專利名稱：一種具有拮抗趨化因子受體ccr5的活性多肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種具有拮抗趨化因子受體CCR5的活性多 肽及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(HIV)侵入人體后，破壞人體免疫功能而使人體發(fā) 生一系列不可治愈的感染和腫瘤，最后導(dǎo)致患者死亡的傳染病。艾滋病由于其傳播快、難治 愈和缺乏有效的治療藥物等特點(diǎn)正在全世界范圍內(nèi)及我國較大規(guī)模地傳播，已引起世界各 國高度重視，成為了二十世紀(jì)的瘟疫。但目前國內(nèi)外市場尚無有效的艾滋病治療藥物，且現(xiàn) 有抗艾滋病藥物副作用較大，價格昂貴。目前市面上的抗艾滋病藥物主要是相關(guān)蛋白酶的 抑制劑，主要有逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，其中包括核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NPTI)和非核苷類逆轉(zhuǎn) 錄酶抑制劑(NNRTI)代表藥物有拉米夫定、阿巴卡韋、泰諾福韋、雙肽芝、Trivizir等藥物， 和蛋白酶抑制劑代表藥物有奈非那韋、安普那韋、吲哚那韋、羅品那韋、利托那韋等。由于這 些藥物都存在干擾人體正常酶類代謝、毒副作用較大和容易產(chǎn)生病毒耐藥性等缺點(diǎn)，所以 人類要戰(zhàn)勝艾滋病這個二十世紀(jì)的瘟疫急需要新型機(jī)制的抗病毒藥物。隨著對HIV感染機(jī)制研究的不斷深入，科學(xué)家們對HIV病毒感染細(xì)胞的機(jī)制已經(jīng) 逐步闡明。能阻斷HIV感染細(xì)胞任何一個生活周期的途經(jīng)都有可能用來治療艾滋病，所以 了解HIV感染細(xì)胞機(jī)制的研究對新型抗艾滋病藥物的開發(fā)十分重要。伴隨著趨化因子受體作為HIV病毒進(jìn)入細(xì)胞的共受體的發(fā)現(xiàn)，作為趨化因子受體 天然配體的趨化因子及其類似物成為了研究的熱點(diǎn)。趨化因子是一大類能使細(xì)胞發(fā)生趨化 運(yùn)動的小分子細(xì)胞因子，其作用是控制和調(diào)節(jié)白細(xì)胞的趨化運(yùn)動及免疫功能，在機(jī)體的免 疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中起重要作用。趨化因子之間的結(jié)構(gòu)和功能相似，分子量多在8-12KD之間，對 嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等多種細(xì)胞均有趨化作用。目前己發(fā)現(xiàn)的趨化因子有50 多種，它們的典型特征是有保守半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)同源性和能與特異的G蛋白偶聯(lián)的 受體結(jié)合的特性。到目前為止，許多趨化因子的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過X光晶體衍射和NMR核 磁共振技術(shù)的方法確定，研究結(jié)果表明趨化因子單體的三維空間結(jié)構(gòu)都是高度一致的。病毒巨口耆細(xì)胞炎個生蛋白—II (virus macrophage inflammatory protein-II, vMIP-II )是由人皰疹病毒8的K4基因編碼的一種病毒趨化因子，與人CC類趨化因子有較 大的同源性，是人趨化因子的類似物。vMIP - II與趨化因子受體結(jié)合后不引起胞內(nèi)Ca2+迅 速內(nèi)流，故不引起信號傳導(dǎo)，從而對趨化因子與相應(yīng)受體的結(jié)合起到拮抗作用。vMIP — II 和CC、C)(C趨化因子受體都能結(jié)合，所以對趨化因子有廣譜的拮抗作用。vMIP-II不同于其 他趨化因子的一個獨(dú)特特點(diǎn)是它能夠拮抗包括CCR1，CCR2，CCR3，CCR5，CXCR4和CX3CR等 在內(nèi)的多種趨化因子受體，特別是對CCR5和CXCR4有較高的親和力。vMIP- II通過對HIV/SIV的共受體CCR5/CXCR4的封閉和阻斷，能夠有效的阻止病毒感染靶細(xì)胞，是一種比較理 想的病毒進(jìn)入抑制劑。vMIP-II的廣譜趨化因子受體封閉的作用，使vMIP-II成為一種廣譜 的HIV進(jìn)入抑制劑。多肽是一類在氨基酸構(gòu)成及其連接方式上與蛋白質(zhì)相同，但在某些性質(zhì)方面又有 別于蛋白質(zhì)的物質(zhì)，如其空間結(jié)構(gòu)較簡單、穩(wěn)定性較高、免疫原性較低或無免疫原性等。多 肽藥物最理想的模式是具有人源蛋白分子的結(jié)構(gòu)，以免引起免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中治療艾滋病藥物缺乏，提供一種具有拮抗趨化 因子受體CCR5的活性多肽。本發(fā)明的另一目的是提供上述多肽的制備方法。本發(fā)明的又一目的是提供上述多肽的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)上述目的
一種具有拮抗趨化因子受體CCR5的活性多肽，命名為C25P，具有SEQ ID NO: 1的氨基 酸序列或者具有通過在SEQ ID NO: 1氨基酸序列中缺失、加入、插入、替換一個或多個氨基 酸殘基所得到的氨基酸序列，具有拮抗趨化因子受體CCR5的活性。上述多肽的制備方法，包括以下步驟
(1)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索成熟形式的趨化因子序列，利用基于結(jié)構(gòu)的多重序列分析，尋 找VMIP- II受體結(jié)合的高度保守區(qū)；
(2)利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分子模擬，預(yù)測多肽的空間結(jié)構(gòu)；
(3)排除無關(guān)殘基的干擾，確定要合成的目標(biāo)多肽的序列；
(4)固相合成法合成目標(biāo)多肽，純化；
(5)檢驗(yàn)多肽的生物活性，篩選目標(biāo)多肽。其中步驟(1)中，蛋白質(zhì)序列檢索自SWISS-PR0T蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，采用成熟形式 的趨化因子序列，(http://us. expasy. org/sprot)。蛋白質(zhì)序列多重對齊比較分析采用 Informax Vector NTI Version 9· 0 軟件包完成。步驟(2)中分子模擬采用SWISS-MODEL建模程序進(jìn)行，為目前最常用、準(zhǔn)確度最高 的建模程序?？臻g建模采用“First Approach Mode”過程。步驟(4 )中純化是指用HPLC進(jìn)行純化。步驟(5)中檢驗(yàn)多肽的生物活性包括三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)多肽趨化和趨化抑制實(shí)驗(yàn)，即通 過檢驗(yàn)多肽本身的趨化活性以及它對生理性趨化因子的阻斷作用來觀察多肽對受體的功 能；細(xì)胞內(nèi)鈣流實(shí)驗(yàn)，是通過研究多肽對趨化因子受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，來觀察多肽對受 體的功能；抗HIV活性實(shí)驗(yàn)，通過細(xì)胞病毒共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，來觀察多肽抗SIV病毒感染細(xì)胞能 力。上述多肽作為CCR5受體拮抗劑在抗炎藥物開發(fā)以及作為制備治療艾滋病的先導(dǎo) 藥物中的應(yīng)用。上述多肽在制備免疫調(diào)節(jié)藥物或增加機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明多肽具有較好的抗趨化因子受體CCR5活性，同時能夠有效保護(hù)免疫系統(tǒng)機(jī)能，并且免疫原性弱，還能夠有效刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，增加T淋巴細(xì)胞功能，增強(qiáng)免疫作用。我們的研究表明，多肽C25P對PHA刺激的T淋巴細(xì)胞早期活化抗原⑶69的表達(dá) 具有促進(jìn)作用；對PHA刺激的T淋巴細(xì)胞增殖也具有促進(jìn)作用，并能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞進(jìn)入分 裂周期，且呈劑量依賴性。提示多肽C25P對T淋巴細(xì)胞功能具有增強(qiáng)作用，促進(jìn)其發(fā)揮免 疫效應(yīng)。昆明種小鼠經(jīng)長期腹腔注射多肽C25P后檢測抗體滴度，并不引起昆明種小鼠產(chǎn)生 中和抗體，表明多肽C25P對小鼠的免疫原性較弱。多肽C25P能明顯提高小鼠的胸腺指數(shù)、 脾臟指數(shù)，增加淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，T細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著性增強(qiáng)，并能促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，說明多 肽C25P具有刺激小鼠免疫系統(tǒng)、增加T淋巴細(xì)胞功能，增強(qiáng)免疫的作用。多肽C25P使小鼠 外周血⑶3+、⑶4+、⑶8+ T細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著性增強(qiáng)，而⑶4+/⑶8+比值仍處于正常水平；同時 體外檢測到小鼠血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-Y和IL-10都有增加趨勢，而且淋巴細(xì)胞凋亡無 顯著變化，提示多肽C25P可能非特異性地增加機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能。


圖1 :VMIP - II與其它CCR5受體結(jié)合因子的多重序列對比分析方框內(nèi)為排除標(biāo) 準(zhǔn)，黑色圓點(diǎn)示高度保守的區(qū)域；
圖2: vMIP-II的CCR5理論結(jié)合位點(diǎn)在分子表面位置； 圖3 =VMIP-II的CCR5理論結(jié)合位點(diǎn)示意圖； 圖4 多肽C25P分子建模，三維結(jié)構(gòu)預(yù)測圖； 圖5 多月太C25P HPLC圖； 圖6:多肽C25P質(zhì)譜圖7 多肽C25P的趨化活性實(shí)驗(yàn)(ri=3)，*表示與陽性對照組相比P<0. 05 ； 圖8 多肽C25P對MIP — 1 β引起細(xì)胞趨化的抑制率； 圖9 :100ng/ml多肽作用后與對照組的趨化指數(shù)比較(n=3)； 圖10 多肽C25P對PBMC胞內(nèi)鈣濃度的影響，選自lOOng/ml濃度組具有代表性結(jié)果； 圖11 不同濃度的C25P對CCR5特異性因子MIP — 1 β引起的鈣流的影響； 圖12 :C25P抑制合胞體形成實(shí)驗(yàn)的各組合胞體形成數(shù)； 圖13 :C25P抑制合胞體形成實(shí)驗(yàn)的各組抑制率； 圖14 多肽C25P抗體滴度的測定。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1多肽設(shè)計(jì)
蛋白質(zhì)序列檢索自SWISS-PROT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，采用成熟形式的趨化因子序列 (http://us. expasy. org/sprot)。蛋白質(zhì)序列多重對齊比較分析采用Informax Vector NTI Version 9.0軟件包 完成。采用其中的AlignX過程對影響趨化因子受體結(jié)合的殘基進(jìn)行預(yù)測分析先選用與某 一受體特異結(jié)合的人源性趨化因子序列進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的多重序列對齊分析，在全部趨化因 子序列中均存在或保守取代的殘基即可能是與該受體結(jié)合有關(guān)的殘基(即標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合殘基模 型的建立)。再將vMIP-II的序列引入標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合殘基模型中進(jìn)行多重序列比較分析從而得 出vMIP-II與該受體結(jié)合有關(guān)的殘基(即vMIP-II與受體結(jié)合可能有關(guān)的殘基)。為了最大可能的除去無關(guān)殘基的干擾，利用與vMIP-II同源性較高，但不與該受體結(jié)合的趨化因子 作為排除標(biāo)準(zhǔn)，排除作為排除標(biāo)準(zhǔn)亦存在的殘基，從而得到與受體結(jié)合高度相關(guān)的殘基。從結(jié)果可以看出vMIP-II與CCR5趨化因子受體結(jié)合位點(diǎn)主要在其核心骨架，主要 的位點(diǎn)有 P21，K45, R46, V50 (圖 1)。進(jìn)一步利用 Informax Vector NTI Version 9· O 軟 件進(jìn)行了這些位點(diǎn)的空間位置觀察，結(jié)果顯示vMIP-II結(jié)合CCR5受體的特異性殘基P21， K45，R46，V50。從位點(diǎn)空間位置看這些保守的位點(diǎn)均在分子表面(圖2，圖3)，有較大的可能 是分子直接的結(jié)合位點(diǎn)。尤其有K45，R46這兩個帶正電荷的氨基酸組成的正電區(qū)，在所有 的結(jié)合CCR5的趨化因子中均存在，而不能結(jié)合CCR5的趨化因子卻不存在這樣的一個區(qū)域， 所以這兩個殘基對CCR5的結(jié)合可能有重要作用。根據(jù)上面序列分析和殘基空間位置分析結(jié)果，我們初步設(shè)計(jì)了分別對應(yīng)CCR5受 體結(jié)合理論位點(diǎn)的多肽?？紤]到分子空間結(jié)構(gòu)在分子間作用的重要地位，我們通過對目的 多肽進(jìn)行了空間三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測驗(yàn)證了目的多肽是否能夠很好的重現(xiàn)類似于趨化因子相 應(yīng)部位的空間結(jié)構(gòu)。目的多肽的空間建模采用了目前最常用、準(zhǔn)確度高的SWISS-MODEL建 模程序進(jìn)行，空間建模采用“First Approach Mode”過程。分子預(yù)測的結(jié)果顯示多肽C25P (序列為PQVLSWYPTSQLCS KPGVIFLTKRG)與νΜΙΡ — II相應(yīng)區(qū)域結(jié)果相似。多肽的分子結(jié) 構(gòu)預(yù)測圖見圖4。實(shí)施例2多肽的合成、純化 (1)多肽合成與純化
多肽采用Fmoc —固相法在多肽合成儀上合成，將反應(yīng)瓶用100%乙醇充分清洗后，加 入約40ml的5%的二甲基二氯硅烷放置通風(fēng)櫥中過夜使反應(yīng)瓶硅烷化，經(jīng)乙醇粗洗后，置 于-80°C冰箱30min冷卻反應(yīng)瓶，再次用乙醇洗滌，烘干備用；稱取0. 5mmol Wang's resin 0.7130g置于反應(yīng)瓶中；加入3倍于樹脂體積的DCM溶液，溶脹30分鐘后排空液體。然后 在多肽合成儀上按偶連氨基酸、茚三酮反應(yīng)檢測和α —氨基脫保護(hù)的循環(huán)從C端到N端進(jìn) 行，直到全部氨基酸殘基都偶連上去。偶連完成后，取下反應(yīng)瓶用DCM清洗，抽干樹脂后用 預(yù)冷的切割液，切割下來的多肽用HPLC進(jìn)行純化。多肽純化在WaterseOOE高壓液相色譜 儀上，用Kromasil 100-5C18柱子進(jìn)行高壓反相色譜，將收集的目的峰多肽凍干保存。通過 Fmoc 一固相法合成法成功合成了來源于νΜΙΡ — II的多肽C25P，通過純化凍干后獲得凍 干粉5. 3mg。(2)多肽的純度檢測
為了進(jìn)一步檢驗(yàn)合成的多肽是否達(dá)到進(jìn)行活性實(shí)驗(yàn)所需的純度，利用HPLC進(jìn)行 了純度分析。(使用儀器類型液相色譜，儀器型號Waters600E，柱溫室溫，柱型號 kromasill00-5C18，梯度方式高壓梯度，檢測器紫外。)取微量多肽C25P的凍干粉溶于 50%甲醇與50%雙蒸水的混合液中溶解，使終濃度小于0. lmg/ml。用HPLC的微量上樣器 按25ul上樣到Kromasil 100-5C18柱子中，用0. 5ml/min的流速按90%乙晴 10%乙晴做 線形梯度洗脫，用220nm波長檢測。合成純化后的多肽C25P峰面積占總面積的95. 1805%， 也即是多肽C25P的純度為95. 18%，見圖5。
權(quán)利要求
1.一種具有拮抗趨化因子受體CCR5的活性多肽，其特征在于具有SEQ ID N0:1的氨基 酸序列或者具有通過在SEQ ID NO: 1氨基酸序列中缺失、加入、插入和/或替換一個或多個 氨基酸殘基所得到的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述多肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索成熟形式的趨化因子序列，利用基于結(jié)構(gòu)的多重序列分析，尋 找vMIP- II受體結(jié)合的高度保守區(qū)；(2)利用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行分子模擬，預(yù)測多肽的空間結(jié)構(gòu)；(3)排除無關(guān)殘基的干擾，確定要合成的目標(biāo)多肽的序列；(4)固相合成法合成目標(biāo)多肽，純化；(5)檢驗(yàn)多肽的生物活性，篩選目標(biāo)多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述多肽的制備方法，其特征在于步驟(1)中，蛋白質(zhì)序列檢索 自SWISS-PR0T蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，采用成熟形式的趨化因子序列，http://us.expasy.org/ sprot，蛋白質(zhì)序列多重對齊比較分析采用hformax Vector NTI Version 9. O軟件包完 成。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述多肽的制備方法，其特征在于步驟(2)中分子模擬采用 SWISS-MODEL建模程序進(jìn)行，空間建模采用“First Approach Mode”過程。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述多肽的制備方法，其特征在于步驟(4)中純化是指用HPLC進(jìn)行純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述多肽的制備方法，其特征在于步驟(5)中所述檢驗(yàn)多肽的生物 活性包括趨化和趨化抑制實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)鈣流實(shí)驗(yàn)及抗HIV病毒活性實(shí)驗(yàn)。
7.權(quán)利要求1所述多肽作為CCR5受體拮抗劑在抗炎藥物開發(fā)以及作為制備治療艾滋 病的先導(dǎo)藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述多肽在制備免疫調(diào)節(jié)藥物或增加機(jī)體免疫系統(tǒng)功能藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有拮抗趨化因子受體CCR5的活性多肽，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或者具有通過在SEQ ID NO:1氨基酸序列中缺失、加入、插入、替換一個或多個氨基酸殘基所得到的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了這種多肽的制備方法，包括在數(shù)據(jù)庫中搜索相關(guān)蛋白質(zhì)序列，進(jìn)行多重對齊比較分析，篩選出vMIP-Ⅱ受體結(jié)合的高度保守區(qū)，通過分析模擬手段排除無關(guān)殘基干擾，確定目的多肽序列，固相合成法合成，最后檢驗(yàn)其生物活性。本發(fā)明的多肽可作為CCR5受體拮抗劑用于抗炎藥物開發(fā)以及作為治療艾滋病的先導(dǎo)藥物，也可以作為免疫調(diào)節(jié)作用藥物或增加機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的藥物應(yīng)用。
文檔編號A61K38/17GK102146132SQ201010580008
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者何滔, 葉石敦, 孫晗笑, 張光, 李秀英, 湯曼莉, 莫雪梅 申請人:暨南大學(xué)