專利名稱：一種h9n2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法及產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法及產(chǎn)品，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
通常禽源病毒繁殖主要采用雞胚繁殖法和細胞培養(yǎng)法，而禽流感病毒因無法直接在細胞中生產(chǎn)繁殖，仍然采用雞胚繁殖法，通過將病毒接種在雞胚基質(zhì)中，在雞胚生長過程中，病毒復制，達到大量生產(chǎn)病毒的目的，是一種類似于自然生物環(huán)境條件下繁殖病毒的方法。雞胚繁殖法簡單易行，不需對病毒進行處理、馴化，分離毒可直接接種雞胚。但生產(chǎn)需要大量雞胚，收獲病毒液后，需對剩余雞胚進行無害化處理，且易于感染禽源外源病毒，產(chǎn)生生物安全隱患。
病毒繁殖的另一種常用的方法是細胞繁殖法，將病毒接種于已擴增的動物細胞內(nèi)，保持細胞活性，通過病毒在細胞間的不斷感染和復制，來達到大量擴增病毒的目的。但禽流感病毒直接接種細胞不能感染、增殖。隨著研究的深入開展，在二十世紀90年代有研究人員發(fā)現(xiàn)在繁殖禽流感病毒時，加入適量的胰酶有助于病毒的增殖，但病毒滴度無法達到生產(chǎn)要求。然而，在生產(chǎn)病毒時，大量、高密度生長良好的細胞是生產(chǎn)高滴度病毒的前提，因此如何解決這一矛盾是細胞培養(yǎng)禽流感病毒成功的關(guān)鍵。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于解決禽流感病毒細胞繁殖難，而目前禽流感生產(chǎn)大量使用雞胚又常常導致生物安全隱患的問題，提供一種安全連續(xù)封閉式細胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)的方法及產(chǎn)品，使該疫苗的生產(chǎn)能夠不再依賴雞胚繁殖而降低生物安全隱患，同時使用該細胞培養(yǎng)方法也能生產(chǎn)出高滴度的病毒，滿足免疫生產(chǎn)要求，在發(fā)生疫情時，能夠快速提供疫苗。
本發(fā)明將通過以下技術(shù)方案實現(xiàn) 一、一種H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟 (1)病毒適應細胞系MDCK細胞的馴化 將病毒適應細胞系MDCK細胞進行無載體培養(yǎng)的馴化，改變其貼壁生長的特性，使其適應全懸浮培養(yǎng)的生長環(huán)境； 其中，所述的無載體培養(yǎng)馴化方法為將復蘇后經(jīng)2～3代貼壁培養(yǎng)的MDCK細胞胰酶消化后，按2×105cells/mL密度加入三角搖瓶，采用含8～10％血清的F-DMEM培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)，PH 7.1～7.5，40～48小時后，待細胞密度達1～5×106cells/mL時，分瓶傳代，同時觀察細胞形態(tài)，每次傳代選取細胞形態(tài)良好的搖瓶分瓶傳代，按上述方法搖床培養(yǎng)，連傳43代，分裝，液氮凍存； (2)MDCK細胞的初級擴增培養(yǎng) 將馴化完成的MDCK細胞向細胞培養(yǎng)生物反應器中接種1～5×105cells/mL的細胞，懸浮培養(yǎng)，直至擴增至0.3～1×107cells/mL，實現(xiàn)細胞初級擴增培養(yǎng)； 其中，所述的培養(yǎng)基為含6～10％血清的F-DMEM培養(yǎng)基； 所述的培養(yǎng)條件為溶氧20～60％、PH值7.0～7.4、溫度35～38℃、初級流加速率6L/天，穩(wěn)定后流加速率3L/天； (3)病毒適應細胞的連續(xù)培養(yǎng) 初級擴增培養(yǎng)結(jié)束后，在上述細胞培養(yǎng)生物反應器中流加新鮮培養(yǎng)基和泵出細胞懸浮液，以維持生物反應器穩(wěn)定的同時，保證細胞在反應器中停留時間內(nèi)擴增至0.3～1×107cells/mL，實現(xiàn)細胞連續(xù)培養(yǎng)； 其中，所述的培養(yǎng)基為流加培養(yǎng)基為懸浮MDCK的無血清NF-DMEM培養(yǎng)基； 所述的培養(yǎng)條件為溶氧30～60％、PH值7.0～7.4、溫度35～38℃、流加速率3L/天； (4)接種病毒培養(yǎng)制備病毒液 將馴化的已適應細胞繁殖的H9N2亞型禽流感分離株JY株病毒接種于懸浮細胞，改變培養(yǎng)因素，隨著細胞懸浮液的不斷流入和病毒上清液以同樣速度的不斷流出，在維持系統(tǒng)動態(tài)平衡的過程中實現(xiàn)病毒的連續(xù)增殖，使病毒適應在懸浮培養(yǎng)細胞中擴增病毒含量≥107TCID50/mL，即血凝價HA≥28； 其中，所述的改變的培養(yǎng)因素為溶氧40～60％、PH值7.0～7.2、溫度32～36℃、流加培養(yǎng)基為懸浮MDCK的含1.2～1.6μg/mL胰酶無血清培養(yǎng)基、流加速率2L/天； (5)病毒濃縮、滅活及制成疫苗產(chǎn)品 其中，病毒液的濃縮及滅活方法為 收集步驟(4)得到的病毒液，預處理后經(jīng)30KD截流分子量的膜包濃縮至病毒HA血凝效價≥29時，停止?jié)饪s，采用甲醛溶液滅活，使滅活劑終濃度為0.1％，37℃滅活16小時； 其中，滅活疫苗的制備 油相制備取注射用白油94份，加硬脂酸鋁1份，邊加邊攪拌，直到完全透明為止，再加入司本-806份，混合后，高壓滅菌備用； 水相制備取濃縮后滅活的病毒液96份，加入滅菌的吐溫-804份，充分搖動，直到吐溫-80完全溶解； 乳化取油相3份置于乳化罐中，攪拌的同時緩慢加入水相1份，持續(xù)攪拌30～60分鐘，攪拌速度800r/min，后通過剪切機2次剪切，剪切速度4000r/min，即制成禽流感(H9亞型JY株)滅活疫苗； 檢測取樣5～10mL，以3000r/min離心15分鐘，如有分層現(xiàn)象，應重復乳化1次。
二、根據(jù)本發(fā)明所述的H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法制得的疫苗產(chǎn)品。
本發(fā)明的有益效果在于 本發(fā)明的技術(shù)方案首先避免采用目前禽流感生產(chǎn)大量使用雞胚的病毒繁殖方法，既避免了生物安全隱患的問題，又克服了疫苗的大量生產(chǎn)受制于雞胚的供應；其次，本發(fā)明提供一種安全連續(xù)的封閉式細胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)的方法，用于H9N2亞型禽流感病毒滅活疫苗的制備，使得不僅能使用細胞培養(yǎng)方法，也能同時生產(chǎn)出高滴度的病毒，滿足免疫生產(chǎn)要求；最后，由于本發(fā)明所述的疫苗的生產(chǎn)方法簡單快速，因此能在發(fā)生疫情時快速提供疫苗。

具體實施例方式 實施例1 本實施例說明本發(fā)明所述的H9N2亞型禽流感分離株JY株的病毒適應細胞系的篩選方法和病毒適應細胞系的最終確定方法。
一、篩選 本發(fā)明所述的H9N2亞型禽流感分離株JY株購自中國農(nóng)科院家禽研究所，毒株代號A型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/Jiangsu/JY/99(H9N2)株，簡稱JY株。
本發(fā)明所述的用于篩選的待選病毒適應細胞為 MDCK(犬腎細胞)，購自揚州大學農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點開放實驗室； VERO(非洲綠猴腎細胞)，購自上海交通大學藥學院。
(1)將H9N2亞型禽流感分離株JY株接種于MDCK細胞，在Ax Cevir-MDCK無血清培養(yǎng)基中控制培養(yǎng)條件為PH值7.0～7.4、溫度32～36℃、胰酶濃度1.0～2.0μg/mL，細胞代次不超過51代，病毒代次不超過12代，測定病毒繁殖滴度達到≥107.0TCID50/mL、HA血凝價≥28以使得病毒毒株適應細胞，確定培養(yǎng)條件為PH值7.0～7.2、溫度33±1℃、胰酶濃度1.1～1.6μg/mL； (2)或者，將H9N2亞型禽流感分離株JY株接種于VERO細胞，在NCTC135培養(yǎng)基中控制培養(yǎng)條件為PH值7.0～7.4、溫度32～38℃、胰酶濃度1.0～2.0μg/mL，細胞代次不超過51代，病毒代次不超過12代，測定病毒繁殖滴度達到≥107.0TCID50/mL、HA血凝價≥28以使得病毒毒株適應細胞，確定培養(yǎng)條件為PH值7.0～7.2、溫度33±1℃、胰酶濃度1.2～1.5μg/mL。
二、細胞的選定 將H9N2亞型禽流感分離株JY株在實施例1中的細胞系上于(1)對應的適宜的培養(yǎng)條件下不斷傳代15次，傳代培養(yǎng)方法分為細胞培養(yǎng)和病毒增殖兩階段 細胞培養(yǎng)階段選用含6～10％血清的DMEM培養(yǎng)基，PH值7.0～7.4、培養(yǎng)溫度36.5±1℃、培養(yǎng)時間36～48小時； 病毒增殖階段采用含少量胰酶的無血清Ax Cevir-MDCK培養(yǎng)基，PH值7.0～7.4、培養(yǎng)溫度33±1℃、培養(yǎng)時間24～96小時。
傳代結(jié)束后，同時對下述病毒特性進行鑒定 (1)鑒定病毒的特異性 用滅菌生理鹽水將毒種稀釋成含4HA單位的抗原液，分別與ND、EDS、H5亞型禽流感、H7亞型禽流感陽性血清，SPF雞血清和H9亞型禽流感陽性血清作HI試驗，毒種對H9亞型禽流感陽性血清應為陽性，對ND等其它陽性血清及SPF雞血清均應為陰性。
(2)鑒定免疫原性 將收獲的細胞毒液，經(jīng)甲醛溶液滅活后，加油佐劑制成油包水型滅活疫苗(具體方法參見實施例5)，按以下方法進行檢驗 首先，從山東SPF雞場購買SPF蛋，在相對隔離的條件下孵化，隔離器飼養(yǎng)。
血清學方法用21～28日齡SPF雞15只，10只各頸部皮下或肌肉注射疫苗0.2mL，另5只作對照。接種后21～28日，每只雞各采血，分離血清，用禽流感病毒H9亞型抗原測定HI抗體。免疫組HI抗體效價的幾何平均值應不小于7log2，對照組HI抗體效價的幾何平均值應不大于2log2。
其中，A、禽流感(H9亞型)血凝抑制試驗抗原制造及檢驗標準為 a、抗原制造 病毒繁殖取A型禽流感病毒A/Chicken/Jiangsu/JY/99(H9N2)株生產(chǎn)用毒種，用SPF雞胚繁殖病毒，收獲雞胚液。
滅活取含毒雞胚液，加入10％甲醛溶液，使其終濃度均為0.1％，37℃滅活16小時。
配制滅活后的雞胚液，加入滅菌甘油25％，充分混勻，定量分裝，保存于2～8℃。
b、檢驗 性狀白色或淡黃色液體。
無菌檢驗按《中國獸藥典》進行，應無菌生長。
效價測定按瓶簽標明的量用滅菌生理鹽水進行稀釋，用微量法測定HA效價，應≥7.0log2。
特異性檢驗分別與ND、EDS76、H5亞型禽流感、H7亞型禽流感陽性血清，SPF雞血清和H9亞型禽流感陽性血清作HI試驗，抗原對H9亞型禽流感陽性血清應為陽性，對ND等其他陽性血清及SPF雞血清應為陰性。
B、禽流感(H9亞型)血凝抑制(HI)試驗操作術(shù)方法為 a、取微量反應板，分別向1～11孔中加入0.025mL生理鹽水，第12孔中加入0.05mL生理鹽水。
b、吸取0.025mL血清，加至第一孔內(nèi)，充分混勻后，吸取0.025mL至第2孔，依次2倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL，棄去。
c、分別向1～11孔中加入含4HA單位的抗原0.025mL，室溫下靜置30～40分鐘。
d、每孔中加入0.025mL 1％(V/V)雞紅細胞懸液，輕輕混勻，室溫下靜置30～40分鐘。對照紅細胞將呈顯著紐扣狀。
e、結(jié)果判定將反應板傾斜后判定結(jié)果。當陰性對照血清HI≤2log2、陽性對照血清HI效價與已知結(jié)果相比，誤差≤1log2時，試驗方可成立。以完全抑止4HA單位抗原的血清最高稀釋度作為HI效價。
免疫攻毒法用21～28日齡SPF雞15只，10只各頸部皮下或肌肉注射疫苗0.2mL，另5只作對照。接種后21～28日，用1∶10稀釋的AIV JY毒種進行翅靜脈注射，每只雞0.2mL。攻毒后第5日，分別采集每只雞的泄殖腔拭子，每個樣品經(jīng)尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚5枚，每胚0.2mL，孵育觀察5日，逐胚測定雞胚液的HA效價。每個樣品接種的5枚雞胚中只要有1枚雞胚胚液的HA效價≥1∶16(微量法)，即可判為病毒分離陽性。對病毒分離陰性的樣品，應盲傳1次后再進行判定。免疫組應至少有9只雞病毒分離陰性，對照組應至少有4只雞病毒分離陽性。
(3)鑒定毒力 對雞胚的毒力用滅菌生理鹽水將毒種作1∶10000稀釋，尿囊腔內(nèi)接種9～11日齡SPF雞胚20枚，每胚0.1mL(約103.0EID50)，接種后24～96小時內(nèi)，應至少有18個雞胚死亡。剖檢觀察，死亡雞胚應出現(xiàn)全身出血、明顯水腫、肝臟壞死等病變。
對雛雞的毒力用滅菌生理鹽水將毒種作1∶10稀釋，翅靜脈接種4～8周齡SPF雞10只，每只雞0.2mL，接種后觀察10日，雞只應不出現(xiàn)死亡或明顯異常反應但有個別雞出現(xiàn)輕微的呼吸道癥狀。接毒后第5日，采集泄殖腔拭子，用9～11日齡SPF雞胚分離病毒，至少9只病毒分離陽性。
(4)進行基因序列分析 引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank登錄的H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/1/94株的HA基因序列(登錄號AF156380)和NA基因序列(登錄號AF156398)設(shè)計2對引物，分別擴增細胞化JY株病毒的HA基因和NA基因部分編碼區(qū)。
HA15’-atggaaacaatatcactaataa-3’ HA25’-aagatccattggacatggccca-3’ NA15’-atgaatccaaatcagaagataata-3’ NA25’-tatagccatgaaattgatattcgc-3’ 細胞化JY株的HA和NA基因編碼區(qū)的擴增及克隆病毒RNA的提取如J.薩姆布魯克等人著的《分子克隆實驗指南》所述步驟進行。經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄后進行PCR擴增。反應條件為94℃變性40s，48℃退火1min，72℃延伸1min；運行5個循環(huán)后，繼續(xù)按下列條件運行94℃變性40s，52℃退火1min，72℃延伸1min；運行30個循環(huán)后，72℃延伸10min，4℃運行10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定，用核酸純化試劑盒回收獲得目的片斷，并克隆到pMD18-T載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pT-HA和pT-NA。
細胞化JY株的HA和NA基因編碼區(qū)核苷酸測序?qū)⒔?jīng)過鑒定的陽性質(zhì)粒pT-HA和pT-NA進行測序，測得的序列與與原胚毒化的JY株的HA和NA序列進行比較，并與GenBank上的4株H9N2亞型和5株H5N1亞型禽流感病毒的HA和NA序列進行同源性比較，確定該細胞化JY株病毒的基因序列是否發(fā)生改變。
上述鑒定和分析結(jié)束后的結(jié)果證明，實施例1所述(1)的細胞系培養(yǎng)的病毒與原分離毒株在特異性、毒力、免疫原性方面與原毒株沒有發(fā)生明顯改變，即確定采用細胞系為MDCK細胞。
實施例2 本實施例說明經(jīng)實施例1確定的病毒適應細胞系MDCK細胞的馴化方法。
將病毒適應細胞系MDCK細胞進行無載體培養(yǎng)的馴化，改變其貼壁生長的特性，使其適應全懸浮培養(yǎng)的生長環(huán)境 將復蘇后經(jīng)2～3代貼壁培養(yǎng)的MDCK細胞胰酶消化后，按2×105cells/mL密度加入三角搖瓶，采用含8～10％血清的F-DMEM培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)，PH 7.5～7.1，40～48小時后，待細胞密度達1～2×106cells/mL時，分瓶傳代，同時觀察細胞形態(tài)，每次傳代選取細胞形態(tài)良好的搖瓶分瓶傳代，按上述方法搖床培養(yǎng)，連傳43代，分裝，液氮凍存。
實施例3 病毒適應細胞的初級擴增培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)方法。
(1)初級擴增培養(yǎng) 將馴化完成的MDCK細胞向5L細胞培養(yǎng)生物反應器中接種1～5×105cells/mL的細胞，懸浮培養(yǎng)，直至擴增至0.3～1×107cells/mL，實現(xiàn)細胞初級擴增培養(yǎng)； 其中，所述的培養(yǎng)基為含6～10％血清的F-DMEM培養(yǎng)基； 所述的培養(yǎng)條件為溶氧20～60％、PH值7.0～7.4、溫度35～38℃、初級流加速率6L/天，穩(wěn)定后流加速率3L/天； (2)連續(xù)培養(yǎng) 初級擴增培養(yǎng)結(jié)束后，在上述細胞培養(yǎng)生物反應器中流加新鮮培養(yǎng)基和泵出細胞懸浮液，以維持生物反應器穩(wěn)定的同時，保證細胞在反應器中停留時間內(nèi)擴增至0.3～1×107cells/mL，實現(xiàn)細胞連續(xù)培養(yǎng)； 其中，所述的培養(yǎng)基為流加培養(yǎng)基為懸浮MDCK的無血清NF-DMEM培養(yǎng)基； 所述的培養(yǎng)條件為溶氧30～60％、PH值7.0～7.4、溫度35～38℃、流加速率3L/天。
實施例4 本實施例說明將病毒接種并培養(yǎng)制備病毒液的方法。
將實施例2中馴化后的已適應細胞繁殖的H9N2亞型禽流感分離株JY株病毒接種于5L的病毒增殖反應器的懸浮細胞中培養(yǎng)，接種感染復數(shù)0.01的病毒，改變培養(yǎng)因素為溶氧40～60％、PH值7.0～7.2、溫度32～36℃、流加培養(yǎng)基為懸浮MDCK專用的含1.2～1.6μg/mL胰酶無血清培養(yǎng)基、流加速率2L/天，使病毒在懸浮培養(yǎng)細胞中感染增殖，使病毒適應在懸浮培養(yǎng)細胞中擴增病毒含量≥107TCID50/mL，即血凝價HA≥28； 泵出細胞懸浮液至100L的病毒增殖反應器接入禽流感病毒，隨著細胞懸浮液的以40L/天不斷流入和病毒上清液的不斷流出，在維持系統(tǒng)動態(tài)平衡的過程中實現(xiàn)病毒的連續(xù)增殖，最終得到的病毒上清液的病毒含量≥107TCID50/mL，即血凝價HA≥28。
實施例5 本實施例說明將病毒上清液濃縮、滅活及制備成疫苗產(chǎn)品的方法。
病毒液的濃縮及滅活 收集實施例4中最終得到的病毒液，經(jīng)30KD截流分子量的膜包濃縮至病毒HA血凝效價≥29時，停止?jié)饪s，采用甲醛溶液滅活，使滅活劑終濃度為0.1％，37℃滅活16小時，可以完全滅活病毒。
滅活疫苗的制備 (1)油相制備取注射用白油94份，加硬脂酸鋁1份，邊加邊攪拌，直到完全透明為止，再加入司本-806份，混合后，高壓滅菌備用； (2)水相制備取濃縮后滅活的病毒液96份，加入滅菌的吐溫-804份，充分搖動，直到吐溫-80完全溶解； (3)乳化取油相3份置于乳化罐中，攪拌的同時緩慢加入水相1份，持續(xù)攪拌30～60分鐘，攪拌速度800r/min，后通過剪切機2次剪切，剪切速度4000r/min，即制成禽流感(H9亞型JY株)滅活疫苗； (4)檢測取樣5～10mL，以3000r/min離心15分鐘，如有分層現(xiàn)象，應重復乳化1次。
實施例6 本實施例說明得到的疫苗產(chǎn)品的效果實驗。
一、免疫抗體水平與攻毒保護關(guān)系的試驗 其中，H9亞型陽性血清購自哈爾濱獸醫(yī)研究所；SPF雞胚及試驗用雞，從山東SPF雞場購買SPF蛋，在相對隔離的條件下孵化，隔離器飼養(yǎng)。
試驗方法 1、免疫將4周齡的SPF雞隨機分成9個試驗組，每組10只，陰性對照組為5只。每批疫苗分3個試驗組，第1組疫苗頸部皮下接種試驗雞10只，接種劑量0.02mL/只；第2組疫苗接種試驗雞10只，0.1mL/只；第3組疫苗接種試驗雞10只，0.2mL/只。三批疫苗均以此方法免疫接種。
2、血清抗體HI的測定免疫后3周，采集每只雞血清，按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄方法測定試驗組和陰性對照組每只雞的HI抗體效價。
3、攻毒試驗試驗組雞免疫3周后，用10倍稀釋的禽流感病毒JY株E1代病毒液靜脈注射攻擊試驗組和對照組雞，攻擊5天后，采集泄殖腔棉拭子，用10日齡SPF雞胚進行病毒分離。以從泄殖腔沒有分離到病毒判定為免疫攻毒保護。
試驗結(jié)果 三批疫苗按照不同的劑量對4周齡的SPF雞進行免疫，疫苗免疫劑量、HI抗體效價和抗攻毒保護之間的關(guān)系見表1。從結(jié)果可見，免疫0.2mL劑量組共保護30/30(100％)，HI抗體效價幾何平均值均≥7.4log2；免疫0.1mL劑量組共保護30/30(100％)，HI抗體效價幾何平均值均≥6.8log2，免疫0.02mL劑量組共保護25/30(83.3％)，HI抗體效價幾何平均值均≥4.9log2。對照組5只，HI抗體效價0，攻毒保護為1/5(20％)。疫苗免疫劑量與攻毒保護率表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，隨著免疫劑量的加大，免疫組雞獲得攻毒保護的數(shù)量增多，但這種差異沒有統(tǒng)計學意義上的差異；血清HI抗體效價與抗攻毒保護則呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)。
表1疫苗免疫劑量、HI抗體效價和攻毒保護之間的關(guān)系
注分母為接種雞的數(shù)量，分子為病毒分離陰性雞的數(shù)量 三批疫苗按照不同的劑量對4周齡的SPF雞進行免疫，HI抗體效價和攻毒保護之間的關(guān)系見表2，結(jié)果表明，免疫后血清HI抗體效價與攻毒保護率呈正相關(guān)。HI≤2log2，攻毒保護率為20％；HI≥5log2，攻毒保護率為100％。
表2免疫后HI抗體效價與攻毒保護的平行關(guān)系
注分母為接種雞的數(shù)量，分子為病毒分離陰性雞的數(shù)量；括號內(nèi)數(shù)字為保護百分率 本試驗結(jié)果表明，禽流感(H9亞型)病毒JY株滅活疫苗免疫劑量與攻毒保護呈現(xiàn)一定的正相關(guān)，但表現(xiàn)不明顯。血清HI抗體效價與抗攻毒保護呈現(xiàn)較明顯的正相關(guān)性，HI抗體≥5log2，即可獲得100％攻毒保護，因此，HI抗體效價可作為疫苗效檢的判定標準。即HI抗體≥5log2，可獲得100％攻毒保護，則該疫苗免疫效力合格。考慮到泄殖腔病毒分離具有一定的不確定性，為保證疫苗的免疫效力，在用免疫HI抗體滴度作為疫苗效力評價指標時，規(guī)定HI抗體滴度幾何平均值≥7log2，同時陰性對照組雞HI抗體滴度≤2log2時，判定該疫苗合格。
二、疫苗的免疫效力及最小免疫劑量試驗 其中，試驗雞為SPF雞，SPF種蛋購自山東家禽所SPF雞場，孵化后在負壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)； 標準抗原和抗血清為禽流感(H9亞型)抗原和抗血清，滅活的抗原HA效價≥1∶128；抗血清HI≥1∶64。
試驗方法 1、分組及免疫將三批疫苗分別以20μL/只、0.1L/只、0.2mL/只接種21日齡的SPF雞每組各免疫10只，各組雞分別設(shè)對照5只，每組雞都進行編號，各組雞隔離飼養(yǎng)； 2、免疫21天后，檢測抗禽流感(H9亞型)的HI抗體；然后用禽流感(H9亞型)JY株(靜脈注射10倍稀釋的病毒尿囊液，0.2mL/只)分別攻擊。攻毒5天后，分別采集每只雞泄殖腔拭子，每個樣品經(jīng)尿囊腔接種5枚10日齡SPF雞胚，0.2mL/胚，37℃孵育5日，逐胚測定HA，每個樣品接種的5枚雞胚中只要有1枚雞胚胚液的HA效價≥1∶16(微量法)，即可判定為病毒分離陽性。對病毒分離陰性的樣品，再盲傳1代后判定。以確定免疫效力及禽流感(H9亞型)JY株部分的最小免疫劑量。
試驗結(jié)果 從表3中可以見到，分別以20μL、0.1mL、0.2mL，免疫不同日齡的SPF雞。在免疫后21天，每只免疫20μL的免疫組，HI抗體幾何平均值≥5log2，攻毒保護率可達到85％；免疫0.1mL、0.2mL的兩組雞，抗禽流感(H9亞型)的HI抗體幾何平均值均≥7log2，攻毒保護SPF雞達到100％，與實驗室前期研究結(jié)果相符。根據(jù)上述實驗結(jié)果，確定疫苗最小免疫劑量為0.1mL，免疫21天后，HI抗體幾何平均值≥7log2?？紤]實際應用中的復雜性，及飼養(yǎng)條件與實驗室的差異等不利因素，為確保免疫效果的可靠性，推薦免疫劑量為0.2mL/只。
表3二聯(lián)疫苗禽流感(H9亞型)部分免疫效力試驗
注HI抗體滴度為10只雞抗體的幾何平均數(shù)，表示為X±SD，X代表平均值，SD代表離散度
權(quán)利要求
1.一種H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟
(1)病毒適應細胞系MDCK細胞的馴化
將病毒適應細胞系MDCK細胞進行無載體培養(yǎng)的馴化，改變其貼壁生長的特性，使其適應全懸浮培養(yǎng)的生長環(huán)境；
(2)MDCK細胞的初級擴增培養(yǎng)
將馴化完成的MDCK細胞向細胞培養(yǎng)生物反應器中接種1～5×105cells/mL的細胞，懸浮培養(yǎng)，直至擴增至0.3～1×107cells/mL，實現(xiàn)細胞初級擴增培養(yǎng)；
(3)病毒適應細胞的連續(xù)培養(yǎng)
初級擴增培養(yǎng)結(jié)束后，在上述細胞培養(yǎng)生物反應器中流加新鮮培養(yǎng)基和泵出細胞懸浮液，以維持生物反應器穩(wěn)定的同時，保證細胞在反應器中停留時間內(nèi)擴增至0.3～1×107cells/mL，實現(xiàn)細胞連續(xù)培養(yǎng)；
(4)接種病毒培養(yǎng)制備病毒液
將馴化的已適應細胞繁殖的H9N2亞型禽流感分離株JY株病毒接種于懸浮細胞，改變培養(yǎng)因素，隨著細胞懸浮液的不斷流入和病毒上清液以同樣速度的不斷流出，在維持系統(tǒng)動態(tài)平衡的過程中實現(xiàn)病毒的連續(xù)增殖，使病毒適應在懸浮培養(yǎng)細胞中擴增病毒含量≥107TCID50/mL，即血凝價HA≥28；
(5)病毒濃縮、滅活及制成疫苗產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(1)的無載體培養(yǎng)馴化方法為將復蘇后經(jīng)2～3代貼壁培養(yǎng)的MDCK細胞胰酶消化后，按2×105cells/mL密度加入三角搖瓶，采用含8～10％血清的F-DMEM培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)，PH 7.1～7.5，40～48小時后，待細胞密度達1～5×106cells/mL時，分瓶傳代，同時觀察細胞形態(tài)，每次傳代選取細胞形態(tài)良好的搖瓶分瓶傳代，按上述方法搖床培養(yǎng)，連傳43代，分裝，液氮凍存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(2)中的培養(yǎng)基為含6～10％血清的F-DMEM培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(2)中所述的培養(yǎng)條件為溶氧20～60％、PH值7.0～7.4、溫度35～38℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(3)中流加的培養(yǎng)基為懸浮MDCK的無血清NF-DMEM培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(3)中所述的培養(yǎng)條件為溶氧30～60％、PH值7.0～7.4、溫度35～38℃。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)中所述的改變的培養(yǎng)因素為溶氧40～60％、PH值7.0～7.2、溫度32～36℃、流加培養(yǎng)基為懸浮MDCK的含1.2～1.6μg/mL胰酶無血清培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(5)的病毒液的濃縮及滅活方法為收集步驟(4)得到的病毒液，預處理后經(jīng)30KD截流分子量的膜包濃縮至病毒HA血凝效價≥29時，停止?jié)饪s，采用甲醛溶液滅活，使滅活劑終濃度為0.1％，37℃滅活16小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(5)的將濃縮及滅活后病毒液制備成疫苗產(chǎn)品的方法為
油相制備取注射用白油94份，加硬脂酸鋁1份，邊加邊攪拌，直到完全透明為止，再加入司本-806份，混合后，高壓滅菌備用；
水相制備取濃縮后滅活的病毒液96份，加入滅菌的吐溫-804份，充分搖動，直到吐溫-80完全溶解；
乳化取油相3份置于乳化罐中，攪拌的同時緩慢加入水相1份，持續(xù)攪拌30～60分鐘，攪拌速度800r/min，后通過剪切機2次剪切，剪切速度4000r/min，即制成H9N2亞型禽流感滅活疫苗；
檢測取樣5～10mL，以3000r/min離心15分鐘，如有分層現(xiàn)象，應重復乳化1次。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法所制得的疫苗產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法及產(chǎn)品，其技術(shù)要點主要涉及病毒適應細胞系的篩選、確定、馴化，病毒適應細胞的初級擴增培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)、接種病毒培養(yǎng)制備病毒液以及最終的滅活及疫苗產(chǎn)品的制備。本發(fā)明首先避免采用目前禽流感生產(chǎn)大量使用雞胚的病毒繁殖方法，既避免了生物安全隱患的問題，又克服了疫苗的大量生產(chǎn)受制于雞胚的供應；其次，本發(fā)明提供一種安全連續(xù)的封閉式細胞培養(yǎng)病毒生產(chǎn)的方法，用于H9N2亞型禽流感病毒滅活疫苗的制備，使得不僅能使用細胞培養(yǎng)方法，也能同時生產(chǎn)出高滴度的病毒，滿足免疫生產(chǎn)要求；最后，由于本發(fā)明所述的疫苗的生產(chǎn)方法簡單快速，因此能在發(fā)生疫情時快速提供疫苗。
文檔編號A61P31/16GK101816785SQ20101015974
公開日2010年9月1日 申請日期2010年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月29日
發(fā)明者李玉和, 沈明君, 范娟, 季明, 潘杰 申請人:揚州優(yōu)邦生物制藥有限公司