本發(fā)明涉及低麩質酵母水解物以及使用脯氨酰基特異性內切蛋白酶產生所述低麩質酵母水解物的方法。發(fā)明背景為產生酵母提取物，典型地可以使面包酵母和圓酵母細胞經受自溶。一些酵母來源(例如用過的啤酒酵母)含有麩質(麥醇溶蛋白(gliadins))殘留物。因此，源于含有麥醇溶蛋白的酵母來源的提取物和懸浮液在食品中的應用有限，這是由于部分人口對麥醇溶蛋白的不耐受(乳糜瀉)造成的。觀察到從含有麥醇溶蛋白的來源獲得的典型酵母提取物或自溶物(例如啤酒酵母提取物)含有按重量計濃度超過20ppm的可接受閾值的麥醇溶蛋白。減少來自含有麥醇溶蛋白的酵母來源的麥醇溶蛋白使得能夠在需要不存在低濃度麩質的食品應用中使用這些酵母及其提取物。減少酵母中的麥醇溶蛋白的一個問題在于特異性地降低麥醇溶蛋白含量，而不存在該處理的不希望的副作用。例如，不希望旨在降低麥醇溶蛋白含量的處理也降解酵母的RNA?，F在出人意料地發(fā)現，可以通過在水解和/或自溶過程中用脯氨酸特異性內切蛋白酶進行孵育而從含有麥醇溶蛋白的酵母來源中去除麥醇溶蛋白。出人意料地發(fā)現，可以將麥醇溶蛋白有效地水解至基于酵母自溶物和提取物的干物質含量按重量計低于20ppm的水平。另外，發(fā)現在水解和/或自溶過程中用脯氨酸特異性內切蛋白酶進行孵育不會降解存在于酵母中的RNA。定義“酵母”在本文中被定義為包含酵母細胞的固體、糊體或液體組合物。優(yōu)選地，酵母細胞來自Saccharomyces屬。酵母可以在發(fā)酵過程(如用于產生常見面包酵母(baker’syeast)的過程)中產生。優(yōu)選地，酵母是啤酒酵母(brewer’syeast)，如可以作為側流從啤酒釀造過程中獲得的用過的啤酒酵母?！白匀堋痹诒疚闹斜欢x為使用內源酵母酶和任選地外源加入的酶使酵母細胞進行的酶促分解。自溶可以產生酵母自溶物和酵母提取物兩者(參見下文的定義)?！八狻痹诒疚闹斜欢x為僅使用外源酶使酵母細胞進行酶促分解。首先通過例如熱激使內源酵母酶失活。水解也可以產生酵母自溶物和酵母提取物兩者(參見下文的定義)?！敖湍杆馕铩痹诒疚闹斜欢x為通過如在上文定義的并且產生如在下文定義的酵母自溶物或酵母提取物的自溶或水解獲得的酵母(如用過的啤酒酵母)消化物?！敖湍缸匀芪铩笔菑钠【平湍讣毎?優(yōu)選地用過的啤酒酵母細胞)中獲得的經濃縮的、未經提取的、部分可溶的消化物。通過如在上文定義的酵母細胞的水解或自溶來完成消化。啤酒酵母自溶物含有源于完整酵母細胞的可溶和不可溶兩種組分(例如食品化學藥典)?！敖湍柑崛∥铩眱H包含啤酒酵母細胞的水溶性組分，其構成主要是氨基酸、肽、碳水化合物和鹽。酵母提取物通過由存在于食用酵母中的天然存在的酶和/或通過加入食品級酶(食品化學藥典)水解肽鍵(即，通過如在上文定義的自溶和/或水解)來產生?！暗鞍酌浮痹诒疚闹斜欢x為以內切方式作用于蛋白質底物中的肽鍵(即切割多肽鏈中任何位置的肽鍵)的水解酶，這與(外)肽酶不同，所述(外)肽酶在本文中被定義為以外切方式作用于蛋白質底物中的肽鍵(即在多肽鏈末端附近起作用)的水解酶：氨肽酶是從多肽鏈的N-末端側切掉氨基酸、二-、三-或更高寡肽，并且羧肽酶是從多肽鏈的C-末端側切掉氨基酸、二-、三-或更高寡肽?；谄浯呋瘷C制將內切蛋白酶分為以下亞類：絲氨酸內切蛋白酶(EC3.4.21.xx)、半胱氨酸內切蛋白酶(EC3.4.22.xx)、天冬氨酸內切蛋白酶(EC3.4.23.xx)和金屬內切蛋白酶(EC3.4.24.xx)?！案彼崽禺愋詢惹械鞍酌浮痹诒疚闹斜欢x為在蛋白質或寡肽底物中的脯氨酸殘基的C-末端側切割蛋白質或寡肽底物的內切蛋白酶。脯氨酸特異性內切蛋白酶已被分類為EC3.4.21.26。所述酶可以從多種來源如哺乳動物來源、細菌(例如Flavobacterium)和真菌(Aspergillus，特別是Aspergillusniger)獲得。Aspergillusniger的酶已被詳細描述于WO02/45524、WO02/46381、WO03/104382中。來自Penicilliumchrysogenum的適合的真菌酶披露于WO2009/144269中。來自Flavobacteriummeningosepticum的適合的細菌酶披露于WO03068170中?！胞熧|”在本文中被定義為在谷物中發(fā)現的蛋白復合物并且被再分為麥醇溶蛋白和麥谷蛋白(glutenin)。發(fā)明詳述在第一方面，本發(fā)明提供了用于制備酵母水解物的方法，其特征在于該方法包括以下步驟：使含有麩質的酵母水解物與脯氨酸特異性內切蛋白酶接觸，產生基于無鹽酵母干物質包含少于100ppm麩質或麥醇溶蛋白的酵母水解物。優(yōu)選地，基于無鹽酵母干物質，所得酵母水解物包含少于50ppm的麩質或麥醇溶蛋白，更優(yōu)選地少于40ppm、更優(yōu)選地少于30ppm且更優(yōu)選地少于20ppm的麩質或麥醇溶蛋白。酵母水解物可以優(yōu)選地含有至少5ppm的麩質或麥醇溶蛋白，更優(yōu)選地至少4ppm的麩質或麥醇溶蛋白、更優(yōu)選地至少3ppm的麩質或麥醇溶蛋白、更優(yōu)選地至少2ppm的麩質或麥醇溶蛋白。最優(yōu)選地，基于無鹽酵母干物質，酵母水解物含有至少1ppm的麩質。本發(fā)明的發(fā)明人出人意料地發(fā)現，本發(fā)明脯氨酸特異性內切蛋白酶提供了低麩質酵母水解物，其中酵母的RNA或衍生的5’核糖核苷酸不被或基本上不被降解，并且因此可用于轉化成增強味道的5’-核糖核苷酸?？梢栽诒景l(fā)明的方法中使用任何脯氨酸特異性內切蛋白酶。脯氨酸特異性內切蛋白酶可以來自于哺乳動物、植物或微生物。適合的微生物脯氨酸特異性內切蛋白酶來自細菌(如Flavobacteriummeningosepticum)或來自真菌(如Penicilliumchrysogenum或Aspergillusniger)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法使用Aspergillusniger的脯氨酸特異性內切蛋白酶。這種酶可作為Brewer’sClarex商購并且可以從荷蘭代爾夫特的DSMFoodSpecialties獲得。其中脯氨酸特異性內切蛋白酶用于降低酵母水解物的麩質含量的步驟的條件(如pH和溫度)可以因脯氨酸特異性內切蛋白酶的不同而不同，但是可以由本領域技術人員無過度負擔地基于在本領域中已知的各種脯氨酸特異性內切蛋白酶的酶特性來選擇。優(yōu)選地，基于無鹽酵母干物質，與本發(fā)明的含有麩質的酵母水解物相接觸的脯氨酸特異性內切蛋白酶的量在多于零至0.5％w/w的范圍內。更優(yōu)選地，基于無鹽酵母干物質，與本發(fā)明的含有麩質的酵母水解物相接觸的脯氨酸特異性內切蛋白酶的量在0.01至0.5w/w的范圍內，更優(yōu)選地在0.02至0.1w/w或至0.01w/w的范圍內。酵母水解物可以是在上文中定義的酵母提取物或酵母自溶物。酵母可以是任何適合的酵母并且優(yōu)選地選自Saccharomyces、Brettanomyces、Kluyveromyces、Candida或Torula屬，優(yōu)選Saccharomyces屬，更優(yōu)選被用作面包酵母的Saccharomycescerevisiae或在釀造工業(yè)中例如被用于生產窖藏啤酒的啤酒酵母Saccharomycescarlsbergensis或與其同義的Saccharomycespastorianus。在一個優(yōu)選實施方案中，酵母是啤酒酵母并且更優(yōu)選作為啤酒釀造過程的副產物的用過的啤酒酵母。酵母水解物可以通過本領域公知的方法(如在上文中定義的自溶或水解)產生自酵母細胞。酵母細胞可以含有麩質，例如因為在酵母的產生過程中使用了含有麩質的原料。特別地，啤酒酵母(更優(yōu)選用過的啤酒酵母)可以含有來自在啤酒釀造過程中使用的大麥或小麥的殘留麩質。在本發(fā)明的方法中，制備了基于無鹽酵母干物質包含少于100ppm的麩質或麥醇溶蛋白的酵母水解物。優(yōu)選地，基于無鹽酵母干物質，所得酵母水解物包含少于50ppm的麩質或麥醇溶蛋白，更優(yōu)選地少于40ppm、更優(yōu)選地少于30ppm且更優(yōu)選地少于20ppm的麩質或麥醇溶蛋白。在該方法中使用的脯氨酸特異性內切蛋白酶通過以上文對脯氨酸特異性內切蛋白酶所描述的特異性切割麩質而減少存在于酵母水解物中的麩質的量。本領域技術人員將容易地理解，為了獲得具有少于100ppm麩質的酵母水解物，經受利用脯氨酸特異性內切蛋白酶的步驟的酵母水解物必須含有多于100ppm，否則脯氨酸特異性內切蛋白酶無法降低麩質含量。類似地，為了獲得具有少于50ppm麩質的酵母水解物，經受利用脯氨酸特異性內切蛋白酶的步驟的酵母水解物必須含有多于50ppm；并且同樣地，為了獲得具有少于40ppm麩質的酵母水解物，經受利用脯氨酸特異性內切蛋白酶的步驟的酵母水解物必須含有多于40ppm；并且同樣地，為了獲得具有少于30ppm麩質的酵母水解物，經受利用脯氨酸特異性內切蛋白酶的步驟的酵母水解物必須含有多于30ppm；并且同樣地，為了獲得具有少于20ppm麩質的酵母水解物，經受利用脯氨酸特異性內切蛋白酶的步驟的酵母水解物必須含有多于20ppm。通常，與其中脯氨酸特異性內切蛋白酶降低麩質含量的步驟之后獲得的酵母水解物相比，經受利用脯氨酸特異性內切蛋白酶的步驟的酵母水解物必須含有更多的麩質。進一步優(yōu)選的是，在使含有麩質的酵母水解物與脯氨酸特異性內切蛋白酶接觸產生基于無鹽酵母干物質包含少于100ppm的麩質且至少1ppm的麩質的酵母水解物的本發(fā)明步驟中還包括用以產生5’-核糖核苷酸的磷酸二酯酶以及任選地用以將5’-AMP轉化為5’-IMP的酶處理。使用磷酸二酯酶與本發(fā)明脯氨酸特異性內切蛋白酶的組合的優(yōu)勢在于獲得具有增加量的5’-核糖核苷酸的低麩質酵母水解物。在第二方面，本發(fā)明提供了基于無鹽酵母干物質包含少于100ppm麩質或麥醇溶蛋白的酵母水解物。優(yōu)選地，基于無鹽酵母干物質，所得酵母水解物包含少于50ppm的麩質或麥醇溶蛋白，更優(yōu)選地少于40ppm、更優(yōu)選地少于30ppm且更優(yōu)選地少于20ppm的麩質或麥醇溶蛋白。酵母水解物可以優(yōu)選地含有至少5ppm的麩質，更優(yōu)選地至少4ppm的麩質或麥醇溶蛋白、更優(yōu)選地至少3ppm的麩質或麥醇溶蛋白、更優(yōu)選地至少2ppm的麩質或麥醇溶蛋白。最優(yōu)選地，基于無鹽酵母干物質，酵母水解物含有至少1ppm的麩質或麥醇溶蛋白。酵母水解物可以是通過任何適合的方法可獲得的，但是優(yōu)選地是通過本發(fā)明的第一方面的方法可獲得的或獲得的。在第一或第二方面的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明中的酵母水解物進一步包含5’-核糖核苷酸。術語“5’-核糖核苷酸”在本文中旨在指游離5’-核糖核苷酸或其鹽。5’-IMP、5’-GMP因其風味增強的特性而聞名。它們能夠在某些類型的食品中增強可口且美味的味道。因此，本發(fā)明中酵母水解物的優(yōu)勢在于它提供了與低量的麥醇溶蛋白和/或麩質組合的風味增強特性。5’-核糖核苷酸在本發(fā)明的酵母水解物中的重量百分比(％w/w)是基于無氯化鈉的酵母水解物干物質的重量并且作為5’-核糖核苷酸的二鈉鹽七水合物(2Na.7H2O)來計算。在第一或第二方面的另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明中的酵母水解物進一步包含5’-GMP(5’-單磷酸鳥苷)和/或5’-IMP(5’-單磷酸肌苷)。優(yōu)選地，本發(fā)明中的酵母水解物包含多于60％、優(yōu)選多于70％、更優(yōu)選多于80％、更優(yōu)選多于90％、更優(yōu)選多于95％的下述量的5’-GMP和/或5’-IMP，所述量為從酵母水解物所獲得自的酵母細胞中存在的給定RNA量能夠獲得的最大的5’-GMP和/或5’-IMP量。優(yōu)選地，基于無氯化鈉的酵母水解物干物質，本發(fā)明中酵母水解物中的5’-GMP和5’-IMP的總量是至少1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5、4％、5％或至少6％。如果酵母水解物是酵母自溶物，則基于無氯化鈉的酵母自溶物干物質，5’-GMP和5’-IMP的總量是至少1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5、4％、5％或至少6％。如果本發(fā)明中的酵母水解物是酵母提取物，則基于無氯化鈉的酵母提取物干物質，5’-GMP和5’-IMP的總量是至少1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5、4％、5％或至少6％。優(yōu)選地，基于無氯化鈉的酵母自溶物或酵母提取物干物質，本發(fā)明酵母自溶物或酵母提取物中的5’-GMP和5’-IMP的總量少于10％，優(yōu)選地少于6％，更優(yōu)選地少于5％或少于4％。本發(fā)明第二方面中的酵母水解物可以是在上文中所定義的酵母提取物或酵母自溶物。酵母可以是任何適合的酵母并且優(yōu)選地選自Saccharomyces,Brettanomyces,Kluyveromyces,Candida或Torula屬，優(yōu)選Saccharomyces屬，更優(yōu)選被用作面包酵母的Saccharomycescerevisiae或在釀造工業(yè)中例如被用于生產窖藏啤酒的啤酒酵母Saccharomycescarlsbergensis或與其同義的Saccharomycespastorianus。在一個優(yōu)選實施方案中，酵母是啤酒酵母并且更優(yōu)選作為啤酒釀造過程中副產物的用過的啤酒酵母。在第三方面，本發(fā)明提供了根據本發(fā)明第二方面的酵母水解物或酵母提取物或酵母自溶物在過程風味反應(processflavourreaction)中、在肉類應用中、或作為風味增強劑、或作為風味改良劑、或在頭香載體(topnotecarrier)中或在桌面應用品(table-topapplication)中的用途。在第四方面中，本發(fā)明提供了包含根據本發(fā)明的第二方面的酵母水解物或酵母提取物或酵母自溶物的風味增強劑、肉制品、風味改良劑、頭香載體或桌面應用品。材料和方法麩質測定通過麩質/麥醇溶蛋白的UPEX-提取(通用醇溶谷蛋白和谷蛋白提取溶液(UniversalProlaminandGlutelinExtractantsolution))并且通過基本上如M.C.Mena等人，Talanta91(2012)pp33–40“ComprehensiveanalysisofgluteninprocessedfoodsusinganewextractionmethodandacompetitiveELISAbasedontheR5antibody”中描述的ELISA試驗定量來測定酵母水解物中的麩質的量。麩質提取程序是基于PBS(Sigma-Aldrich貨號：P3813，荷蘭)中的還原型三(2-羧乙基)-膦(TCEP)(Sigma-Aldrich貨號：C4706，荷蘭)和陰離子表面活性劑N-月桂酰肌氨酸(十二烷基肌酸鈉)(Sigma-Aldrich貨號：61745，荷蘭)試劑。1.稱取250mg干酵母水解物并轉移到10ml聚丙烯管中。2.向含有酵母水解物的管中加入2.5mlUPEX溶液(PBS(pH7)中的5mMTCEP、2％N-月桂酰肌氨酸)。為了防止還原劑失活，在使用之前即刻制備UPEX溶液。3.將管緊閉，并且將帽用膜覆蓋以避免蒸發(fā)。4.將管的內容物通過渦旋5至10秒充分混合，并且將管置于試管架上。5.將管在50℃下在GL水浴型號1003中孵育40分鐘。6.允許管在室溫下冷卻5分鐘。7.加入7.5ml的80％乙醇/水(v/v)，并且將樣品通過渦旋10–60秒而徹底地分散直到實現樣品完全分散，然后在室溫下在旋轉(頭頂式)振蕩器(StuartScientificRollermixer型號：SRT2)中以45轉/分鐘孵育1小時。8.將管在室溫下在臺式離心機(Eppendorf型號5810R)中以2500g離心10分鐘。9.使用新巴氏移液管，將來自每個管的上清液轉移到干凈的10ml聚丙烯管中。10.在提取24小時內，通過ELISA試驗對溶液進行分析。為了進行ELISA試驗，使用由R-Biopharm供應的麥醇溶蛋白競爭性試劑盒(R-BiopharmAG，德國達姆施塔特)。實施例實施例1減少麥醇溶蛋白用過的啤酒酵母膏源自荷蘭的釀酒廠。將獲得的酵母加熱至55℃并且將pH值設為5.3。向漿料中加入基于酵母無鹽干物質1％w/w用量的(含有Bacilluslicheniformis的內切蛋白酶枯草溶菌素(subtilisinCarlsberg)并且由丹麥的諾維信生產并且購自Sigma，目錄號P4860)。將懸浮液孵育過夜。孵育之后，將懸浮液設為pH為5.3并且分為4個不同的部分。根據表1，基于無鹽干物質，給予0至0.5％w/w范圍的脯氨酸特異性內切蛋白酶。將懸浮液維持在61℃下并孵育15小時。孵育之后，將懸浮液加熱，以終止殘留酶的活性。取懸浮液和提取物(澄清懸浮液之后)的樣品并通過蒸發(fā)進行濃縮。通過如在材料和方法中描述的UPEX提取和ELISA試驗分析濃縮物的麥醇溶蛋白含量。表1：脯氨酸特異性內切蛋白酶的劑量效應實施例2減少麥醇溶蛋白將粉末劑型的啤酒酵母提取物(EXPRESA2200S，DSMFOODSPECIALTIES，荷蘭代爾夫特)溶于水中至10％w/w。將溶液的pH值設為5.3，并且將溫度維持在61攝氏度。將樣品分為兩部分。將脯氨酸特異性內切蛋白酶加入兩個含有酵母提取物的燒瓶之一中，并且基于無鹽酵母干物質給予0.5％w/w。將溶液孵育15小時。孵育之后，將溶液加熱至90℃，以終止殘留酶活性。將獲得的溶液通過水蒸發(fā)進行濃縮。使用濃縮的樣品，通過在材料和方法中描述的UPEX提取和ELISA試驗分析其麥醇溶蛋白含量。表2：脯氨酸特異性內切蛋白酶的作用實施例3與蛋白酶相比脯氨酸特異性內切蛋白酶的RNA的減少在這個實施例中，將用脯氨酸特異性內切蛋白酶降低麥醇溶蛋白含量之后的不希望的RNA降解與用可商購的也適于降低麥醇溶蛋白含量的蛋白酶進行的處理進行比較。獲自荷蘭啤酒廠的啤酒酵母用于以高酵母增溶產率產生含有核苷酸的酵母自溶物。測量酵母RNA并且基于干物質是3.4％。首先，將酵母在95℃下熱激5分鐘。隨后通過兩個蛋白酶步驟將干物質溶解。第一步，將(含有Bacilluslicheniformis的內切蛋白酶枯草溶菌素并且由丹麥諾維信生產并且購自Sigma，目錄號P4860)在pH值為8且溫度為62℃的條件下孵育6小時(用量：基于干物質是0.8％)。對于第二蛋白酶處理，對若干不同的酶進行測試：·Proteax(可獲得自AmanoEnzyme)·肽酶R(可獲得自AmanoEnzyme)·Accelerzyme(可獲得自DSM)·SumizymeFP(可獲得自ShinNihon)·脯氨酸特異性內切蛋白酶(BrewersClarex，來自DSM)將這些蛋白酶分開應用于不同的實驗中(1％，基于干物質)，并且在pH為5.2且溫度為51.5℃的條件下孵育15小時。這兩個蛋白酶步驟之后，通過85℃熱激使酶失活。通過用5’-磷酸二酯酶(DSM)和脫氨酶(Amano)孵育來轉化RNA，以產生5’GMP和5’IMP。孵育是在pH值為5.3且溫度為60℃的條件下進行15小時。這些不同的處理之后，隨后根據以下方法通過HPLC測定樣品中5’-GMP和5’-IMP的量(被表示為基于無氯化鈉干物質的其二鈉七水合物的重量百分比)。通過使用WhatmanPartisil10-SAX柱、作為洗脫液的磷酸鹽緩沖液(pH3.35)的HPLC和UV檢測來對5’-GMP和5’-IMP進行定量。在5’-GMP和5’-IMP標準品的基礎上計算濃度。通過用Jenway氯計PCLM3(Jenway，英格蘭埃塞克斯)測量樣品中的氯離子并計算氯化鈉的對應量來測定氯化鈉。通過測定增溶產率和蛋白質的水解程度來測量蛋白酶的效力。結果匯總于表3中：表3：1.通過DM上清液/DM培養(yǎng)液進行計算2.通過HPLC測量酸水解之后的游離氨基酸/總氨基酸進行計算表3顯示，考慮到起始酵母的RNA含量(3.4％)，使用脯氨酸特異性內切蛋白酶提供了5’-GMP和5’-IMP預期量的至少90％的5’-GMP和5’-IMP。因此，如在實施例1和2中所示的，脯氨酸特異性內切蛋白酶能夠減少麩質，同時存在于酵母中的RNA不被降解，并且因此可用于轉化為5’-核糖核苷酸(如5’-GMP和5’-IMP)。鑒于其他蛋白酶的5’-GMP和5’-IMP量，這是出人意料的，因為所述其他酶顯然還降解酵母RNA。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3