專利名稱：禽流行性感冒病毒的特異性抗病毒反義核酸藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽流行性感冒病毒的特異性抗病毒反義核酸藥物。
背景技術(shù)：
禽流感是由正黏病毒科甲型流感病毒引起的一種禽烈性傳染病，其臨床表現(xiàn)為呼 吸系統(tǒng)疾病、產(chǎn)蛋下降等。禽流感曾在世界各地爆發(fā)流行，引起禽只大量死亡及生產(chǎn)性能的 急劇下降，使養(yǎng)禽業(yè)遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。陸基家禽，水禽及野鳥均可被感染，以引起呼吸 系統(tǒng)和嚴(yán)重?cái)⊙Y以致全身多臟器功能衰竭，病情進(jìn)展快、病死率高為主要特征。禽流感作為人流感新毒株形成的最龐大基因庫將對(duì)人類造成直接感染，一些禽流 感病毒(H7型)正在發(fā)生變異，而變異的病毒能夠在人與人之間傳播，目前，共有包括中國 在內(nèi)的15個(gè)國家暴發(fā)了人禽流感疫情，共造成412人感染，其中256人死亡。在禽類中傳 染的所有禽流感病毒中，H5N1禽流感病毒現(xiàn)已具備大流行開始所需的所有先決條件，即迄 今為止，H5W病毒造成嚴(yán)重病情人數(shù)和死亡人數(shù)最多，它跨越了物種傳染屏障，從禽類傳染 到了人類。一旦形成有效的人與人之間的傳播，H5W病毒將變異成引起新一輪流感疫情所 需的特性。目前，急需一種具備高水平的生物利用度、穩(wěn)定理化性能及高效安全的禽流行性 感冒病毒的特異性抗病毒藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具備高水平的生物利用度、穩(wěn)定理化性能及高效安全的 禽流行性感冒病毒的特異性抗病毒反義核酸藥物。本發(fā)明所提供的禽流行性感冒病毒的特異性抗病毒反義核酸藥物，其活性成分為 四種反義核酸，所述四種反義核酸的核苷酸序列分別為序列表中的序列4、序列7、序列11 和序列14。本發(fā)明的禽流行性感冒病毒的特異性抗病毒反義核酸藥物，其中所述四種反義 核酸為任意質(zhì)量比。本發(fā)明的禽流行性感冒病毒的特異性抗病毒反義核酸藥物，其中所述四種反義 核酸的質(zhì)量比為1 1 1 1。本發(fā)明的禽流行性感冒病毒的特異性抗病毒反義核酸藥物，其中還包括可藥用 載體或賦形劑。本發(fā)明的禽流行性感冒病毒的特異性抗病毒反義核酸藥物具備高水平的生物利 用度、穩(wěn)定理化性能，無毒副作用，無耐藥性，能特異性直接殺死AIV，抗病毒效果好，成本低 廉
MTv ο
具體實(shí)施例方式
人工合成如下反義核酸
AMl 5，-CAUCCACAUCACUCUGCUGUU-3’ ；
AM2 5，-CCUGCCGUAGAUGGCCCUCUU-3'；
AM3 5，-AAGGCGAGGAUAAAUGCAUUU-3’ ；
AM4 5，-GCAACAACAAGAGGAUCACUU-3’ ；
ANPl5-AUU⑶CAUACUCCUCAGCAUU-3，；
ANP25-CU⑶GACUUG⑶CAUCAUCUU-3，；
ANP35-AAUUCCCCUUUGACGCGUAUU-3，；
ANP45-UUGAACAAGCCCAUCAUCAUU-3，；
APAl5-CACCGAGAGCCCAGUUUAAUU-3，；
APA25-C⑶UUUCCGCCUUCCUUCUUU-3，；
APA35-GAAU⑶GGUACUUGUAGCAUU-3，；
APA45-UCUUU⑶GAUACCAUUUUCUU-3，；
APBl5-GUCCAUCAACCGGGUUGAGUU-3，；
APB25-UACCAUUCUCUUG⑶CCUGUU-3，；
APB35-GAAU⑶GGUGCUUAUAGCAUU-3，；
APB45-UUUCCCUAAGCUAGCCAUCUU-3，。
流感毒株腳1，H9N2實(shí)驗(yàn)條件涉及H5亞型的在BSL-3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，其它在BSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。細(xì)胞系犬腎細(xì)胞MDCK反義核酸均為1. 5 μ g/ml采用細(xì)胞病變級(jí)數(shù)指標(biāo)測(cè)定反義核酸抗病毒活性.Dayl 鋪板消化前期準(zhǔn)備的MDCK細(xì)胞，離心收集，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度 調(diào)到1 X IO5個(gè)/ml，鋪24孔板，于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)18-24小時(shí)。Day2 顯微鏡觀察細(xì)胞的密度，待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔板面積的70 80%時(shí)，且細(xì)胞狀態(tài)良好。 吸去培養(yǎng)液，每孔加入300 μ 1待篩選藥物，每個(gè)藥物10個(gè)孔。溫育1小時(shí)后，加入100 μ 1 流感病毒(感染比為0.01)，吸附2小時(shí)后，用營養(yǎng)液洗去未吸附的病毒后，再加入完全培養(yǎng) 基，在37°C和5% CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中還設(shè)不加病毒和反義核酸的正常細(xì)胞 對(duì)照組，加病毒、不加反義核酸陽性對(duì)照組和加反義核酸藥物、不加病毒的陰性對(duì)照組。Day3-5 觀察藥物對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)判。結(jié)果評(píng)判對(duì)照組成立和細(xì)胞病變?cè)u(píng)判指標(biāo)。(1)正常細(xì)胞對(duì)照組實(shí)驗(yàn)過程無病變；陽性對(duì)照組出現(xiàn)細(xì)胞病變，且到實(shí)驗(yàn)結(jié)束 時(shí)90%以上細(xì)胞產(chǎn)生病變；藥物陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)過程細(xì)胞無病變。(2)細(xì)胞病變?cè)u(píng)判指標(biāo)細(xì)胞無病變-細(xì)胞病變?cè)?5%以下 +細(xì)胞病變?cè)?6%-50% ++細(xì)胞病變?cè)?1%-75% +++細(xì)胞病變?cè)?6%-100% ++++
實(shí)驗(yàn)組篩選結(jié)果如表1.表1.反義核酸在細(xì)胞上的抗病毒活性分析
處理方式MDCK細(xì)胞病變率序號(hào)反義核酸H5N1 H9N21AMl+++ +2AM2+ +3AM3++ +
4AM4-+
55ANPl++++
6 ANP2+++
7. ANP3++
8ANP4+-
9APAl++++
10APA2++
11APA3++
12APA4+++++
13APBl+-
14APB2-— 15、APB3+++ 16APB4++++
18陽性對(duì)照組++++++++
19陰性對(duì)照組-_
20 正常細(xì)胞對(duì)照組上述細(xì)胞病毒實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果表明AM4、ANP3、APA3、APB2為優(yōu)選。毒性分析Dayl 鋪板消化前期準(zhǔn)備的MDCK細(xì)胞，離心收集，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度 調(diào)到IX IO5個(gè)/ml，鋪24孔板，在37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)。Day2 顯微鏡觀察細(xì)胞的密度，待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔板面積的70 80%時(shí)，且細(xì)胞狀態(tài)良好。 吸去培養(yǎng)液，每孔加入300 μ 1待篩選藥物，每種藥物加10孔。在37°C和5% CO2環(huán)境中繼 續(xù)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)只加PBS液無反義核酸的陰性對(duì)照組。Day3-5 觀察藥物對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)判，結(jié)果如表2。
表2.反義核酸毒性分析
四種反義核酸AM4、ANP3、APA3和APB2按照任意質(zhì)量比混合制成本發(fā)明的反義核 酸藥物。具體以反義核酸AM4、ANP3、APA3和APB2按照質(zhì)量比為1 1 1 1混合制成 的反義核酸藥物為例。反義核酸藥物穩(wěn)定性分析高溫流通蒸汽高溫105°C，20分鐘滅菌不影響其生物活性。極端溫度50°C存放2個(gè)月不影響其生物活性。室溫存放24個(gè)月不影響其生物活性。低溫-20°C存放48個(gè)月不影響其生物活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)動(dòng)物20日齡的SPF雞160只，分成16組，每組10只。病毒H5m，H9N2實(shí)施方案(一)藥效性試驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)組用H5W或H9N2毒感染(感染毒劑量100個(gè)TCID50)， 24小時(shí)后，分別肌肉注射各單體反義核酸或本發(fā)明的核酸藥物，劑量均為10 μ g，并設(shè)只攻 毒不用反義核酸陽性對(duì)照組和設(shè)立只用反義核酸、不攻毒的作為陰性對(duì)照組。攻毒后每日 觀察雞的情況，14天后統(tǒng)計(jì)雞死亡數(shù)(見表3、表4)。表3、各單體反義核酸及本發(fā)明核酸藥物對(duì)SPF雞人工感染H5W毒后的治療性試
驗(yàn)結(jié)果 表4、各單體反義核酸及本發(fā)明核酸藥物對(duì)SPF雞感染H9N2后的治療性試驗(yàn)結(jié)果 ( 二 )不同給藥組對(duì)雞體內(nèi)病毒抑制試驗(yàn)雞只在注射反義核酸藥物72小時(shí)和 168小時(shí)后，分別用滅菌的棉拭子涂擦泄殖腔，將浸透分泌物的棉拭子放入含青霉素、鏈霉 素2000U/ml的HANK'S液中，充分捻動(dòng)、震蕩，8000轉(zhuǎn)/min，離心lOmin，取上清液作為接種 材料。分別接種10日齡SPF雞胚，培養(yǎng)5d后凍死活胚，全部測(cè)定血凝性，以HA效價(jià)> 21og2 判定為雞只排病毒陽性(見表5)，結(jié)果表明本發(fā)明的反義核酸可以獲得良好的治療效果。表5.各單體反義核酸及本發(fā)明核酸藥物對(duì)SPF雞感染H5m，H9N2抑制效果
權(quán)利要求
禽流行性感冒病毒的特異性抗病毒反義核酸藥物，其活性成分為四種反義核酸，所述四種反義核酸的核苷酸序列分別為序列表中的序列4、序列7、序列11和序列14。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗病毒反義核酸藥物，其特征在于所述四種反義核酸為任 意質(zhì)量比。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗病毒反義核酸藥物，其特征在于所述四種反義核酸 的質(zhì)量比為1 1 1 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗病毒反義核酸藥物，其特征在于還包括可藥用載體或賦 形劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種禽流行性感冒病毒的特異性抗病毒反義核酸藥物。本發(fā)明的禽流行性感冒病毒的特異性抗病毒反義核酸藥物，其活性成分為四種單體反義核酸，所述四種反義核酸的核苷酸序列分別為序列表中的序列4、序列7、序列11和序列14。本發(fā)明的禽流行性感冒病毒的特異性抗病毒反義核酸藥物具備高水平的生物利用度、穩(wěn)定理化性能，無毒副作用，無耐藥性，能特異性直接殺死AIV，抗病毒效果好，成本低廉。
文檔編號(hào)A61P31/16GK101920022SQ20101015965
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月29日
發(fā)明者韓健寶 申請(qǐng)人:韓健寶