專利名稱：趨化素樣因子－1在器官炎性損傷中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種趨化因子在器官炎性損傷中的用途。具體地說，涉及趨化素樣因子-1在檢測(cè)樣品炎性損傷的病理狀態(tài)、制作器官炎性損傷的動(dòng)物模型、制備具有治療器官炎性損傷的CKLF-1抗體和拮抗劑中的用途，尤其是在支氣管哮喘氣道損傷及重塑和肺纖維化中的用途。
背景技術(shù)：
支氣管哮喘是嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病，其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)不斷上升。目前美國(guó)的發(fā)病人數(shù)已達(dá)1500萬，英國(guó)幾乎1/7的兒童患有哮喘，而我國(guó)約有數(shù)千萬患者。因此，對(duì)哮喘的研究與防治是一項(xiàng)緊迫而艱巨的任務(wù)。
在過去的十幾年間，哮喘研究的重點(diǎn)放在研究引發(fā)氣道粘膜炎性浸潤(rùn)的機(jī)制上，如免疫活性細(xì)胞分泌的各種前炎因子引起的炎性細(xì)胞粘附、滾動(dòng)、趨化、游走、局部浸潤(rùn)、直至呼吸爆發(fā)并釋放組胺、脂質(zhì)介質(zhì)及活性氧等多種炎性介質(zhì)所造成的炎性損傷。1995年WHO與美國(guó)心肺血液研究所在共同制定的綱領(lǐng)性文件“全球哮喘防治戰(zhàn)略”中將支氣管哮喘明確定義為“多種細(xì)胞特別是嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥，并由此導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性及氣道阻塞”。該文件還指出“這種氣道阻塞通過治療可部分逆轉(zhuǎn)或自行逆轉(zhuǎn)?！?Global strategy for asthmamanagement and prevention NHLBI/WHO workshop reportthe definitionof asthma in global，1995，6-7)。
但大量臨床資料表明某些哮喘病人的臨床表現(xiàn)無法用單純的氣道炎癥來解釋，一些病人即使經(jīng)規(guī)范合理的抗炎治療，氣道阻塞仍不能逆轉(zhuǎn)。如今人們已明白，那些難治病例是因?yàn)闅獾勒衬ぱ仔該p傷后的不全或過度修復(fù)，包括上皮細(xì)胞脫落、粘液細(xì)胞增生、粘膜下膠原纖維沉積，平滑肌增生肥大等病變而使得氣管管徑顯著縮小。當(dāng)炎性分泌物增多、氣道平滑肌收縮、粘液腺分泌增加時(shí)，氣道阻塞加重，因而出現(xiàn)持續(xù)的呼吸困難等臨床癥狀，皮質(zhì)激素亦不能使之逆轉(zhuǎn)。這種氣道結(jié)構(gòu)的病理改變被稱為“氣道重塑”。
支氣管哮喘患者的支氣管粘膜活檢與死亡病例尸解亦證實(shí)，伴有顯著的氣道結(jié)構(gòu)改變是支氣管哮喘的病理特征(Redinogton A.E.，et al.Thorax，1997；52310-312)。多年來人們一直試圖復(fù)制哮喘氣道結(jié)構(gòu)變化的動(dòng)物模型，但迄今為止各類模型多為支氣管粘膜的炎性病變。例如，變應(yīng)性哮喘模型、感染性哮喘模型、職業(yè)性哮喘模型等，都只表現(xiàn)出明顯的炎性浸潤(rùn)(如嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等在支氣管周圍的聚集浸潤(rùn))，但缺少氣道上皮嚴(yán)重受損、上皮下膠原沉積、平滑肌增生等病變，因此不能夠真實(shí)地反映哮喘的病理特征。
一些研究還提示某些免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子參與了哮喘的發(fā)病過程，因?yàn)樵谙∽兘M織中檢測(cè)到多種細(xì)胞因子的表達(dá)。例如，從支氣管哮喘病人外周血單個(gè)核細(xì)胞、肺泡灌洗液及支氣管粘膜活檢中檢測(cè)到高水平表達(dá)的細(xì)胞因子及其受體(如EGF、TGF-β、GM-CSF、PDGF、ET-1、EGFR)。但由于受體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的限制，細(xì)胞因子與氣道炎癥及修復(fù)的直接關(guān)系，尤其是某單一因子與肺支氣管病理變化關(guān)系的報(bào)道極少。而這些對(duì)闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制無疑是非常重要的。
趨化素樣因子-1(Chemokine-like factor1，CKLF-1)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的趨化因子，其GenBank登錄號(hào)為AF096895。CKLF-1具有C-C亞家族趨化因子的特點(diǎn)，即位于氨基酸序列N末端的第一和第二個(gè)半胱氨酸(Cys)緊密相連，呈Cys-Cys排列，即CC結(jié)構(gòu)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)CKLF-1，該因子對(duì)嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞有趨化作用，并能促進(jìn)人低密度骨髓細(xì)胞增值及集落形成(參見PCT申請(qǐng)PCT/CN00/00026)。
發(fā)明概述本發(fā)明人根據(jù)多年積累的臨床資料和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，從眾多的細(xì)胞因子中選擇趨化素樣因子-1，進(jìn)行支氣管哮喘病的研究。經(jīng)過長(zhǎng)期研究和大量實(shí)驗(yàn)，發(fā)明人首次公開了CKLF-1對(duì)器官炎性損傷，尤其是對(duì)支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化的重要作用，并成功地建立了氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化的動(dòng)物模型。
本發(fā)明一個(gè)方面公開了趨化素樣因子-1在器官炎性損傷，尤其是在支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化中的用途。
本發(fā)明涉及通過檢測(cè)樣品中CKLF-1的過量表達(dá)，從而確定樣品為炎性損傷組織的體外檢測(cè)方法。
本發(fā)明另一個(gè)方面公開了利用趨化素樣因子-1制作器官炎性損傷的動(dòng)物模型中的方法，尤其是制作支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑、肺纖維化動(dòng)物模型的方法。
本發(fā)明再一個(gè)方面公開了趨化素樣因子-1在制備具有治療器官炎性損傷作用的抗體和拮抗劑中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，公開了趨化素樣因子-1對(duì)器官炎性損傷，尤其是對(duì)支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化的作用。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，CKLF-1的導(dǎo)入直接介導(dǎo)了小鼠氣道損傷及重塑樣改變。例如，導(dǎo)入CKLF-1后2周，小鼠氣道上皮細(xì)胞明顯充血水腫，支氣管變形，管腔內(nèi)可見脫落的上皮及滲出物。隨后上皮纖毛消失，杯狀細(xì)胞增生(支氣管哮喘氣道上皮表型改變的特征)。6周后小鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)排列嚴(yán)重紊亂，呈現(xiàn)明顯的粘膜皺折，大量上皮細(xì)胞脫入支氣管腔，基底膜增厚，上皮下膠原沉積，平滑肌增殖。
在實(shí)施方案中，CKLF-1的導(dǎo)入還引起小鼠體內(nèi)的肺纖維化病變。例如引起肺小血管異常，肺泡壁增厚，肺泡上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞聚集增生，肺間質(zhì)膠原沉積。因此，CKLF-1廣泛地參與了支氣管肺的炎性損傷與修復(fù)過程，亦可能在慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸衰竭的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。
除肺部效應(yīng)外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)CKLF-1可引起肝、脾、腎、睪丸等組織的變性腫脹以及結(jié)構(gòu)改變。故有理由推測(cè)CKLF-1對(duì)其它組織器官也會(huì)產(chǎn)生病理生理效應(yīng)，即CKLF-1具有致器官炎性損傷的作用。
炎性損傷是指炎細(xì)胞積聚活化，釋放大量炎性介質(zhì)所造成的組織細(xì)胞損傷，如毛細(xì)血管通透性增加，血漿滲出，細(xì)胞腫脹變性，功能受阻等等。炎性損傷發(fā)生在不同的組織器官既有炎癥的一般表現(xiàn)，也有不同的特性。
因此，本發(fā)明涉及一種體外檢測(cè)方法，包括相對(duì)于正常對(duì)照，通過檢測(cè)樣品中CKLF-1的過量表達(dá)而確定樣品炎性損傷狀態(tài)的方法。樣品可以是來自有機(jī)體的組織或細(xì)胞，如肺手術(shù)切除組織，肺支氣管粘膜組織，外周血單個(gè)核細(xì)胞等。檢測(cè)標(biāo)的物可以是CKLF-1核酸編碼序列或CKLF-1蛋白。檢測(cè)來自宿主的樣品中CKLF-1改變水平的分析方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，在DNA水平上，可以從樣品細(xì)胞中獲得用于診斷的核酸，基因組DNA可以直接用于檢測(cè)，或者在分析前用與CKLF-1核酸序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在蛋白質(zhì)水平上的分析方法包括放射免疫測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定、Western印跡分析、ELASA測(cè)定等等。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用CKLF-1特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)到哮喘患者PBMCs中CKLF-1的表達(dá)明顯高于非哮喘患者。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，公開用CKLF-1制作炎性損傷的動(dòng)物模型的方法，尤其是制作哮喘氣道損傷及重塑和肺纖維化動(dòng)物模型的方法。
可以用各種已知的方法將CKLF-1導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，制作炎性損傷的病理模型。例如，可以采用鼻吸、口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注等方法，建立支氣管哮喘氣道損傷的病理模型。優(yōu)選注射和吸入途徑，更優(yōu)選霧化吸入途徑。
霧化吸入是指借助霧化裝置將溶質(zhì)吸入肺支氣管，使溶質(zhì)直接在肺局部發(fā)揮作用。由于抗原的氣道吸入是大部分哮喘的始發(fā)途徑，因此霧化吸入途徑非常接近哮喘發(fā)生的真實(shí)狀況。
導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)的CKLF-1可以與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑一起制成組合物，用于注射或輸注的組合物包括無菌水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及臨使用前在無菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。用于適于吸入的組合物中，CKLF-1可以被壓縮或含于壓縮氣體如氮?dú)饣蛞夯瘹怏w推進(jìn)劑中。
用于制作病理模型的動(dòng)物可以是除人類以外的哺乳動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、兔等。使用的動(dòng)物符合國(guó)家規(guī)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，發(fā)明人采用電脈沖裸基因肌肉注射法，將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDI-CKLF1導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，成功地復(fù)制出類似于支氣管哮喘氣道損傷及重塑的小鼠動(dòng)物模型，表現(xiàn)為大量氣道上皮脫落，杯狀細(xì)胞增生，基底膜增厚，上皮下膠原沉積，平滑肌增殖及肺小血管異常等病變。發(fā)明人用該方法同時(shí)建立了小鼠肺纖維化的病理模型。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，公開了CKLF-1在制備具有治療器官炎性損傷作用的抗體和拮抗劑中的用途。
根據(jù)本發(fā)明，CKLF-1可以用于制備和篩選具有治療器官炎性損傷作用的抗體和拮抗劑?？贵w可以是單克隆的或者是多克隆的。拮抗劑包括在一定條件下與CKLF-1結(jié)合的寡肽或化合物。拮抗劑可以與CKLF-1結(jié)合并在受體位點(diǎn)阻斷其活性，或者，可以與CKLF-1受體結(jié)合，從而阻止CKLF-1與受體的結(jié)合?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的各種方法制備CKLF-1抗體和拮抗劑。例如，將CKLF-1蛋白注入動(dòng)物體內(nèi)，獲得CKLF-1抗血清。用人B細(xì)胞-雜交瘤技術(shù)、EB病毒-雜交瘤技術(shù)等制備CKLF-1單克隆抗體。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)概述如下首先，首次公開了CKLF-1對(duì)器官炎性損傷，尤其是對(duì)支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化的重要作用。本發(fā)明不僅提供了一種新的器官炎性損傷的檢測(cè)方法，而且為這類疾病的深入研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
其次，利用本發(fā)明成功地建立了小鼠氣道炎性損傷及重塑樣模型。該模型克服了以往哮喘研究動(dòng)物模型的缺陷，具有氣道上皮脫落等病變，能夠真實(shí)地反映哮喘的病理特征，因此為闡明哮喘發(fā)病機(jī)理，研究和防治哮喘提供了有益工具。
第三，本發(fā)明公開的實(shí)驗(yàn)資料和結(jié)果，對(duì)哮喘及相關(guān)疾病的研究意義深遠(yuǎn)。例如，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)(1)在基礎(chǔ)狀態(tài)下，人氣道上皮細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)表達(dá)CKLF-1；(2)前炎因子TNF-α可以上調(diào)人氣道上皮細(xì)胞CKLF-1的表達(dá)；(3)嗜酸性粒細(xì)胞在哮喘氣道損傷及重塑中未必是不可缺少的因素；(4)嗜中性粒細(xì)胞的聚集活化在哮喘樣氣道損傷及重塑中具有重要意義。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示人氣道上皮16HBE細(xì)胞和外周血單個(gè)核胞CKLF-1的表達(dá)。
圖2顯示TNF-α對(duì)16HBE細(xì)胞CKLF-1表達(dá)的影響。
圖3A-6B顯示CKLF-1對(duì)小鼠氣道上皮的影響。其中，圖3A是導(dǎo)入pcDI空質(zhì)粒2周后，小鼠(對(duì)照組)氣道上皮細(xì)胞的蘇木精-伊紅(HE)染色結(jié)果(20×)；圖3B是導(dǎo)入pcDI-CKLF1質(zhì)粒2周后，小鼠(實(shí)驗(yàn)組)氣道上皮細(xì)胞的HE染色結(jié)果(20×)；圖4是導(dǎo)入pcDI-CKLF1質(zhì)粒3周后，小鼠(實(shí)驗(yàn)組)氣道上皮細(xì)胞的HE染色結(jié)果(20×)，圖中顯示氣道上皮杯狀細(xì)胞增生；圖5A是導(dǎo)入pcDI-CKLF1質(zhì)粒6周后，小鼠(實(shí)驗(yàn)組)氣道上皮細(xì)胞的HE染色結(jié)果(20×)；圖5B是導(dǎo)入pcDI-CKLF1質(zhì)粒6周后，小鼠(實(shí)驗(yàn)組)氣道上皮細(xì)胞的HE染色結(jié)果(20×)，圖中可見明顯的氣道粘膜皺折；圖6A顯示導(dǎo)入pcDI空質(zhì)粒8周后，小鼠(對(duì)照組)姬姆薩染色支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的少量上皮細(xì)胞(20×)；圖6B顯示導(dǎo)入pcDI-CKLF1質(zhì)粒8周后，小鼠(實(shí)驗(yàn)組)姬姆薩染色支氣管肺泡灌洗液(BALF)中以集落形式脫落的上皮細(xì)胞(20×)；圖7顯示CKLF-1對(duì)小鼠氣道基底膜的影響(HE染色，20×)。
圖8顯示CKLF-1對(duì)小鼠氣道平滑肌的影響(20×)。
圖9A-10B顯示CKLF-1對(duì)小鼠肺組織的影響。其中，圖9A是導(dǎo)入pcDI空質(zhì)粒2周后，小鼠(對(duì)照組)肺組織的HE染色結(jié)果(20×)；圖9B是導(dǎo)入pcDI-CKLF1質(zhì)粒2周后，小鼠(實(shí)驗(yàn)組)肺組織的HE染色結(jié)果(10×)；圖10A是導(dǎo)入pcDI空質(zhì)粒4周后，小鼠(對(duì)照組)肺組織Mallory改良染色的結(jié)果(40×)；圖10B是導(dǎo)入pcDI-CKLF1質(zhì)粒4周后，小鼠(實(shí)驗(yàn)組)肺組織Mallory改良染色的結(jié)果(40×)，圖中顯示膠原纖維。
圖11A～11B顯示CKLF-1對(duì)小鼠肺組織血管的影響。其中，圖11A是導(dǎo)入pcDI空質(zhì)粒4周后，小鼠(對(duì)照組)肺組織血管的HE染色結(jié)果(20×)；圖11B是導(dǎo)入pcDI-CKLF1質(zhì)粒4周后，小鼠(實(shí)驗(yàn)組)肺組織血管的HE染色結(jié)果(20×)。
圖12A-12B顯示CKLF-1對(duì)小鼠肺組織巨噬細(xì)胞的影響。其中，圖12A顯示苔盼蘭活體注射后對(duì)照組小鼠肺組織切片(20×)；圖12B顯示苔盼蘭活體注射后實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織切片(20×)。
圖13A-13B顯示肺組織CKLF-1表達(dá)的免疫組化檢測(cè)。其中，圖13A是對(duì)照組小鼠肺組織CKLF-1表達(dá)的免疫組化檢測(cè)(40×)；圖13B是實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織CKLF-1表達(dá)的免疫組化檢測(cè)(40×)。
圖14顯示正常對(duì)照組與哮喘組外周血單個(gè)核細(xì)胞的CKLF-1表達(dá)。
圖15A-15B顯示正常對(duì)照與哮喘患者支氣管粘膜CKLF-1蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)。其中，圖15A是正常對(duì)照支氣管粘膜CKLF-1蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)(蘇木素復(fù)染，40×)；圖15B是哮喘患者支氣管粘膜CKLF-1蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)，(蘇木素復(fù)染，40×)。
為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照以下實(shí)施例對(duì)其進(jìn)行說明。實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍沒有任何限制意義。優(yōu)選實(shí)施例的描述實(shí)施例1.CKLF-1在人氣道上皮細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞的表達(dá)以及TNFα對(duì)人氣道上皮細(xì)胞中CKLF-1表達(dá)的影響為探測(cè)CKLF-1是否參與支氣管哮喘的發(fā)生，須確定CKLF-1是否表達(dá)于炎性細(xì)胞和氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞，以及在前炎因子刺激下CKLF-1表達(dá)是否發(fā)生變化。
本實(shí)施例(1)以正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞為炎細(xì)胞代表，以正常人氣道上皮細(xì)胞16HBE為氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞代表，檢測(cè)了CKLF-1的表達(dá)。(2)檢測(cè)了前炎因子TNF-α對(duì)氣道上皮細(xì)胞CKLF-1表達(dá)的影響。
1.正常人氣道上皮細(xì)胞株16HBE的培養(yǎng)取正常人氣道上皮細(xì)胞株16HBE(Southampton)凍存管1支，在37℃水浴迅速凍融，加入含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)液。以1×105細(xì)胞/ml接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，在37℃，5％二氧化碳孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔2天換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至基本匯合狀態(tài)時(shí)按照1∶3傳代。傳代時(shí)用0.125％的胰酶消化2分鐘，用含血清培養(yǎng)基吹懸細(xì)胞后離心。以1×105/ml接種于12孔培養(yǎng)板，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞80％匯合成片時(shí)，吸凈上清改用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。12小時(shí)后用1000U/ml TNF-α刺激培養(yǎng)細(xì)胞。
2.外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的分離從健康受試者抽取外周靜脈血3-4毫升，肝素抗凝。用4℃預(yù)冷的生理鹽水將新鮮血稀釋1倍并混勻。將稀釋血液加于2毫升淋巴細(xì)胞分離液(比重1.077)之上，2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘。吸出中層單個(gè)核細(xì)胞，加入另一試管。加2毫升生理鹽水洗滌單個(gè)核細(xì)胞。4℃，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘。棄上清，加1毫升生理鹽水重復(fù)洗滌。4℃，2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘。棄上清，沉淀即為PBMCs。
3.總RNA提取和cDNA合成按照《基因操作技術(shù)》(第一版)(王申五主編，北京醫(yī)科大學(xué)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社出版.1991；46-48)和《分子克隆》(第二版)(J.薩姆布克等著，金冬雁等譯.科學(xué)出版社出版)中的方法分別提取16HBE、PBMCs總RNA，并在逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)的作用下合成cDNA，用于檢測(cè)正常氣道上皮細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞中CKLF-1的表達(dá)。
于TNF-α刺激16HBE細(xì)胞8、12、20小時(shí)后，分別提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR，用于檢測(cè)TNF-α對(duì)氣道上皮細(xì)胞CKLF-1表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組只加DMEM無血清培養(yǎng)液。
4.PCR擴(kuò)增CKLF-1片段(1)引物CKLF-1擴(kuò)增引物上游引物5’-ATG GAT AAC GTG CAG CCG AAA AT-3’下游引物5’-CCG CTC GAG TTA CAA AAC TTC TTT TTT TTC-3’β-actin擴(kuò)增引物上游引物5-`ATG TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG CTG CG-3`，下游引物5-`CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC-3`。
(2)反應(yīng)體系分別以16HBE細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞、TNF-α刺激16HBE細(xì)胞8、12、20小時(shí)后mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體系含有10×PCR緩沖液2.5ul，1.25mM的dNTP 4ul，上游、下游引物各50pmol，模板2ul，Taq DNA聚合酶1U，加滅菌雙蒸水至25ul。
以β-actin擴(kuò)增作為PCR反應(yīng)的對(duì)照。以質(zhì)粒pcDI-CKLF1(含CKLF-1開放讀碼框架，構(gòu)建見下文)擴(kuò)增出的片段作為CKLF-1的對(duì)照。
(3)反應(yīng)參數(shù)預(yù)變性94℃變性8分鐘，加Taq酶0.8μl，94℃變性2分鐘；
循環(huán)94℃變性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸30秒，35個(gè)循環(huán)；延伸72℃7分鐘。
5.PCR產(chǎn)物鑒定及定量分析反應(yīng)結(jié)束后，將PCR反應(yīng)管置4℃冰箱10分鐘。隨后取6μl反應(yīng)終產(chǎn)物，于2％瓊脂糖凝膠(含溴乙錠0.5μg/ml)，6V/cm恒壓下電泳30分鐘。取凝膠在紫外線燈下觀察，并在UVP暗箱式紫外凝膠圖象分析儀上，對(duì)凝膠進(jìn)行攝影記錄和熒光亮度測(cè)定，并進(jìn)行相對(duì)定量分析。
結(jié)果1.CKLF-1在正常人氣道上皮細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)如圖1所示，作為PCR對(duì)照的反應(yīng)管擴(kuò)增出838bp的β-actin片段。用CKLF-1特異性引物，從質(zhì)粒pcDI-CKLF1中擴(kuò)增出作為CKLF-1對(duì)照的300bp片段(條帶B)；同時(shí)從16HBE和PBMCs中亦擴(kuò)增出300bp片段(條帶C、D、E)。由圖可見，CKLF-1在人氣道上皮細(xì)胞高表達(dá)，在人外周血單個(gè)核細(xì)胞亦有一定水平的表達(dá)。
由于氣道上皮細(xì)胞不僅具有防御保護(hù)和物理屏障的功能，而且具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的功能。例如在環(huán)境因素刺激下，氣道上皮細(xì)胞活化，分泌大量的粘附分子及細(xì)胞因子，這些物質(zhì)又作用于氣道上皮，引發(fā)一系列特征性哮喘氣道炎癥反應(yīng)。CKLF-1在氣道上皮細(xì)胞的表達(dá)提示該因子可能參與氣道的炎癥反應(yīng)。
此外，已經(jīng)證實(shí)哮喘的發(fā)生有炎性細(xì)胞的參與，炎性細(xì)胞分泌的生物活性物質(zhì)可以介導(dǎo)炎癥的發(fā)生。CKLF-1表達(dá)于炎性細(xì)胞(如外周血單個(gè)核細(xì)胞)提示當(dāng)哮喘發(fā)生、炎細(xì)胞聚集于氣道粘膜時(shí)，炎細(xì)胞可能表達(dá)并釋放CKLF-1，參與哮喘炎癥的發(fā)生。
2.前炎因子TNF-α對(duì)氣道上皮細(xì)胞CKLF-1表達(dá)的影響。
如圖2所示，前炎因子TNF-α刺激8小時(shí)、12小時(shí)后，人氣道上皮細(xì)胞CKLF-1表達(dá)無明顯變化；刺激20小時(shí)后，人氣道上皮細(xì)胞的CKLF-1表達(dá)水平顯著增高。
TNF-α的活化是哮喘發(fā)病的重要特征之一。由TNF-α活化而引發(fā)一系列前炎因子的分泌，構(gòu)成作用復(fù)雜、效應(yīng)廣泛的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，最終導(dǎo)致哮喘炎癥損傷及重塑的特征性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞CKLF-1可以被TNF-α活化，則CKLF-1可能通過細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)參與哮喘的氣道炎癥反應(yīng)。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)前炎因子TNF-α刺激后，CKLF-1的表達(dá)并非即刻增強(qiáng)。說明CKLF-1表達(dá)的上調(diào)依賴于TNF-α的持續(xù)作用，或者其表達(dá)是受TNF-α刺激后上調(diào)的其它細(xì)胞因子作用而增強(qiáng)的，即CKLF-1對(duì)TNF-α的反應(yīng)需要經(jīng)歷一定的時(shí)段。
綜合上述結(jié)果，CKLF-1可能參與了哮喘氣道炎癥及重塑病變。
實(shí)施例2.CKLF-1介導(dǎo)的小鼠肺支氣管病變用電脈沖裸基因注射法，將CKLF-1導(dǎo)入小鼠體內(nèi)。觀察注入CKLF-1后2至8周小鼠肺支氣管的病理變化，以檢測(cè)單一因子CKLF-1對(duì)肺支氣管的直接病理作用。
1.質(zhì)粒(1)質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒pcDI將pcDNA3(Invitrogen公司)的BglI-kpnI片段與PcI(Promega公司)的BglI-kpnI片段置換，得到pcDI真核表達(dá)質(zhì)粒。
質(zhì)粒pcDI-CKLF-1EcoRI酶切PGEM-T-Easy-CKLF-1質(zhì)粒，釋放CKLF-1的ORF片段，連接至經(jīng)EcoRI酶切并用CIP處理過的pcDI質(zhì)粒中，再經(jīng)酶切鑒定得到正向插入的CKLF-1的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDI-CKLF-1。
(2)質(zhì)粒的大量提取與純化將陽性菌株劃板，37℃孵育過夜。挑取單克隆菌落置于3ml LB培養(yǎng)基和抗生素中37℃，200rpm搖8小時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移入2000ml含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖過夜。質(zhì)粒提取純化及內(nèi)毒素的處理方法和步驟嚴(yán)格按照EndoFree Plasmid Giga Kit(IAGEM-tip10000，Hilden，Germany)操作說明進(jìn)行。
2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4-6周齡BALB/c健康小鼠(購自北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所)共140只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組(見表1)。每組一半為實(shí)驗(yàn)鼠，一半為對(duì)照鼠。實(shí)驗(yàn)鼠分別為導(dǎo)入pcDI-CKLF-1后2w，3w，4w，6w，8w及相應(yīng)的對(duì)照鼠。本文簡(jiǎn)稱為2w組，3w組，4w組，6w組，8w組及對(duì)照組。
表1.CKLF-1轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)小鼠分組(只)組別 pcDI-CKLF1 pcDI對(duì)照2w組 10 103w組 20 204w組 20 206w組 10 108w組 10 103.CKLF-1基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)移將經(jīng)過無菌處理的質(zhì)粒溶解到生理鹽水中，調(diào)節(jié)濃度至1μg/μl，利用微量注射器將100μl(100ug)質(zhì)粒溶液注射到實(shí)驗(yàn)鼠一側(cè)大腿的股四頭肌內(nèi)，對(duì)照鼠于相同部位注射pcDI空質(zhì)粒100ul(100ug)，注射后立即在注射部位插入兩根電極，電極由不銹鋼針制成，直徑0.08mm，長(zhǎng)10mm，插入深度5mm，電極間距5mm，電極連接至湯氏基因治療儀(TS-A)，給予直流方波電脈沖刺激.參數(shù)為場(chǎng)強(qiáng)200v/cm，脈沖波寬40ms，刺激頻率1Hz，作用時(shí)間6秒。然后分期分批頸椎脫臼處死。每組10只小鼠中4-6只用于形態(tài)觀察，其余作支氣管肺泡灌洗。
4.導(dǎo)入CKLF-1后動(dòng)物的生理指標(biāo)檢測(cè)(1)動(dòng)物的呼吸頻率、體重、肺系數(shù)的觀察記錄3，4W組實(shí)驗(yàn)鼠與對(duì)照鼠的呼吸頻率，稱量體重后，摘取肺臟稱其總重量，再計(jì)算肺系數(shù)。肺系數(shù)為肺重g/體重g×100。
(2)臺(tái)盼藍(lán)活體注射稱取適量臺(tái)盼藍(lán)粉劑，溶于生理鹽水，配成終濃度為1％的臺(tái)盼藍(lán)水溶液、然后煮沸10分鐘滅菌。選取導(dǎo)入CKLF-1后3到4w的小鼠，以無菌手術(shù)操作方法，按2-5ml/kg之劑量將滅菌臺(tái)盼藍(lán)溶液注入小鼠腹腔，48小時(shí)后重復(fù)注射一次。再經(jīng)歷24小時(shí)后處死小鼠，取肺組織，立即固定。
(3)病理光鏡標(biāo)本制備將新鮮肺組織立即投入Bouin溶液中固定48小時(shí)以上，分別用70％、80％、90％、95％乙醇脫水12小時(shí)，每次脫水期間換液3次。再用無水乙醇脫水2小時(shí)，期間換液2次。隨后用二甲苯透明45-60分鐘，期間換液1次。65℃浸蠟一小時(shí)。浸蠟后的組織放入65℃石蠟包埋，4mm連續(xù)切片。用HE及改良Mallory染色，進(jìn)行顯微鏡觀察。
(4)電鏡標(biāo)本制備將新鮮肺組織立即固定于新近配制的4℃2.5％戊二醛溶液中，真空抽出肺內(nèi)空氣，按電鏡常規(guī)制備標(biāo)本。半薄切片定位后再行超薄切片。醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色，在日立H-600透射電鏡下觀察。
(5)支氣管肺泡灌洗按分組于第3、4、6、8周頸椎脫臼處死動(dòng)物，氣管切開插管，1640培養(yǎng)液灌洗，每次0.8ml共3次。灌洗液回收率＞80％，行細(xì)胞記數(shù)。沉淀涂片作HE染色或姬姆薩染色。
(6)灌洗液細(xì)胞涂片的制作，細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類離心獲得的BALF中細(xì)胞經(jīng)沉淀，用1ml生理鹽水稀釋，取一部分進(jìn)行計(jì)數(shù)，算出每毫升的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而計(jì)算細(xì)胞總數(shù)；同時(shí)涂片，立即用電吹風(fēng)筒的冷風(fēng)檔迅速吹干玻片，待細(xì)胞干燥固定后作HE染色或姬姆薩染色。光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類，數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞的百分比，用細(xì)胞總數(shù)乘以百分比數(shù)即得細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)。
結(jié)果由電脈沖裸基因肌肉注射法導(dǎo)入的CKLF-1，成功地在注射局部獲得表達(dá)產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)，CKLF-1蛋白隨血液循環(huán)到達(dá)肺部，從而導(dǎo)致了肺支氣管的一系列病變(詳見下文)。免疫組化顯示的CKLF-1主要表達(dá)在氣道上皮細(xì)胞和上皮下部分間質(zhì)細(xì)胞，亦證實(shí)了CKLF-1體內(nèi)轉(zhuǎn)移的成功。
1.導(dǎo)入CKLF-1小鼠的呼吸頻率及體重變化如表2所示，導(dǎo)入CKLF-1 3，4周后的小鼠與對(duì)照相比，在籠內(nèi)活動(dòng)增多，呼吸頻率加快，體重降低。
表2.CKLF-1導(dǎo)入3、4周后小鼠呼吸頻率及體重的變化組別 呼吸頻率(b/min)n＝8體重(g)n＝32實(shí)驗(yàn)組107.8±20.7※ 22.93±1.88※對(duì)照組81.7±15.8 26.09±1.57※與對(duì)照組相比P＜0.052.CKLF-1對(duì)小鼠肺組織重量的影響如表3所示，肉眼觀CKLF-1導(dǎo)入3、4周后小鼠與對(duì)照相比，肺體積膨大，有些肺組織表面明顯充血。肺系數(shù)比對(duì)照組增加39.2％。
表3.CKLF-1對(duì)小鼠肺組織重量的影響組別 例數(shù) 肺系數(shù)實(shí)驗(yàn)組 n＝16 0.78±0.10※對(duì)照組 n＝16 0.56±0.07※與對(duì)照組相比P＜0.053.CKLF-1對(duì)小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞的影響如表4所示，對(duì)照組小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)雖比其它資料顯示為高，但實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞總數(shù)比對(duì)照組顯著增高，各實(shí)驗(yàn)組均比對(duì)照組高200％以上，細(xì)胞總數(shù)增高至少維持8周。
表4.CKLF-1導(dǎo)入小鼠后BALF細(xì)胞總數(shù)的變化(×106)組別 對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組3w 4.3±2.2 11.6±3.8※4w 4.5±2.9 10.7±3.5※6w 3.8±2.6 9.9±2.9※8w 3.3±1.7 9.5±3.2※與對(duì)照組相比P＜0.01，各實(shí)驗(yàn)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
如表5所示，實(shí)驗(yàn)組BALF中細(xì)胞的分類表明，大量細(xì)胞中以上皮細(xì)胞增加為著，為對(duì)照組的8.1倍。與對(duì)照組相比淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞亦明顯增加。但兩組均未見嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)。
表5.CKLF-1導(dǎo)入3周后小鼠BALF細(xì)胞學(xué)變化(×106)組別 細(xì)胞總數(shù) Eos 上皮細(xì)胞 L+N對(duì)照組4.3±2.2 0 0.8±0.200.7±0.2實(shí)驗(yàn)組11.6±3.8※ 0 6.5±2.6※ 2.3±0.7※注L淋巴細(xì)胞 N中性粒細(xì)胞與對(duì)照組相比P＜0.014.對(duì)小鼠氣道上皮的影響(1)導(dǎo)入CKL-1后2周，小鼠氣道上皮細(xì)胞充血水腫、脫落如圖3A所示，對(duì)照組小鼠(注射pcDI空質(zhì)粒)氣道上皮細(xì)胞排列較整齊、無脫落，周圍肺泡結(jié)構(gòu)及肺血管無明顯異常。實(shí)驗(yàn)組小鼠(注射pcDI-CKLF1)氣道上皮細(xì)胞充血水腫，支氣管變形，管腔內(nèi)可見脫落的上皮及滲出物，周圍肺組織明顯充血水腫(圖3B)。
(2)導(dǎo)入CKLF-1后3周，小鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞增生如圖4所示，小鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞增生(支氣管哮喘氣道上皮表型改變的特征)，大量分泌物、滲出物充溢支氣管管腔，管腔明顯狹窄。在40×視野下放大增殖的杯狀細(xì)胞，可見杯狀細(xì)胞分泌的粘原顆粒。電鏡檢查可見上皮細(xì)胞纖毛幾乎脫光。
(3)導(dǎo)入CKLF-1后6周，氣道上皮嚴(yán)重受損，結(jié)構(gòu)排列紊亂如圖5A所示，平行排列的3個(gè)支氣管已無正常形態(tài)，細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞連接破壞，大量上皮細(xì)胞與基底膜分離，脫落于管腔，幾乎堵塞管腔。如圖5B所示，平行排列的支氣管上皮細(xì)胞排列紊亂、脫落?？梢娒黠@的氣道粘膜皺折(哮喘氣道病變的一個(gè)重要特征)。
(4)導(dǎo)入CKLF-1后2-8周，肺泡灌洗液中氣道上皮細(xì)胞脫落導(dǎo)入CKLF-1后2周，肺泡灌洗液中檢測(cè)到大量脫落的氣道上皮細(xì)胞。3周后脫落的細(xì)胞成片或以集落形式出現(xiàn)直至第8周，脫落細(xì)胞以柱狀上皮細(xì)胞為主。圖6A示導(dǎo)入pcDI(對(duì)照)8周后，BALF中少量的上皮細(xì)胞；圖6B示導(dǎo)入pcDI-CKLF1 8周后，BALF中以集落形式脫落的上皮細(xì)胞。
5.CKLF-1對(duì)小鼠氣道基底膜的影響正常情況下，小鼠氣道的光鏡觀察難以見到基底膜。而CKLF-1轉(zhuǎn)入6周后，可見小鼠氣道基底膜增厚。圖7示變形的支氣管，嚴(yán)重受損的上皮。緊貼上皮下的條狀粉紅色均一結(jié)構(gòu)為基底膜。
6.CKLF-1對(duì)小鼠氣道平滑肌的影響光鏡下觀察，正常豚鼠的小支氣管周圍有明顯的平滑肌結(jié)構(gòu)，圍繞支氣管呈環(huán)型排列，而正常小鼠很難見到平滑肌結(jié)構(gòu)。而CKLF-1導(dǎo)入4周后，小鼠支氣管平滑肌細(xì)胞增殖。圖8示變形的支氣管，粗大的氣管粘膜皺折。粘膜下顯著增厚的組織為增殖的平滑肌細(xì)胞。
7.CKLF-1對(duì)小鼠肺組織的影響導(dǎo)入pcDI后2周，對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)無明顯異常(圖9A)；導(dǎo)入pcDI-CKLF1后2周，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺周邊肺泡正常結(jié)構(gòu)消失，肺泡壁增厚，肺泡間隔細(xì)胞聚集增生，肺間質(zhì)充血水腫(圖9B)。
導(dǎo)入CKLF-1后3周，小鼠肺泡壁明顯增厚，大量免疫活性細(xì)胞聚集增生，增多的細(xì)胞有肺泡上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，巨噬細(xì)胞及嗜中性粒細(xì)胞。
Mallory改良染色(可顯示膠原纖維)顯示與對(duì)照組相比(圖10A)，導(dǎo)入CKLF-1后4周，小鼠肺間質(zhì)大量膠原纖維增生(圖10B)。
8.KLF1對(duì)小鼠肺組織血管的影響與對(duì)照組(圖11A)相比，導(dǎo)入CKLF-1后4周小鼠支氣管上皮受損，基底膜增厚。氣管旁肺小血管管壁明顯增厚，膠原蛋白沉積，透明樣變性(圖11B)。
9.CKLF-1對(duì)小鼠肺組織巨噬細(xì)胞的影響苔盼蘭活體注射一定時(shí)間后處死小鼠，取肺標(biāo)本立即固定，常規(guī)切片，鏡下觀察。由圖12A和12B可見肺結(jié)構(gòu)支架及巨噬細(xì)胞吞噬的蘭色顆粒。與對(duì)照相比(圖12A)，導(dǎo)入CKLF-1的小鼠肺中蘭色顆粒明顯增多，表明巨噬細(xì)胞增生聚集。小鼠肺內(nèi)苔盼蘭顆粒不但數(shù)量多且體積大，表明肺組織巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多且活性增強(qiáng)(圖12B)。
10.肺組織CKLF-1表達(dá)的免疫組化分析對(duì)照組小鼠無特異陽性反應(yīng)，血管內(nèi)的黃褐色顆粒為非特異性染色(圖13A)；實(shí)驗(yàn)組小鼠氣道上皮細(xì)胞內(nèi)的黃褐色顆粒為CKLF-1免疫反應(yīng)強(qiáng)陽性，CKLF-1主要表達(dá)在氣道上皮細(xì)胞和上皮下部分間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中，細(xì)胞核內(nèi)無特異免疫反應(yīng)，仍呈蘭色(圖13B)。
上述結(jié)果充分證明CKLF-1導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，直接介導(dǎo)了類似支氣管哮喘氣道粘膜活檢及尸解所見氣道損傷及重塑樣改變。發(fā)明人推測(cè)CKLF-1介導(dǎo)氣道損傷及重塑的機(jī)制在于(1)直接刺激氣道上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等的增殖(直接作用)；(2)作為趨化因子趨化并活化免疫細(xì)胞，活化的免疫細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子，進(jìn)而引起一系列病變(間接作用)。
除引起氣道損傷及重塑樣改變，CKLF-1導(dǎo)入小鼠體內(nèi)尚引起肺泡充血水腫、肺泡壁增厚、肺間質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞聚集活化，肺間質(zhì)膠原沉積，形成纖維化樣改變。因此，CKLF-1還參與了肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生。
此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)(1)嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)未必是哮喘氣道損傷及重塑中不可缺少的因素。已往的研究認(rèn)為Eos浸潤(rùn)是哮喘氣道炎癥的主要特征，本發(fā)明人將CKLF-1導(dǎo)入小鼠體內(nèi)后的2至8周內(nèi)，支氣管肺泡灌洗液始終未見脫落的Eos，支氣管肺組織病理切片亦未見粘膜Eos浸潤(rùn)。這些結(jié)果提示Eos在氣道損傷及重塑中并非不可缺少的因素，僅針對(duì)Eos采取治療措施或許有失偏頗。(2)嗜中性粒細(xì)胞是哮喘發(fā)病中的重要因素。本發(fā)明人證實(shí)了CKLF-1的肺內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞趨化活性，結(jié)合CKLF-1所致肺支氣管病變，認(rèn)為CKLF-1引起的嗜中性粒細(xì)胞聚集活化，在CKLF-1介導(dǎo)的哮喘樣氣道損傷及重塑中具有重要意義。
實(shí)施例3.哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞CKLF-1mRNA的表達(dá)及支氣管粘膜CKLF-1蛋白的檢測(cè)用RT-PCR方法觀察哮喘病人外周血單個(gè)核細(xì)胞CKLF-1mRNA的表達(dá)，用免疫組織化學(xué)方法探測(cè)哮喘病人支氣管粘膜CKLF-1蛋白水平的表達(dá)。以通過臨床研究驗(yàn)證CKLF-1是否參與哮喘的發(fā)病。
1.哮喘病人外周血單個(gè)核細(xì)胞CKLF-1mRNA的表達(dá)(1)實(shí)驗(yàn)對(duì)象支氣管哮喘組男12例，女9例。平均年齡30±7.2歲。入選標(biāo)準(zhǔn)1.符合1997年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)病情輕或中度。2.三周內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素或其它抗炎藥物。3.近期無呼吸道感染。4.皮膚過敏原測(cè)試，兩種以上過敏原陽性。5近期喘息發(fā)作。
正常對(duì)照組21例自愿受試者男11例，女9例，年齡29±8.2歲。無哮喘、過敏性鼻炎及其它過敏疾病，無腫瘤及慢性炎癥疾病。
(2)PCR檢測(cè)CKLF-1的表達(dá)從哮喘患者及健康受試者抽取外周靜脈血3-4毫升，肝素抗凝。外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離方法如前所述。
提取PBMCs細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
以PBMCs逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增引物、反應(yīng)體系及參數(shù)如前所述。
結(jié)果如圖14所示，哮喘患者PBMCs的CKLF-1表達(dá)水平明顯高于健康人。癥狀期哮喘組CKLF-1/β-actin比值顯著高于正常人，分別為0.815±0.103和0.561±0.0862(P＜0.05)(見表6)。
表6.哮喘與對(duì)照PBMC的CKLF-1/β-actin比值X±SD組別 例數(shù) CKLF-1/β-actin哮喘組 21 0.815±0.103※對(duì)照組 21 0.561±0.0862與對(duì)照組相比P＜0.052.哮喘病人支氣管粘膜的病理觀察及CKLF-1的免疫組化分析(1)實(shí)驗(yàn)對(duì)象哮喘組男4例，女4例，平均年齡30±7.2歲。入選標(biāo)準(zhǔn)1.符合1997年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)病情中或重度。2.三周內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素或其它抗炎藥物。3.近期無呼吸道感染排除其它慢性炎癥。4.支氣管鏡檢查的前一天進(jìn)行肺通氣功能和組織胺激發(fā)實(shí)驗(yàn)。
對(duì)照組男4例，女2例，年齡29±8.2歲。無哮喘過敏性鼻炎及其它過敏疾病，無肺部腫瘤及炎癥感染疾病。因肺內(nèi)局部陰影需作支氣管纖維鏡檢查的非哮喘患者。
(2)纖維支氣管鏡檢查囑受試者早晨空腹，術(shù)前半小時(shí)口服安定2.5mg，阿托品0.3mg，術(shù)前30分鐘5％利多卡因2ml+0.5％舒喘寧0.5-1ml混合霧化吸入，2％利多卡因局部噴霧麻醉口咽喉部，術(shù)前用麻黃素和2％利多卡因處理鼻腔，受試者仰臥，吸入氧氣，監(jiān)測(cè)其心率，操作按常規(guī)將支氣管纖維鏡經(jīng)鼻咽腔插入氣管，然后分別在右上葉嵴，右中葉嵴鉗取粘膜組織2-3塊，放入1％多聚甲醛固定液中固定。
(3)病理觀察樣本制備將活檢肺組織即刻放入10％福爾馬林液中固定過夜。70％乙醇2小時(shí)→80％乙醇1小時(shí)→95％乙醇1小時(shí)→95％乙醇1小時(shí)→無水乙醇2小時(shí)→無水乙醇1.5小時(shí)→無水乙醇1.3小時(shí)，進(jìn)行脫水處理。TO生物透明劑(廣西松香廠)依次處理30分鐘、1小時(shí)、30分鐘。50℃低溫浸蠟1小時(shí)。浸蠟后的組織放入60℃石蠟中包埋。4mm連續(xù)切片。HE染色，顯微鏡觀察并攝影。
(4)免疫組化取2張石蠟包埋組織切片，二甲苯脫蠟2次各5分鐘。90％，80％，70％乙醇水化各5分鐘。自來水沖洗2分鐘，蒸餾水漂洗2次。置檸檬酸鈉緩沖液中于微波爐92-98℃加溫1-2分鐘，室溫冷卻。置于3％H2O2漂洗10分鐘。加入50μl過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10分鐘。PBS漂洗5分鐘各3次。加入50μl非免疫性動(dòng)物血清。室溫孵育10分鐘，吸取多余液體。
2張玻片分別加入50μl PBS、CKLF-1單克隆抗體，室溫孵育60分鐘，PBS洗滌3次。加入50μl生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育10分鐘，PBS洗滌3次。加入50μl鏈霉素親和素-過氧化物酶，室溫孵育10分鐘，PBS洗滌3次。加入100μl新配制DAB液，顯微鏡下觀察染色情況，自來水沖洗5分鐘終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染。自來水沖洗，自然干燥，用中性樹膠封片。
結(jié)果1.支氣管粘膜活檢的組織學(xué)觀察(1)對(duì)照組(健康受試者)正常氣道上皮由多種細(xì)胞組成，如假復(fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、基底細(xì)胞等。盡管上皮的多種細(xì)胞排列參差不齊，但所有細(xì)胞均緊貼于基底膜之上，仍為一單層細(xì)胞(假復(fù)層上皮)。靠近頂腔的上皮細(xì)胞緊密相連，形成上皮屏障?；准?xì)胞靠近基底膜表面。杯狀細(xì)胞很少。
(2)實(shí)驗(yàn)組(哮喘患者)
纖維支氣管鏡檢查發(fā)現(xiàn)，8例哮喘患者的氣道粘膜充血水腫，嚴(yán)重者粘膜發(fā)白，支氣管管徑狹窄。2例病人的支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞涂片可見大量氣道上皮細(xì)胞呈片狀脫落。支氣管粘膜活檢顯示患者氣道粘膜主要以淋巴細(xì)胞、Eos浸潤(rùn)為主，氣道上皮細(xì)胞破壞，細(xì)胞外基質(zhì)明顯增多。其中1例患者氣道粘膜無明顯Eos浸潤(rùn)，其氣道上皮層的纖毛細(xì)胞及杯狀細(xì)胞幾乎全部脫落，僅剩少量基底細(xì)胞附于基底膜之上；基底膜顯著增厚，透明樣變性；間質(zhì)中膠原沉積、大量細(xì)胞聚集及平滑肌增生。這些充分表明支氣管哮喘是伴有顯著氣道結(jié)構(gòu)改變的氣道炎癥。
2.支氣管粘膜CKLF-1蛋白表達(dá)的免疫組化分析(1)對(duì)照組(健康受試者)正常對(duì)照上皮纖毛排列整齊形成一完整屏障，未見基底膜結(jié)構(gòu)。CKLF-1免疫反應(yīng)呈陰性，無特異性顯色(圖15A)。
(2)實(shí)驗(yàn)組(哮喘患者)蛋白免疫組化分析顯示CKLF-1mRNA在患者PBMCs(包括單個(gè)核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，以淋巴細(xì)胞為主)高表達(dá)。8例中的5例患者部分上皮細(xì)胞及上皮下間質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)呈陽性。其中1例重癥患者的陽性反應(yīng)最為明顯(圖15B)。
根據(jù)上述結(jié)果，認(rèn)為哮喘患者在細(xì)胞水平上至少有淋巴細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞、上皮下間質(zhì)的成纖維細(xì)胞及巨噬細(xì)胞處于活化狀態(tài)，因而使CKLF-1表達(dá)水平增高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示哮喘患者尤其重癥患者的氣道上皮及上皮下間質(zhì)均有高水平CKLF-1蛋白表達(dá)，推測(cè)CKLF-1有加強(qiáng)間質(zhì)及平滑肌增殖的作用。作為氣道門戶的上皮細(xì)胞最早接受環(huán)境因素的刺激，由此激活上皮下成纖維細(xì)胞，啟動(dòng)逐級(jí)放大的瀑布樣炎癥鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及炎癥損傷后的修復(fù)反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種體外檢測(cè)方法，包括檢測(cè)來自宿主的樣品中趨化素樣因子-1的過量表達(dá)，確定樣品炎性損傷的病理狀態(tài)。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中所述炎性損傷是支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中所述來自宿主的樣品是人外周血細(xì)胞、肺手術(shù)切除組織、肺支氣管粘膜組織。
4.一種制作器官炎性損傷的動(dòng)物模型的方法，包括將趨化素樣因子-1導(dǎo)入除人類之外的哺乳動(dòng)物體內(nèi)。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中所述炎性損傷是支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中采用注射的方法將趨化素樣因子-1導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)。
7.如權(quán)利要求5的方法，其中采用霧化吸入的方法將趨化素樣因子-1導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)。
8.如權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是小鼠。
9.趨化素樣因子-1在制備具有治療器官炎性損傷作用的抗體和拮抗劑中的用途。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中所述炎性損傷是支氣管哮喘氣道炎性損傷及重塑和肺纖維化。
全文摘要
本發(fā)明公開了趨化素樣因子－1在檢測(cè)樣品炎性損傷的病理狀態(tài)、制作器官炎性損傷的動(dòng)物模型、制備具有治療器官炎性損傷的CKLF－1抗體和拮抗劑中的用途，尤其是在支氣管哮喘氣道損傷及重塑和肺纖維化中的用途。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1420358SQ0113996
公開日2003年5月28日 申請(qǐng)日期2001年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月21日
發(fā)明者鐘南山, 譚亞夏, 馬大龍, 韓文玲, 宋泉聲, 陳英玉 申請(qǐng)人:廣州呼吸疾病研究所, 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部