專利名稱：經(jīng)修飾的被脅迫酵母的提取物及相關組合物的美容用途的制作方法
經(jīng)修飾的被脅迫酵母的提取物及相關組合物的美容用途
相關申請
本申請要求2009年8月31日遞交的美國臨時專利申請系列號61/238，427的優(yōu)先權，其內容在此以其全部通過引用而并入。發(fā)明領域
本發(fā)明一般性地涉及用于向皮膚或毛發(fā)表面施用的組合物，其包含被脅迫酵母的提取物的與金屬絡合的肽級分，以及涉及此類組合物用于向皮膚或毛發(fā)提供特定益處的用途。
發(fā)明背景
消費者持續(xù)地尋求改善他們的皮膚和毛發(fā)的外觀。所關心的包括可見的衰老跡象，以及變色或過度色素沉著，發(fā)紅和/或發(fā)炎；和在皮膚表面過度產(chǎn)生油和脂質。因此，仍然需要提供抗衰老、抗炎、抗-脂質和/或淡化效果的產(chǎn)品。
皮膚和毛發(fā)色素沉著是由表皮或毛發(fā)纖維中存在的黑色素的水平?jīng)Q定的。表皮中存在三種不同類型的黑色素=DH1-黑色素，其顏色是黑色的；DHICA-黑色素，其是褐色的； 以及褐黑素，其顏色是微紅的。黑色素是在色素細胞(黑素細胞)內稱作黑素體的專門的細胞器中合成的，合成過程是以酪氨酸酶在氨基酸酪氨酸上的作用開始的。黑色素合成是由數(shù)個細胞內因素(例如酪氨酸酶的活性、小眼球誘導的轉錄因子(MITF)的活性、激素(例如黑素細胞-刺激激素(MSH))的信號傳導、氧化脅迫以及其它因素)調控的。
發(fā)炎還促成皮膚變色和對皮膚外觀的其 它有害影響。Ruiz-Maldonado et al. (1997)Semin Cutan Med Surrg. 16(I) :36-43 ;Tomita et al. (1989)Dermatologica 179 Suppl1:49_53。例如，發(fā)炎的痤瘡損傷可導致瘢痕(Holland et al. SeminCutan Med Surg. 2005 Jun ；24(2) :79-83);且已顯示發(fā)炎的累積退變效應加劇人類皮膚內在的(按年代的)和外在的(光)衰老。Pillai，et al. (2005) Int J Cosmet Sc1. Feb ；27(1) 17-34 ； Bissett, et al. (1990)Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 7 153-8 ；Thornfeldt, CR(2008) J. Cosmet. Dermatol. 7 :78_82。關鍵的炎性介導因子腫瘤壞死因子-a (TNFa)被認為對于急性和慢性皮膚發(fā)炎均負有責任。
膠原合成和降解也在通常的皮膚關注中起作用。膠原I (皮膚中的膠原類型)的減少與失去皮膚的緊實和彈性相關并導致與衰老相關的皺紋形成。膠原是身體的主要結構蛋白并且給予皮膚力量，持久性，以及光滑、飽滿的外觀。它是由位于真皮中的專門的皮膚細胞成纖維細胞產(chǎn)生的，產(chǎn)生的過程涉及由早前膠原I向前膠原1、并最終向原膠原(形成膠原纖維的形式)的轉化。膠原I在皮膚中被基質金屬蛋白酶(MMP)降解。Gross J, et al. Biochem Biophys Res Commun 1974 ；61 :605_12。MMP 是相關的鋒依賴性蛋白酶的家族， 包括金屬蛋白酶(MMP-1, MMP-8和MMP-13)和明膠酶(MMP-2和MMP 9)。
透明質酸是在皮膚的美學外觀中起作用的另一個皮膚組分。透明質酸是在皮膚中發(fā)現(xiàn)的粘多糖(GAG)，其作為細胞外基質的一部分(ECM)。然而隨著年齡，GAG合成以及總體的 GAG 皮膚含量似乎下降。Smith et al. J.1nvest. Dermatol. , 1962, 39,第 347—350頁；Fleischmajer et al. Biochim. Biophys. Acta, 1972, 279,第 265-275 頁；Longas et al. Carbohydr. Res.，1987，159，第127-136頁。相信GAG的這種減少促成皮膚的機械特性方面與年齡相關的變化，這包括例如，組織水合、以及飽滿度和抵抗自由基的保護的變化。Carrino et al. , Arch Biochem Biophys. 2000 Jan I ；373 (I) :91-101 ;Vogel et al. , Z Gerontol. 1994 May-Jun ；27 (3) 182-5 ；Lanir et al. , J Biomech Eng. 1990 Feb ； 112 (I) :63-9) ；ffiest et al. J Dtsch Dermatol Ges. 2008 Mar ；6 (3) :176-80 ；Bert et al.Biorheology. 1998 May-Jun ；35 (3) :211_9。
皮膚中去角質酶的活性也在其美學上年輕的外觀方面起作用。在角質層(皮膚的最外層)中，細胞與細胞的凝聚主要取決于已知為角化粒(corneodesmosome)的蛋白。在皮膚重構和更新的過程中，通過分解角化粒的天然蛋白酶的作用而使死細胞從皮膚表面脫落，因而幫助去角質。人類組織激肽釋放酶(KLKs)是存在于角質層中的蛋白酶家族并且已知其直接參與角化粒更新。Kishibe Metal. J. Biol. Chem. 2006 ；282 :5834-5841。
過度產(chǎn)生脂質也影響皮膚以及毛發(fā)的外觀。例如，過度 分泌皮脂與油性的皮膚、毛發(fā)和痤瘡有關；皮下脂肪的過度累積可產(chǎn)生橘皮組織。橘皮組織是團塊狀的、不均勻類型的脂肪，其主要在臀部和大腿上累積并引起“橘皮”或“松軟干酪”的樣子。脂質代謝一部分是由過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)控制的，所述PPAR形成一組核轉錄因子。特別地， PPAR-gamma(PPAR- Y )被認為在有利于脂肪細胞的分化以及通過脂肪細胞進行能量儲存的前饋通路中是關鍵的。
在不希望的皮膚或毛發(fā)的形成中起作用的許多生理學過程在真核微生物(例如酵母)中有相應物，并且酵母提取物已被用于美容應用中。例如，在對于熱、UV輻射或其它脅迫的響應中，已知酵母產(chǎn)生促進細胞增殖或存活的因子。見例如美國專利號2，239，345。 含有此類因子的被脅迫的酵母裂解物已經(jīng)被描述并被顯示用于針對抵消某些脅迫對皮膚的作用的美容應用中。例如，經(jīng)UV-脅迫的酵母裂解物已被用于美容應用中。見例如，美國專利號5，643，587 ;5，676，956和5，776，441。最近，經(jīng)臭氧-脅迫的酵母裂解物被描述可用于保護皮膚細胞免受臭氧的有害影響。見例如Scholz等人的美國專利號6，461，857和 6，858，212 ；以及美國專利申請公開號2003/0198682和2006/0110815。然而，這些較早的例子沒有認識到某些美容用途并且沒有鑒別出細胞裂解物中的活性成分。
因此，仍然需要更好地確定的美容組合物，其有效地提供其它的皮膚益處，包括去角質、抗衰老、抗脂質、抗發(fā)炎和/或皮膚(或毛發(fā))淡化效果。因此，本發(fā)明的目標在于提供組合物和方法，其用于減少黑色素合成、TNFa產(chǎn)生、PPAR信號傳導、和/或金屬蛋白酶活性；和/或用于增加膠原合成，透明質酸產(chǎn)生和/或KLKs活性。本發(fā)明的目標還在于通過使用所述組合物來改善皮膚和毛發(fā)的總體外觀，以及根據(jù)需要淡化皮膚和毛發(fā)。
進行前面的討論僅僅是為了提供對于本領域面臨的問題的性質的更好的理解，而不應以任何方式被解釋為承認現(xiàn)有技術，本文中引用的任何參考文獻也不應被解釋為承認所述參考文獻構成本申請的“現(xiàn)有技術”。
發(fā)明概述
根據(jù)前述目標及其它目標，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了源自被脅迫的酵母并與金屬離子絡合的特定肽級分能夠減少黑色素合成，TNFa產(chǎn)生，PPARs信號傳導和/或膠原降解，和/或增加膠原合成，透明質酸產(chǎn)生，和/或KLK活性；并因此是對于改善皮膚和毛發(fā)的外觀有益的試劑。還令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了通過抑制向色素細胞內的鈣流入而減少了黑色素合成，這為降低過度色素沉著提供了新的方法。
本發(fā)明的一個方面涉及用于化妝品組合物的經(jīng)修飾的酵母肽級分。特別地，提供了包含經(jīng)修飾的酵母肽級分的組合物，所述經(jīng)修飾的酵母肽級分包含與金屬離子(優(yōu)選二價金屬離子，例如鋅離子)相絡合的含有SEQ ID N0:1的肽。此類組合物用作抗脂質、抗炎、和/或皮膚淡化劑，以及用于增強去角質和/或處理和/或預防可見的皮膚衰老跡象。 在一些實施方案中，所述經(jīng)修飾的肽級分的存在量足以減少下述的至少一項黑色素合成、 TNFa產(chǎn)生和/或PPARs信號傳導。在一些針對衰老跡象的實施方案中，所述經(jīng)修飾的肽級分的存在量足以降低金屬蛋白酶活性；增加膠原合成；增加透明質酸產(chǎn)生，和/或增加KLK活性。
本發(fā)明的另一方面涉及組合物用于向人類皮膚提供至少一種益處的美容用途，所述組合物包含含有與金屬相絡合的包含SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分。此類益處包括
(a)處理和/或預防細紋或皺紋；
(b)減少毛孔大小；
(C)改善皮膚厚度，飽滿度，和/或緊固度；
(d)改善皮膚柔韌度和/或柔軟性；
(e)改善皮膚色調，光彩，和/或清澈性；
(f)改善皮膚質地和/或促進重新組織化(retexturization)；
(g)改善皮膚屏障修復和/或功能；
(h)改善皮膚輪廓的外觀；
⑴恢復皮膚光澤和/或明亮度；
(j)補充皮膚中關鍵的營養(yǎng)物和/或組分；
(k)改善由更年期減退的皮膚外觀；
⑴改善皮膚濕潤和/或水合；
(m)增加和/或防止喪失皮膚彈性和/或彈力；
(η)改善前膠原和/或膠原合成；
(O)處理和/或預防皮膚松垂或萎縮；
(P)增強去角質和/或減少干燥；
(q)處理和/或預防皮膚過度色素沉著；
(r)處理 和/或預防發(fā)炎，例如發(fā)紅、腫脹和/或浮腫；
(S)處理和/或預防過度的皮脂排出；以及
(t)處理和/或預防橘皮組織。
所述組合物可被施用于需要處理的皮膚，例如將受益于所述組合物的去角質、抗衰老、抗脂質、抗炎和/或皮膚(或毛發(fā))淡化效果的皮膚。在一些實施方案中，在化妝品上可接受的載體中提供有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分并將其表面施用至皮膚區(qū)域足夠的時間以產(chǎn)生所希望的效果。優(yōu)選的表面制劑包括水劑、霜劑、軟膏、精華、凝膠或棒。在某些實施方案中，經(jīng)修飾的酵母肽級分被用于淡化毛發(fā)。
本發(fā)明的另一個方面涉及鈣流入抑制劑用于處理過度色素沉著的用途。鈣流入抑制劑可通過阻礙鈣進入到產(chǎn)生色素的細胞中而減少黑色素合成。優(yōu)選的鈣流入抑制劑包括包含含有與鋅相絡合的SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分；以及化合物2-氨乙基-二苯基硼酸鹽。在一些實施方案中，在化妝品上可接受的載體中提供有效量的鈣流入抑制劑并將其表面施用于過度色素沉著的皮膚區(qū)域，以淡化受影響的區(qū)域。在一些實施方案中，將所述抑制劑與至少一種其它的皮膚淡化劑相組合。在一些實施方案中，鈣抑制劑用于淡化毛發(fā)。
通過參考下列對本發(fā)明的詳細描述將更好地理解本發(fā)明的這些和其它方面。
發(fā)明詳述
令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了包含含有與金屬相絡合的SEQ ID NO 1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分能夠通過抑制鈣流入色素細胞中而減少黑色素合成。還令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了經(jīng)修飾的酵母肽級分能夠減少TNFa產(chǎn)生、減少PPARs信號傳導、降低金屬蛋白酶活性、增加膠原合成、 增加透明質酸產(chǎn)生，和/或增加KLKs活性。
鑒于這些和其它的發(fā)現(xiàn)，料想包含含有與金屬相絡合的包含SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分的表面組合物可用于淡化皮膚(或毛發(fā))、減少發(fā)炎、增強去角質和/ 或控制脂質過度產(chǎn)生，以及可用于對抗皮膚損傷和皮膚衰老的跡象，包括減少細紋和皺紋、 保持皮膚緊實度和飽滿度、改善皮膚水合和彈力、恢復皮膚光澤和明亮度、以及抵抗其它相關的皮膚衰老跡象。還料想到其它抑制鈣流入色素細胞中的化合物可用于淡化皮膚和/或毛發(fā)。
經(jīng)修飾的酵母肽級分及其與金屬相絡合的肽
本發(fā)明的一個方面涉及被脅迫酵母的提取物的經(jīng)修飾的肽級分。所述級分包含具有SEQ ID NO :1中所示的序列的肽，其中所述肽與金屬離子相絡合?！芭c金屬離子相絡合” 及相關的術語例如“金屬絡合物”、“與金屬相絡合的”、“與金屬相絡合的衍生物”、“含有金屬離子的絡合物”等，在本申請中指與周圍的金屬離子相連的中央肽的配位化合物。所述金屬離子可以是任何能夠與肽的一個或多個帶負電的氨基酸殘基形成絡合物的金屬陽離子， 這包括但不限于堿金屬的離子、堿土金屬的離子、過渡金屬的離子、后過渡金屬的離子、鑭系元素的離子、錒系元素的離子、準金屬的離子等，或其任意組合。通常，金屬離子將是M+n 的形式，其中M為任何金屬或準金屬，而η是I至4 (通常為I或2)的整數(shù)。
如本申請中所使用的，“肽”指包括通過肽鍵連接在一起的兩個或更多個氨基酸的任何組合物。肽的長度可以是約2至約200個氨基酸或更長，并通常相應于全長蛋白的片段，其中所述片段不包括天然全長蛋白的所有氨基酸。在一些實施方案中，所述肽的長度可以是至少約3個、至少約4個、至少約5個、至少約6個、至少約8個、至少約10個、至少約 15個、或至少約20個氨基酸。在一些實施方案中，所述肽的長度可以是不超過約200個、不超過約100個、不超過約50個、不超過約30個、或不超過約20個氨基酸。例如，在一些優(yōu)選的實施方案中，所述肽包括少于約20個氨基酸、少于約15個氨基酸、少于約10個氨基酸或約6個氨基 酸，包括序列Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro。
在一些實施方案中，序列Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro中6個氨基酸的一個或多個可被保守取代。氨基酸的合適的保守取代是本領域技術人員已知的并且通常可不改變所產(chǎn)生的分子的生物學活性而制備。氨基酸取代通常是單個殘基的，但是可以是多個殘基(成簇的或沿著六聚體序列散布的)。氨基酸可被不同的天然產(chǎn)生的或非常規(guī)的氨基酸殘基所替代。這樣的取代可被歸類為“保守的”，其中肽中所包含的氨基酸殘基被關于極性、側鏈官能和/或大小有相似特征的另一個氨基酸所替代。實例包括用Met、Leu或Tyr取代Phe ； 用Ile或Leu取代Val ;或者用Gly或Ser取代Ala。
還將被理解的是，所述肽可含有除通常被稱為20個天然產(chǎn)生的氨基酸的20個氨基酸之外的氨基酸，給定的肽中的許多氨基酸(包括末端氨基酸)可以是經(jīng)修飾的，所述修飾是通過天然的過程(例如糖基化及其它翻譯后修飾)，或通過化學修飾技術，例如本領域中所熟知的那些。本發(fā)明的肽中可存在的已知修飾包括但不限于乙?；饔谩Ⅴ；饔谩?ADP-核糖基化、酰胺化、支化、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、糖基化、羥基化、碘化、甲基化、氧化、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化和遍在蛋白化。
在一些實施方案中，所述肽基本上由相應于SEQ ID NO :1的氨基酸序列組成?！盎旧嫌?.·組成”是指所述肽排除將實質上影響所述肽的下列能力的額外的序列和其它組成成分有效減少黑色素合成、TNFa產(chǎn)生、PPARs信號傳導、和/或膠原降解；和/或增加膠原合成、透明質酸產(chǎn)生、和/或KLK活性。影響所述功能的能力可由本領域技術人員如下確定使用例如測定(如本申請中所描述的體外測定(見下文中的實施例1-7和13))或本領域已知用于測試黑色素合成、TNFa產(chǎn)生、PPARs表達或信號傳導、膠原合成、膠原降解、透明質酸產(chǎn)生和/或KLK活性的其它測定。
本發(fā)明的經(jīng)修飾的酵母肽級分可從某些酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevesiae))直接獲得。例如，酵母肽級分可從被脅迫酵母的提取物獲得，其是通過在營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)酵母(例如使用本領域技術人員已知的標準發(fā)酵過程)、使酵母經(jīng)受脅迫、然后裂解細胞而制備的。使生長的細胞經(jīng)受一種或多種脅迫，通常以亞致死的劑量。脅迫包括例如熱、UV輻射、X-射線、過氧化氫、臭氧、污染物、化學損傷或其他不利條件。“被脅迫的酵母”是經(jīng)歷了暴露于一種或多種此類脅迫的酵母?！氨幻{迫酵母的提取物”是從酵母獲得的裂解物，所述酵母在于某個時刻暴露于一種或多種脅迫的營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長、且隨后被殺死以提供包含酵母組分的組合物?！敖湍柑崛∥铩笔侵笍慕湍斧@得的裂解物，所述酵母生長在營養(yǎng)培養(yǎng)基上并隨后被殺死以提供包含酵母組分的組合物，所述酵母組分包括但不限于細胞的蛋白物質、細胞的核物質、細胞質物質、細胞原生質物質、細胞壁組分和/或營養(yǎng)培養(yǎng)液。術語“酵母”可包括單個的酵母細胞、多個酵母細胞和/或酵母細胞的培養(yǎng)物。
所使用的酵母可以是本領域技術人員已知的各種屬的，其中確定的是包含SEQ ID N01的肽可由其獲得。不愿被理論所限，所表示的是酵母通過產(chǎn)生細胞組分(包括蛋白) 而響應于脅迫(例如UV輻射)，如本申請中所教導的，所述細胞組分能夠抵抗脅迫的有害影響且令人驚訝地發(fā)現(xiàn)其還為人類皮膚細胞提供不同的和額外的益處。此類蛋白的表達可響應于脅迫而被誘導或上調。被誘導或上調的蛋白包括被稱為酵母“熱激蛋白”(hsp)的蛋白，也被稱為 “脅迫響應蛋白”。見例如美國專利號2，239，345。已知熱激蛋白改善面對不利條件時的細胞增殖和/或細胞存活，例如，通過替換由脅迫而喪失的細胞功能，或通過作為分子伴侶來保護天然的結構，例如通過修飾蛋白折疊。
例如，響應于脅迫(例如UV暴露)而被誘導或上調的酵母蛋白可如下確定通過將被脅迫酵母的提取物中存在的蛋白與未經(jīng)受相同脅迫的酵母提取物中存在的那些進行比較，使用例如比較二維聚丙烯酰胺凝膠電泳。見例如美國專利申請公開2006/0110815。 另一種方法涉及進行酵母基因微陣列以鑒別響應于脅迫而改變表達的酵母基因，例如以確定哪些基因響應于脅迫而被誘導、上調、關閉或下調。這種比較可表明響應于脅迫而被誘導或上調的若干酵母熱激蛋白，可對所鑒別的蛋白進行分析以確定它們是否含有SEQ ID N0:1?？杀环治龅牟煌湍赴ǖ幌抻诠?jié)束酵母屬(Arthroascus),短梗霉屬 (Aureobasidium), Botryoascus,酒香酵母屬(Brettanomyces),假絲酵母屬(Candida),固囊酵母屬(Citeromyces),棒孢酵母屬(Clavispora),隱球酵母菌屬(Cryptococcus),德巴利酵母屬(Debaryomyces),德克酵母屬(Dekkera),線黑粉酵母屬(Filobasidium),季氏酵母屬(Guilliermondella),漢遜酵母屬(Hansenula), Haneseniaspora, Hormoascus, Klockera,克魯維酵母屬(Kluyveromyces),白冬抱酵母屬(Leucosporidium),油脂酵母屬(Lipomyces),馬拉色菌(Malassezia)，梅奇酵母屬(Metschnikowia),拿遜酵母屬(Nadsonia),榛針孢酵母屬(Nematospora),卵孢酵母屬(Oosporidium),菅囊酵母屬(Pachysolen),抱突酵母屬(Pachytichospora),青霉屬(Penicillium),畢赤酵母屬(Pichia),普通變形桿菌(Prototheca),紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium),紅酵母屬 (Rhodotorula),酵母屬(Saccharomyces),類酵母屬(Saccharomycodes),復膜抱酵母屬 (Saccharomycopsis)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyce)，許旺酵母屬(Schwanniomyces), 擲抱酵母屬(Sporobolomyces),原抱酵母屬(Sporopachydermia),銀耳屬(Tremella)， Trichosporan,三角酵母屬(Trigonopsis),有抱圓酵母屬(Torulaspora),球擬酵母屬(Torulopsis),擬威爾酵母屬(Willlopsis),亞羅酵母屬(Yarrowia),接合酵母屬 (Zygosaccharomyces)等,可使用任何被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生包含SEQ ID NO :1的蛋白或肽的那些，以及它們的組合。在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的跨膜蛋白中也發(fā)現(xiàn)了 SEQ ID NO :1，其也可以存在于一種或多種其它物種的跨膜蛋白中，例如上文所列的一種或多種其它酵母物種。
在一些實施方案中，所使用的酵母來自酵母屬(Saccharomyces)。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述酵母為釀酒酵母，也已知為面包酵母。另外，在一些實施方案中可排除某些類型的酵母。例如，在一些實施方案中，所使用的酵母不是葡萄酒酵母(例如如法國專利號FR 2904552和日本專利號JP 2003252743中所描述的)和/或不是近平滑假絲酵母 (Candida parapsilosis)(例如如韓國專利號KR 2005095167中所描述的)。
所選擇的一種或多種酵母物種可在受控的溫度下生長在營養(yǎng)培養(yǎng)基上，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基也稱為營養(yǎng)物培養(yǎng)基或生長培養(yǎng)基。通常所述培養(yǎng)基含有氨基酸、蛋白胨、低分子量肽片段和其它常見的生長培養(yǎng)基成分。優(yōu)選的生長培養(yǎng)基是“酵母發(fā)酵培養(yǎng)基”，在 Handb·ook of Microbiological Media(由 CRC Press 出版)中對其進行了描述。培養(yǎng)酵母的方法是本領域技術人員已知的。例如，可在露天的發(fā)酵容器中培養(yǎng)酵母，或者通過使用密封的生物學發(fā)酵罐，例如可從New Brunswick Scientific, Edison, N. J獲得。在某些時刻，使生長中的細胞經(jīng)受一種或多種脅迫(通常是以亞致死的劑量)。脅迫包括例如熱、UV 輻射、X-射線、過氧化氫、臭氧、污染物、化學損傷或其它不利條件。通常，以在酵母中引起響應的量使用脅迫(例如以誘導熱激蛋白的產(chǎn)生)，但其對于酵母是亞致死的。亞致死是指至少約I %的酵母在暴露于所述脅迫后幸存。在一些實施方案中，至少約I %、至少約10%、 至少約25%、至少約50%或至少約80%的酵母在處理后幸存。
在一些優(yōu)選的實施方案中，用UV光(更優(yōu)選地在286nm處)脅迫存活的酵母細胞。 如上文所討論的,細胞通過產(chǎn)生各種保護性物質而響應。可例如通過利用UV分光光度計測定256至258nm處的吸收而監(jiān)控細胞的生物化學變化。UV暴露的程度可影響產(chǎn)生哪些蛋白 (包括熱激蛋白)，以及它們的量。酵母可暴露于UV數(shù)分鐘至數(shù)天，這取決于酵母的類型、 所使用的波長、通氣速度、溫度等。通常，暴露于UV光持續(xù)至多數(shù)天，直到完成了復雜的生物化學保護機制。
在一些實施方案中，酵母暴露于UV輻射波長的時間段允許最大量、接近最大量或可觀部分的酵母產(chǎn)生在向人類皮膚或毛發(fā)提供益處(例如改善皮膚或毛發(fā)的外觀)方面有效的細胞組分。在某些優(yōu)選的實施方案中，酵母暴露于UV輻射波長的時間段允許最大量、 接近最大量、或可觀部分的酵母產(chǎn)生有效抵抗不希望的皮膚狀況的細胞組分，所述不希望的皮膚狀況包括過度色素沉著、發(fā)炎、脂質過度產(chǎn)生和/或可見的衰老跡象。例如，酵母可暴露于UV輻射波長的時間段允許最大量、接近最大量、或可觀部分的酵母產(chǎn)生細胞組分， 所述細胞組分能夠減少下列的一種或多種黑色素合成、TNFa產(chǎn)生、PPAR信號傳導和金屬蛋白酶活性；和/或能夠增加膠原合成、透明質酸產(chǎn)生和/或KLK活性。在某些優(yōu)選的實施方案中，酵母暴露于UV輻射波長的時間段允許最大量、接近最大量或可觀部分的酵母產(chǎn)生至少一種熱激蛋白，更優(yōu)選地，所述熱激蛋白包括至少一個肽部分，所述肽部分能夠減少下列的一種或多種黑色素合成、TNFa產(chǎn)生、PPAR信號傳導和金屬蛋白酶活性；和/或能夠增加下列的一種或多種膠原合成、透明質酸產(chǎn)生、和KLK活性。在某些特別優(yōu)選的實施方案中，酵母暴露于UV輻射波長的時間段允許最大量、接近最大量或可觀部分的酵母產(chǎn)生包括包含 SEQ ID NO I (Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro)的肽的熱激蛋白。
然后，可裂解被脅迫的酵母以獲得被脅迫酵母的提取物，例如，可通過用適當?shù)牡鞍姿饷阜纸饧毎诙拱l(fā)酵停止?？赏ㄟ^本領域技術人員已知的各種方法來裂解酵母， 所述方法包括但不限于酶、高速攪拌、自體溶解、生長培養(yǎng)基的變化和/或PH的變化。被脅迫酵母的提取物通常含有可溶于水和不溶于水的組分。不溶于水的組分可被分離和移除以提供包含可溶于水的組分的被脅迫酵母的提取物。例如，可用離心機分離不可溶的細胞壁材料并收獲細胞原生質。在一些實施方案中，酵母提取物是可溶于水的，或基本上可溶于水的。“可溶于水”通常是指O.1克的酵母組分溶解于I克的水中。
可通過本領域技術人員已知的任意數(shù)目的手段根據(jù)需要進一步純化被脅迫酵母的提取物，所述手段包括但不限于色譜法、蒸汽蒸餾、溶劑提取、離心、傾析、過濾和/或碳處理。
在某些優(yōu)選的實施方案中，使用離心、過濾和/或色譜系統(tǒng)對提取物進行分級以分離主要的肽級分。可純化被脅迫酵母的提取物以富集小分子量的肽(在1000至3000Da 的范圍內)，其中包含六聚肽Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro的肽是主要的級分?？蓪⑺鲭呐c被脅迫酵母的提取物的其它組分基本上分離，并且所述肽優(yōu)選包括的少于其所源自的全長蛋白。
在一些實施方案中，六聚肽本身是合成的，例如使用自動化的化學合成或重組手段，并且被重新加至酵母肽級分中，例如以人工地增加酵母肽級分中六聚肽的濃度。例如，可使用標準的化學肽合成而將相對短的分子合成為單一連續(xù)的肽?？墒褂霉滔嗪铣?， 其中序列的C-末端氨基酸連接至不可溶的支持物，隨后順次添加序列中剩余的氨基酸。 已描述了用于固相合成的技術，例如由Barany和Merrifield在Solid-Phase Peptide Synthesis ；pp. 3284；在 The Peptides Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2 SpecialMethods in Peptide Synthesis,部分A 中et al. (1963) J. Am. Chem. Soc., 85:2149 2156 中；以及在 Stewart et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co. , Rockford, 111 中。
也可使用重組表達系統(tǒng)來合成六聚肽。通常，這涉及產(chǎn)生編碼所需肽的DNA序列、 將所述DNA置于在特定啟動子控制之下的表達盒中、在宿主中表達所述肽、分離所表達的肽，以及如果需要的話，使所述肽復性。見例如美國專利號7，030，231?？赏ㄟ^任何合適的方法制備編碼包含SEQ ID NO 1的肽的DNA，所述方法包括例如，克隆和限制適當?shù)男蛄谢蛲ㄟ^例如下列方法直接化學合成Narang et al. (1979)Meth. Enzymol. 68 :90 99的憐酸三酯法；Brown et al. (1979)Meth. Enzymol. 68 109 151 的憐酸二酯法；Beaucage et al. (1981)Tetra. Lett. ,22 :1859 1862的二乙基亞磷酰胺法；和美國專利號4，458，066的固體支持物法?；瘜W合成可產(chǎn)生單鏈的寡核苷酸，其可通過與互補序列雜交或通過使用單鏈作為模板以DNA聚合酶聚合而被轉換為雙鏈DNA。
備選地，序列可被克隆并使用適當?shù)南拗菩悦盖懈钸m當?shù)膩喰蛄?。然后，可將編碼六聚肽的核酸序列連接到具有合適的相應限制性位點的載體中。可通過定點突變將適當?shù)南拗菩晕稽c加至編碼肽的核酸上。所述序列可在各種宿主細胞中表達，所述宿主細胞包括酵母、E. coli，其它細菌宿主，和各種更高級的真核細胞，例如COS，CHO和HeLa細胞系，以及骨髓瘤細胞系。重組序列將被任選地連接至對于各個宿主適當?shù)谋磉_控制序列。本領域技術人員將認可，可對肽進行修飾而不減少其生物學活性?？蛇M行一些修飾以促進分子的克隆或表達。此類修飾是本領域技術人員熟知的且包括例如，加至氨基末端的甲硫氨酸以提供起始位點，或置于任一末端的其它氨基酸(例如聚組氨酸)以產(chǎn)生方便地放置的限制性位點或終止密碼子或純化序列。
可通過熟知的方法將表達載體轉移到所選擇的宿主細胞中，例如對于大腸桿菌的氯化鈣轉化和用于哺乳動物細胞的磷酸鈣處理或電穿孔?？赏ㄟ^對抗生素的抗性來選擇經(jīng)質粒轉化的細胞，所述抗性是由表達載體上所含有的基因賦予的，例如amp, gpt, neo和 hyg基因。一旦表達，可根據(jù)本領域的標準程序純化重組的肽，所述方法包括硫酸銨沉淀、 親和柱、柱色譜法、凝膠電泳等。參見，一般性地R. Scopes, (1982)Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. ；Deutscher(199 0)Methods in Enzymology Vol. 182 Guide to ProteinPurification. , Academic Press, Inc. N. Y.。可純化和 / 或濃縮所述妝以給出適于美容應用的形式。如本領域技術人員所知，可測試肽組合物以確定其對于美容用途的適用性，如上文中所討論的。然后可將所合成的包含SEQ ID NO :1的肽加至經(jīng)分離的酵母肽級分，如上文中所描述的。所述六聚肽以及包含所述肽作為主要級分的酵母肽級分也是商業(yè)上可得的,例如Peptamide 6(INCI名稱六肽11)，其可從Arch Personal Care Products, L. P. , South Plainfield, NJ (www. archpersonal care, com)獲得。
然后，可通過與一種或多種金屬離子相絡合而修飾酵母肽級分以給出經(jīng)修飾的酵母肽級分。如本申請中所使用的，“經(jīng)修飾的酵母肽級分”以及相關的術語，例如“經(jīng)修飾的肽級分”在本申請中用于指含有一種或多種與金屬相絡合的肽(其為至少一種與金屬離子相絡合的肽)的酵母提取物肽級分。例如，可用含水金屬鹽溶液清洗所述酵母肽級分以在金屬離子與所述級分中的一種或多種肽之間形成絡合物。所述金屬鹽可包含但不限于，堿金屬的鹽、堿土金屬的鹽、過渡金屬的鹽、后過渡金屬的鹽、鑭系元素的鹽、錒系元素的鹽、準金屬的鹽等，或其任意組合。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述金屬鹽為二價金屬鹽，例如下列的鹽丐(Ca2+)、銅(Cu2+)、鎂(Mg2+)、錳(Mn2+), M (Be2+)、鋅(Zn2+)等；并且所述鹽可包括硫酸鹽、溴化物、氯化物、磷酸鹽、醋酸鹽等。一些特別優(yōu)選的實施方案使用鋅鹽，例如溴化鋅、氯化鋅、磷酸鋅、醋酸鋅、硫酸鋅等。例如，可用含水硫酸鋅溶液(甚至更優(yōu)選地飽和的含水硫酸鋅溶液)清洗所述酵母肽級分，以與所述肽形成鋅絡合物，這包括與包含SEQ ID NO 1的肽形成的鋅絡合物。
在反應進程完成后，可通過離子交換柱色譜去除剩余的陰離子和游離金屬離子 (如果有的話)。即，可使所形成的金屬絡合物流過離子交換柱以去除例如過量的未絡合的離子。這可提供不含、基本上不含或甚至完全不含金屬鹽和游離金屬離子的，與金屬相絡合的肽。所產(chǎn)生的組合物是酵母提取物的經(jīng)修飾的肽級分，所述修飾是與所添加的金屬的絡合。包含SEQ ID NO :1的、與金屬相絡合的肽可構成約O. 001重量％至約5重量％，優(yōu)選約 O. 01重量％至約3重量％，更優(yōu)選約O.1重量％至約2重量％，或約O.1重量％，基于酵母提取物的這種經(jīng)修飾的肽級分的總重量。經(jīng)修飾的酵母肽級分的其它余下的組分可包括， 例如其它低分子量的肽、寡肽、糖和寡糖。基于本申請中的教導，從合適的酵母肽級分產(chǎn)生含有與金屬相絡合的包含SEQ ID NO:1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分的其它方法對于本領域技術人員而言將是顯然的。
本發(fā)明的化妝品組合物一般包含一定量的經(jīng)修飾的酵母肽級分，其包含與金屬相絡合的含有SEQ ID NO:1的肽，所述量有效向人類皮膚提供益處。在優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含一定量的經(jīng)修飾的肽級分，和/或一定量的與金屬相絡合的含有SEQ ID NO I的肽，所述量有效減少黑色素合成、TNFa產(chǎn)生、PPAR信號傳導和/或金屬蛋白酶活性；和 /或有效增加膠原合成、透明質酸產(chǎn)生和/或KLK活性。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述化妝品組合物包含的與金屬相絡合的含有SEQ ID NO 1的肽的量為約O. 001重量％至約5重量％，基于組合物的總重量；優(yōu)選為約O. 01重量％至約3重量％，基于組合物的總重量；且更優(yōu)選為約O.1重量％至約2重量％，或約I重量％，基于組合物的總重量。上述量是指經(jīng)修飾的酵母肽級分的“有活性的量”，例如與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的量。術語“有活性的量”是指不存在稀釋劑、溶劑、載體、填充劑等時，經(jīng)修飾的肽級分和/或與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的量。本文中所描述的化妝品組合物可用作去角質劑， 抗衰老劑，抗脂質劑，抗炎劑，和/或皮膚(或毛發(fā))淡化劑，例如，如下文所詳述的。
經(jīng)修飾的酵母肽級分和相關組合物的美容用途
本發(fā)明的另一方面涉及含有經(jīng)修飾的酵母肽級分和/或其它鈣流入抑制劑的組合物的美容用途，所述經(jīng)修飾的酵母肽級分包含與金屬相絡合的含有SEQ ID N0:1的肽。 所述化妝品組合物令人驚訝地起作用以增加下列的一項或多項KLK活性、透明質酸產(chǎn)生和膠原合成；和/或減少下列的一項或多項金屬膠原酶活性、PPAR信號傳導、TNFa產(chǎn)生、 和黑色素合成，并相應地可用于去角質、抗衰老、抗脂質、抗炎和/或皮膚(或毛發(fā))淡化產(chǎn)品中。
在一些實施方案中，提供了為人類皮膚提供至少一種益處的方法，其中所述方法包括向有需要的皮膚表面施用化妝品上可接受的載體中的、至少一種本申請中所描述的組合物。所述組合物將包含有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分；與金屬相絡合的含有SEQ ID NO:1的肽 ；和/或其它鈣流入抑制劑。向皮膚提供特定益處的“有效的量”或“有效量”是指當施用了足夠的時間時，足以在皮膚的特定表現(xiàn)方面提供臨床上可測量的改善的經(jīng)修飾的級分、與金屬相絡合的肽或鈣流入抑制劑的有活性的量。此類益處包括但不限于下列
(a)處理和/或預防細紋或皺紋；
(b)減少毛孔大小；
(c)改善皮膚厚度，飽滿度，和/或緊固度；
(d)改善皮膚柔韌度和/或柔軟性；
(e)改善皮膚色調，光彩，和/或清澈性；
(f)改善皮膚質地和/或促進重新組織化(retexturization)；
(g)改善皮膚屏障修復和/或功能；
(h)改善皮膚輪廓的外觀；
⑴恢復皮膚光澤和/或明亮度；
(j)補充皮膚中關鍵的營養(yǎng)物和/或組分；
(k)改善由更年期減退的皮膚外觀；
(I)改善皮膚濕潤和/或水合；
(m)增加和/或防止喪失皮膚彈性和/或彈力；
(η)改善前膠原和/或膠原合成；
(O)處理和/或預防皮膚松垂或萎縮；
(P)增強去角質和/或減少干燥；
(q)處理和/或預防皮膚過度色素沉著；
(r)處理和/或預防發(fā)炎；
(s)處理和/或預防過度的皮脂排出；以及
⑴處理和/或預防橘皮組織。
本發(fā)明的組合物可被施用于需要處理的皮膚，例如遭受缺乏或喪失任意前述特質或狀況的皮膚，或者將受益于所述組合物的去角質，抗衰老，抗脂質，抗炎和/或皮膚淡化效果的皮膚，例如如本申請中所描述的。例如，可在化妝品上可接受的載體中提供所述經(jīng)修飾的肽級分和/或其它鈣流入抑制劑，所述經(jīng)修飾的肽級分包含與金屬相絡合的含有SEQ ID NO 1的肽；將其表面施用于所希望的皮膚區(qū)域，并允許其以一定的量保持在所述區(qū)域上，所述量有效處理和/或預防不希望的皮膚特征或狀況，和/或有效改善皮膚的美學外觀。例如，可在數(shù)分鐘內實現(xiàn)去角質益處，而其它的益處可要求在皮膚上更長的時間段。
“皮膚的狀況”或“ 皮膚狀況”在本文中與“皮膚病況”可互換地使用。如本申請中所使用的，“處理(treatment) ”以及相關的術語例如“處理(treat) ”或“處理(treating)” 是指清除、減少、緩解或逆轉與被處理的皮膚狀況相關的一個或多個不希望的特征，從而消費者察覺到關于所述狀況的改善或其它處理益處。如本申請中所使用的，“預防 (prevention) ”以及相關的術語例如“預防(prevent) ”或“預防(preventing) ”是指給予尚未被所述狀況影響的皮膚益處，其用于避免、延遲、防止或最小化與待預防的皮膚狀況相關的一個或多個不希望的特征。此類預防性益處包括，例如延遲所述狀況的產(chǎn)生，或者縮短與所述狀況相關的一個或多個不希望的特征的持續(xù)時間、降低其嚴重性或強度(如果所述狀況最終產(chǎn)生)。
過度色素沉著
在某些優(yōu)選的實施方案中，本文中描述的化妝品組合物可被用于處理和/或預防皮膚和/或毛發(fā)的過度色素沉著，例如用于淡化皮膚或毛發(fā)。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，將包含有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分肽的組合物表面施用至皮膚或毛發(fā)(例如過度色素沉著的皮膚或毛發(fā)區(qū)域)，其中所述經(jīng)修飾的酵母肽級分肽包含與金屬相絡合的含有SEQ ID N0:1的肽。如本申請中所使用的且除非另外特別指明，“過度色素沉著”是指“黑素細胞-介導的過度色素沉著”，這表示著色完全、大部分、或至少基本上是由黑素細胞、合成黑色素的色素生產(chǎn)細胞的作用引起的。
過度色素沉著包括個體皮膚或毛發(fā)的任何著色，其比所述個體所希望的更深并且是由黑素細胞引起的。此類不希望的色素沉著也可被稱為變色。過度色素沉著的皮膚區(qū)域包括離散的或斑駁的過度色素沉著區(qū)域。離散的過度色素沉著區(qū)域可以是顏色更深的顯著、均勻區(qū)域并且可表現(xiàn)為皮膚上的棕色斑點或雀斑，這包括通常被稱為色素斑點或“老年斑”的標記。斑駁的過度色素沉著的皮膚區(qū)域可以是暗的斑塊，其在大小和形狀方面比離散的色素沉著區(qū)域更大和更不規(guī)則。過度色素沉著的區(qū)域還包括曬黑的皮膚區(qū)域，例如由于 UV暴露而曬黑的皮膚。過度色素沉著的毛發(fā)包括比所希望的更深的任何毛發(fā)色度。
皮膚過度色素沉著可由任何數(shù)目的因素引起，這包括例如，遺傳、UV或日光照射、 年齡、瘢痕或由于皮膚損傷引起的變色，所述損傷包括裂傷、燒傷、曬傷、痤瘡，或其它皮膚病學狀況等。例如，皮膚過度色素沉著的區(qū)域包括黑斑片。黑斑是涉及面部皮膚變色的常見皮膚病況，其在懷孕的婦女中特別普遍，被稱為面部黃褐斑或黃褐斑。黑斑(或黃褐斑) 斑片可表現(xiàn)為臉上深棕色、不規(guī)則的斑片，特別是在上頰、鼻子、唇、上唇和前額上。所述斑片通常隨時間逐漸產(chǎn)生且一般不癢或疼痛，但是可負面地影響個體的外觀。皮膚過度色素沉著也指腋下的區(qū)域，例如與所希望的相比，已變得更暗或正在變得更暗的區(qū)域。
皮膚過度色素沉著可包括或不包括個體眼睛下面的區(qū)域，其比個體所需的更暗， 通常稱為“眼下黑圈”或“黑眼圈”。黑眼圈通常是每只眼睛下方的圓形、均勻色素沉著區(qū)域， 其可由遺傳、過敏、疲勞或其它原因引起。在一些實施方案中，處理過度色素沉著不包括處理眼睛下方面部皮膚的變色和/或袋狀化。值得注意的是，眼睛下方過度色素沉著不是簡單的黑素細胞-介導的色素沉著問題。見例如美國專利號5，643，587。病源包括循環(huán)機能不良，例如增加的血管滲透性引起皮膚表面之下的滲漏，發(fā)炎，和暴露于環(huán)境，并且所述問題一般對于已知的降低色素沉著的化合物或皮膚增白化合物響應不佳。的確，在那種情形下，用于減少眼睛下方變色的表面組合物包括高百分比的抗壞血酸磷酸鹽，其本身是已知的皮膚淡化劑并因此可能促成了眼睛下方皮膚的淡化。下文的實施例14進一步證實了美國專利號5，643，587中所描述的被脅迫酵母的提取物在不存在抗壞血酸磷酸鹽和不存在本發(fā)明的與金屬相絡合的肽時不起減少眼睛下方過度色素沉著的作用。
處理過度色素沉著或過度色素沉著的皮膚/毛發(fā)是指清除、減少、緩解或逆轉與過度色素沉著相關的一個或多個不希望的特征，例如在受影響的區(qū)域中產(chǎn)生皮膚或毛發(fā)的可察覺的淡化。淡化過度色素沉著的皮膚區(qū)域可以是所希望的，特別是在下列方面減少老年斑 ，淡化曬黑，均勻或優(yōu)化皮膚色調(例如在斑駁的過度色素沉著區(qū)域中)，處理黑斑和黃褐斑，雀斑，燒傷后的疤痕和損傷后的過度色素沉著。預防過度色素沉著或過度色素沉著的皮膚是指給予尚未被過度色素沉著影響的皮膚益處，其用于避免、延遲、防止或最小化與皮膚過度色素沉著相關的一個或多個不希望的特征，例如降低最終產(chǎn)生的過度色素沉著區(qū)域的暗度或大小。能夠處理和/或預防過度色素沉著的皮膚的、包含與金屬相絡合的含有 SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分可被稱作“皮膚淡化劑”。當用于淡化毛發(fā)時，它們可被稱作“毛發(fā)淡化劑”。“淡化”和相關的術語是指使得不希望的暗色區(qū)域更淡的任何過程，并且包括下列概念漂白、降低色素沉著、增白和/或脫色。用于過度色素沉著應用的組合物將包含有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分，和/或與金屬相絡合的含有SEQ ID N0:1的肽，以處理和/或預防過度色素沉著，例如用于淡化受影響的區(qū)域中的皮膚/毛發(fā)。
由存在于表皮或毛發(fā)纖維中的黑色素的水平和類型確定皮膚(包括唇)和毛發(fā)的色素沉著。例如，DH1-黑色素(最深的黑色素類型)的表皮水平越高，皮膚越深。如上文中所說明的，黑色素是在色素細胞(也稱作色素產(chǎn)生細胞或黑素細胞)中稱為黑素體的專門的細胞器中合成的，并且合成過程是以通過酪氨酸酶將氨基酸酪氨酸轉化為多巴醌開始的。大多數(shù)其它皮膚淡化方法依賴施用于皮膚的酪氨酸酶抑制劑來減少黑色素合成。見例如韓國專利號KR 2005095167 ;和日本專利號JP 2003252743，和JP 61260009。然而，這些例案以及日本專利號JP 2002234828和JP 2001151631使用了從非脅迫的酵母獲得的提取物，即所述提取物來自未曾暴露于一種或多種脅迫的酵母。不愿被理論所束縛，相信包含含有與金屬相絡合的包含SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的肽級分不依賴于酪氨酸抑制劑來減少黑色素合成，而是似乎具有不同的作用機制。的確，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的組合物通過抑制鈣流入色素細胞中而減少黑色素合成。此外，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了包含其他鈣流入抑制劑的組合物也可被用于抗過度色素沉著的美容應用中。見下文的實施例1。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及包含鈣流入抑制劑的組合物用于皮膚和/或毛發(fā)淡化的美容用途。如本申請中所使用的，“鈣流入抑制劑”是指任意這樣的化合物其減少、降低、阻礙或抑制鈣進入色素細胞中。在本申請中，此術語與“鈣通道抑制劑”可交換地使用。鈣流入抑制劑將包括本領域中已知調控鈣進入色素細胞的化合物，例如而不限于2氨乙基二苯基硼酸鹽(2-APB)。例如，已知此化合物特異性地阻礙鈣進入細胞中， 包括進入色素細胞中。其它已知的鈣流入抑制劑包括而不限于氨基六氫芴，芐普地爾， 隹丐阻蛋白(Calcicludine), Calciseptine,氯化卡米達佐(Calmidazolium chloride), 硝苯地平，維拉帕米，F(xiàn)S2(黑曼巴)，加蘭肽，普羅托平，四氫巴馬汀，生長抑素-14， L-St印holidinealverine及其鹽；以及錳和它的鹽、鎂和它的鹽。見例如EP 1419764 ;國際專利申請公開號WO 2006048671 ;和美國專利申請公開號2009/0028826。包含鈣流入抑制劑的化妝品組合物令人驚訝地起作用以減少黑色素合成，并因此可用于皮膚或毛發(fā)淡化產(chǎn)品中，例如用于處理和/或預防皮膚過度色素沉著，或用于漂白毛發(fā)。能夠處理和/或預防過度色素沉著的皮膚的鈣流入抑制劑也可被稱作“皮膚淡化劑”。當用于淡化毛發(fā)時，它們也可被稱作“毛發(fā)淡化劑”。在過度色素沉著應用中使用的組合物將包含有效量的一種或多種鈣流入抑制劑，以處理和/或預防過度色素沉著，例如用于淡化受影響的區(qū)域中的皮膚/ 毛發(fā)。
在某些實施方案中 ，本發(fā)明的組合物包含經(jīng)修飾的肽級分和/或其它鈣流入抑制劑，所述經(jīng)修飾的肽級分含有與金屬相絡合的包含SEQ ID NO :1的肽，當表面施用于皮膚 (或毛發(fā))的給定區(qū)域時，所述經(jīng)修飾的肽級分和/或其它鈣流入抑制劑的量足以減少所述區(qū)域中的黑色素合成。如本申請中所使用的，“減少黑色素合成”和相關的表述是指減少在皮膚中生物合成的和/或沉積在毛發(fā)中的一種或多種不同類型的黑色素的量，特別是指減少黑素細胞-介導的過度色素沉著。不愿被理論所束縛，相信黑色素的減少是由抑制鈣流入到色素細胞中而引起的，如上文所述。優(yōu)選地，黑色素合成的減少引起接受處理的皮膚 (或毛發(fā))的可察覺的淡化，雖然一些黑色素生物合成持續(xù)(以及一些鈣流入持續(xù))。例如， 在一些實施方案中，與不存在包含皮膚(或毛發(fā))淡化劑的組合物時的黑色素合成相比，黑色素合成減少至少約10 %，至少約25 %，至少約50 %，至少約75 %，或至少約90 %。在一些實施方案中，與不存在包含皮膚(或毛發(fā))淡化劑的組合物時的鈣流入相比，鈣流入減少至少約20 %，至少約40 %，至少約50 %，至少約80 %或至少約95 %。黑色素合成和/或鈣流入的程度可通過適當?shù)臏y定確定，例如本文中所描述的或本領域中已知的體外測定。例如， 下文的實施例1和13提供了用于確定鈣流入抑制和總黑色素合成的測定的實驗細節(jié)。
在一些實施方案中，用于處理和/或預防過度色素沉著(例如淡化皮膚(或毛發(fā)))的化妝品組合物還包含至少一種其它的皮膚淡化劑(或至少一種其它的毛發(fā)淡化劑)。例如，以有效處理和/或預防過度色素沉著的量包含含有與金屬相絡合的包含SEQ ID NO 1的肽的經(jīng)修飾的肽、和/或其它鈣流入抑制劑的化妝品組合物可進一步包含至少一種其它的皮膚淡化劑(或至少一種其它的毛發(fā)淡化劑)。在一些實施方案中可包括，例如酪氨酸抑制劑，這包括KR 2005095167、JP 2003252743和JP 61260009中所公開的任何酪氨酸抑制劑。任何可施用于皮膚(或毛發(fā))以淡化皮膚(或毛發(fā))的其它物質也可作為其它的皮膚(或毛發(fā))淡化劑而與本文中所描述的組合物一起使用。皮膚淡化劑的實例包括但不限于對苯二酚、曲酸、甘草精華和/或其衍生物、抗壞血酸和/或其衍生物、熊果苷、熊果提取物、光果甘草及其衍生物、小球藻提取物、紫蘇提取物、椰果提取物和/或其它脫色劑。 已公開了紫蘇提取物作為增白劑，例如在美國專利號5，980，904和日本公開號07025742， 07187989，10265322,2001163759 和 2001181173 中。在日本專利號 2896815B2 中公開了椰果提取物作為增白劑。
其它的皮膚淡化劑包括紫鉚(Butea frondosa)提取物，補血草(Naringi crenulata)提取物，烏厳(Stenoloma chusana)提取物，印度棟(Azadirachta indica)提取物，光果甘草(Glycyrrhiza glabra linn)提取物，海巴戟(Morinda citrifolia)提取物，番茄糖酯或它們的任意組合，以及抗壞血酸葡萄糖苷，維生素C，視黃醇和/或其衍生物，熊果苷，皺葉酸模提取物，乳蛋白(包括水解的乳蛋白)，N，N, S-三(羧甲基)半胱胺，齊墩果酸，紫蘇油，胎盤提取物，saxifragia sarmentosa,檜酸,硫代二丙酸(TDPA), 當歸(ligusticum chiangxiong hort.), asmunda japonica thunb.,紫縷(stellaria medica(L.)cyr.),垂盆草(sedum sarmentosum bunge),當歸(ligusticum Iucidum Ait.)，冬青(ilex purpurea hassk)，印度醋栗(emblica，apigenin)，ascorbyl palmitol, carruba多酚，橙皮素，稲畑多酚，異甘草素，山奈酚_7新橙皮糖，L-含羞草氨酸，木犀草素， 可溶于油的甘草提取物P-T (40), oxa acid,異硫氰酸苯酯，cococin,水飛薊素，T4CA,四氫姜黃素，unitrienol，熊果酸-齊墩果酸，UVA/URSI，或它們的任意組合。此外，料想到在一些實施方案中，用一種或多種此類其它皮膚(或毛發(fā))淡化劑與本發(fā)明的組合物相組合可獲得協(xié)同的改善。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種或多種本文中所描述的組合物與TDPA的協(xié)同作用，例如以對皮膚提供增強的皮膚淡化益處。
發(fā)炎
在某些優(yōu)選的實施方案中，本文所描述的化妝品組合物可被用于處理和/或預防發(fā)炎，例如，用于減少與皮膚發(fā)炎相關的發(fā)紅和/或浮腫。在一些特別優(yōu)選的實施方案中， 將包含有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分的組合物表面施用于皮膚(例如發(fā)炎的皮膚區(qū)域)， 所述酵母肽級分包含與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽。發(fā)炎通常是由個體對不希望的刺激的應答引起的，所述刺激為例如病原體、毒素、空氣污染、損害細胞的物理損傷、外來體(例如碎片)、燒傷、化學刺激物、自體免疫反應等，并且可以是急性的或慢性的。在個體中產(chǎn)生炎性應答的刺激物可被稱作“刺激劑”。發(fā)炎通常被表征為五個主要跡象發(fā)紅，增加的熱度，腫脹，疼痛，以及喪失功能?！鞍l(fā)炎的皮膚”或“被炎癥影響的皮膚區(qū)域”是指顯示出一個或多個與發(fā)炎相關的跡象或特征的任何皮膚，所述跡象或特征為例如發(fā)紅，腫脹或浮腫。炎性皮膚狀況包括而不限于濕疹，水腫，職業(yè)性皮炎或接觸性皮炎，銀屑病，痤瘡，蕁麻疹(也已知為風疹)，紅斑痤瘡，或者其它響應于刺激物(例如毒葛)的疹或過敏性反應。 發(fā)炎的區(qū)域包括被此類狀況影響的皮膚區(qū)域，例如痤瘡損傷，疣，丘疹，斑塊，和受刺激的區(qū)域，例如發(fā)紅、腫脹和/或浮腫的區(qū)域，以及瘢痕，剝落，搔癢，灼熱，刺痛，麻刺，和/或麻木的區(qū)域。
處理發(fā)炎或發(fā)炎的皮膚是指清除、減少、緩解或逆轉與發(fā)炎相關的一個或多個不希望的特征，例如可察覺地減少受影響區(qū)域的發(fā)紅，浮腫和/或腫脹，或者舒緩或鎮(zhèn)靜所述區(qū)域。預防發(fā)炎是指給予尚未發(fā)炎的皮膚益處，其用于避免、延遲、防止或最小化與發(fā)炎相關的一個或多個不希望的特征，例如減小在暴露于刺激物之后可產(chǎn)生的腫脹的程度。能夠處理和/或預防發(fā)炎的皮膚的、包含與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分可被稱作“抗炎劑”。用于抵抗發(fā)炎的組合物將包含有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分和/或與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽，以處理和/或預防發(fā)炎，例如用于減少受影響區(qū)域的發(fā)紅，腫脹和/或浮腫。在一些特定的實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物針對的是抗擊痤瘡周期的所有階段-在爆發(fā)之前、之中和之后，例如在痤瘡損傷露出表面之前對其進行預防，減少露出表面的痤瘡損傷的數(shù)目，在爆發(fā)的過程中加速愈合等。
發(fā)炎中所涉及的關鍵炎性介導劑是細胞因子腫瘤壞死因子-a (TNFa)，也已知為惡液質素或惡病質素。TNFa被認為促成急性皮膚發(fā)炎和慢性發(fā)炎。TNFa主要由巨嗜細胞以及其它類型的細胞產(chǎn)生，所述其它類型的細胞包括淋巴細胞、肥大細胞、內皮細胞和成纖維細胞，局部增加TNFa濃度帶來發(fā)炎的主要跡象。不愿被理論所束縛，相信包含與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分可起作用以減少TNFa產(chǎn)生，從而減少一種或多種與發(fā)炎相關的不希望的特征，例如發(fā)紅，浮腫和/或腫脹。見下文的實施例2。
在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含經(jīng)修飾的酵母肽級分和/或與金屬相絡合的包含SEQ ID NO :1的肽，當表面施用于給定的皮膚區(qū)域時，所包含的量足以減少所述區(qū)域中TNFa的產(chǎn)生。如本申請中所使用的，“減少TNFa產(chǎn)生”和相關的表述是指減少響應 于刺激物而產(chǎn)生的TNFa的量，例如，通過抑制響應于刺激物的TNFa的誘導。優(yōu)選地，TNFa產(chǎn)生的減少引起受影響區(qū)域的發(fā)紅，浮腫和/或腫脹的可察覺的減少，雖然某些TNFa產(chǎn)生持續(xù)。例如，在一些實施方案中，與不存在包含抗炎劑的組合物時的TNFa產(chǎn)生相比，TNFa產(chǎn)生減少至少約10%,至少約25%,至少約50%,至少約75%或至少約90%?？赏ㄟ^適當?shù)臏y定來確定TNFa產(chǎn)生的程度，例如本申請中所描述的或本領域中已知的體外測定。例如， 下文的實施例2提供了用于確定TNFa產(chǎn)生的測定的實驗細節(jié)。
在一些實施方案中，用于處理和/或預防發(fā)炎(例如減少發(fā)紅或腫脹)的化妝品組合物還可包含至少一種其它的抗炎劑，例如抗痤瘡劑。例如，包含有效處理和/或預防發(fā)炎的量的經(jīng)修飾的酵母肽級分的化妝品組合物還可包含至少一種其它的抗炎劑，所述經(jīng)修飾的酵母肽級分包含與金屬相絡合的含有SEQ ID N0:1的肽?？寡讋┛砂?，例如，類固醇、氫化可的松、潑尼松、潑尼松龍、阿司匹林、阿司匹林衍生物、蘆薈、柳樹皮、甘菊，和它們的混合物；以及抗刺激劑，晚期糖化終產(chǎn)物(AGE)抑制劑，和免疫系統(tǒng)抑制劑。在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物包括抗痤瘡劑，例如水楊酸。一些此類實施方案還包括羥乙酸。然而，在一些其它的實施方案中，排除了其它的抗痤瘡劑，例如水楊酸。此外，所料想的是在一些實施方案中，通過將一種或多種此類其它的抗炎劑與本發(fā)明的組合物相組合可獲得協(xié)同的改善。
脂質過量產(chǎn)生
在某些優(yōu)選的實施方案中，本文所描述的化妝品組合物可被用于處理和/或預防脂質過量產(chǎn)生，例如，用于減少過度皮脂排出和/或橘皮組織。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，將包含有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分的組合物表面施用于皮膚(例如被脂質過量產(chǎn)生所影響的皮膚區(qū)域)，所述經(jīng)修飾的酵母肽級分包含與金屬相絡合的含有SEQ ID N0:1的肽?！斑^量產(chǎn)生脂質”或“脂質過量產(chǎn)生”是指超過個體所需的油的任何產(chǎn)生或分泌，和/或皮下脂肪的產(chǎn)生或沉積。例如脂質過量產(chǎn)生包括皮脂的過量產(chǎn)生、分泌或累積，以及皮下脂肪的過度產(chǎn)生或累積，例如橘皮組織。
皮脂是含有脂肪、角蛋白和細胞物質的油性分泌物，其由皮脂腺產(chǎn)生，皮脂腺是鄰近毛囊的微小管道。皮脂被分泌(從頭皮)到皮膚和毛發(fā)上。過度的皮脂排出與油性皮膚和毛發(fā)相關，并可促成這樣的狀況，例如痤瘡和油性頭皮屑(皮脂性皮炎)。這種問題在青少年中特別常見，因為增加的性激素水平刺激皮脂過量產(chǎn)生。被脂質過量產(chǎn)生所影響的區(qū)域包括皮膚的油性區(qū)域，例如油性面部皮膚或頭皮的區(qū)域，以及被與過度皮脂排出相關的皮膚狀況(例如痤瘡損傷)所影響的區(qū)域。
橘皮組織是成塊的不均勻類型的皮下脂肪，其主要在許多婦女的臀部和大腿上累積。許多因素可引起橘皮組織，這包括遺傳、腸的、循環(huán)的、淋巴的、激素的和生活方式的因素。橘皮組織被認為是不美觀的，因為其給予了皮膚之下的組織“橘皮”或“松軟干酪”的樣子，并且抓捏皮膚可產(chǎn)生“氣墊外觀”，伴有脂肪層的凸出和凹陷。受到脂質過量產(chǎn)生影響的區(qū)域包括橘皮組織的區(qū)域，例如具有“橘皮”、“松軟干酪”或“氣墊”外觀的皮膚區(qū)域。術語“處理橘皮組織”包括緩解橘皮組織的可見跡象。
處理脂質過量產(chǎn)生是指清除、減少、或緩解、或逆轉與脂質過量產(chǎn)生相關的一個或多個不希望的特征。與皮脂的過量產(chǎn)生相關的不希望的特征，例如包括油性、發(fā)光的、有痤瘡傾向的皮膚，油性頭皮，油性毛發(fā)，有頭皮屑傾向的毛發(fā)，或不希望的體味。與皮下脂肪過量產(chǎn)生相關的不希望的 特征，例如包括不美觀的橘皮組織區(qū)域。處理益處包括，例如減少受影響的皮膚或毛發(fā)的油性外觀，控制表面的油，平衡有油性傾向的皮膚中的皮脂，使毛孔可見地最小化，減少由于過量皮脂累積而產(chǎn)生的不希望的體味，或改善被橘皮組織沉積影響的區(qū)域的外觀。預防脂質過量產(chǎn)生是指給予尚未被影響的皮膚益處，其用于避免、延遲、防止或最小化與脂質過量產(chǎn)生相關的一個或多個不希望的特征，例如減少在被處理的區(qū)域最終產(chǎn)生的油性的程度，痤瘡的嚴重性，或橘皮組織的團塊性。能夠處理和/或預防脂質過量產(chǎn)生的、包含與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分可被稱作“抗脂質劑”，其可作為例如抗油劑和/或抗橘皮組織劑。用于控制脂質過量產(chǎn)生的組合物將包含有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分和/或與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽以處理和/ 或預防脂質過量產(chǎn)生，例如以減少痤瘡和/或橘皮組織。
脂質代謝是由過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)部分地控制的，所述PPAR形成核轉錄因子的超家族。PPARs是配體依賴性細胞內蛋白，其通過在被適當?shù)呐潴w活化后結合核中特定的DNA序列而刺激特定基因的轉錄。特別地，PPAR-Y活性是通過小的親脂性配體的結合而被控制的，所述配體主要是脂肪酸，其源自自身通常被PPAR-Y所控制的營養(yǎng)或代謝通路。的確，相信PPAR-Y是有利于脂肪細胞的分化和通過脂肪細胞進行能量存儲的前饋通路的核心部分。不愿被理論所束縛，相信包含與金屬相絡合的含有SEQ ID NO I的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分可起作用以減少PPAR信號傳導，特別是PPAR-Y的信號傳導， 從而減少脂質產(chǎn)生和作為抗油和/或抗橘皮組織的試劑起作用。例如，所述組合物可起作用以減少PPAR-Y的誘導，從而更少的PPAR-Y可用于發(fā)出信號使脂肪細胞分化和進行脂肪存儲。見下文的實施例3。
此外，可注意到，其產(chǎn)生被本發(fā)明的某些組合物所減少的脂質區(qū)別于膜脂(例如在脂雙層中發(fā)現(xiàn)的那些)。雙層脂包括，例如角質層的雙層中的脂質，或其它皮脂，例如膽固醇，膽固醇酯，游離脂肪酸和構成皮膚脂雙層的神經(jīng)酰胺。見例如美國專利申請公開號 2006/0110815。
在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含經(jīng)修飾的酵母肽級分和/或與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽，當表面施用于給定的皮膚區(qū)域時，所包含的量足以減少給定皮膚區(qū)域中的PPAR信號傳導。如本申請中所使用的，“減少PPAR信號傳導”和相關的表述是指減少一種或多種PPARs (特別是PPAR- Y)可向細胞發(fā)出信號的程度。
在一些實施方案中，用于處理和/或預防脂質過量產(chǎn)生(例如減少皮脂排出或橘皮組織)的化妝品組合物還可包含至少一種其它的抗脂質劑。例如，含有有效處理和/ 或預防脂質過量產(chǎn)生的量的經(jīng)修飾的酵母肽級分的化妝品組合物可進一步包含至少一種其它的抗脂質試劑，其中所述經(jīng)修飾的酵母肽級分包含與金屬相絡合的含有SEQ ID NO:1的肽。實例包括而不限于某些抗-痤瘡試劑和其它PPAR抑制劑，例如來自澤瀉(Alisma orientate)的提取物。見例如美國專利號7，410，658。此外，料想的是在一些實施方案中， 通過將一種或多種此類其它抗脂質劑與本發(fā)明的組合物相組合可獲得協(xié)同的改善。
衰老的跡象
在某些優(yōu)選的實施方案中，本文中所描述的化妝品組合物可被用于處理和/或預防皮膚衰老或其它皮膚損傷的跡象。皮膚衰老的跡象包括衰老的任何皮膚病學跡象，包括由內在的(按年代的)衰老引起的，或由外部的因素(例如在光衰老中)引起的跡象。所述組合物可被施用于已經(jīng)顯示出可見的衰老跡象的皮膚或很可能顯示出此類跡象的皮膚， 例如由于年齡或日光照射。
皮膚衰老的早期跡象包括逐漸產(chǎn)生面部皺紋，無論是表面細紋還是更深的褶皺。 雖然皺紋形成和其它衰老跡象是皮膚內在的，此過程可通過外部因素而加速，例如過度暴露于太陽和其它損害性元素，過于活躍的面部表情肌，經(jīng)常使用煙草產(chǎn)品，營養(yǎng)不良，或某些皮膚病況。發(fā)展為更深的褶皺的表面細紋、 由于重復的皮膚折疊而加深的面部皺紋以及伴隨成熟而產(chǎn)生的深折是與衰老相關的可見的變化。
處理皮膚衰老的跡象是指清除、減少、緩解或逆轉與皮膚衰老相關的一個或多個不希望的特征，例如通過減少皮膚緊實度或飽滿度的喪失至可察覺的程度。例如，本發(fā)明的組合物和方法可被用于逆轉或處理皮膚衰老跡象(一旦其顯現(xiàn))，例如在年齡超過25歲的個體中所常見的。預防皮膚衰老的跡象是指給予皮膚益處，其用于避免、延遲、防止或最小化與衰老相關的一個或多個不希望的特征，例如當皮膚最終衰老時通過減慢緊實度或飽滿度的喪失。即，本發(fā)明的組合物和方法可被預防性地采用，例如用于防止尚未顯現(xiàn)出皮膚衰老跡象的個體中的皮膚衰老跡象，這在年齡為25歲以下的個體中最常見。
能夠處理和/或預防衰老跡象的、包含與金屬相絡合的含有SEQ ID NO 1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分可被稱作“抗衰老劑”。用作抗衰老劑的組合物將包含有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分和/或與金屬相絡合的含有SEQ ID NO 1的肽，以處理和/或預防衰老的跡象。一些特別優(yōu)選的實施方案提供了用于表面施用的組合物，其包含有效量的與鋅相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽，以處理和/或預防衰老的跡象。處理和/或預防通常引起一個或多個不希望的特征的改善和/或被處理的皮膚的總體美學外觀的改善。
不希望的特征和/或總體美學外觀的改善可包括下列的一種或多種減少按年代的衰老、光衰老、激素性衰老，和/或光化學性衰老的皮膚病學跡象；預防和/或減少紋和/ 或皺紋的出現(xiàn)；減少面部的紋和皺紋的可注意性，減少臉頰、前額上的面部皺紋，減少眼睛之間的垂直皺紋、眼睛上方和嘴周圍的平行皺紋、木偶紋、特別是深的皺紋或褶皺的可注意性；預防、減少和/或消除紋和/或皺紋的出現(xiàn)和/或深度；改善眶下紋和/或眼角紋的外觀；減少魚尾紋的出現(xiàn)；使皮膚(特別是衰老的皮膚)恢復年輕和/或恢復活力；減少皮膚脆弱性；防止皮膚萎縮；改善皮膚的色調、光彩和/或清澈性；防止、減少和/或緩解皮膚松垂；改善皮膚緊實度、飽滿度、緊固度、豐滿度和/或柔軟性；改善皮膚質地和/或促進再組織化；改善皮膚屏障修復和/或功能；改善皮膚輪廓的外觀；恢復皮膚光澤和/或明亮度； 使疲勞和/或脅迫的皮膚病學跡象最小化；抵抗環(huán)境的脅迫；補充皮膚中由于衰老和/或更年期而減少的成分，例如關鍵的營養(yǎng)物或其它皮膚組分；改善雌激素不平衡的影響；改善皮膚細胞之間的交流；增加細胞增殖和/或倍增；增加由于衰老和/或更年期而減少的皮膚細胞代謝；延遲細胞衰老；改善皮膚水分和/或水合；增加皮膚厚度；增加皮膚彈性和 /或彈力；改善前膠原和/或膠原合成；增強去角質；改善微循環(huán)；減少干燥；及其任意組·合。
在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法針對的是處理和/或預防皮膚中的細紋或皺紋。在處理的情形中，將所述組合物施用于需要此類處理的皮膚，這是指具有皺紋和/或細紋的皮膚。細紋和/或皺紋可出現(xiàn)在皮膚的任何表面上，包括但不限于手、手臂、腿、頸、胸、和面部(包括前額)的皮膚。優(yōu)選地，將所述組合物直接施用于細紋和/或皺紋。例如，用于處理細紋和皺紋的方法可包括向有需要的皮膚表面施用本文中所描述的組合物，例如直接表面施用于細紋和/或皺紋，施用的量和時間足以減少細紋和/或皺紋的嚴重性。可定性地評估所述組合物對于細紋和皺紋的出現(xiàn)的影響(例如通過目測)，或定量地評估(例如通過顯微鏡或計算機輔助測量皺紋的形態(tài))(例如皺紋的數(shù)量、深度、長度、面積、體積和/或寬度/單位皮膚面積)。
術語“皺紋”或“皺紋形成”是指細小皺紋形成和/或粗皺紋形成。細小皺紋形成或細紋是指淺表的紋和皮膚表面上的皺紋。粗皺紋形成是指深的溝，特別是臉上和眼睛周圍的深紋/皺紋，包括表情紋，例如眉間紋和皺紋，抬頭紋和皺紋，魚尾紋和皺紋，法令紋以及木偶紋和皺紋。抬頭紋和皺紋是指前額的皮膚上的淺表紋和/或深溝。魚尾紋和皺紋是指眼睛區(qū)域周圍皮膚上的淺表紋和/或深溝。木偶紋和皺紋是指嘴周圍皮膚上的淺表紋和 /或深溝。
在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法針對的是改善皮膚的緊實度， 飽滿度和/或緊固度。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法針對的是增加和/ 或預防皮膚彈性的喪失。皮膚的彈性是指皮膚的彈力和/或回彈性，這歸因于皮膚在變形后重新獲得其原始的形狀和尺寸的能力?？赏ㄟ^拉伸或擠壓皮膚而通過可引起變形的抓捏測試來評估皮膚的彈性。
喪失緊實度、皺紋形成及其它衰老的跡象一部分是由隨著時間而失去皮膚膠原引起的。如本申請中所使用的，“膠原”與“膠原I”或“膠原類型I”可互換地使用，其為存在于皮膚中作為真皮基質組分的類型。膠原I由以緊密的三重螺旋纏繞在一起的三條蛋白鏈構成，其提供比鐵更大的抗張強度。它是由成纖維細胞產(chǎn)生的，所述成纖維細胞是位于真皮中的專門化皮膚細胞。所述形成涉及由核糖體沿著粗糙內質網(wǎng)(RER)產(chǎn)生早前膠原I ;轉化為前膠原I和在RER內形成三重螺旋結構；以及在細胞外最終形成原膠原，所述原膠原是聚集以產(chǎn)生膠原纖絲、然后產(chǎn)生膠原纖維的形式。膠原賦予皮膚緊實度、力量、持久性和年輕的光滑、飽滿的外觀。不愿被理論所束縛，相信包含與金屬相絡合的含有SEQ ID N0:1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分能夠起作用以增加膠原產(chǎn)生并因此增加膠原皮膚的水平，從而延遲與皮膚衰老相關的一個或多個不希望的特征，例如通過保持皮膚的緊實度和飽滿度。見下文的實施例4。
在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含經(jīng)修飾的酵母肽級分和/或與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽，當表面施用于給定的皮膚區(qū)域時，所包含的量足以增加所述區(qū)域中的膠原合成。如本申請中所使用的，“增加膠原合成”和相關的表述是指刺激、誘導或上調前膠原和/或膠原產(chǎn)生以增加皮膚區(qū)域中的膠原含量，優(yōu)選將皮膚緊實度和/或飽滿度改善至可察覺的程度。例如，在一些實施方案中，與不存在所述組合物時的膠原合成相比， 膠原合成增加至少約10%，至少約25%，至少約50%，至少約75%或至少約90%。皮膚中的膠原和/或膠原合成的程度可通過適當?shù)臏y定確定，例如本文中所描述的或本領域中已知的體外測定。也可確定一種或多種膠原前體的水平作為皮膚膠原水平的指示，并且此類體外測定也是本領域中已知的。例如，下文的實施例4提供了用于測量人真皮成纖維細胞中前膠原I水平的測定的實驗細節(jié)。
雖然膠原是由成纖維細胞產(chǎn)生的，其降解通常是由基質金屬蛋白酶(MMPs)控制的。Gross J，et al. Biochem Biophys Res Commun 1974 ；61 :605_12。MMPs 是具有超過 25 個成員的相關的鋅依賴性蛋白酶的家族，其中包括金屬蛋白酶(MMP-1，MMP_8和MMP-13)和明膠酶(MMP-2和MMP-9)。MMP對膠原的降解與喪失皮膚的緊實度和彈性相關。例如，膠原降解導致膠原纖維的異常交聯(lián)而產(chǎn)生剛性的、較不柔韌的結構。不愿被理論所束縛，相信包含與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分可作為金屬蛋白酶抑制劑起作用，其減少金屬蛋白酶活性并從而減少膠原的喪失和相關的皮膚衰老的不希望的特征。見下文的實施例5。
在某些實施方案中 ，本發(fā)明的組合物包含含有與金屬相絡合的含有SEQ ID N01的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分，當表面施用于給定的皮膚區(qū)域時，其所包含的量足以減少所述區(qū)域中的金屬蛋白酶活性。如本申請中所使用的，“減少金屬蛋白酶活性”和相關的表述是指抑制、下調或減少金屬蛋白酶超家族的一種或多種酶的活性。優(yōu)選地，金屬蛋白酶活性的減少以可察覺的程度減少皮膚中膠原的喪失，雖然一些金屬蛋白酶活性持續(xù)。例如，在一些實施方案中，與不存在包含金屬蛋白酶抑制劑的組合物時的金屬蛋白酶活性相比，金屬蛋白酶的活性減少至少約10%，至少約25%，至少約50%，至少約75%或至少約90 %。金屬蛋白酶活性和/或抑制的程度可通過適當?shù)臏y定確定，例如本文中所描述的或本領域中已知的體外測定。例如，下文中的實施例5提供了用于測量金屬蛋白酶活性和抑制的測定的實驗細節(jié)。
隨著時間失去透明質酸也在皮膚衰老中起作用。透明質酸是在皮膚中發(fā)現(xiàn)的、 作為ECM的一部分的粘多糖(GAG)。GAGs是長的無支鏈的、重復二糖單元的聚合物，其主要由己糖胺、己糖、己糖醛酸部分，或其硫酸鹽構成。GAGs結合皮膚中的蛋白質以形成蛋白聚糖，其有助于皮膚的生長、保存和修復。透明質酸特別被報道促成皮膚的水合、營養(yǎng)物交換，和保護皮膚抵抗自由基。Wiest et al. J Dtsch Dermatol Ges. 2008 Mar ；6 (3) 176-80 ；Bert et al. Biorheology. 1998May-Jun ;35 (3) :211_9。然而，還報道了當皮膚隨著時間衰老時，GAG合成下降并且皮膚中總體的GAG含量減少。Smith et al.1n J.1nvest. Dermatol. ,1962,39,第 347-350 頁；Fleischmajer et al. Biochim. Biophys. Acta,1972, 279，第 265-275 頁；Longas et al. Carbohydr. Res.，1987，159，第 127-136 頁。皮膚中 GAG 和透明質酸含量的這種減少被相信促成皮膚的機械特性方面與年齡相關的改變，特別是組織水合和彈力方面的改變。Carrino et al. ,Arch Biochem Biophys. 2000 Jan I ；373 (I) 91-101 ；Vogel et al. ,Z Gerontol.1994May-Jun ；27 (3) :182-5 ；Lanir et al. ,J Biomech Eng. 1990Feb ；112(1) :63-9)。不愿被理論所束縛，相信包含與金屬相絡合的含有SEQ ID NO 1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分可起作用以增加透明質酸產(chǎn)生、從而減少與皮膚衰老相關的一個或多個不希望的特征，例如通過改善皮膚的水合和彈力。見下文的實施例6。
在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法針對的是改善皮膚的水分和/ 或水合。例如，在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含含有與金屬相絡合的含有SEQ ID NO 1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分，當表面施用于給定的皮膚區(qū)域時，其所包含的量足以增加所述區(qū)域的透明質酸產(chǎn)生。如本申請中所使用的，“增加透明質酸產(chǎn)生”及相關的表述是指刺激、誘導或上調透明質酸合成以增加皮膚區(qū)域中的透明質酸含量，優(yōu)選以可察覺的量改善皮膚水合和/或彈力。例如，在一些實施方案中，與不存在所述組合物時的透明質酸產(chǎn)生相比，透明質酸產(chǎn)生增加至少約10%，至少約25%，至少約50%，至少約75%或至少約 90%。皮膚中透明質酸和/或透明質酸產(chǎn)生的程度可通過適當?shù)臏y定確定，例如本文所描述的或本領域中已知的體外測定。例如，下文的實施例6提供了用于測量人真皮成纖維細胞中透明質酸水平的測定的實驗細節(jié)。
皮膚中的去角質酶，例如KLKs也參與皮膚衰老。KLKs是存在于人皮膚角質層中的蛋白酶家族，其通過分解促成細胞與細胞凝聚的蛋白而幫助對死皮細胞進行去角質。Kishibe M et al. 2006 “Kallikrein 8 Is Involved in Skin Desquamation in C ooperation with Other Kallikreins.，，J. Biol. Chem. 282 :5834-5841。在角質層中，細胞與細胞凝聚主要取決于已知為角化粒的蛋白。角化粒已知在皮膚重構和更新的過程中被KLK降解，這允許死細胞從皮膚表面蛻掉。對死細胞的去角質改善皮膚的美學外觀，例如通過防止在皮膚表面上構建給予皮膚干燥、粗糙、暗沉的外觀的死細胞。去角質可使皮膚感覺更光滑并看起來更清新，且還可提升其它皮膚活性物質的穿透性。然而，相信隨著年齡，角化粒更新減緩，這允許了在皮膚表面上構建死細胞。不愿被理論所束縛，相信包含與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分能夠起作用以增加KLKs活性，從而減少與皮膚衰老相關的一個或多個不希望的特征，例如減少干燥和/或改善皮膚光澤和/或明亮度。見下面的實施例7。上調KLK活性可增加脫落死皮膚的速度，并因此自然地增強皮膚去角質。
因此，在某些優(yōu)選的實施方案中，本文中所描述的組合物可被用于增強去角質。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，可將包含有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分和/或與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的組合物表面施用于皮膚，例如施用于需要去角質的皮膚區(qū)域。 需要去角質的皮膚區(qū)域包括將受益于增加去除在皮膚表面上構建的死細胞的速度的任何皮膚表面，例如，如可在年齡超過25歲的個體中所常見的，并且特別是干燥皮膚的區(qū)域。干燥皮膚的去角質可產(chǎn)生所述區(qū)域的更清新、更光滑的樣子。需要去角質的皮膚區(qū)域也包括需要增加或提升表面遞送的皮膚活性物質的穿透性的區(qū)域。需要去角質的皮膚區(qū)域還包括有痤瘡傾向的區(qū)域，例如在那里去角質可在痤瘡開始前幫助其停止，例如通過去除堵塞毛孔的污物和油以顯露出更清新、更明亮的皮膚和/或沒有閃光的光潔面?？墒芤嬗谠鰪姷娜ソ琴|的區(qū)域包括但不限于，手、手臂、腿、頸、胸和面部(包括前額)的皮膚。特別地，關節(jié)和腳的皮膚傾向于累積死皮細胞，其在此類區(qū)域中導致粗糙、干燥、暗沉、有皺紋的，和/或褪色的皮膚。
在一些甚至更優(yōu)選的實施方案中，將本文中所描述的組合物表面施用于肘部、膝蓋、踝部、腳、腳底、跟部等的皮膚，這些區(qū)域可特別受益于增強的去角質。在一些優(yōu)選的實施方案中，將本文中所描述的組合物表面施用于干燥皮膚的區(qū)域，這種區(qū)域通常也受益于增強的去角質。能夠增強去角質的、包含與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分可被稱作“去角質劑”。用作去角質劑的組合物將包含有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分和/或與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽，以在表面施用于給定的皮膚區(qū)域時改善或增強所述區(qū)域中的去角質。
更特別地，在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含含有與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分，當表面施用于給定的皮膚區(qū)域時，其所包含的量足以增加所述區(qū)域的KLKs活性。如本申請中所使用的，“增加KLK活性”及相關的表述是指刺激、誘導或上調KLKs家族的一種或多種蛋白酶的蛋白水解活性，以增加從皮膚區(qū)域去除死皮細胞。優(yōu)選地，增加KLKs的活性使得以可察覺的程度增加從皮膚表面對死細胞的去角質速度，從而例如在皮膚光澤和/或明亮度方面觀察到改善；和/或在皮膚色調，光彩，和/或清澈性方面觀察到改善。例如，在一些實施方案中，與不存在所述組合物時的KLK蛋白酶活性相比，KLK活性增加至少約10%，至少約25%，至少約50%，至少約75%或至少約90%。 皮膚中的去角質和/或KLKs活性的程度可通過適當?shù)臏y定確定，例如本文中所描述的或本領域中已知的體外測定。例如，下文的實施例7提供了用于測量重組人KLK5的活性的 測定的實驗細節(jié)。
在一些實施方案中，用于增強去角質的方法還包括將包含去角質劑的組合物相對于皮膚表面摩擦。此類摩擦通常涉及將所述組合物相對于皮膚按壓，并將其在皮膚上來回移動(優(yōu)選重復移動，更優(yōu)選以圓周運動重復移動)?！爸貜偷亍笔侵复蠹s兩次、大約三次、 大約五次、大約十次或更多次，例如以幫助蛻去通過所述組合物的蛋白水解增強特性而被疏松的死皮細胞。摩擦可以是輕柔的或有力的，這取決于例如被去角質的區(qū)域。去角質之后，通常沖洗(例如用冷水)皮膚區(qū)域，然后保濕以保護經(jīng)去角質的皮膚表面。
在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含含有與金屬相絡合的含有SEQ ID N01 的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分，當表面施用于給定的皮膚區(qū)域時，其所包含的量足以在所述區(qū)域帶來下列的兩種或更多種增加KLK活性、增加透明質酸產(chǎn)生、增加膠原合成，和減少金屬蛋白酶活性。不愿被理論所束縛，靶向不同的衰老過程的兩種或更多種此類組合的作用，在處理和/或預防皮膚衰老跡象方面可具有協(xié)同的結果。
此外，本文所描述的組合物的皮膚-淡化，抗炎和/或抗脂質特性也可促成其抗衰老特性。例如，發(fā)炎被顯示活化各種基質降解性金屬蛋白酶，引起可促成皮膚衰老的異?；|降解。Pillai, et al. (2005) Int J Cosmet Sc1. Feb ；27 (I) :17_34。發(fā)炎還被顯不通過引起活性氧(其損傷然后在真皮和表皮區(qū)室中累積的細胞蛋白、脂質和碳水化合物)的累積而加劇人類皮膚內在和外在的衰老。Pillai, et al. (2005) Int J Cosmet Sc1. Feb ； 27(1) :17-34 ；Bissett, et al. (1990)Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 7 :153-8; ThornfeIdt, CR(2008) J. Cosmet. Dermatol. 7 :78_82。發(fā)炎已知也促成皮膚變色，例如，在發(fā)炎后觀察到了皮膚中的過度色素沉著。Ruiz-Maldonado et al. (1997) Semin Cutan Med Surg. 16(I) :36-43 ；Tomita et al. (1989)Dermatologica. 179 Suppl1:49-53) ；Holland et al. Semin Cutan Med Surg. 2005 Jun ；24(2) :79_83。皮膚變色，以及油性和 / 或橘皮組織的區(qū)域可進一步促成衰老的出現(xiàn)。同樣，不愿被理論所束縛，在某些實施方案中，本文中所描述的組合物的組合作用可提供協(xié)同的皮膚益處，例如通過顯示出兩種或更多種下列調節(jié)活性減少黑色素合成、減少TNFa產(chǎn)生、減少PPAR信號傳導、減少金屬蛋白酶活性、增加膠原合成、增加透明質酸產(chǎn)生、以及增加KLK活性。
在一些實施方案中，用于處理和/或預防皮膚衰老跡象的化妝品組合物還可包含其它的去角質和/或抗衰老試劑。例如，以有效處理和/或預防皮膚衰老跡象的量包含含有與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分的化妝品組合物可進一步包含至少一種其它的去角質和/或抗衰老劑。所料想的是在一些實施方案中，可通過此類組合而獲得協(xié)同的改善。
示例性的去角質劑包括但不限于α-輕基酸、β -輕基酸、oxaacids、oxadiacids 及它們的衍生物，例如它們的脂、酸酐和鹽。合適的羥基酸包括，例如，羥基乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、2-羥基烴酸、扁桃酸、水楊酸和它們的衍生物，以及果酶，例如菠蘿酶。 優(yōu)選的其它去角質劑是羥基乙酸。
示例性的抗衰老劑包括而不限于例如，植物提取物(例如紫鉚提取物)；硫代二丙酸(TDPA)及其酯；類視黃醇(例如全反式維甲酸，9-順維甲酸，植烷酸及其它)；羥基酸 (包括α -羥基酸和β -羥基酸)，水楊酸和水楊酸鹽；抗氧化劑，去角質劑(例如羥基乙酸， 3，6，9-三氧雜十一烷二酸等)，雌激素合成酶刺激化合物(例如咖啡因及衍生物)；能夠抑制5α-還原酶活性的化合物(例如亞麻酸、亞油酸、非那雄胺以及它們的混合物)；屏障功能增強劑(例如神經(jīng)酰胺、甘油酯、膽固醇及其酯、α-羥基 和ω-羥基脂肪酸及其酯等)；膠原酶抑制劑；以及彈性蛋白酶抑制劑；抗衰老植物提取物，角質溶解劑，剝離劑，角化細胞增殖增強劑和作為用于皮膚的其它膠原增強劑的皮膚豐盈劑。合適的皮膚豐盈劑的實例是棕櫚酰寡肽。其它的皮膚豐盈劑包括其它的膠原和/或其它的粘多糖(GAG)增強劑。示例性的類視黃醇包括而不限于，維甲酸(例如全反式或13-順式)及其衍生物，視黃醇(維生素A)及其酯，例如視黃醇棕櫚酸酯，視黃醇乙酸酯和視黃醇丙酸酯，以及它們的鹽。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種或多種本文中所描述的組合物與TDPA的協(xié)同作用，例如用于向皮膚提供增強的抗衰老益處?？顾ダ蟿┑钠渌鼘嵗谙挛闹刑峁?br> 基于本文中所提供的教導，本領域技術人員將認識到用于本文所描述的組合物的其它美容和/或藥物應用，并且此類應用也被料想在本發(fā)明的范圍之內。例如，本文中所描述的組合物也可用于個人護理產(chǎn)品中，例如皮膚護理產(chǎn)品或毛發(fā)護理產(chǎn)品，其中需要在應用所述產(chǎn)品后產(chǎn)生本文中所描述的皮膚益處。用于皮膚的個人護理產(chǎn)品包括，例如腋下除臭劑。料想的是，例如，本文中所描述的組合物可用于淡化腋下皮膚的腋下制劑中，例如其中腋下的區(qū)域已變得或正在變得比所需要的更深。
本發(fā)明提供了用于向皮膚提供益處的方法，其是通過以足以產(chǎn)生一種或多種本文所描述的益處的時間向皮膚的區(qū)域表面施用包含含有與金屬相絡合的含有SEQ ID N0:1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分，和/或其它鈣流入抑制劑的組合物。通常，將每日一次、兩次或三次向皮膚施用所述組合物，只要是為了達到所希望的結果(例如如本文中所描述的去角質、抗衰老、抗脂質、抗炎和/或皮膚(或毛發(fā))淡化益處)所需的。這種處理方案可包括每日施用或隔天施用，施用至少約一周、至少約兩周、至少約四周、至少約八周、至少約十二周或更長。例如，在一些針對抗痤瘡的實施方案中，本發(fā)明的組合物可在早晨和/或傍晚施用，例如通過將產(chǎn)品輕柔地滑過面部，優(yōu)選施用至清潔過的干燥皮膚。也料想到了慢性處理方案，例如關于目的在于防止一種或多種皮膚衰老跡象或其它不希望的皮膚特征(例如痤瘡)的預防性處理。
本文所描述的化妝品組合物可用于去角質，抗衰老，抗脂質，抗橘皮組織，抗炎，和 /或皮膚(或毛發(fā))淡化產(chǎn)品，優(yōu)選地配制用于表面施用于皮膚(或毛發(fā))，例如用化妝品上可接受的載體配制，如下文中所描述的。
經(jīng)修飾的肽級分和相關組合物的美容制劑
本文中所描述的組合物可被配制為用于用于表面施用的各種皮膚或毛發(fā)護理產(chǎn)品。可以適于施用于皮膚(包括頭皮)和/或毛發(fā)的各種產(chǎn)品形式配制所述組合物，例如水劑，霜劑，精華液，噴霧，氣霧劑，餅，軟膏，精華，凝膠，糊劑，貼劑，墊，筆，潤發(fā)油，溶液，小毛巾，面膜，棒，泡沫，酏劑，慕斯，粉末，浴鹽
所述組合物將包含有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分，和/或與金屬相絡合的含有 SEQ ID N0:1的肽，和/或鈣流入抑制劑，所述有效量的含義是足以賦予所配制的產(chǎn)品一種或多種所需特性或調節(jié)活性的量，例如作為皮膚(或毛發(fā))淡化劑，抗炎劑，抗脂質劑，去角質劑，和/或抗衰老劑起作用。例如，所存在的經(jīng)修飾的肽級分或與金屬相絡合的含有SEQ ID NO 1的肽的量可以是約O. 001重量％至約5重量基于組合物的總重量；優(yōu)選地,為約O. 01重量％至約3重量％，基于組合物的總重量；并且更優(yōu)選 地為約O.1重量％至約2 重量％，或約I重量％，基于組合物的總重量。
組合物可包括化妝品上可接受的載體?；瘖y品上可接受的載體是指用于適于用于與人類組織和/或人類毛發(fā)直接、安全接觸的化妝品、藥物或藥品的任何媒介，并且可包括例如任何稀釋劑、溶劑、載體、填充劑等。此類媒介可以采用任何本領域已知的適于向皮膚(或毛發(fā))施用的形式，并且可包括水(例如去離子水)；植物油；礦物油；酯例如八棕櫚酸酯，肉豆蘧酸異丙酯和棕櫚酸異丙酯；醚例如二辛基醚和二甲基異山梨酯；醇例如乙醇和異丙醇；脂肪醇例如鯨蠟醇，鯨蠟硬脂醇，硬脂醇和聯(lián)苯基醇；異鏈烷烴例如異辛烷，異十二烷和異十六烷；硅油例如環(huán)甲基硅油，二甲基硅油，二甲基硅油交聯(lián)聚合物，聚硅氧烷， 以及它們的衍生物，優(yōu)選經(jīng)有機修飾的衍生物；烴油例如礦物油，凡士林油，異十二烷和聚異丁烯；多元醇例如丙二醇，甘油，丁二醇，戊二醇和己二醇；蠟例如蜂蠟和植物蠟；或前述的任意組合或混合物?；诒疚闹械慕虒?，本領域技術人員將能夠選擇適當?shù)拿浇?，?或選擇它們的量，使得可保持本發(fā)明的化妝品組合物的一種或多種所需的特性。
所述媒介可包括含水相，油相，醇相，硅相或其混合物。化妝品上可接受的載體也可包含乳劑。合適的乳劑的非限制性實例包括油包水乳劑、水包油乳劑、水包有機硅乳齊U、 有機硅包水乳劑、水包蠟乳劑、水包油包水三重乳劑，或者具有霜劑，凝膠或微型乳劑外觀的類似物。乳劑可包括乳化劑，例如非離子的、陰離子的或兩性的表面活性劑。
乳劑的油相優(yōu)選具有一種或多種有機化合物，包括軟化劑；保濕劑，例如丁二醇、 丙二醇、甲基葡糖醇聚醚-20和甘油；其它水分散的或可溶于水的組分，包括增稠劑例如硅酸鎂鋁或羥烴基纖維素；凝膠劑，例如高MW的聚丙烯酸，例如CARB0P0L 934 ;以及它們的混合物。所述乳劑可具有能夠乳化組合物中存在的各種組分的一種或多種乳化劑。
適于在油相中使用的化合物包括而不限于，植物油；酯例如辛基棕櫚酸酯，肉豆蘧酸異丙酯，和異丙基棕櫚酸酯；醚例如二辛基醚；脂肪醇例如鯨蠟醇，硬脂醇和二十二醇； 異鏈烷烴例如異辛烷，異十二烷和異十六烷；硅油例如二甲基硅油，環(huán)形有機硅和聚硅氧烷；烴油例如礦物油，凡士林油，異十二烷和聚異丁烯；天然或合成的蠟等。含油的相可由單一的油或不同油的混合物構成。合適的疏水性烴油可以是飽和的或不飽和的、具有脂肪族特征、是直鏈的或支鏈的、或含有脂環(huán)的或芳香的環(huán)。烴油包括具有6-20個碳原子的那些，更優(yōu)選地包含10-16個碳原子。代表性的烴包括癸烷，十二烷，十四烷，十三烷和C8_2(l異鏈燒烴。鏈燒族烴可從Exxon獲得，商標為IS0PARS,以及可從Permethyl Corporation獲得。此外，料想C8_2。鏈燒烴,例如由Permethyl Corporation制造的、具有商品名Permethyl 99ATM的C12異鏈烷烴(異十二烷)也是適合的。各種商業(yè)上可得的C16異鏈烷烴，例如異十六烷(具有商品名Permethylra)也是適合的。優(yōu)選的揮發(fā)性烴的實例包括聚癸烷，例如異十二燒和異癸燒，這包括例如，Permethyl-99A(Presperse Inc.)和C7-C8至C12-C15異鏈燒烴，例如Isopar系列,可從Exxon Chemicals獲得。代表性的烴溶劑是異十二燒。
油相可包含一種或多種蠟，這包括例如，稻麩蠟，巴西棕櫚蠟，ouricurry蠟，小燭樹臘，褐煤臘，甘鹿臘，地臘，聚乙烯臘,Fischer-Tropsch臘,蜂臘,微晶臘,有機娃臘,氟臘, 及其任意組合。
非限制性的乳 化劑包括乳化性蠟，乳化性多元醇，聚醚多元醇，聚醚，多元醇的單或二酯，單硬脂酸乙二醇，單硬脂酸甘油，二硬脂酸甘油，含有機硅的乳化劑，大豆固醇，脂肪醇例如鯨蠟醇，丙烯酸酯，脂肪酸例如硬脂酸，脂肪酸鹽，及其混合物。一些優(yōu)選的乳化劑包括大豆留醇，鯨蠟醇，硬脂酸，乳化蠟，丙烯酸酯，含有機硅的乳化劑，及其混合物。其它可與本文中所描述的組合物一起使用的特定乳化劑包括但不限于，下列的一種或多種例如，Cltl,烷基丙烯酸交聯(lián)聚合物；二甲基硅油PEG-7異硬脂酸酯；丙烯酰胺共聚物；礦物油； 山梨酸酯；聚甘油-3-二異硬脂酸酯；山梨醇酐單硬脂酸酯；山梨醇酐三硬脂酸酯；倍半油酸山梨坦；山梨醇酐單油酸；甘油酯例如單硬脂酸甘油酯和單油酸甘油酯；聚氧乙烯酚，例如聚氧乙烯辛基苯酚和聚氧乙烯壬基苯酚；聚氧乙烯醚例如聚氧乙烯十六醚和聚氧乙烯硬脂醇醚；聚氧乙烯甘油酯；聚氧乙烯失水山梨醇酯；二甲基硅油共聚多元醇；聚甘油酯例如聚甘油基-3-二異硬脂酸酯；甘油月桂酸酯；硬脂醇聚醚_2，硬脂醇聚醚-10和硬脂醇聚醚-20。其它的乳化劑在 INCI Ingredient Dictionary and Handbook Ilth Edition 2006 中提供，其公開的內容在此通過引用而并入。這些乳化劑通常將以下列量存在于組合物中 約O. 001%至約10%按重量，特別是約O. 01%至約5%按重量的量，且更優(yōu)選地約O. 1%至約3%按重量的量?；诒疚闹械慕虒?，本領域技術人員將能夠選擇合適的乳化劑，或本文中所描述的任何其它材料，和/或選擇它們的量，使得可保持本發(fā)明的化妝品組合物的一種或多種所需的特性。
油相可包含一種或多種揮發(fā)性的和/或非揮發(fā)性的硅油。揮發(fā)性的有機硅包括環(huán)狀的和線性的揮發(fā)性二甲基硅氧烷有機硅。在一些實施方案中，揮發(fā)性的有機硅可包括環(huán)二甲基硅油，這包括四聚(M)、五聚(D5)和六聚(D6)環(huán)甲基硅油，或其混合物?？商貏e提及的是揮發(fā)性環(huán)甲基硅油-六甲基環(huán)三硅氧烷，八甲基-環(huán)四硅氧烷和十甲基-環(huán)五硅氧燒。適合的二甲基娃油可獲得自Dow Corning名稱為Dow Corning 200 Fluid并且具有的粘性范圍為約0. 65至約600，000厘拖或更高。合適的非極性，揮發(fā)性液體硅油公開于美國專利號4，781，917中，在此以其全部通過引用而并入。其它的揮發(fā)性有機硅材料在Todd et al. , “Volatile Silicone Fluids for Cosmetics”，Cosmetics and Toiletries,91 : 27-32(1976)中描述，在此以其全部通過引用而并入。線性的揮發(fā)性有機硅在25°C時通常具有的粘性為少于約5厘拖，而環(huán)狀有機硅在25°C時具有的粘性為少于約10厘拖。不同粘性的揮發(fā)性有機娃的實例包括Dow Corning 200, Dow Corning 244, Dow Corning245, Dow Corning 344 和 Dow Corning 345 (Dow Corning Corp.) ;SF_1204 和 SF-1202 有機娃流體(G. E. Silicones) ；GE 7207 和 7158 (General Electric Co.);以及 SWS-03314 (SWS Silicones Corp.)。線性、揮發(fā)性有機硅包括低分子量聚二甲基硅氧烷化合物，例如六甲基 _■娃氧燒，八甲基二娃氧燒，十甲基四娃氧燒，和十_■甲基五娃氧燒。
非揮發(fā)性的硅油將通常包括聚烷基硅氧烷，聚芳基硅氧烷，聚烷基芳基硅氧烷，或其混合物。聚二甲基硅氧烷是優(yōu)選的非揮發(fā)性硅油。非揮發(fā)性硅油在25°C時將通常具有的粘性為約10至約60，000厘拖，優(yōu)選為約10至約10，000厘拖，且更優(yōu)選為約10至約50 0 厘拖；并且在大氣壓力下具有超過250°C的沸點。非限制性的實例包括二甲基聚硅氧烷(二甲基硅油)，苯基三甲基硅油和二苯基二甲基硅油。揮發(fā)性和非揮發(fā)性的硅油可任選地被各種官能團取代，例如燒基、芳基、胺基、乙稀基、輕基、齒燒基、燒基芳基和丙稀酸酷基團。
有機硅包水乳劑可被非離子性的表面活性劑(乳化劑)乳化，例如，聚二有機硅氧烷-聚氧乙烯嵌段共聚物，這包括美國專利號4，122，029中所描述的那些，其公開的內容在此通過引用而并入。這些乳化劑通常包含聚二有機硅氧烷主鏈，通常是聚二甲基硅氧燒，其具有包含-(EO)m-和/或-(PO)n-基團的的側鏈，其中EO是乙烯氧基而PO是I, 2_丙烯氧基，所述側鏈通常以氫或低級烷基(例如C^6，通常為(V3)加帽或終結。其它合適的有機硅包水乳化劑在美國專利號6，685，952中被公開，其所公開的內容在此通過引用而并入。商業(yè)上可得的有機娃包水乳化劑包括可獲得自Dow Corning、商品名為3225C和 5225C FORMULATION AID的那些；可獲得自General Electric的有機硅SF-1528 ;可獲得自 Goldschmidt Chemical Corporation (Hopewell, VA)的 ABIL EM 90 和 EM 97 ;以及由 OSI Specialties (Danbury, CT)銷售的 SILWET 乳化劑系列。
有機硅包水乳化劑的實例包括但不限于，二甲基硅油PEG 10/15交聯(lián)聚合物，二甲基硅油共聚多元醇，十六烷基二甲基硅油共聚多元醇，PEG-15月桂基二甲基硅油交聯(lián)聚合物，月桂基甲基硅油交聯(lián)聚合物，環(huán)甲基硅油，二甲基硅油共聚多元醇，二甲基硅油共聚多元醇，辛酸/癸酸三甘油酯，聚甘油_4異硬脂酸酯，十六烷基二甲基硅油共聚多元醇，月桂酸己酯，二甲基硅油共聚多元醇，環(huán)五硅氧烷，以及這些中的兩種或更多種的任意組合。 有機硅包水乳化劑的優(yōu)選實例包括但不限于PEG/PPG-18/18 二甲基硅油(商品名5225C， Dow Corning)，PEG/PPG-19/19 二甲基硅油(商品名 BY25-337，Dow Corning)，十六烷基 PEG/PPG-10/1 二甲基娃油(商品名 Abil EM-90, Goldschmidt Chemical Corporation), PEG-12 二甲基硅油(商品名 SF 1288，General Electric)，月桂基 PEG/PPG-18/18 甲基硅油(商品名5200F0RMULATI0N AIDjDow Corning)，PEG-12 二甲基硅油交聯(lián)聚合物(商品名 9010和9011有機硅彈性體混合物，Dow Corning)，PEG-1O 二甲基硅油交聯(lián)聚合物(商品名 KSG-20，Shin-Etsu)，二甲基硅油 PEG-10/15 交聯(lián)聚合物(商品名 KSG-210，Shin-Etsu)， 和二甲基硅油PEG-7異硬脂酸酯。有機硅包水乳化劑通常以下列的量存在于組合物中約 O. 001%至約10%按重量，特別是約O. 01%至約5%按重量的量，且更優(yōu)選地，低于I %按重量。
乳劑的含水相可包括一種或多種其它的溶劑，這包括低級醇，例如乙醇、異丙醇等。揮發(fā)性溶劑也可以是化妝品上可接受的酯，例如丁基乙酸酯或乙酸乙酯；酮類，例如丙酮或乙基甲基酮等。
含油的相將通常構成約10%至約99%，優(yōu)選約20%至約85%，更優(yōu)選約30%至約70%按重量，基于乳劑的總重量，而含水相將通常構成約1%至約90%，優(yōu)選約5%至約 70%，更優(yōu)選約20%至約60%按重量的總乳劑。含水相將通常包含約25%至約100%，更通常約50%至約95%按重量的水。
所述組合物可包括脂質體。脂質體可包含其它添加劑或物質和/或可以是經(jīng)修飾的以在施用后更特異性地到達或保留在位點。其它合適的遞送媒介包括，例如niosomes，亞微乳，多聚密封劑(polymeric encapsulants),凝膠,霜劑,水劑,及其組合。
所述組合物可任選地包含對本領域技術人員而言顯然的其它美容活性物質和賦形劑，這包括但不限于填充劑、乳化劑、表面活性劑、成膜劑、螯合劑(例如EDTA)、膠凝劑、 增稠劑、軟化劑、保濕劑、濕潤劑、維生素、礦物質、粘性和/或流變學修飾劑、防曬劑、類視黃醇、激素化合物、α-羥基酸、α-酮酸，抗-分支桿菌劑、抗真菌劑、抗微生物劑、抗病毒劑、鎮(zhèn)痛劑、脂性化合物、抗 腫瘤藥、免疫系統(tǒng)加強劑、抗過敏劑、Hl或Η2抗組胺藥、麻醉劑、 防腐劑、殺蟲劑、皮膚冷卻化合物、皮膚保護劑、皮膚滲透增強劑、去角質劑、潤滑劑、香料、 著色劑、脫色劑、防腐劑(例如DMDM乙內酰脲/碘丙炔醇丁基氨甲酸酯)、穩(wěn)定劑、藥劑、光穩(wěn)定劑、中和劑(例如三羥乙基胺)，及其混合物。除了前述的之外，本發(fā)明的化妝品組合物可含有任何用于處理皮膚狀況或病況的其它化合物。基于本文中的教導，本領域技術人員將能夠選擇任何這些或其它物質，和/或選擇它們的量，使得可保持本發(fā)明的化妝品組合物的一種或多種所需的特性。
防腐劑可包括例如醇，乙二醇，苯甲酸酯，四元含氮化合物，異噻唑啉酮，醛釋放劑，抗氧化劑，鹵代化合物，及它們的組合。闡釋性的醇包括，例如苯氧乙醇，異丙醇，和芐醇；闡釋性的乙二醇包括，例如丙烯、丁烯和戊二醇；闡釋性的苯甲酸酯(也已知為對羥苯甲酸)包括，例如甲基、丙基和丁基-苯甲酸酯；闡釋性的四元含氮化合物包括，例如氯化苯甲烴銨和季銨鹽15 ;闡釋性的異噻唑啉酮包括，例如甲基異噻唑啉酮和甲基氯異塞唑啉酮；闡釋性的醛釋放劑包括，例如DMDM乙內酰脲，咪唑烷基脲，和尿素醛；闡釋性的抗氧化劑包括，例如丁羥甲苯和生育酚，以及闡釋性的鹵代化合物包括，例如三氯生和雙氯苯雙胍己烷二葡萄糖酸酯。可用于本發(fā)明的目的的防腐劑的其它實例可在下列中找到例如 Steinberg,D. “Frequency of Use of Preservatives 2001，，Cosmet. Toilet. 117,41-44, (2002)和 “Preservative Encyclopedia” Cosmet. Toilet. 117,80-96(2002)。
著色劑可包括，例如有機和無機色素和珠光劑。合適的無機色素包括但不限于，氧化鈦、二氧化鈦、氧化錯和氧化鋪，以及氧化鋅、氧化鐵、氧化鉻和鐵藍。合適的有機色素包括鋇、鍶、鈣、和鋁色淀以及炭黑。合適的珠光劑包括以氧化鈦、氧化鐵或天然色素涂覆的云母。
可加入各種填充劑和其它的組分。填充劑通常存在的量為約O重量％至約20重量％，基于組合物的總重量，優(yōu)選為約0.1重量％至約10重量％。合適的填充劑包括但不限于二氧化硅、經(jīng)處理的二氧化硅、滑石、硬脂酸鋅、云母、高嶺土、尼龍粉末例如Orgasol 、 聚乙烯粉末、Teflon 、淀粉、氮化硼、共聚物微球例如Expancel (Nobel Industries), PoIytrap (Dow Corning)和有機娃樹脂微珠(來自 Toshiba 的 Tospearl )等。
在一些優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包括至少一種其它皮膚(或毛發(fā))淡化劑， 至少一種其它抗炎劑，至少一種其它抗脂質劑；至少一種其它去角質劑，和/或至少一種其它抗衰老劑。其它的常規(guī)添加劑包括維生素衍生物例如抗壞血酸基單棕櫚酸酯；增稠劑例如羥基烷基纖維素；膠凝劑；和結構劑例如膨潤土，蒙脫石，硅酸鎂鋁和硅酸鋰鎂。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的表面組合物也可包括下列的一種或多種軟化劑、光學漫射劑、防曬劑和抗氧化劑。這些添加劑也可作為抗衰老劑起作用。基于本申請中的教導，本領域技術人員將能夠選擇合適的軟化劑、光學漫射劑、防曬劑和/或抗氧化劑，或任何其它材料，和/或能夠選擇它們的量，使得可保持本發(fā)明的化妝品組合物的一種或多種所需的特性。
軟化劑提供增強皮膚柔軟 性和減少細紋和粗皺紋出現(xiàn)的功能性益處。實例包括肉豆蘧酸異丙酯、凡士林油、羊毛脂酸異丙酯、有機硅(例如甲基硅油，二甲基硅油)、油、礦物油、脂肪酸酯、十六烷基己酸乙酯、C12_15烴基安息香酸酯、異硬脂酸異丙酯、二異丙基二聚二亞油酸酯，或其任意混合物。軟化劑可優(yōu)選地以下列量存在約0. lwt%至約50wt%組合物的總重量。
光學漫射劑是改變皮膚的表面視光學的粒子，其產(chǎn)生對例如紋和皺紋的視覺模糊和柔化?？捎糜诒景l(fā)明的光學漫射劑的實例包括但不限于氮化硼、云母、尼龍、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氨酯粉末、絹云母、二氧化硅、有機硅粉末、滑石、特氟隆、二氧化鈦、氧化鋅、或其任意混合物。當存在的時候，光學漫射劑可以下列量存在約0. 01重量％至約20 重量％的組合物的總重量。
還可包括用于保護皮膚免受破壞性紫外線的防曬劑。優(yōu)選的防曬劑是具有寬范圍的UVB和UVA保護的那些，例如奧克立寧，阿伏苯宗(帕索1789)，甲氧桂皮酸辛酯，水楊酸辛酯，氧苯酮，homosylate,苯甲酮,茨酮衍生物,氧化鋅和二氧化鈦。當存在時,防曬劑可構成約O. 01重量％至約70重量％的組合物。
抗氧化劑的功能特別是從皮膚上清除自由基以保護皮膚免受環(huán)境侵襲?？捎糜诋斍暗慕M合物中的抗氧化劑的實例包括具有酚羥基官能的化合物，例如抗壞血酸及其衍生物 /酯；α -羥基酸；β -胡蘿卜素；兒茶酸；姜黃素；阿魏酸衍生物(例如阿魏酸乙酯和阿魏酸鈉)；沒食子酸衍生物(例如沒食子酸丙酯)；番茄紅素；還原酸；迷迭香酸；丹寧酸；四氫姜黃素；生育酚及其衍生物(例如醋酸生育酚)；尿酸；或其任意混合物。其它合適的抗氧化劑是具有一個或多個巰基官能(-SH)的那些，其以還原或非還原的形式，例如谷胱甘肽，硫辛酸，硫代羥基乙酸，和其它含巰基化合物。抗氧化劑可以是無機的，例如重亞硫酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、或其它含硫的無機鹽和酸。本發(fā)明的組合物可包含優(yōu)選下列量的抗氧化劑約O. 001重量％至約10重量％，且更優(yōu)選地約O. 01重量％至約5重量％， 的組合物的總重量。實施例
實施例1.通過抑制鈣流入而減少黑色素合成
就抑制鈣流入到產(chǎn)生色素的細胞中的能力在體外測試包含與鋅絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分。按照制造商的指導，使用Fluo-4 NW鈣測定試劑盒 (Invitrogen),設計了實驗來測量B16黑素瘤細胞中的細胞內I丐。使B16小鼠黑素瘤細胞系(ATCC，cat. # :CRL-6475)生長在96-孔組織培養(yǎng)經(jīng)處理的皿中的生長培養(yǎng)基中。在鈣處理之前，從B16細胞培養(yǎng)物中移除生長培養(yǎng)基并將100 μ L的染料加載溶液快速加入96-孔板的每個孔中。將板在37°C孵育30分鐘，然后在室溫下再孵育30分鐘。移除染料緩沖液并用IX PBS清洗板一次，并且用含有鈣及測試化合物的測定緩沖液(根據(jù)制造商的指導形成)進行替換。所使用的測試化合物為100 μ M的2-ΑΡΒ (已知的鈣流入抑制劑)，和包含不同濃度的與鋅相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分，這包括O. 1%的與鋅相絡合的肽。將媒介(不含測試化合物的測定緩沖液)用作對照。
使用酶標儀，分別在485nm/530nm的激發(fā)/發(fā)射波長處測量熒光。將酶標儀設置為每30秒讀取熒光，讀取5分鐘的時間段。在5分鐘結束時，通過向測定緩沖液中加入毒胡蘿卜素(以給出每個孔中IuM的終濃度)而刺激鈣離子流入。使用不含毒胡蘿卜素的測定緩沖液作為陰性對照。將熒光酶標儀設置為每30秒進行熒光測量，測量30分鐘的時間段，同樣分別在485nm/530nm的激發(fā)/發(fā)射波長處進行測量。將熒光單位相對于時間(以分鐘計)作圖以給出鈣流入圖。使用鈣流入峰的曲線下面積來比較2APB或經(jīng) 修飾的肽級分相對于對照的效果。
觀察到的是ΙΟΟμΜ 2-ΑΡΒ處理以86%抑制了鈣進入細胞中。此外，出人意料地觀察到用包含O. 1%與鋅相絡合的含有SEQ ID NO 1的肽的經(jīng)修飾的肽級分處理Β16色素細胞也抑制了鈣進入細胞，并且以約45 %進行了所述抑制。
然后，在Β16細胞中檢測了 2-ΑΡΒ和具有與鋅相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的肽級分對于黑色素合成的作用。使Β16小鼠黑素瘤細胞系(ATCC，cat. # :CRL-6475)生長在96-孔組織培養(yǎng)經(jīng)處理的皿(Falcon)中并用測試化合物進行處理以確定其調節(jié)色素形成(黑色素合成)的能力。具體地，將細胞暴露于ΙΟΟμΜ 2-ΑΡΒ或包含不同濃度的與鋅相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分，這包括I %和O.1 %的與鋅相絡合的肽，進行七(7)天。處理階段之后，使用Packard酶標儀在540nm處定量所合成的黑色素的水平。
定量了所合成的黑色素的量之后，使用MTT轉化法確定細胞存活性。MTT轉化法測量通過NAD (P) H-依賴性微粒體脫氫酶而使MTT染料從黃色的、可溶于水的四唑鹽至藍紫色不可溶甲瓚沉淀物的還原，所述酶僅在存活的細胞中起作用。因此，藍色的強度指示細胞的存活。對黑色素合成進行定量后，使培養(yǎng)物暴露于濃度為lmg/ml的MTT染料溶液三小時。 用試劑醇(95%乙醇5%異丙醇)溶解甲瓚材料并在定軌搖床上搖動15分鐘。通過使用 Packard酶標儀在570nm處測量所提取的甲瓚而測定活細胞對MTT染料的攝取和轉化。
在對細胞存活進行歸一化之后，計算總的色素沉著，并表示為對照的活性百分比。 令人驚訝地觀察到2-APB以77%抑制黑色素合成；而O. 1%和I %的與鋅相絡合的的肽相對于對照分別顯示出27%和52%的抑制效果(P < O. 05)。結果表示包含含有與金屬相絡合的包含SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分和/或其它鈣流入抑制劑的組合物可被用于減少過度色素沉著，例如，當表面施用于過度色素沉著的皮膚時。
實施例2.通過經(jīng)修飾的酵母肽級分減少TNFa的產(chǎn)生
就減少TNFa產(chǎn)生的能力在體外測試包含與鋅相絡合的含有SEQ ID NO 1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分，TNFa的產(chǎn)生已知參與發(fā)炎。在37°C和5% CO2下、在6孔板內的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)人表皮角化細胞48小時。用ImL含有10ng/mL佛波醇肉豆蘧基乙酸酯(PMA) 的生長培養(yǎng)基處理細胞以刺激腫瘤壞死因子a (TNFa)。還用包含不同濃度的與鋅相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分共處理細胞，其中包括O. 1%和1%與鋅相絡合的肽。
于37°C孵育6小時之后，收集培養(yǎng)基并使用ELISA試劑盒(Quantikine Human TNF- a /TNFSFIA, R&D系統(tǒng))來分析TNFa的水平。所觀察到的是用包含O.1 %和I %與鋅相絡合的含有SEQ ID NO 1的肽的經(jīng)修飾的肽級分進行處理，分別以25%和46%抑制了 PMA 對TNFa的誘導(P < O. 05)。結果表示表面施用包含含有與金屬相絡合的含有SEQ ID NO I的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分的組合物可減少發(fā)炎并引起與炎性皮膚狀況相關的癥狀的改盡口 ο
實施例3.通過經(jīng)修飾的酵母肽級分減少PPAR-Y的表達
就減少PPAR- Y表達的能力在體外測試包含與鋅相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分，已知PPAR-Y的表達參與脂質產(chǎn)生和儲存。使用熒光素酶報道分子測定系統(tǒng)監(jiān)測PPAR-Y基因表達。此測定系統(tǒng)涉及與熒光素酶編碼區(qū)相連的PPAR-Y啟動子序列。熒光素酶活性的水平指示來自PPAR-Y啟動子的基因表達活性。通過將三個拷貝的PPAR元件[(ACO) 3]插入pGL3載體中而構建PPAR-Y報道分子。然后將所述構建體轉染到CV-1細胞中。
以DMEM培養(yǎng)基中6 0%的密度將CV-1細胞鋪板在24-孔板中，所述DMEM培養(yǎng)基中補充了 10%的胎牛血清(脫脂的)。達到85%匯合后，使用含有LipofectAMINE和Plus Reagent的轉染混合物轉染細胞。轉染混合物含有PPAR-Y報道分子(AC03_tk)構建體(IOOng/孔)，以及PPAR- Y質粒(IOOng/孔)以及參考質粒pRL-NULL (IOng/孔)。起初將質粒構建體與20μ1 Plus Reagent在室溫下混合15分鐘,所述Plus Reagent在750 μ I血清和無抗生素的培養(yǎng)基中被稀釋；然后與30 μ ILipofectAMINE Reagent再混合15分鐘,所述LipofectAMINE Reagent在5ml相同的培養(yǎng)基中被稀釋。將最終的轉染復合物(1. 5ml/ 孔)加入CV-1細胞的單層中。孵育3小時之后，用普通的培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基并在含有 5. 0% CO2的37°C濕潤培養(yǎng)箱中孵育過夜。
用包含不同濃度的與鋅相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分處理經(jīng)轉染的細胞，這包括包含O. 004%與鋅相絡合的肽的組合物。作為陽性對照，用ΙΟμΜ 的環(huán)格列酮處理細胞；作為陰性對照，用不含任何被脅迫酵母的提取物的媒介處理細胞。將經(jīng)處理的細胞再培養(yǎng)24小時，用磷酸鹽緩沖鹽水清洗一次，并通過在室溫下輕柔振蕩30分鐘而在100 μ I細胞裂解緩沖液中進行裂解。在_80°C孵育3小時后，通過刮擦而收集細胞裂解物。一式三份進行所有的實驗并包括了適當?shù)年栃曰蜿幮詫φ铡?br> 按照制造商所描述的，使用雙重-熒光素酶報道分子測定系統(tǒng)(Promega)來確定熒光素酶活性。這一系統(tǒng)含有兩種底物，其用于依次確定兩種熒光素酶的活性。通過將裂解物的等份(10 μ I)與熒光素酶測定試劑II相混合而起始代表報道基因活性的螢火熒光素酶活性。然后通過向樣品板加入Stop&Glo試劑而淬滅螢火熒光并同時激活海腎熒光。計算每個樣品中螢火熒光信號與海腎熒光信號的比率，并將來自經(jīng)提取物處理的孔與來自經(jīng)媒介處理的孔的信號比記錄為誘導(> I)或抑制(< I)的倍數(shù)。
在一式三份的測試中，發(fā)現(xiàn)加入包含0.004%與鋅相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的肽級分以30%減少報道基因的表達(P < 0. 05)，這表示PPAR-Y表達減少 30%。所述結果表示表面施用包含含有與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分的組合物可控制脂質產(chǎn)生，例如減少皮脂過量產(chǎn)生和/或橘皮組織。
實施例4.通過經(jīng)修飾的酵母肽級分增加膠原合成`
就增加膠原(特別是真皮基質組分前膠原I，已知其在衰老的皮膚中減少)合成的能力在體外測試包含與鋅相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分。在 96-孔組織培養(yǎng)板中、在200 μ I生長培養(yǎng)基(DMEM，5% FBS, I % L-Glut和I %抗生素)中培養(yǎng)人真皮成纖維細胞(Cascade Biologies)并于37°C孵育24小時。用包含不同濃度的與鋅相絡合的含有SEQ ID NO:1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分(在生長培養(yǎng)基中被稀釋)處理細胞，這包括含有在生長培養(yǎng)基中被稀釋的0.1 %與鋅相絡合的肽的級分，并且在37°C 下孵育72小時。此時間段之后，如本申請中所討論的，收集經(jīng)調節(jié)的培養(yǎng)基并測定前膠原 I (膠原I的前體形式)的水平。
按照制造商的指導，使用購自Takara Bio USA，WI，USA的固相夾心ELISA免疫測定(前膠原類型-1C-肽EIA試劑盒)來測量前膠原I。包含0.1 %與鋅相絡合的含有SEQ ID NO 1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分以20. 5%刺激前膠原I。所述結果表示表面施用包含含有與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分的組合物可增加膠原合成并因此增加皮膚中的膠原水平，從而防止和/或改善不希望的皮膚衰老跡象。
實施例5.通過經(jīng)修飾的酵母肽級分減少膠原酶活性
就減少金屬蛋白酶活性的能力在體外測試包含與鋅相絡合的含有SEQ ID N0:1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分。具體地，使用了由分子探針制造的Enzcheck明膠酶/膠原酶測定試劑盒(E-12055)。此測定使用以分子探針BODIPY FL染料標記的DQ明膠底物，使得綴合物的熒光被淬滅。在消化了膠原底物之后，顯露了熒光。此測定中所使用的膠原酶是從溶組織梭菌中純化的金屬蛋白酶。
將包含不同濃度的與鋅相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分 (包括I %與鋅相絡合的肽)應用于此測定以確定其抑制金屬蛋白酶消化DQ明膠底物的能力。來自反應混合物的滅光發(fā)射的減少表不抑制。在黑暗中在室溫下將反應鮮育一小時。 使用熒光酶標儀分別在485nm/530nm的激發(fā)/發(fā)射波長處進行讀取。
觀察到的是包含1%與鋅相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的肽級分以 20%減少金屬蛋白酶活性。所述結果表不表面施用包含含有與金屬相絡合的含有SEQ ID NO 1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分的組合物可減少金屬蛋白酶活性，從而減少膠原的喪失和相關的皮膚衰老的不希望的特征，例如通過減少皮膚緊實度和飽滿度的喪失。
實施例6.通過經(jīng)修飾的酵母肽級分增加透明質酸
就增加透明質酸產(chǎn)生的能力(特別是在真皮成纖維細胞中)而在體外測試包含與鋅相絡合的含有SEQ ID NO:1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分。將人真皮成纖維細胞(Cascade Biologies)在96-孔組織培養(yǎng)板中、在200 μ I生長培養(yǎng)基(DMEM,5% FBS, I % L-Glut和 1%抗生素)中培養(yǎng)，并于37°C孵育24小時。用包含不同濃度的與鋅相絡合的含有SEQ ID N01的肽(在生長培養(yǎng)基中被稀釋)的經(jīng)修飾的酵母肽級分處理細胞，其中包括含有 0.01%與鋅相絡合的肽(在生長培養(yǎng)基中被稀釋)的級分，并于37°C孵育24小時。此時間段之后，收集經(jīng)調節(jié)的培養(yǎng)基并按照生產(chǎn)商的指導，使用購自Corgenix, Inc. , CO, USA的測定試劑盒測定透明質酸的水平。
觀察到的是包含O. 01%與鋅相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的肽級分以100%刺激透明質酸合成。所述結果表示表面施用包含含有與金屬相絡合的含有SEQ ID NO 1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分的組合物可增加透明質酸產(chǎn)生，從而減少與皮膚衰老相關的一個或多個不希望的特征，例如通過改善皮膚的水合和彈力。
實施例7.通過經(jīng)修飾的酵母肽級分增加激肽釋放酶活性
就增加KLK家族成員(特別是重組的人(rh)KLK5)的酶活性的能力在體外測試包含與鋅相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分。將包含不同濃度的與鋅相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分(包括0.1%，0.01%和0.001% 的與鋅相絡合的肽)與重組人KLK5(R&D系統(tǒng)；Cat No. 1108-SE)預孵育。預處理之后， 通過測量合成的底物的肽鍵裂解速度而評估KLK5活性。所述底物與經(jīng)淬滅的熒光基團 (Boc-V-P-R-AMC Fluorogenic Peptide Substrate, R&D系統(tǒng)，Cat No. ES011)相綴合,從而在臨近的肽鍵裂解之后顯露出熒光，當在340nm的波長處激發(fā)時，其在612nm的波長處產(chǎn)生可測量的發(fā)射。熒光讀數(shù)的增加指示增加的rhKLK5活性。
觀察到的是，包含O. 1%，0. 01%和O. 001%的與鋅相絡合的含有SEQID NO:1的肽的經(jīng)修飾的肽級分分別以23 %、27 %和31 %刺激KLK5活性，令人驚訝地給出倒置的劑量應答。結果表示，表面施用包含含有與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母 肽級分的組合物可增加KLKs活性，從而增強去角質并減少與皮膚衰老相關的一個或多個不希望的特征，例如通過改善皮膚的光澤和/或明亮度。
實施例8 皮膚淡化和/或抗衰老精華制劑
下面提供了用于表面施用于皮膚的示例性化妝品組合物，其包含含有與鋅相絡合的包含SEQ ID NO :1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分。以可用于抗衰老和/或皮膚淡化應用中的精華的形式提供所述組合物。
權利要求
1.用于處理過度色素沉著的方法，所述方法包括向過度色素沉著的皮膚區(qū)域表面施用包含化妝品上可接受的載體中的有效量的鈣流入抑制劑的組合物，其中所存在的所述鈣流入抑制劑的量足以減少所述過度色素沉著的皮膚區(qū)域中的黑色素合成。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述鈣流入抑制劑是包含與金屬相絡合的含有SEQIDNO 1的肽的經(jīng)修飾的酵母肽級分。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述鈣流入抑制劑選自2-氨乙基二苯基硼酸鹽、氨基六氫荷，節(jié)普地爾，I丐阻蛋白，Calciseptine,氯化卡米達佐,硝苯地平,維拉帕米,FS2 (黑曼巴)，加蘭肽，普羅托平，四氫巴馬汀，生長抑素-14, L-Stepholidinealverine ;猛；鎂；以及它們的鹽。
4.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述鈣流入抑制劑與至少一種選自硫代二丙酸(TDPA)或其酯衍生物的其它皮膚淡化劑相組合。
5.用于淡化皮膚或毛發(fā)的方法，所述方法包括向所述皮膚或毛發(fā)表面施用包含化妝品上可接受的載體中的有效量的鈣流入抑制劑的組合物，其中施用的時間足以淡化所述皮膚或毛發(fā)。
6.向人類皮膚提供益處的方法，所述方法包括向有需要的皮膚表面施用包含有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分的組合物，所述經(jīng)修飾的酵母肽級分包含化妝品上可接受的載體中的與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽。
7.根據(jù)權利要求6的方法，其中所述金屬為二價金屬離子，優(yōu)選鋅離子。
8.根據(jù)權利要求6的方法，其中所存在的經(jīng)修飾的酵母肽級分的量足以減少下列的至少一種黑色素合成、TNFa產(chǎn)生、PPAR信號傳導和金屬蛋白酶活性；和/或足以增加下列的至少一種KLKs活性、透明質酸產(chǎn)生和膠原合成。
9.根據(jù)權利要求6的方法，其中所述皮膚益處選自 (a)處理或預防皮膚衰老的跡象； (b)處理和/或預防細紋或皺紋； (C)減少毛孔大小； (d)改善皮膚厚度，飽滿度，和/或緊固度； (e)改善皮膚柔韌度和/或柔軟性； (f)改善皮膚色調，光彩，和/或清澈性； (g)改善皮膚質地和/或促進重新組織化； (h)改善皮膚屏障修復和/或功能； (i)改善皮膚輪廓的外觀； (J)恢復皮膚光澤和/或明亮度； (k)補充皮膚中關鍵的營養(yǎng)物和/或組分； (I)改善由更年期減退的皮膚外觀； (m)改善皮膚濕潤和/或水合； (n)增加和/或防止喪失皮膚彈性和/或彈力； (0)改善前膠原和/或膠原合成； (P)處理和/或預防皮膚松垂或萎縮； (q)增強去角質和/或減少干燥；(r)處理和/或預防皮膚過度色素沉著； (S)處理和/或預防發(fā)炎； (t)處理和/或預防過度的皮脂排出；以及 (U)處理和/或預防橘皮組織。
10.根據(jù)權利要求9的方法，其中所述皮膚過度色素沉著包括老年斑、斑駁的區(qū)域、離散的過度色素沉著的區(qū)域、被曬黑的區(qū)域、腋下區(qū)域或黑斑片。
11.根據(jù)權利要求9的方法，其中所述發(fā)炎包括痤瘡損傷、丘疹或受刺激的區(qū)域。
12.用于淡化皮膚或毛發(fā)的方法，所述方法包括向所述皮膚或毛發(fā)表面施用包含有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分的組合物，其中所述經(jīng)修飾的酵母肽級分包含化妝品上可接受的載體中的、與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽，其中施用的時間足以淡化所述皮膚或毛發(fā)。
13.表面組合物，其包含 0.001重量％至5重量％的經(jīng)修飾的酵母肽級分，所述經(jīng)修飾的酵母肽級分包含化妝品上可接受的載體中的與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽； 其中所述表面組合物是以水劑，霜劑，精華，軟膏，凝膠或棒的形式。
14.處理皮膚脂質過量產(chǎn)生的方法，所述方法包括向受脂質過量產(chǎn)生影響的皮膚區(qū)域表面施用包含有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分的組合物，所述經(jīng)修飾的酵母肽級分包含化妝品上可接受的載體中的與金屬相絡合的含有SEQ ID NO :1的肽，其中施用的時間足以減少所述脂質過量產(chǎn)生。
15.用于增強去角質的方法，所述方法包括 向有需要的皮膚區(qū)域表面施用包含有效量的經(jīng)修飾的酵母肽級分的組合物，所述經(jīng)修飾的酵母肽級分包含化妝品上可接受的載體中的與金屬相絡合的含有SEQ ID NO:l的肽；以及 相對于所述皮膚摩擦所述組合物。
全文摘要
公開了包含被脅迫的酵母提取物的與金屬相絡合的肽級分和/或鈣流入抑制劑的化妝品組合物，以及使用此類組合物來賦予皮膚去角質，抗衰老，抗脂質，抗炎，和/或淡化益處，和/或賦予毛發(fā)淡化益處的方法。相信這些組合物具有針對皮膚衰老，發(fā)炎，脂質合成和黑色素產(chǎn)生中所顯現(xiàn)出的至少一種生物化學通路的調節(jié)活性。
文檔編號A61K8/18GK103037886SQ201080038485
公開日2013年4月10日 申請日期2010年8月4日 優(yōu)先權日2009年8月31日
發(fā)明者U·桑塔納姆, C·D·基魯, D·馬齊施, 洪奇, H·H·沙欣 申請人:雅芳產(chǎn)品公司