科學(xué)公司(Thermo Scientific))的去離子(DI)水中。向其中加入10克USP肝素、4克N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)和4克鹽酸EDC。使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行4小時(shí)，接著用50，000MWC0膜(Spectra/ por )透析過(guò)夜。將滯留物(從505毫升得到約400毫升)轉(zhuǎn)移至燒杯中，冷卻至0°c。加入亞硝酸鈉(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反應(yīng)在0°C進(jìn)行I小時(shí)。用50，000MWC0膜進(jìn)行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析過(guò)夜。冷凍滯留物并凍干，得到細(xì)粉末。實(shí)施例6本實(shí)施例描述包含肝素和乙二胺(EDA)作為核心的肝素實(shí)體的構(gòu)造。該肝素實(shí)體包含可用于連接底物表面的游離末端醛。采用冰浴，用等體積的HCl和去離子水稀釋液將EDA(0. 0043克，密蘇里州圣路易斯的西格瑪-艾爾德里奇公司)中和至PH為4. 7，再溶解在含MES緩沖液(pH 4. 7，BupH 熱科學(xué)公司(Thermo Scientific))的300毫升去離子水中。向其中加入10克USP肝素、 4克N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)和4克鹽酸EDC。使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行4小時(shí)，接著用50，000MWC0膜(Spectra/ Por )透析過(guò)夜。將滯留物(從505毫升得到約400毫升)轉(zhuǎn)移至燒杯中，冷卻至0°C。加入亞硝酸鈉(10毫克)和乙酸(2毫升)，使反應(yīng)在0°C進(jìn)行I小時(shí)。用50，000MWC0膜進(jìn)行透析，向透析液中加入I克NaCl，透析過(guò)夜。冷凍滯留物并凍干，得到細(xì)粉末。實(shí)施例I將實(shí)施例1-6中含游離末端醛的肝素實(shí)體固定在ePTFE底物的表面上，并測(cè)試ATIII活性。片層形式的ePTFE底物材料獲自亞利桑那州弗拉格斯塔夫的W. L.戈?duì)柭?lián)合公司(ff. L. Gore&Associates, Inc. ,Flagstaff,AZ),商品名為 GORETM 微孔過(guò)濾介質(zhì)(GMM-406)。將底基涂層形式的覆蓋材料施加于ePTFE材料，具體是將該材料設(shè)置到直徑十厘米(IOcm)的塑料繡花圈(embroidery hoop)上,并將支持的ePTFE材料浸入100%異丙醇(IPA)約五分鐘(5分鐘)，然后浸入聚乙烯亞胺(PEI，Lupasol，BASF)和IPA的一比一(I I)溶液中。LUPASOL 無(wú)水PEI獲自BASF，將其稀釋至約4%的濃度，并調(diào)節(jié)至pH 9. 6。將ePTFE材料浸入該溶液約15分鐘后，由該溶液中取出該材料，并用PH 9. 6的去離子水沖洗15分鐘。保留在ePTFE材料上的PEI與pH 9. 6的0. 05%戊二醛水溶液(安氏公司(Amresco))交聯(lián)15分鐘。將該構(gòu)造放入pH 9. 6的0. 5% PEI水溶液中15分鐘，然后再次用pH 9. 6的DI水沖洗15分鐘，以使附加的PEI加入該構(gòu)造。用氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)溶液(5g溶解于I升去離子水中，PH 9. 6)還原戊二醛與PEI層之間反應(yīng)形成的亞胺15分鐘，并用DI水沖洗30分鐘。將該構(gòu)造物浸入pH 9.6的0.05%戊二醛水溶液15分鐘，然后浸入pH 9. 6的0. 5% PEI水溶液15分鐘，以便將另一層PEI加入該構(gòu)造物。然后用pH 9. 6的DI水沖洗該構(gòu)造物15分鐘。將該構(gòu)造物浸入NaCNBH3溶液(5g溶解于I升去離子水，pH 9. 6) 15分鐘，然后用DI水沖洗30分鐘，將得到的亞胺還原。通過(guò)重復(fù)這些步驟將第三層施加于該構(gòu)造物。產(chǎn)物是多孔疏水性氟聚合物基料或圓盤，該基料的基本上所有暴露表面和間隙表面上都具有親水性交聯(lián)聚合物基料涂層。在將另一層PEI設(shè)置到該構(gòu)造物上的制備過(guò)程中，可將中間化學(xué)層粘附于聚合物底基涂層。在硫酸葡聚糖(安瑪西亞生物技術(shù)公司(Amersham Pharmacia Biotech))和氯化鈉(0. 15g硫酸葡聚糖和IOOg NaCl溶解于IL DI水，pH 3)的60°C溶液中處理該構(gòu)造90分鐘，然后用DI水沖洗15分鐘，以制備中間離子電荷層。
將該構(gòu)造物放置在0. 3% PEI水溶液(pH 9)中約45分鐘，然后用氯化鈉溶液(50gNaCl溶解于IL DI水)沖洗20分鐘，將本文中稱為“加帽層”的PEI層粘附于中間層。最后用DI水沖洗20分鐘。通過(guò)將構(gòu)造物放置在含肝素實(shí)體的氯化鈉鹽溶液(約0. 9克含游離末端醛的肝素實(shí)體、5. 88克NaCl溶解在200毫升去離子水中，pH 3. 9)中并在60°C保持10分鐘將實(shí)施例1-6中含游離末端醛的肝素實(shí)體連接或偶聯(lián)到PEI層上。向肝素實(shí)體溶液(200毫升)加入體積為572微升的2. 5% (w/v)NaCNBH3水溶液。在上述溫度下再保持樣品110分鐘。然后用DI水沖洗樣品15分 鐘，用硼酸鹽緩沖液(10. 6g硼酸，2. Ig NaOH和0. IgNaCl溶解于IL DI水，pH 9. 0)沖洗20分鐘，最后用DI水沖洗15分鐘，然后凍干整個(gè)構(gòu)造，得到包含結(jié)合于ePTFE底物材料表面的肝素實(shí)體的干燥構(gòu)造物。用甲苯胺藍(lán)對(duì)該構(gòu)造樣品的兩側(cè)染色，以測(cè)定肝素大分子構(gòu)造物的存在和均勻性。染色產(chǎn)生均勻的染色表面，表明存在肝素，且肝素均勻地與ePTFE材料結(jié)合。將標(biāo)稱尺寸約I平方厘米的樣品從構(gòu)造物中切出，通過(guò)測(cè)量包含端點(diǎn)連接在ePTFE底物表面上的游離末端醛的肝素實(shí)體的ATIII結(jié)合能力來(lái)測(cè)定肝素活性° 該測(cè)定參見(jiàn) Larsen M. L.等，“Assay of plasma heparin using thrombin andthe chromogenic substrate H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S-2238)(用凝血酶和發(fā)色底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA(S-2238)測(cè)定血漿肝素)”。Thromb Res 13 :285-288(1978)和Pasche B.等，“A binding of antithrombin to immobilized heparin under varyingflow conditions(抗凝血酶在不同流動(dòng)條件下與固定肝素的結(jié)合)”，Artif. Organs 15 281-491 (1991)，它們通過(guò)引用納入本文用于所有目的。結(jié)果表示為每單位表面積底物材料結(jié)合的ATIII量，單位是皮摩爾/平方厘米(pmol/cm2)。在整個(gè)測(cè)定中，將所有樣品保持在濕潤(rùn)條件下。重要的是，注意到如果考慮到材料的兩面，則約一平方厘米(Icm2)的各樣品的總表面積為2平方厘米(2cm2)，以pmol/cm2計(jì)算ATIII肝素實(shí)體結(jié)合活性時(shí)只考慮樣品的一個(gè)表面(即Icm2)。將表示實(shí)施例1-6中制備的各偶聯(lián)構(gòu)造物的凍干樣品放入單獨(dú)的Tower DUALPEEL 自密封袋(伊利諾州麥克格的安利真健康護(hù)理公司(AllegianceHealthcare Corp.，McGaw Park, IL))中并密封，以進(jìn)行EtO滅菌。在調(diào)理I小時(shí)(Ihr)、EtO氣體停留時(shí)間I小時(shí)(Ihr)、設(shè)定溫度為55°C、曝氣時(shí)間12小時(shí)(12hr)的條件下進(jìn)行環(huán)氧乙烷滅菌。對(duì)各EtO滅菌之后的樣品用EtO滅菌，重復(fù)3次。圖2是示出實(shí)施例1-6中固定在ePTFE表面上含游離末端醛的肝素實(shí)體和進(jìn)行最高達(dá)三次EtO滅菌循環(huán)的肝素實(shí)體的ATIII結(jié)合能力的柱狀圖?？鼓窱II結(jié)合活性表示為每平方厘米底物材料上的結(jié)合抗凝血酶III的皮摩爾數(shù)。從結(jié)果中可以看出，在滅菌之前和接著進(jìn)行三次EtO滅菌之前，所有含游離末端醛的偶聯(lián)肝素實(shí)體具有高的抗凝血酶III結(jié)合活性。所有的柱狀物表示樣品數(shù)的平均值，標(biāo)出相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)偏差的誤差線。實(shí)施例8對(duì)實(shí)施例2、3、4和6中制得的含游離末端醛的肝素實(shí)體進(jìn)行分析，以確定其絕對(duì)
分子量。Waters 2414RI檢測(cè)器與Wyatt ASTRA 5. 3. 4. 10軟件結(jié)合使用，來(lái)確定激光器的波長(zhǎng)為660nm時(shí)在含0. 02% NaN3的IOOmM NaNO3中USP肝素的dn/dc。對(duì)已知的肝素濃度對(duì)RI檢測(cè)器響應(yīng)作圖并計(jì)算斜率，確定USP肝素的dn/dc (折射率變化除以濃度變化)。用Wyatt-Dawn Helleos-II 18-角光散射檢測(cè)器(Wyatt-DawnHelIeos-1118-angle light scattering detector)(懷亞特技術(shù)公司(Wyatt TechnologyCorp.))分析肝素實(shí)體，進(jìn)行絕對(duì)分子量測(cè)量，不使用檢測(cè)器1，2，3，4，17和18。在具有0. 02% NaN3流動(dòng)相的IOOmM NaNO3中制備肝素實(shí)體的母液。從該母液得到以下濃度對(duì)實(shí)施例 3 和 4 的肝素實(shí)體為 0. 5mg/mL, I. Omg/mL, I. 5mg/mL, 2. Omg/mL 和 2. 5mg/mL。對(duì)于實(shí)施例 2 和 6 的肝素實(shí)體，制備濃度為 0. 25mg/mL, 0. 5mg/mL, I. Omg/mL, I. 5mg/mL 和 2. Omg/mL。各樣品在注入光散射檢測(cè)器之前，使用5毫升注射器用0. 02微米的注射器過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。使用Zimm曲線和USP肝素(0. 126L/g)的dn/dc對(duì)所有樣品進(jìn)行批料數(shù)據(jù)分析。表I不出絕對(duì)分子量。表I.肝素實(shí)體的絕對(duì)分子量
權(quán)利要求
1.一種醫(yī)療底物，其包括 通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上的肝素實(shí)體，所述結(jié)合的肝素實(shí)體對(duì)肝素酶敏感。
2.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述底物選自聚こ烯、聚氨酷、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟こ烯、膨脹型聚四氟こ烯和生物相容性金屬。
3.如權(quán)利要求2所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述底物是膨脹型聚四氟こ烯。
4.如權(quán)利要求2所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述生物相容性金屬是鎳鈦諾。
5.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述底物是醫(yī)療裝置的組件。
6.如權(quán)利要求5所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管、心臟導(dǎo)線、氣囊和留置濾器。
7.如權(quán)利要求6所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述支架可以用于心臟、外周或神經(jīng)應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求6所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述支架-移植物可以用于心臟、外周或神經(jīng)應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述肝素實(shí)體包括至少ー個(gè)肝素分子和至少ー個(gè)核心分子。
10.如權(quán)利要求9所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述核心分子是環(huán)狀、直線狀、支鏈狀、樹(shù)枝狀、Y形、T形或星形的。
11.如權(quán)利要求9所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述核心分子選自蛋白質(zhì)、烴、氨基糖苷、多糖和聚合物。
12.如權(quán)利要求11所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自白蛋白、粘菌素和聚賴氨酸。
13.如權(quán)利要求11所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述多糖選自環(huán)糊精、纖維素和殼聚糖。
14.如權(quán)利要求11所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述聚合物選自聚こニ醇(PEG)和四氟こ烯共聚物。
15.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療基材底物，其特征在于，所述肝素從?；蜇i來(lái)源中得到。
16.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療底物，其特征在于，在肝素酶處理之后，在所述底物上將檢測(cè)不到肝素或其片段。
17.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療底物，其特征在于，在肝素酶處理之后，在所述底物上檢測(cè)到的肝素或其片段的水平與肝素酶處理之前相比明顯更低。
18.如權(quán)利要求16所述的醫(yī)療底物，其特征在于，通過(guò)與肝素或其片段結(jié)合的標(biāo)記物檢測(cè)肝素或其片段。
19.如權(quán)利要求18所述的醫(yī)療底物，其特征在于，與肝素或其片段結(jié)合的所述標(biāo)記物選自染料、多克隆抗體和蛋白質(zhì)。
20.如權(quán)利要求19所述的醫(yī)療底物，其特征在于，所述染料是甲苯胺藍(lán)。
21.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療底物，其特征在于，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍(lán)將與殘余肝素或其片段結(jié)合，但在所述底物上目測(cè)檢測(cè)不到。
22.如權(quán)利要求I所述的醫(yī)療底物，其特征在于，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍(lán)將與殘余肝素或其片段結(jié)合，檢測(cè)器讀數(shù)約為背景水平或者與不含肝素實(shí)體的底物相比與背景沒(méi)有明顯差別。
23.如權(quán)利要求I所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)端點(diǎn)連接與所述底物相連。
24.如權(quán)利要求I所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)環(huán)狀連接與所述底物相連。
25.如權(quán)利要求I所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)端點(diǎn)醛與所述底物相連。
26.如權(quán)利要求I所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)沿著所述肝素的長(zhǎng)度的醛與所述底物相連。
27.ー種肝素實(shí)體，其包含 至少ー個(gè)肝素分子和至少ー個(gè)核心分子，當(dāng)所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上時(shí)，所述肝素實(shí)體對(duì)肝素酶敏感。
28.如權(quán)利要求27所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述底物選自聚こ烯、聚氨酷、硅酮、含聚酰胺的聚合物、聚丙烯、聚四氟こ烯、膨脹型聚四氟こ烯和生物相容性金屬。
29.如權(quán)利要求27所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述底物是膨脹型聚四氟こ烯。
30.如權(quán)利要求28所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述生物相容性金屬是鎳鈦諾。
31.如權(quán)利要求27所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述底物是醫(yī)療裝置的組件。
32.如權(quán)利要求31所述的肝素實(shí)體，其特征在干，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管、心臟導(dǎo)線、氣囊和留置濾器。
33.如權(quán)利要求32所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述支架可以用于心臟、外周或神經(jīng)應(yīng)用。
34.如權(quán)利要求32所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述支架-移植物可以用于心臟、夕卜周或神經(jīng)應(yīng)用。
35.如權(quán)利要求27所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述核心分子是環(huán)狀、直線狀、支鏈狀、樹(shù)枝狀、T形、Y形或星形的。
36.如權(quán)利要求27所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述核心分子選自蛋白質(zhì)、多肽、烴、多糖、氨基糖苷和聚合物。
37.如權(quán)利要求36所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自白蛋白、粘菌素和聚賴氨酸。
38.如權(quán)利要求36所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述多糖選自環(huán)糊精、纖維素和殼聚糖。
39.如權(quán)利要求36所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述聚合物選自聚こニ醇(PEG)和四氟こ烯共聚物。
40.如權(quán)利要求27所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述肝素從牛或豬來(lái)源中得到。
41.如權(quán)利要求27所述的肝素實(shí)體，其特征在于，在肝素酶處理之后，在所述底物上將檢測(cè)不到肝素或其片段。
42.如權(quán)利要求27所述的肝素實(shí)體，其特征在于，在肝素酶處理之后，檢測(cè)到的肝素或其片段的水平與肝素酶處理之前相比明顯更低。
43.如權(quán)利要求41所述的肝素實(shí)體，其特征在于，通過(guò)與肝素或其片段結(jié)合的標(biāo)記物檢測(cè)肝素或其片段。
44.如權(quán)利要求45所述的肝素實(shí)體，其特征在干，與肝素或其片段結(jié)合的所述標(biāo)記物選自染料、抗體和蛋白質(zhì)。
45.如權(quán)利要求46所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述染料是甲苯胺藍(lán)。
46.如權(quán)利要求27所述的肝素實(shí)體，其特征在于，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍(lán)將與殘余肝素或其片段結(jié)合，但在所述底物上目測(cè)檢測(cè)不到。
47.如權(quán)利要求27所述的肝素實(shí)體，其特征在于，在肝素酶處理之后，可忽略量的甲苯胺藍(lán)將與殘余肝素或其片段結(jié)合，檢測(cè)器讀數(shù)約為背景水平或者與不含肝素實(shí)體的底物相比背景水平?jīng)]有明顯差別。
48.如權(quán)利要求27所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)端點(diǎn)連接與所述底物相連。
49.如權(quán)利要求27所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)環(huán)狀連接與所述底物相連。
50.如權(quán)利要求27所述的肝素實(shí)體，其特征在干，所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)端點(diǎn)醛與所述底物相連。
51.如權(quán)利要求27所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述肝素實(shí)體通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上，所述結(jié)合的肝素分子通過(guò)沿所述肝素長(zhǎng)度的醛與所述底物相連。
52.ー種ATIII結(jié)合實(shí)體，其包含 核心分子， 與所述核心分子相連的多糖鏈，和 位于所述多糖鏈上的游離末端醛部分。
53.如權(quán)利要求54所述的ATIII結(jié)合實(shí)體，其特征在于，所述多糖鏈?zhǔn)歉嗡亍?br> 54.如權(quán)利要求54所述的ATIII結(jié)合實(shí)體，其特征在于，所述核心分子選自蛋白質(zhì)、烴、氨基糖苷、多糖和聚合物。
55.如權(quán)利要求56所述的ATIII結(jié)合實(shí)體，其特征在于，所述蛋白質(zhì)選自白蛋白、粘菌素和聚賴氨酸。
56.如權(quán)利要求56所述的ATIII結(jié)合實(shí)體，其特征在于，所述多糖選自環(huán)糊精、纖維素和殼聚糖。
57.如權(quán)利要求56所述的ATIII結(jié)合實(shí)體，其特征在于，所述聚合物選自聚こニ醇(PEG)和四氟こ烯共聚物。
58.如權(quán)利要求55所述的ATIII結(jié)合實(shí)體，其特征在于，所述肝素從?；蜇i來(lái)源中得至IJ。
59.如權(quán)利要求55所述的ATIII結(jié)合實(shí)體，其特征在于，所述肝素通過(guò)端點(diǎn)連接結(jié)合到所述核心分子上。
60.如權(quán)利要求55所述的ATIII結(jié)合實(shí)體，其特征在于，所述肝素通過(guò)端點(diǎn)連接結(jié)合到所述底物上。
61.如權(quán)利要求62所述的ATIII結(jié)合實(shí)體，其特征在于，所述底物選自聚こ烯、聚氨酷、硅酮、含聚酰胺的聚合物、和聚丙烯、聚四氟こ烯、膨脹型聚四氟こ烯和生物相容性金屬。
62.如權(quán)利要求63所述的ATIII結(jié)合實(shí)體，其特征在于，所述底物是膨脹型聚四氟こ烯。
63.如權(quán)利要求63所述的ATIII結(jié)合實(shí)體，其特征在于，所述生物相容性金屬是鎳鈦諾。
64.如權(quán)利要求62所述的ATIII結(jié)合實(shí)體，其特征在于，所述底物是醫(yī)療裝置的組件。
65.如權(quán)利要求66所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述醫(yī)療裝置選自移植物、人造血管、支架、支架-移植物、分叉狀移植物、分叉狀支架、分叉狀支架-移植物、貼片、塞子、藥物遞送裝置、導(dǎo)尿管和心臟導(dǎo)線。
66.如權(quán)利要求67所述的肝素實(shí)體，其特征在于，所述支架可以用于心臟、外周或神經(jīng)應(yīng)用。
67.一種確定與底物結(jié)合的肝素實(shí)體結(jié)構(gòu)的方法，其包括以下步驟 a)提供包含肝素實(shí)體的底物， b)解聚所述肝素實(shí)體，以產(chǎn)生可溶性肝素片段的混合物， c)使用柱色譜檢測(cè)所述混合物中的各肝素片段， d)確定從步驟(c)得到的各被檢測(cè)肝素片段的身份特征，和 e)從被檢測(cè)的肝素片段的身份特征得到肝素實(shí)體的結(jié)構(gòu)。
68.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述解聚通過(guò)肝素酶-I解聚進(jìn)行。
69.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述柱色譜是SAX-HPLC。
70.一種確定與底物結(jié)合的肝素實(shí)體結(jié)構(gòu)的方法，其包括以下步驟 a)提供包含肝素實(shí)體的底物， b)解聚所述肝素實(shí)體，以產(chǎn)生包含表面-結(jié)合的肝素片段的表面， c)用能向所述表面-結(jié)合的肝素片段引入可檢測(cè)組分的標(biāo)記試劑與所述表面反應(yīng)， d)通過(guò)所述可檢測(cè)組分檢測(cè)所述表面-結(jié)合的肝素片段， 和 e)從存在的表面-結(jié)合的肝素片段得到所述肝素實(shí)體的結(jié)構(gòu)。
71.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述解聚通過(guò)肝素酶-I解聚進(jìn)行。
72.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在干，所述標(biāo)記試劑是鑭系邁克爾類加成有機(jī)絡(luò)合物。
73.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)絡(luò)合物是三(4-甲硫基)苯甲酸鋪。
74.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記試劑是異染性染料。
75.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述異染性染料是甲苯胺藍(lán)。
76.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)通過(guò)表面熒光法、吸收光譜法和目測(cè)進(jìn)行。
77.一種確定與底物結(jié)合的肝素實(shí)體的空間分布的方法，其包括以下步驟 a)提供包含肝素實(shí)體的底物， b)解聚所述肝素實(shí)體，以產(chǎn)生包含表面-結(jié)合的肝素片段的表面，c)用能向所述表面-結(jié)合的肝素片段引入可檢測(cè)組分的標(biāo)記試劑與所述表面反應(yīng)， d)通過(guò)所述可檢測(cè)組分檢測(cè)所述表面-結(jié)合的肝素片段， 和 e)從存在的表面-結(jié)合的肝素片段得到所述肝素實(shí)體的空間分布。
78.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，所述解聚通過(guò)肝素酶-I解聚進(jìn)行。
79.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在干，所述標(biāo)記試劑是鑭系邁克爾類加成有機(jī)絡(luò)合物。
80.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記試劑是三(4-甲硫基)苯甲酸鋪。
81.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在干，所述有機(jī)絡(luò)合物包含化學(xué)吸收的金納米顆粒。
82.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)通過(guò)表面熒光顯微鏡或透射電子顯微鏡進(jìn)行。
83.—種確定與底物結(jié)合的肝素實(shí)體結(jié)構(gòu)的系統(tǒng),其包括 a)解聚溶液， b)標(biāo)記試劑溶液，和 (c)檢測(cè)器。
84.如權(quán)利要求85所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述解聚溶液包含肝素酶-I。
85.如權(quán)利要求85所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述標(biāo)記試劑溶液包含甲苯胺藍(lán)和三(4-甲硫基)苯甲酸鋱。
86.如權(quán)利要求85所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測(cè)器包括SAX-HPLC、表面熒光顯微鏡和吸收分光儀。
全文摘要
本發(fā)明涉及經(jīng)過(guò)處理之后保持明顯生物活性的固定生物活性實(shí)體。本發(fā)明還包括醫(yī)療底物，所述醫(yī)療底物包括通過(guò)至少一個(gè)肝素分子結(jié)合到底物上的肝素實(shí)體，所述結(jié)合的肝素實(shí)體對(duì)肝素酶-1敏感。
文檔編號(hào)A61L31/16GK102695530SQ201080051584
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日
發(fā)明者C·D·克勞德, M·李, N·馬迪羅夏, P·D·德拉姆赫勒, R·L·克里克, R·比朗 申請(qǐng)人:戈?duì)柶髽I(yè)控股股份有限公司