專利名稱：：穿心蓮內(nèi)酯衍生物在制備抗hiv藥物中的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及穿心蓮內(nèi)酯衍生物的醫(yī)藥用途，具體是指穿心蓮內(nèi)酯衍生物在制備抗HIV藥物中用途，屬于藥物化學領域。
背景技術：
：艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)，是一種由人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)引起的，以全身免疫系統(tǒng)嚴重損害為特征的傳染性疾病。迄今仍無艾滋病疫苗問世，抗HIV藥物依然是艾滋病防治的主要手段。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highlyactiveantiretroviraltherapy,HAART)是目前臨床廣泛使用的治療艾滋病的方法，但此種療法價格昂貴，毒副作用大，不能徹底清除人體內(nèi)的HIV，而且易引起病毒產(chǎn)生變異性和耐藥性。因此，尋找具有新的作用靶點、抗耐藥，且價格低、療效佳、毒性小的新型藥物已成為目前抗HIV藥物研究的趨勢。傳統(tǒng)中藥和藥用植物來源的天然化合物具有結構多樣性、毒性較低、來源廣泛等特點，可能具有與現(xiàn)有藥物不同的抗HIV機制，因而在防治艾滋病方面有著獨特的優(yōu)勢和巨大的潛力。[張旋，黃寧，鄭永唐，我國中藥來源的抗HIV天然化合物研究進展[J].藥學學報，2010，45(2)141-153.]穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide)為爵床科植物穿心蓮Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees的主要有效成分之一。具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、降血糖等廣泛的生理活性，臨床上主要用于治療上呼吸道感染等疾病。隨著對穿心蓮內(nèi)酯藥理作用研究的不斷深入，其在免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤和抗HIV等方面顯示了誘人的應用前景。[李晶，黃文龍，張惠斌等，穿心蓮內(nèi)酯酰胺類衍生物的合成及其cox-2表達抑制活性[J].中國藥科大學學報，2007，38(04)299-304.；Jackman，R.W.，M.G.Rhoads，E.Cornwell,etal.,Microtubule-MediatedNF-KbActivationintheTNF-αSignalingPathway[J].ExperimentalCellResearch,2009,315(19)3242-3249.；Madav,S.,H.Tripathi,Tandan,etal.,Analgesic,AntipyreticandAntiulcerogenicEffectsofAndrographolide[J].IndianJ.Pharm.Sci,1995,57(3)121-125.；Roy,S.,K.Rao,C.Bhuvaneswari,etal.,PhytochemicalAnalysisofAndrographisPaniculataExtractandItsAntimicrobialActivity[J]·WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology,2010,26(1)85-91.；DeutschlanderM.S.,M.vandeVenter,S.Roux,etal.,HypoglycaemicActivityofFourPlantExtractsTraditionallyUsedinSouthAfricaforDiabetes[J].JournalofEthnopharmacology,2009,124(3):619-624.；Farinacci,Μ.,Μ.Colitti,S.Sgorlon,etal.,ImmunomodulatoryActivityofPlantResiduesonOvineNeutrophils[J].VeterinaryImmunologyandImmunopathology，2008，126(1-2)54-63.；Chen,J-X.，H-J.Xue,ff-C.Ye,etal.，ActivityofAndrographolideandItsDerivativesagainstInfluenzaVirusinVivoandinVitro[J].Biol.Pharm.Bull.,2009,32(8)1385-1391.；Shi,M-D.,H-H.Lin,T-A.Chiang,etal.,AndrographolideCouldInhibitHumanColorectalCarcinomaLovoCellsMigrationandInvasionViaDown-RegulationofMmp-7Expression[J].Chemico-BiologicalInteractions,2009,180(3)344-352.；Ding,Y.,L.Zhang,J.S.Goodwin,etal.,PlectinregulatesthesignalingandtraffickingoftheHIV-lco-receptorCXCR4andplaysaroleinHIV-Iinfection[J].ExperimentalCellResearch,2008,314(3)=590-602.；戴桂馥，王俊峰，何帥偉，等.穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物的藥理活性研究進展.中成藥，2006，28(7)1032-1035.]文獻報道穿心蓮內(nèi)酯具有抗HIV活性[S.HoltandL.Comae.MiracleHerbsHowHerbsCombinewithModernMedicinetoTreatCancer,HeartDisease,AIDS,andMore.CaroPublishingGroup,1998.；N.Srinivas,R.Sriram,P.Sairam,P.SunilKumar,B.KochunarayanaandC.Rajan.Compoundshavinganti-tumaractivity:processfortherepreparationandpharmaceuticalscompositioncontainthem.PCT,Int.App1.,WO01/57026A1,2001],Venkateswarlu等從中藥穿心蓮中分離得到到1個新的二萜二聚體雙穿心蓮內(nèi)酯醚以及4個已知的二萜化合物和2個已知的黃酮類化合物。對分離得到的所有化合物均進行了抗HIV活性的檢測，結果顯示穿心蓮內(nèi)酯和14-脫氧-11，12-二脫氫穿心蓮內(nèi)酯具有顯著的抗HIV活性，EC50分別為49.Oμg/mL和56.8μg/mL,但均低于抗HIV藥物AZT的活性(EC5tl為20ng/mL)。[Reddy，V.L.N.，S.Μ.Reddy，V.Ravikanth,etal.，AnewBIS—AndrographolideEtherfromAndrographispaniculataNeesandevaluationofanti-HIVactivity[J].NaturalProductResearchFormerIyNaturalProductLetters,2005，19(3):223-230.]現(xiàn)有文獻中未見有關穿心蓮內(nèi)酯衍生物具有抗HIV活性的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供穿心蓮內(nèi)酯衍生物在制備抗HIV藥物中的應用。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，根據(jù)SFDA“抗HIV藥物非臨床藥效學研究技術指導原則(2006)”采用國際通用實驗方法對穿心蓮內(nèi)酯衍生物的抗HIV-I活性進行檢測，研究證實穿心蓮內(nèi)酯衍生物具有抗HIV活性，可以用于制備抗HIV藥物。本發(fā)明中涉及的穿心蓮內(nèi)酯衍生物為以下化合物^OR1HO^A1_4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>A112-0-苯甲酰-14-脫氧穿心蓮內(nèi)酯A212-0-對硝基苯甲酰-14-脫氧穿心蓮內(nèi)酯A3:12-0-(3，4_亞甲二氧基肉桂酰)-14_脫氧穿心蓮內(nèi)酯A412-0-(3,4-亞甲二氧基_6_硝基苯甲酰)_14_脫氧穿心蓮內(nèi)酯其化合物的制備方法已在本研究前期申請的發(fā)明專利CN=200710019983.3中公Jf,同時可以:Li,J.，W.Huang,H.Zhang,etal.，SynthesisofandrographolidederivativesandtheirTNF-αandIL_6expressioninhibitoryactivities[J].Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,2007,17(24):6891_6894.。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>B1:3_肟脫水穿心蓮內(nèi)酯B2:3-0-對氯苯甲酰肟脫水穿心蓮內(nèi)酯其化合物的制備方法已在本研究前期申請的發(fā)明專利CN=200710019983.3中公開。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>C1:12，13-二氫穿心蓮內(nèi)酰胺C1:3-N-甲基-12，13-二氫穿心蓮內(nèi)酰胺其化合物的制備方法己在本研究前期申請的發(fā)明專利CN=200710019983.3中公開，還可以參考李晶，黃文龍，張惠斌等，穿心蓮內(nèi)酯酰胺類衍生物的合成及其C0X-2表達抑制活性[J]·中國藥科大學學報，2007，38(04)=299-304.。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>D1:3，19-二-O-乙酰異穿心蓮內(nèi)酯D2:3，19-二-O-丙酰異穿心蓮內(nèi)酯D3:3，19-二-O-己酰異穿心蓮內(nèi)酯D4:3，19-二-O-苯甲酰異穿心蓮內(nèi)酯D5:19-0_苯甲酰異穿心蓮內(nèi)酯D6:19-0_三苯甲基異穿心蓮內(nèi)酯D73-0-乙酰異穿心蓮內(nèi)酯D83-0-丙酰異穿心蓮內(nèi)酯D93-0-己酰異穿心蓮內(nèi)酯Dltl:3，19-二-0-(2-(6-甲氧基萘基)丙酰)異穿心蓮內(nèi)酯D11:3，19_二-0-(2-(4-苯甲?；交?丙酰)異穿心蓮內(nèi)酯D12:3，19-二-0-(4-N_(2，6-二氯苯胺)苯乙酰)異穿心蓮內(nèi)酯D13:3，19-二-0-(2-乙酰氧基苯甲酰)異穿心蓮內(nèi)酯其化合物的制備方法已在本研究前期申請的發(fā)明專利CN=200710019984.8中公開，可以:Li,J.，W.Huang,H.Zhang,etal.，SynthesisofandrographolidederivativesandtheirTNF-αandIL_6expressioninhibitoryactivities[J].Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,2007,17(24):6891_6894.。根據(jù)SFDA“抗HIV藥物非臨床藥效學研究技術指導原則(2006)”采用國際通用實驗方法對穿心蓮內(nèi)酯衍生物的抗HIV-I活性進行檢測，結果顯示穿心蓮內(nèi)酯衍生物具有較好的抗HIV活性，具有繼續(xù)開發(fā)的潛力。具體實施例方式通過藥理實驗，詳細說明穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物的抗HIV活性。實施例1穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物的細胞毒性實驗和致細胞病變抑制實驗I.材料和方法一、測定藥物和化合物待測樣品穿心蓮內(nèi)酯及衍生物1_22#。陽性對照化合物疊氮胸苷(3，-Azido-3，-deoxythymidine,AZT)購自Sigma公司。待測樣品溶解于DMSO中，貯存液濃度為25mg/ml，儲存條件為4°C;AZT溶解于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，0.22μm濾膜過濾除菌，分裝后_20°C保存。二、試劑和溶液(1)試劑HEPES(N-2(2-Hydroxyothyl)piperazine-N'-(2-ethanesufonicacid)>MTT(3,(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)>DMF(N,N，-Dimethylformamine)、青霉素(Penicillin)、硫酸鏈霉素(Streptomycinsulfate)>谷氨酰胺(Glutamine)均購自Sigma公司；2-巰基乙醇(2-ME，2-Mercaptoethanol)為Bio-Rad公司產(chǎn)品。RPMI-1640和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。(2)培養(yǎng)基RPMI-1640完全培養(yǎng)基，含有10%胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，IOmMHEPES,50μΜ2-巰基乙醇，100，000IU青霉素，100μg/ml鏈霉素。三、細胞和病毒人T淋巴細胞系C8166、HIV-I實驗株HIV-Iiiib均由英國MedicalResearchCouncil,AIDSReagentProject惠贈。所有細胞和病毒均以含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。按常規(guī)方法制備HIV-Iiiib，滴定并計算出病毒的TCID5tlt5病毒貯存液分裝后，置-70°C保存。細胞和病毒按常規(guī)方法凍存和復蘇。四、HIV-I感染性滴定HIV-Iiiib按Johnson&Byington(1990)所述方法改良進行滴定，簡述如下將HIV-I貯存液在96孔板上作4倍稀釋，10個梯度，每梯度6個重復孔，同時設置對照孔6孔。每孔加入C8166細胞50μ1，每孔終體積為200μ1。37°C，5%CO2培養(yǎng)。第3天補加新鮮RPMI-1640完全培養(yǎng)基100μ1，第7天在倒置顯微鏡下觀察每孔中HIV-I誘導的細胞病變效應(CytopathicEffect，CPE)，以每孔是否有合胞體(Syncytium)的形成確定；按Reed&Muench方法計算病毒的TCID5tl(50%TissueCultureInfectionDose)。五、對C8166細胞的毒性實驗4XlOVmlC8166細胞懸液100μ1與不同的待測藥物溶液混合，設3個重復孔。同時設置不含藥物的對照孔，37°C，5%CO2培養(yǎng)3天，采用MTT比色法檢測細胞毒性。ELx800酶標儀測定OD值，測定波長為595nm，參考波長為630nm。計算得到CC5tl值(50%CytotoxicConcentration)，即對50%的正常T淋巴細胞系C8166產(chǎn)生毒性時的藥物濃度。六、對HIV-Iiiib致細胞病變(CPE)的抑制實驗將8X105/mlC8166細胞50μ1/孔接種到含有100μ1/孔梯度倍比稀釋藥物的96孔細胞培養(yǎng)板上，然后加入50μ1的HIV-Iiiib稀釋上清，1300TCID50/孔。設3個重復孔。同時設置不含藥物的正常細胞對照孔。AZT為陽性藥物對照。37°C，5%C02培養(yǎng)3天，倒置顯微鏡下(100X)計數(shù)合胞體的形成。EC5tl(50%EffectiveConcentration)為抑制合胞體形成50%時的藥物濃度。II.藥理活性數(shù)據(jù)表1.穿心蓮內(nèi)酯及衍生物體外細胞毒性和抗HIV-I活性結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>蓮內(nèi)致細胞病變抑制epEQ7250819酯實驗_.細胞毒性實驗MTT2.682.7432A1致細胞病變抑制CPE09490.5222^"5'25實驗細胞毒性實驗MTT2.482.2373A2致細胞病變抑制cPE06922.232⑶0-3·58實驗細胞毐性實驗MTT2.712.232.4A3致細胞病變抑制CPE10950.4822·47"4·63實驗.細胞毒性實驗MTT2.712.4665A4.致細胞病變抻制CPE06100.648⑶1"4·44實驗細胞毒性實驗MTT>200>2006B1.致細胞病變抑制CPE17.06111.188⑷·723實驗細胞毒性實驗MTT21.2112.317762致細胞病變抑制ePE1066410.554彳.17-1."實驗細胞毒性實驗MTT>200>2008C1致細胞病變抑制cpE>200>200.實驗細胞毒性實驗MTT59.7253.9299C2致細胞病變抑制428212·59"12·67實驗..‘細胞毒性實驗MTT128.0265.5361001致細胞病變抑制CPE9704149.087^1·34實驗細胞毒性實驗MTT37.38126.53711D2致細胞病變抑制1729920.8581^"2'16實驗’細胞毒性實驗Μπ44.75137.27712D3致細胞病變抑制323944028.47-13.82實驗’細胞毒性實驗MTT138.11962.773.13D4致細胞病變抑制4776284822_Q4_28·91實驗‘細胞毒性實驗MTT158.006158.2021405.致細胞病變抑制cpE92130111.169^^^實驗_細胞毒性實驗MTT4.4322.98115D6致細胞病變抑制cpEQ67212842_32_6·60實驗’16D7細胞毒性實驗MTT168.807124.3471.27-2.64■致細胞病變抑制CPE63.93298.020實驗細胞毒性實驗MTT126.917104.31317D8致細朐病變抑偉(I1.23-2.95^mmm^tmicpE43.06084.651實驗細胞毒性實驗MTT23.72434.3741809致細胞實病驗變抑制CPE3.5194.0486^8'49細胞毒性實驗MTT>200>20019°10致細胞、病脅變抑制CPE44.38577.754>2.57.買驗細胞毒性實驗MTT100.013170.11820011致細H變抑制CPE20.31217.5234^"971.實驗細胞毒性實驗MTT>200>20021D12致細胞病變抑制>1-68CPE101.816118.954t頭驗細胞毒性實驗MTT>200>20022D13致細胞病變抑制>33·19實驗CPE25775237細胞毒性實驗MTT137123AZT致細胞病變抑制274200_實驗CPE_^5_通過對以上化合物的活性篩選，發(fā)現(xiàn)B1,C2,D3,D4及D13的TI值大于10，具有一定的體外抗HIV-I活性；其中D13有較高的體外抗HIV-I活性，TI值>33.19，具有繼續(xù)開發(fā)的潛力，為幵發(fā)抗HIV藥物提供了新的藥物途徑，擴大了臨床用藥的選擇范圍，對充分利用和發(fā)掘穿心蓮資源具有重要意義。權利要求下列任一化合物的醫(yī)藥用途，其特征在于將其應用于制備抗HIV藥物A112-O-苯甲酰-14-脫氧穿心蓮內(nèi)酯A212-O-對硝基苯甲酰-14-脫氧穿心蓮內(nèi)酯A312-O-(3，4-亞甲二氧基肉桂酰)-14-脫氧穿心蓮內(nèi)酯A412-O-(3，4-亞甲二氧基-6-硝基苯甲酰)-14-脫氧穿心蓮內(nèi)酯B13-肟脫水穿心蓮內(nèi)酯B23-O-對氯苯甲酰肟脫水穿心蓮內(nèi)酯C112，13-二氫穿心蓮內(nèi)酰胺C13-N-甲基-12，13-二氫穿心蓮內(nèi)酰胺D13，19-二-O-乙酰異穿心蓮內(nèi)酯D23，19-二-O-丙酰異穿心蓮內(nèi)酯D33，19-二-O-己酰異穿心蓮內(nèi)酯D43，19-二-O-苯甲酰異穿心蓮內(nèi)酯D519-O-苯甲酰異穿心蓮內(nèi)酯D619-O-三苯甲基異穿心蓮內(nèi)酯D73-O-乙酰異穿心蓮內(nèi)酯D83-O-丙酰異穿心蓮內(nèi)酯D93-O-己酰異穿心蓮內(nèi)酯D103，19-二-O-(2-(6-甲氧基萘基)丙酰)異穿心蓮內(nèi)酯D113，19-二-O-(2-(4-苯甲?；交?丙酰)異穿心蓮內(nèi)酯D123，19-二-O-(4-N-(2，6-二氯苯胺)苯乙酰)異穿心蓮內(nèi)酯D133，19-二-O-(2-乙酰氧基苯甲酰)異穿心蓮內(nèi)酯。全文摘要本發(fā)明涉及穿心蓮內(nèi)酯衍生物A1-4，B1-2，C1-2和D1-13在制備抗HIV藥物中的應用。文檔編號A61K31/4015GK101829110SQ20101017795公開日2010年9月15日申請日期2010年5月20日優(yōu)先權日2010年5月20日發(fā)明者張惠斌,李晶,王彬,羅榮華,鄭永唐,錢海,黃文龍申請人:中國藥科大學