專利名稱：制備醋酸亮丙瑞林的方法、產(chǎn)品及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備醋酸亮丙瑞林的方法，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醋酸亮丙瑞林(LeuproreIin Acetate)，屬于原料藥，是人工合成的促黃體生成釋放激素(LH-RH)的高活性衍生物，廣泛用于治療早熟、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤或絕經(jīng)前乳腺癌等女性患者和前列腺癌等男性患者。目前國內(nèi)亮丙瑞林粗品的合成多采用Fmoc(芴甲氧羰?；?保護(hù)方法，雖然該方法合成效率較高，反應(yīng)周期短，但是由于過程中需要采用大量的六氫吡啶、三氟乙酸、乙硫醇和苯酚等毒性非常大的脫保護(hù)試劑，對環(huán)境污染很大，同時對產(chǎn)品的安全性有較大的風(fēng)險。而在亮丙瑞林的純化過程中，雖然國內(nèi)基本上都使用C18液相色譜柱層析填料進(jìn)行純化，但目前的工藝中多采用三氟乙酸-乙腈-水的緩沖體系進(jìn)行純化，該方法收率偏低，同時在產(chǎn)品中帶入了三氟乙酸等毒性較大的試劑；同時由于將亮丙瑞林粗品直接進(jìn)行 C18層析，填料的使用壽命非常短。

發(fā)明內(nèi)容
除非另外指出，本文中基團(tuán)“ —”為聚苯乙烯樹脂，基團(tuán)“Boc”為叔丁氧羰?；?， 基團(tuán)“But”為叔丁基；基團(tuán)“Tos”為對甲苯磺?；换鶊F(tuán)“DCCI”為二環(huán)己基碳二亞胺；基團(tuán)“HOBt”為1-羥基苯駢三唑；基團(tuán)“ iftOH”為異丙醇，基團(tuán)“ftx)”為脯氨酸，基團(tuán)“Arg” 為精氨酸，基團(tuán)“Leu”為亮氨酸，基團(tuán)“Tyr”為酪氨酸，基團(tuán)“Ser”為絲氨酸，基團(tuán)“Trp”色氨酸，基團(tuán)“His”為組氨酸，基團(tuán)“pGlu”為焦谷氨酸。本發(fā)明的一個目的是提供一種制備醋酸亮丙瑞林的方法，相比現(xiàn)有生產(chǎn)工藝，該方法能夠獲得更高純度和收率的醋酸亮丙瑞林。本發(fā)明的另一個目的是提供根據(jù)所述方法制備的醋酸亮丙瑞林產(chǎn)品。本發(fā)明的另一個目的是提供所述醋酸亮丙瑞林產(chǎn)品在制備用于治療早熟、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤或絕經(jīng)前乳腺癌等女性患者和/或前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。針對以上發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案一方面，本發(fā)明提供一種制備醋酸亮丙瑞林的方法，包括以下步驟1)制備Boc-Pro- MfBoc-Pro的甲醇溶液，加入到Cs2CO3的水溶液中，得到 Boc-Pro-Cs溶液，濃縮，蒸去溶劑，得固體物，加入甲醇并減壓蒸干，減壓干燥至恒重，將得到的Boc-Pro-Cs加入無水DMF( 二甲基甲酰胺)溶劑中，加熱，待Boc-Pro-Cs溶解后倒入 Cl-CH2- 樹脂中，攪拌，反應(yīng)完成后過濾，并洗滌樹脂，烘干，真空干燥得Boc-Pro- ；2)固相接肽通過準(zhǔn)備原料、接二肽、接三肽、接四肽、接五肽、接六肽、接七肽、接八肽和接九肽的步驟，得到亮丙瑞林九肽樹脂，其中，接二肽到接九肽的步驟均包括去保護(hù)基、洗滌、中和、再洗滌、接肽和檢測游離氨；
3)胺解通過乙基胺從上述亮丙瑞林九肽樹脂上解離亮丙瑞林，得到亮丙瑞林粗4) HPLC純化經(jīng)HPLC制備柱純化得到醋酸亮丙瑞林中間純化品；5)濃縮；6)過濾、凍干。進(jìn)一步，所述步驟1)包括將質(zhì)量濃度為15 17%的Boc-Pro的甲醇溶液，加入到質(zhì)量濃度為15 17%的Cs2CO3的水溶液中，得到pH值為7. O 7. 5的Boc-Pro-Cs溶液，在40 50°C水浴中減壓濃縮，蒸去溶劑，得固體物，加入甲醇并減壓蒸干，在以I32O5為干燥劑的干燥器內(nèi)減壓干燥至恒重，將得到的干燥的Boc-Pro-Cs加入無水DMF溶劑中，力口熱至40 50°C，待Boc-Pro-Cs溶解后倒入Cl-CH2- 樹脂中，其中，Cl-CH2- 樹脂的用量為干燥的Boc-Pro重量的2. 5 3倍，40 50°C恒溫攪拌反應(yīng)40 48小時，反應(yīng)完成后過濾，并洗滌樹脂，在45 50°C的烘箱中烘12 16h，在以P2O5為干燥劑的干燥器內(nèi)真空干燥至恒重，得到Boc-Pro- 。更進(jìn)一步，步驟1)中，所述加入甲醇并減壓蒸干需要進(jìn)行不少于兩次，甲醇的每次用量為200 300ml。所述無水DMF溶劑在溶解Boc-Pro-Cs后，還可以再用其蕩洗燒瓶， 并入樹脂中，溶解和蕩洗燒瓶共用去800 1000ml。所述洗滌樹脂包括用無水DMF洗滌樹脂3次，每次用400 600ml，再用純化水洗滌至無Cl—反應(yīng)，最后用無水乙醇洗滌4次， 用甲醇洗2次，無水乙醇和甲醇每次用量均為400 600ml。進(jìn)一步，步驟2)中，所述準(zhǔn)備原料包括將600重量份的Boc-Pro- ，以無水 CH2Cl2洗滌2 3次，每次用1500 1800ml，攪拌3 5min，抽干。進(jìn)一步，步驟2)中，接二肽到接七肽時，所述去保護(hù)基包括將準(zhǔn)備的原料加入 800 IOOOml濃度為9 ION的HCl/iPrOH溶液和800 IOOOmlCH2Cl2混合液中，攪拌 50 60min，抽干；接八肽和接九肽時，所述去保護(hù)基包括將接七肽后所得物加入800 1000ml濃度為9 10N的HCl/iPrOH溶液、750 900ml的CH2Cl2和50 IOOrnl的巰基乙醇混合液中，振搖50 60min，抽干；接二肽到接九肽時，所述洗滌包括將去保護(hù)基所得物用CH2Cl2洗滌3次，每次用1500 1800ml，抽干，再用1500 1800ml的DMF洗滌1次，抽干；接二肽到接九肽時，所述中和包括將洗滌所得物加入三乙胺/CH2Cl2溶液洗滌3次，每次用1500 1800ml，每次攪拌2min，其中，三乙胺與CH2Cl2的體積比為5/95，抽干；接二肽到接九肽時，所述再洗滌包括將中和所得物用1500 1800ml的DMF洗滌1次，抽干，再用 CH2Cl2洗滌5 6次，每次用1500 1800ml，至呈中性，抽干；接二肽到接九肽時，所述接肽包括將接肽原料用1500 1800ml無水DMF溶解，倒入Boc-Pro- 樹脂中，密塞瓶口，攪拌15 18h，抽干溶劑，以CH2Cl2洗滌3次，無水乙醇洗滌4次，DMF洗滌2次，CH2Cl2洗滌 3次，上述每種溶劑每次用量均為1500 1800ml，抽干；接二肽到接九肽時，所述檢測游離氨基為用Kaiser試劑檢測。更進(jìn)一步，所述接肽原料以重量份計包括，接二肽原料為Boc-Arg · HCl247. 5，HOBt139. 9,DCCI213. 21 ；接三肽原料為
Boc-Leu · H2O225. 0，HOBt139. 9,DCCI213. 21 ；接四肽原料為Boc-D-Leu207. 8，HOBt139.9，DCCI213. 21 ；接五肽原料為Boc-Tyr253. 98，HOBt139. 9,DCCI213. 21 ；接六肽原料為
But丨235. 26， Boc-SerHOBt139. 9,DCCI213. 21 ；接七肽原料為Boc-Trp273. 6，HOBt139. 9,DCCI213. 21 ；接八肽原料為
Tos\360， Boc-HisHOBt139. 9,DCCI213. 21 ；接九肽原料為pGlu115.5，HOBt139.9DCCI213.21。進(jìn)一步，步驟2~)中，所述接九肽完成后，將所得物用CH2Cl2洗滌3次，無水乙醇洗滌4次，DMF洗滌2次，CH2Cl2洗滌3次，甲醇洗滌4次，上述每種溶劑每次用量均為1500 1800ml，抽干，然后在40 50°C烘箱中干燥5小時以上，再置于以P2O5為干燥劑的干燥器中干燥至恒重，得亮丙瑞林九肽樹脂。進(jìn)一步，所述步驟幻胺解包括將干燥的亮丙瑞林九肽樹脂加入無水甲醇中，通入乙基胺，密閉，室溫下振搖20 M小時，抽去多余的乙基胺，過濾，過濾后的樹脂用甲醇洗滌，減壓濃縮至干，成泡沫狀，得濃縮物I ；將濃縮物I以甲醇溶解，再以丙酮沉淀，過濾， 濾餅用醋酸溶解，減壓濃縮至干，加甲醇溶解再濃縮至干，成泡沫狀，得濃縮物II ；將濃縮物II，以甲醇溶解，再以丙酮沉淀，過濾，濾餅用丙酮、乙醚洗滌，抽干，真空干燥，得亮丙瑞林粗品。
進(jìn)一步，所述步驟4) HPLC純化包括將亮丙瑞林粗品用乙酸鈉溶液溶解，過濾，調(diào)節(jié)電導(dǎo)率，經(jīng)色譜柱上樣，上樣完畢后用乙酸鈉緩沖液洗滌至吸光值穩(wěn)定，再用乙酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫，出峰時開始收集洗脫液，至吸光值不再變化時停止收集；收集的洗脫液經(jīng)膜過濾后，經(jīng)HPLC制備柱上樣，進(jìn)行梯度洗脫，收集主峰溶液，即得醋酸亮丙瑞林中間純化品。進(jìn)一步，所述步驟幻濃縮包括醋酸亮丙瑞林中間純化品用注射用水稀釋后再吸附到HPLC制備柱上，用醋酸銨溶液洗滌，用乙酸/乙腈溶液洗滌，最后用乙酸/乙腈溶液洗脫，收集有吸收值的部分，減壓濃縮，得到醋酸亮丙瑞林濃縮物。進(jìn)一步，所述步驟6)過濾、凍干包括將醋酸亮丙瑞林濃縮物送入潔凈區(qū)，配制成溶液，濾膜過濾，濾液用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，得醋酸亮丙瑞林凍干制品。另一方面，本發(fā)明提供一種根據(jù)上述方法制備的醋酸亮丙瑞林產(chǎn)品。另一方面，本發(fā)明提供上述醋酸亮丙瑞林產(chǎn)品在制備用于治療早熟、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤或絕經(jīng)前乳腺癌等女性患者和/或前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的制備醋酸亮丙瑞林的方法及產(chǎn)品，其有益效果為本發(fā)明提供的制備方法中，使用了 Boc保護(hù)方法進(jìn)行合成亮丙瑞林粗品，過程中使用了 HCl/異丙醇作為脫保護(hù)試劑，避免了對環(huán)境造成較大的污染，同時提高了產(chǎn)品的安全性。在接下來純化亮丙瑞林粗品的過程中，首先將亮丙瑞林粗品進(jìn)行一步離子交換層析， 然后再進(jìn)行C18柱的HPLC純化；增加的一步離子交換層析，不但沒有降低產(chǎn)品的收率，反而保護(hù)了 C18柱層析填料；同時制備過程中使用乙酸-乙腈-水的緩沖體系，使HPLC的收率達(dá)到95%以上，而且大大增加了產(chǎn)品的安全性。本發(fā)明制備方法得到的醋酸亮丙瑞林的粗品收率為15% 25%，粗品轉(zhuǎn)化為中間純化品的收率為85 95%，中間純化品轉(zhuǎn)化為成品的收率高達(dá)95 100%


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施例，具體地，圖1為制備醋酸亮丙瑞林的方法的工藝流程圖，其中，圖IA為由原料合成亮丙瑞林粗品的工藝流程圖，圖IB為由亮丙瑞林粗品合成醋酸亮丙瑞林成品的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例11.制備 Boc-Pro-②在3L三口燒瓶內(nèi)稱取103. 2g的Boc-Pro，溶于600ml甲醇中。在IL三口燒瓶內(nèi)稱取101. 4g的Cs2CO3溶于600mlH20中，緩緩加入上述Boc-Pro溶液中，得到無色透明的 Boc-Pro-Cs溶液，其pH值為7. O 7.5 ；在40°C水浴中水泵減壓濃縮，蒸去溶劑，得固體物； 加入甲醇250ml，減壓蒸干，再次加入甲醇250ml減壓蒸干，在以I32O5為干燥劑的干燥器內(nèi)減壓干燥至恒重，得160 185g干燥的Boc-Pro-Cs。稱取樹脂Cl-CH2- 300g置于3L三角燒瓶中；將上述Boc-Pro-Cs加入無水DMF 溶劑中，加熱至40°C，待Boc-Pro-Cs溶解后倒入樹脂中，再以無水DMF蕩洗三口燒瓶，并入樹脂中，共用IOOOml無水DMF ；50°C恒溫攪拌反應(yīng)48小時；反應(yīng)完成后用2號砂芯漏斗過濾，樹脂用無水DMF洗滌3次(每次用500ml)，再用純化水洗滌至無Cl_反應(yīng)(AgNO3試劑檢測)，最后用無水乙醇洗滌4次，用甲醇洗2次(無水乙醇和甲醇每次用量均為500ml)。 在45 50°C的烘箱中烘12 16h，，再置于以P2O5為干燥劑的干燥器中真空干燥至恒重， 得 300 360g 的 Boc-Pro-②。2.固相接肽2. 1準(zhǔn)備原料稱取相當(dāng)于300mmol (通過樹脂重量和取代量計算)重量的Boc-Pro- ，置于 5000ml反應(yīng)瓶中，以無水CH2Cl2洗滌2 3次(每次用1800ml)，每次攪拌5min，抽干。2. 2 接二肽 Boc-Arg-Pro- (1)去保護(hù)基將步驟2. 1中的原料加入900ml濃度為9 ION的HCl/iPrOH溶液和900mlCH2Cl2混合液中，攪拌60min，抽干。(2)洗滌上步中所得物用CH2Cl2洗滌3次(每次用1800ml)，抽干；再用1800ml 的DMF洗滌1次，抽干。(3)中和上步中所得物加入三乙胺/CH2Cl2溶液(5/95的體積比)中，洗滌3次 (每次用1800ml)，每次攪拌2min，抽干。(4)再洗滌上步中所得物用1800ml的DMF洗滌1次，抽干；再用CH2Cl2洗滌5 6次(每次用1800ml)至呈中性，抽干。(7)接肽將 247. 5g(即 900mmol) Boc-Arg · HCl,139. 9g(即 1035mmol) HOBt 禾口 213. 21g(即1035mmol)DCCI分別用無水DMF溶解(共用無水DMF約1800ml)，然后倒入 Boc-Pro- 樹脂中，密塞瓶口，攪拌12 16h，之后，抽干溶劑，以CH2Cl2洗滌3次，無水乙醇洗滌4次，DMF洗滌2次，CH2Cl2洗滌3次(上述每種溶劑每次用量均為1800ml)，抽干。(8)檢測游離氨基整個接肽過程應(yīng)確保氨基酸次序正確無誤，在保護(hù)氨基酸單體質(zhì)量的先決條件下，保證脫保護(hù)基完全和接肽完全是控制質(zhì)量的關(guān)鍵；為保證接肽完全， 需采用足夠量單體接肽，并在每次洗滌后均需用Kaiser試劑檢測是否接肽完全，以保證接肽質(zhì)量；每克樹脂含5 μ mol氨基時即能顯輕微的藍(lán)色(檢出靈敏度5 μ mol/940 μ mol < 1%)，具體測試方法為取約2_3mg樹脂置于小試管中，加入Kaiser試劑A、B、C各一滴，于水浴中加熱至 100°C，應(yīng)無藍(lán)色出現(xiàn)；若有藍(lán)色出現(xiàn)或樹脂顯藍(lán)色，則按前述接肽方法再補(bǔ)接1.5倍量的保護(hù)氨基酸單體，振搖池，洗滌后再次檢測，其中，試劑A為20g苯酚溶于5ml乙醇中，試劑 B為5mgKCN溶于35mlH20，用吡啶稀釋至100ml，試劑C為1. 5g茚三酮溶于30ml乙醇中。2. 3 接三肽 Boc-Leu-Arg-Pro- 步驟2. 2接二肽后所得物經(jīng)去保護(hù)基-洗滌-中和-再洗滌后，進(jìn)行接肽和檢測游離氨基，其中，去保護(hù)基、洗滌、中和、再洗滌、接肽和檢測游離氨基的方法均與步驟2. 2接二肽中的上述方法相同，所不同的是，當(dāng)前步驟中接肽使用的原料為Boc-Leu · H2O225. Og (艮口 900mmol)HOBt139. 9g (即 1035mmol)DCCI213. 21g(即 1035mmol)。2· 4 接四月太 Boc-D-Leu-Leu-Arg-Pro-
步驟2. 3接三肽后所得物經(jīng)去保護(hù)基-洗滌-中和-再洗滌后，進(jìn)行接肽和檢測游離氨基，其中，去保護(hù)基、洗滌、中和、再洗滌、接肽和檢測游離氨基的方法均與步驟2. 2接二肽中的上述方法相同，所不同的是，當(dāng)前步驟中接肽使用的原料為Boc-D-Leu207. 8g(艮口 900mmol)HOBt139. 9g (即 1035mmol)DCCI213. 21g(即 1035mmol)。2. 5 接五肽 Boc-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro- 步驟2. 4接四肽后所得物經(jīng)去保護(hù)基-洗滌-中和-再洗滌后，進(jìn)行接肽和檢測游離氨基，其中，去保護(hù)基、洗滌、中和、再洗滌、接肽和檢測游離氨基的方法均與步驟2. 2接二肽中的上述方法相同，所不同的是，當(dāng)前步驟中接肽使用的原料為Boc-Tyr253. 98g(即 900mmol)HOBt139. 9g (即 1035mmol)DCCI213. 21g(即 1035mmol)。
But2. 6 接六肽 I
Boc-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro- 步驟2. 5接五肽后所得物經(jīng)去保護(hù)基-洗滌-中和-再洗滌后，進(jìn)行接肽和檢測游離氨基，其中，去保護(hù)基、洗滌、中和、再洗滌、接肽和檢測游離氨基的方法均與步驟2. 2接二肽中的上述方法相同，所不同的是，當(dāng)前步驟中接肽使用的原料為
ButI235. ^g (即 900mmol) Boc-SerHOBt139. 9g (即 1035mmol)DCCI213. 21g(即 1035mmol)。2. 7 接七肽 Boc-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro- 步驟2. 6接六肽后所得物經(jīng)去保護(hù)基-洗滌-中和-再洗滌后，進(jìn)行接肽和檢測游離氨基，其中，去保護(hù)基、洗滌、中和、再洗滌、接肽和檢測游離氨基的方法均與步驟2. 2接二肽中的上述方法相同，所不同的是，當(dāng)前步驟中接肽使用的原料為Boc-Trp273. 6g(艮口 900mmol)HOBt139. 9g (即 1035mmol)DCCI213. 21g(即 1035mmol)。
Tos2.8 接八肽 It cτ τ Λ
Boc-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro- 步驟2. 7接七肽后所得物經(jīng)去保護(hù)基-洗滌-中和-再洗滌后，進(jìn)行接肽和檢測游離氨基，其中，去保護(hù)基的方法為將接七肽后所得物加入900ml濃度為9-10N的HCl/iPrOH 溶液、810ml的CH2Cl2和90ml的巰基乙醇混合液中，振搖60min，抽干；洗滌、中和、再洗滌、 接肽和檢測游離氨基的方法均與步驟2. 2接二肽中的上述方法相同，所不同的是，當(dāng)前步驟中接肽使用的原料為
TosI360g (即 900mmol) Boc-HisHOBt139. 9g (即 1035mmol)
10
DCCI213. 21g (即 10;35mmol)。2.9 接九肽 pGlu—Hi s-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro- 步驟2. 8接八肽后所得物經(jīng)去保護(hù)基-洗滌-中和-再洗滌后，進(jìn)行接肽和檢測游離氨基，其中，去保護(hù)基的方法與步驟2. 8接八肽中的上述方法相同；洗滌、中和、再洗滌、 接肽和檢測游離氨基的方法均與步驟2. 2接二肽中的上述方法相同，所不同的是，當(dāng)前步驟中接肽使用的原料為pGlu115. 5g (即 900mmol)HOBt139. 9g (即 10;35mmol)DCCI213. 21g(即 1035mmol)。將接九肽后所得物用CH2Cl2洗滌3次，無水乙醇洗滌4次，DMF洗滌2次，CH2Cl2洗滌3次，甲醇洗滌4次(上述每種溶劑每次用量均為1800ml)，抽干，然后在50°C烘箱中干燥5小時以上，再置于以P2O5為干燥劑的干燥器中干燥至恒重，得亮丙瑞林九肽樹脂，樹脂增重為300 360g (樹脂理論增重為0. 3 X (1067-101) = 289. 8g)。3.胺解(將亮丙瑞林從樹脂上解離)將上述干燥的亮丙瑞林九肽樹脂置于12L裂解瓶(抽氣口應(yīng)先嚴(yán)密封閉)中，力口入3360ml無水甲醇，各通入約5000ml乙基胺，密閉，于室溫下振搖M小時之后，抽去多余的乙基胺，合并后過濾，過濾后的樹脂用甲醇洗滌4次(每次用1000ml)，濾洗液在40 45°C下減壓濃縮至干，加甲醇溶解再減壓濃縮至干，如此反復(fù)三次，成泡沫狀，得濃縮物I。將濃縮物I稱重，以5倍體積的甲醇溶解，再以50倍體積的丙酮沉淀，過濾，濾餅用5倍體積的50% (體積比)的醋酸溶解，40 45°C下減壓濃縮至干，加甲醇溶解再濃縮至干，如此反復(fù)至少三次，至成泡沫狀，得濃縮物II。將濃縮物II稱重，以10倍體積的甲醇溶解，再以50倍體積的丙酮沉淀，過濾，濾餅用丙酮洗滌1次，乙醚洗滌3次(上述每種溶劑每次用量均為250ml)，抽干，真空干燥，得亮丙瑞林粗品；濾液可回收利用，用丙酮洗滌1次，乙醚洗滌3次(上述每種溶劑每次用量均為250ml)，抽干，真空干燥，得亮丙瑞林粗品并回收。4. HPLC 純化將上述亮丙瑞林粗品用pH值為6. 0、濃度為0. 05mol/L的乙酸鈉溶液溶解，雙層濾紙過濾，調(diào)節(jié)電導(dǎo)率與PH值為6. 0、濃度為0. 05mol/L的乙酸鈉溶液基本一致后，經(jīng)pH值為6. 0、濃度為0. 05mol/L的乙酸鈉緩沖液平衡后的CM-kphadex G25柱(柱體積200ml) 上樣，上樣完畢后用PH值為6.0、濃度為0.05mol/L的乙酸鈉緩沖液洗滌至吸光值(λ為 280nm,靈敏度為0. 01)穩(wěn)定，再用pH值為6. 0、濃度為0. 5mol/L的乙酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫， 出峰時開始收集洗脫液，至吸光值不再變化時停止收集。收集的洗脫液經(jīng)HPLC分析純度為 95% (純度應(yīng)彡70%),并計算含量為0. 64mg/ml (含量應(yīng)彡0. 2mg/ml)。收集的洗脫液經(jīng)0. 45 μ m膜過濾后，經(jīng)5cm的反相C_18液相色譜柱(即HPLC制備柱)上樣，用溶劑A(含0.5% (體積比)乙酸和5% (體積比)乙腈的溶液)和溶劑B(含 0.5% (體積比)乙酸和80% (體積比)乙腈的溶液)進(jìn)行梯度洗脫，收集主峰溶液，主峰溶液合并即得醋酸亮丙瑞林中間純化品，經(jīng)HPLC檢測，純度達(dá)到99. 5%，和薄層色譜法檢測雜質(zhì)含量小于0.5%。5.濃縮
醋酸亮丙瑞林中間純化品用1 2倍注射用水稀釋后再吸附到HPLC制備柱上，用溶劑C (0. lmol/L醋酸銨溶液)洗滌30min，用溶劑A洗滌60min，最后用溶劑D (含0. 5 % (體積比)乙酸和40% (體積比)乙腈的溶液)洗脫，收集有吸收值的部分，經(jīng)40 45°C 減壓濃縮去除殘留有機(jī)溶劑和注射用水。6.過濾、凍干將上述濃縮物送入10000級(局部100級)潔凈區(qū)，用注射用水配制成8 % 10% (重量比)的溶液，用0.22 μ m濾膜過濾，濾液用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，預(yù)凍溫度彡-:35°C，干燥溫度30°C 40°C，真空度彡30Pa，保溫時間6 8h，得凍干制品。7.分裝、入庫將上述凍干制品分裝于玻璃藥瓶中，同時取樣送檢，加蓋密封后，貼上注有品名、 批號、重量、生產(chǎn)日期、有效期、操作人和復(fù)核人的標(biāo)簽，遮光、密閉保存，待化驗(yàn)合格，辦理入庫手續(xù)。8.醋酸亮丙瑞林質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(1)依據(jù)QS-PRF-004. 01(2)性狀本品為白色或類白色粉末；無臭，有引濕性。本品在水、醋酸中易溶，在甲醇中略溶。比旋度為-38.0° -42.0°。吸收系數(shù)為53 56。(3)鑒別HPLC色譜圖中，供試品峰的的保留時間應(yīng)與對照品峰的保留時間一致。TCL薄層色譜中，供試品所顯主斑點(diǎn)的顏色和位置應(yīng)與對照品的主斑點(diǎn)相同。(4)檢查溶液澄清度與顏色應(yīng)符合規(guī)定。含醋酸量為4. 7 9.0%。氨基酸比值應(yīng)符合以下規(guī)定谷氨酸0. 85 1. 1 ；脯氨酸0. 85 1. 1 ；亮氨酸 1. 80 2. 2 ；組氨酸0. 85 1. 1 ；精氨酸0. 85 1. 1 ；酪氨酸0. 85 1. 1 ；且絲氨酸應(yīng)被檢測出，其它氨基酸除色氨酸外均不得檢出。有關(guān)物質(zhì)應(yīng)符合規(guī)定。殘留溶劑應(yīng)符合以下規(guī)定含乙醚不得超過0. 5 %，丙酮不得超過0. 5 %，甲醇不得超過0.3%，乙醇不得超過0.5%，二氯甲烷不得超過0. 06 %，乙腈不得超過0. 041 %，N， N’ - 二甲基甲酰胺不得超過0. 088%。水分不得超過5.0%。細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)小于16. 7EU/mg醋酸亮丙瑞林(以無水、無醋酸物計算)。無菌應(yīng)符合規(guī)定?？梢姰愇餀z查應(yīng)符合規(guī)定。9.產(chǎn)品收率粗品收率15% 25%粗品一中間純化品收率85 % 95 %
12
中間純化品一成品收率95% 100%(計算公式收率=(實(shí)際產(chǎn)量/理論產(chǎn)量)X100% )10.物料消耗和生產(chǎn)設(shè)備本實(shí)施例中消耗的物料和所使用主要生產(chǎn)設(shè)備分別列于表1、和表2中。表1實(shí)施例1中物料消耗
權(quán)利要求
1.一種制備醋酸亮丙瑞林的方法，其包括以下步驟1)制備Boc-Pro- 將Boc-Pro的甲醇溶液，加入到Cs2CO3的水溶液中，得到 Boc-Pro-Cs溶液，濃縮，蒸去溶劑，得固體物，加入甲醇并減壓蒸干，減壓干燥至恒重，將得到的Boc-Pro-Cs加入無水DMF溶劑中，加熱，待Boc-Pro-Cs溶解后倒入Cl-CH2-②樹脂中， 攪拌，反應(yīng)完成后過濾，并洗滌樹脂，烘干，真空干燥得Boc-Pro- ；2)固相接肽通過準(zhǔn)備原料、接二肽、接三肽、接四肽、接五肽、接六肽、接七肽、接八肽和接九肽的步驟，得到亮丙瑞林九肽樹脂，其中，接二肽到接九肽的步驟均包括去保護(hù)基、 洗滌、中和、再洗滌、接肽和檢測游離氨；3)胺解通過乙基胺從上述亮丙瑞林九肽樹脂上解離亮丙瑞林，得到亮丙瑞林粗品。4)HPLC純化經(jīng)HPLC制備柱純化得到醋酸亮丙瑞林中間純化品；5)濃縮；6)過濾、凍干。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)包括將質(zhì)量濃度為15 17%的Boc-Pro的甲醇溶液，加入到質(zhì)量濃度為15 17%的Cs2CO3的水溶液中，得到pH 值為7. O 7. 5的Boc-Pro-Cs溶液，在40 50°C水浴中減壓濃縮，蒸去溶劑，得固體物， 加入甲醇并減壓蒸干，在以P2O5為干燥劑的干燥器內(nèi)減壓干燥至恒重，將得到的干燥的 Boc-Pro-Cs加入無水DMF溶劑中，加熱至40 50°C，待Boc-Pro-Cs溶解后倒入Cl-CH2- 樹脂中，其中，Cl-CH2- 樹脂的用量為干燥的Boc-Pro重量的2. 5 3倍，40 50°C恒溫攪拌反應(yīng)40 48小時，反應(yīng)完成后過濾，并洗滌樹脂，在45 50°C的烘箱中烘12 16h， 在以P2O5為干燥劑的干燥器中真空干燥至恒重，得到Boc-Pro- 。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述加入甲醇并減壓蒸干需要進(jìn)行不少于兩次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述洗滌樹脂包括用無水DMF洗滌樹脂，再用純化水洗滌至無Cl—反應(yīng)，最后用無水乙醇和甲醇分別洗滌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟幻中，所述準(zhǔn)備原料包括將600重量份的Boc-Pro- ，以無水CH2Cl2洗滌，攪拌，抽干。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟幻中，接二肽到接七肽時，所述去保護(hù)基包括將準(zhǔn)備的原料加入濃度為9 ION的HCl/iPrOH溶液和CH2Cl2混合液中，攪拌， 抽干，優(yōu)選地，HCl/iPrOH溶液與CH2Cl2的體積比為1:1;接八肽和接九肽時，所述去保護(hù)基包括將接七肽后所得物加入濃度為9 ION的 HCl/iPrOH溶液、CH2Cl2和巰基乙醇混合液中，振搖，抽干，優(yōu)選地，HCl/iPrOH溶液、CH2Cl2 與巰基乙醇的體積比為10 9 1 ；接二肽到接九肽時，所述洗滌包括將去保護(hù)基所得物用CH2Cl2洗滌，抽干，再用DMF， 抽干；接二肽到接九肽時，所述中和包括將洗滌所得物加入三乙胺/CH2Cl2溶液洗滌，攪拌 2min，抽干，優(yōu)選地，三乙胺與CH2Cl2的體積比為5/95 ；接二肽到接九肽時，所述再洗滌包括將中和所得物用DMF洗滌，抽干，再用CH2Cl2洗滌至呈中性，抽干；接二肽到接九肽時，所述接肽包括將接肽原料用無水DMF溶解，倒入Boc-Pro- 樹脂中，密塞瓶口，攪拌，抽干溶劑，以CH2Cl2、無水乙醇、DMF分別洗滌，再用CH2Cl2洗滌，抽干； 接二肽到接九肽時，所述檢測游離氨基為用Kaiser試劑檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述接肽原料以重量份計包括，接二肽原料為Boc-Arg · HCl247.5，HOBt139.9,DCCI213.21;接三肽原料為 Boc-Leu · H2O225. 0，HOBt139.9,DCCI213.21;接四肽原料為 Boc-D-Leu207.8，HOBt139.9,DCCI213.21;接五肽原料為 Boc-Tyr253.98，HOBt139.9,DCCI213.21;接六肽原料為 ButI235. 26,Boc-SerHOBt139.9,DCCI213.21;接七肽原料為 Boc-Trp273.6，HOBt139.9,DCCI213.21;接八肽原料為 TosI360，Boc-HisHOBt139.9,DCCI213.21;接九肽原料為 pGlu115.5,HOBt139.9DCCI213.21。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的方法，其特征在于步驟幻中，所述接九肽完成后，將所得物用CH2Cl2、無水乙醇、DMF分別洗滌，再用CH2C12、甲醇洗滌，抽干，然后在40 50°C烘箱中干燥不少于5小時，再置于以P2O5為干燥劑的干燥器中干燥至恒重，得亮丙瑞林九肽樹脂。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)胺解包括將干燥的亮丙瑞林九肽樹脂加入無水甲醇中，通入乙基胺，密閉，室溫下振搖，抽去多余的乙基胺，過濾，過濾后的樹脂用甲醇洗滌，減壓濃縮至干，成泡沫狀，得濃縮物I ；將濃縮物I以甲醇溶解，再以丙酮沉淀，過濾，濾餅用醋酸溶解，減壓濃縮至干，加甲醇溶解再濃縮至干，成泡沫狀，得濃縮物II ；將濃縮物II，以甲醇溶解，再以丙酮沉淀，過濾，濾餅用丙酮、乙醚洗滌，抽干，真空干燥，得亮丙瑞林粗品。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4)HPLC純化包括將亮丙瑞林粗品用乙酸鈉溶液溶解，過濾，調(diào)節(jié)電導(dǎo)率，經(jīng)色譜柱上樣，上樣完畢后用乙酸鈉緩沖液洗滌至吸光值穩(wěn)定，再用乙酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫，出峰時開始收集洗脫液，至吸光值不再變化時停止收集；收集的洗脫液經(jīng)膜過濾后，經(jīng)HPLC制備柱上樣，進(jìn)行梯度洗脫，收集主峰溶液，即得醋酸亮丙瑞林中間純化品。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟幻濃縮包括醋酸亮丙瑞林中間純化品用注射用水稀釋后再吸附到HPLC制備柱上，用醋酸銨溶液洗滌，用乙酸/乙腈溶液洗滌，最后用乙酸/乙腈溶液洗脫，收集有吸收值的部分，減壓濃縮，得到醋酸亮丙瑞林濃縮物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟6)過濾、凍干包括將醋酸亮丙瑞林濃縮物送入潔凈區(qū)，配制成溶液，濾膜過濾，濾液用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，得醋酸亮丙瑞林凍干制品。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的方法制備的醋酸亮丙瑞林產(chǎn)品。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的醋酸亮丙瑞林產(chǎn)品在制備用于治療早熟、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤或絕經(jīng)前乳腺癌等女性患者和/或前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備醋酸亮丙瑞林的方法，其步驟包括制備Boc-Pro--固相接肽-胺解-HPLC純化-濃縮-過濾凍干，其中，固相接肽為通過準(zhǔn)備原料、接二肽、接三肽、接四肽、接五肽、接六肽、接七肽、接八肽和接九肽的步驟，得到亮丙瑞林九肽樹脂。通過本發(fā)明提供的制備方法能夠獲得更高純度和收率的醋酸亮丙瑞林，且制備過程對環(huán)境污染較少，產(chǎn)品安全性較高。
文檔編號A61P5/24GK102464702SQ20101061091
公開日2012年5月23日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者萬龍巖, 王林鵬, 程元亨, 籍曉濤, 肖建國, 謝振東 申請人:上海麗珠制藥有限公司