一種雙基因缺失粗糙型牛種布魯氏菌及其疫苗的生產方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種雙基因缺失粗糙型牛種布魯氏菌及其疫苗的生產方法。該重組菌株通過非抗性基因篩選技術，缺失牛種布魯氏菌2308株WboA基因以及vjbR基因。上述2個基因的缺失，一方面使其失去了光滑型布魯氏菌細胞壁LPS結構中O鏈形成的條件(WboA基因缺失導致)，菌落形態(tài)由光滑型轉變?yōu)榇植谛?；另一方面由于vjbR基因的缺失，導致重組菌的毒力和在細胞內生存能力下降，降低布魯氏菌對靶動物的感染能力，進一步提高了疫苗的安全性。以此菌株生產疫苗將改變布魯氏菌疫苗免疫動物與野毒株感染動物難以區(qū)分的現狀，并有效提高現有疫苗的安全性。
【專利說明】一種雙基因缺失粗糙型牛種布魯氏菌及其疫苗的生產方法
[0001]【技術領域】本發(fā)明涉及一種雙基因缺失粗糙型牛種布魯氏菌及其疫苗的生產方法。該疫苗為牛、羊和豬對布魯氏菌病的預防用活疫苗，屬獸用生物制品領域。
技術背景
[0002]布魯氏菌病(布病)是由布魯氏菌或稱布氏菌(Brucella)引起的以流產和發(fā)熱為特征的人獸共患病，嚴重地威脅著人和多種動物的生命健康。本病不但對動物的繁殖和生產性能具有嚴重危害，更重要的是，人感染布魯氏菌后，往往難以治愈，從而造成嚴重的公共衛(wèi)生問題。因此在布魯氏菌流行的國家，消除布病一直是公共衛(wèi)生計劃中最重要的目標之一。目前全世界范圍內消除該病的主要方法是撲殺與免疫相結合，對布病發(fā)生相對比較嚴重的中國，由于撲殺的成本高，疫苗預防成為本病主要控制手段。布魯氏菌疫苗免疫帶來的主要問題是無法區(qū)分疫苗免疫和自然感染的動物，這在很大程度上限制了布魯氏菌病疫苗的使用和推廣，也給布病的有效防治和清除帶來了一定的難度。 [0003]根據布魯氏菌表型的差異，可將布魯氏菌分為光滑型(S)和粗糙型(R)兩類，目前在我國使用的布病活疫苗均為光滑型菌株，其免疫帶來的主要問題是使用后無法區(qū)分疫苗免疫與自然感染的動物，這在很大程度上限制了布魯氏菌疫苗的使用和推廣，也給布病的有效防治和清除帶來了一定的難度。
[0004]雖然布魯氏菌存在兩種不同的表型，在凝集類抗體水平上無交叉反應，但卻具有良好的交叉保護性，并且不同種來源的布魯氏菌相互之間同樣存在交叉保護能力。如果用粗糙型布魯氏菌疫苗免疫的動物，其血清只與粗糙型抗原發(fā)生凝集反應，而與光滑型血清不反應，以此可以區(qū)分疫苗生產用菌株和野毒株?；谏鲜鲈?，人們對粗糙型布魯氏菌疫苗株的研發(fā)從未間斷過。到目前為止，成功開發(fā)出具有良好免疫原性的粗糙型布魯氏菌疫苗株卻鮮有報道。
[0005]最早使用過的粗糙型布魯氏菌疫苗是用45/20菌株制備的，但該菌株極不穩(wěn)定，經常會出現從R型到S型的變異，造成毒力返強，因而該疫苗已基本不再使用。90年代美國科學家以牛種布魯氏菌參考強毒株(2308株)為原始菌種，通過人工誘變的方法篩選獲得了粗糙型布魯氏菌疫苗株(RB51)，動物試驗表明該菌株具有良好的免疫力。1996年被美國批準為牛用布病疫苗，現已在美國、歐洲及拉美等多個國家生產和廣泛使用。由于知識產權等方面的原因，我國尚未能成功引進RB51疫苗株。隨后基因組測序研究表明，相對于原始菌2308株，RB51在WboA基因中有一個大小為71 Ibp的插入(IS711)，從而導致WboA基因的破壞。
[0006]功能基因組學研究證實布魯氏菌細胞壁脂多糖(LPS)中的O鏈組成決定了其光滑型或粗糙型的表型，O鏈的某些成分缺失，會導致菌株由光滑型變成粗糙型?，F已發(fā)現多個與布魯氏菌光滑型表型相關的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wbkC、wz和wbkC等。WboA基因編碼了一種糖基轉移酶，該酶參與了布魯氏菌LPS中O鏈的形成。因此，WboA基因得缺失或破壞同樣會導致布魯氏菌無法形成含有O鏈完成結構的LPS，從而表現為粗糙型。[0007]本實驗室曾以豬種布魯氏菌疫苗株(S2株)為研究對象，構建了 wbkC和wboA基因缺失的重組布魯氏菌疫苗株，并比較了它們之間的免疫效果。其后，又進一步構建了 WboA基因不完全缺失株，系統(tǒng)地研究了 WboA基因不同長度缺失株的存活率、免疫保護性以及粗糙型表型等方面的特性，并最終確定了 wboA基因1-897之間的片段為缺失的最佳片段區(qū)域。
[0008]隨著RB51粗糙型布魯氏菌疫苗株的廣泛應用，其安全性也遭到了更多質疑。有研究表明，靜脈注射全劑量RB51疫苗可引起試驗牛嚴重的胎盤炎和胎盤感染，并能從奶液中分離到RB51。RB51疫苗同樣會引起早期懷孕牛的流產等等。
[0009]基于上述研究背景， 申請人:以2308株為研究對象，通過基因同源重組和蔗糖敏感基因的負篩選技術，首先構建了布魯氏菌2308株wboA基因(1-897#)缺失的粗糙型布魯氏菌2308-wboA缺失株(該疫苗株實質上等同于RB51株疫苗株)，在此基礎上，又利用同樣的原理和技術，敲除了與布魯氏菌毒力相關的另一個基因vjbR(l-614#)，獲得了具有更好安全性，并保留有良好免疫原性的粗糙型牛種布魯氏菌疫苗株2308- Δ WboA- Δ vjbR。

【發(fā)明內容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供一種不干擾布病臨床診斷的安全、高效的布病疫苗株及其疫苗生產方法。
[0011]本發(fā)明是采用蔗糖敏感基因的負篩選技術，缺失牛種布魯氏菌(Brucellaabortus) 2308株(本發(fā)明又簡稱為牛種布魯氏菌2308株)wboA基因(I~897bp之間的序列)及vjbR基因(l_614bp之間的序列)，構建重組布魯氏菌2308- Δ WboA- Δ vjbR株，該重組菌使原始菌株由光滑型轉變?yōu)榱舜植谛?，其安全性滿足疫苗生產要求。用該菌制備的疫苗免疫動物后，其血清用常規(guī)凝集試驗即可與自然感染相區(qū)分。
[0012]本發(fā)明的技術方案
[0013]I基因缺失粗糙型布魯氏菌，其特征在于采用非抗性篩選技術，缺失牛種布魯氏菌2308菌株wboA基因I~897bp之間的序列，使原始菌株由光滑型轉變?yōu)榱舜植谛?；同時缺失了 vjbR基因，使重組菌的安全性進一步提高。牛種布魯氏菌(Brucellaabortus) 2308-Λ WboA-Λ vjbR菌株制備的疫苗免疫動物后，其血清可用常規(guī)的凝集試驗與自然感染相區(qū)分，本菌株已于2014年5月20日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物保藏委員會普通微生物保藏中心，保藏號為=CGMCCN0.8884。
[0014]2 一種基因缺失粗糙型布魯氏菌活疫苗，其特征在于該疫苗該疫苗含有活的布魯氏菌CGMCC N0.8884株和獸用生物制品常用的凍干保護劑。
[0015]3.一種基因缺失粗糙型布魯氏菌活疫苗的生產方法，其特征在于用胰大豆肉湯作為重組菌疫苗制造用培養(yǎng)基，培養(yǎng)基滅菌后按培養(yǎng)基量的按1%~2%接入布魯氏菌CGMCCN0.8884株種子菌液，37°C，按常規(guī)方法發(fā)酵培養(yǎng)28~38h，加入凍干保護劑，充分混勻、分裝疫苗瓶中后經冷凍真空干燥，即成為2308-Λ WboA-Λ vjbR株基因缺失粗糙型布魯氏菌活疫苗。
[0016]4.一種基因缺失粗糙型布魯氏菌活疫苗的鑒別診斷，其特征在于使用如序列7、8和序列13、14所述序列的2對引物，通過PCR方法可對其進行特異性鑒別。[0017]本發(fā)明是通過以下步驟實現的:
[0018]1.重組穿梭質粒的構建及轉化
[0019](I)蔗糖敏感基因(SucBlr)克隆以含有蔗糖敏感基因(SucBlr)的商品化質粒PKNG101 (購自英國NCCB。)為模板，PCR擴增SucBk基因，然后通過限制性內切酶Nde I，將SucBlr基因克隆進pUC18載體中，構建重組質粒pUC-SacB。
[0020](2)穿梭質粒pLR(fflTOA)-SacB的構建將WboA基因(I~897位)的上、下游同源臂(L (ffboA)和R(ffb()A))的PCR產物分別克隆進pUC18載體中，構建重組質粒pUC(ffb()A)-L-R。通過一對引物，以pUC(ffb()A)-L-R為模板，將包含L(ffb()A)和R(ffb()A)的片段擴增后通過Sal I和Sma I克隆進pUC-SacB質粒中，獲得重組穿梭質粒pLR(fflroA)-SacB。
[0021](3)穿梭質粒pLR(vjM)-SacB的構建將vjbR基因的上、下游同源臂(L(vjbK)和R(vJbK))的PCR產物分別克隆進pUC18載體中，構建重組質粒pUC(vjbK)-L-R。通過一對引物，以pUC(V_-L-R為模板，將包含L(vjbK)和R(vjbK)的片段擴增后通過EcoR I和Sph I克隆進pUC-SacB質粒中，獲得重組穿梭質粒pLR(vjbK)-SacB。
[0022](4)按常規(guī)方法制備布魯氏菌2308株的感受態(tài)細胞，取50 μ I制備好的感受態(tài)細胞，加入5μ1的pLR(ffb()A)-SaCB (濃度約為400μ8/μ1)，進行電轉化。設定點轉化參數為:Tc = 5ms，V = 2500vo
[0023]2.重組菌2308-Λ WboA的篩選與鑒定將電轉化的2308涂布到含5 μ g/ml氨芐青霉素(Amp)的TSA平板上 ，利用pUC18載體中的氨芐抗性(AmpK)以及克隆進的蔗糖抗性(SucBe)基因進行篩選。首先用篩選出能在50 μ g/ml氨芐上生長的重組菌(第一次同源重組)，挑選出的重組菌經不含氨芐的TSB培養(yǎng)后，再通過5%蔗糖TSA平板篩選出丟失氨芐抗性基因和蔗糖敏感基因全的重組菌(第二次同源重組)。通過一對PCR引物，鑒定wboA基因缺失的重組菌2308- Δ WboA。
[0024]3.重組菌2308- Δ WboA- Δ vjbR的篩選與鑒定按1.4中的方法制備2308- Δ WboA感受態(tài)細胞，取50 μ I制備好的感受態(tài)細胞，加入5 μ I的pLR(vjbK)-SacB (濃度約為400 μ g/μ I)，進行電轉化。設定點轉化參數為:Tc = 5ms, V = 2500v。
[0025]4.對獲得的重組布魯氏菌進行形態(tài)學、血清學及基因水平檢測，并對重組菌安全性、免疫保護性進行鑒定。
[0026]5疫苗制備對安全性和免疫保護性良好的重組菌，按布魯氏菌活疫苗(A19株)的生產方法(參照(中華人民共和國農業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程二〇〇〇年版.化學工業(yè)出版社，2001，本發(fā)明簡稱《規(guī)程》)，將2308- Λ WboA- Δ vjbR接種于適宜培養(yǎng)基，收獲培養(yǎng)物，加適宜穩(wěn)定劑，經冷凍真空干燥制成活疫苗。用于預防布魯氏菌病。
[0027]發(fā)明的詳細描述
[0028]本發(fā)明所涉及基因為與光滑型表型相關的布魯氏菌WboA基因，以及與布魯氏菌毒力相關基因vjbR。本發(fā)明所涉及基因重組技術包括:利用含蔗糖敏感基因的穿梭質粒介導，篩選wboA基因缺失的重組布魯氏菌2308- Δ WboA,并在此基礎上，利用同樣的原理和技術再篩選vjbR基因缺失的重組菌，即為2308- Δ WboA- Δ vjbR。
[0029]本發(fā)明通過2次同源重組，無痕缺失了光滑型牛種布魯氏菌2308株的wboA基因第l_897bp之間的序列，以及vjbR全基因(l-614bp之間的序列)，最終篩選獲得了粗糙型重組布魯氏菌2308-Λ WboA-Λ vjbR株。[0030]1.重組布魯氏菌的構建及篩選
[0031]本發(fā)明首先利用同源重組及蔗糖敏感基因的負篩選技術，成功構建了 WboA基因第l-897bp之間的序列缺失的重組牛種布魯氏菌2308-Λ WboA株，該重組菌株由光滑型轉變?yōu)榱舜植谛?。進一步通過同源重組和蔗糖負篩選技術，敲除了 2308-Λ WboA株中的一個毒力相關基因vjbR(l-614#)，使其毒力進一步下降，從而滿足疫苗安全性要求，并保留了良好的免疫原性。重組菌在培養(yǎng)基上傳20代后，遺傳性狀仍很穩(wěn)定。動物試驗表明重組菌比牛種布魯氏菌A19的安全性更高，免疫保護性與A19相似，其突出的優(yōu)點還在于該重組菌免疫動物后產生的抗體不干擾布病的臨床診斷。
[0032]具體操作方法如下:
[0033](I)PCR擴增wboA基因上、下游同源臂
[0034]引物設計:
[0035]上游同源臂引物(序列I和序列2):
[0036]Fffb03LSJ -CGCAGAGCTCGCATCCAGATACATTGAAC-3，(含 SacI 位點);
[0037]RffboalSJ -CCGTTCTAGAACTGATTTCCCGTGTCAAC-3，(含 XbaI 位點)。
[0038]下游同源臂引物(序列3和序列4):
[0039]Fm1a^f -ATGCTCTAGAGACAAGGAGTATGCGCAGC-3，(含 XbaI 位點); [0040]1。油5，-CACGGCATGCTGACCTGATAACACGACTA-3’(含 SphI 位點)。
[0041]用Promega公司的細菌基因組提取試劑盒(Lot: 187282)，參照說明書(附件I)提取布魯氏菌2308基因組DNA，并以提取的基因組DNA為模板擴增wboA上、下游的基因片斷。PCR 反應程序為:95°C變性 5min ；95°C 50s—54°C 50s—72°C lmin，進行 30 個循環(huán)，72°C延伸lOmin。獲得的上游同源臂標注為L(ffb()A)，下游同源臂標注為R(ffb()A)。
[0042](2)構建用于同源重組的穿梭質粒。
[0043]I) pUC-L-R質粒的構建
[0044]將以上(I)項中PCR獲得的左側同源臂L，用SacI和XbaI酶雙酶切后，克隆進同酶處理的PUC18質粒中，按常規(guī)方法篩選重組質粒pUC-L ;將其與(I)項中PCR獲得右側同源臂R均用XbaI和SphI雙酶切后，連接、轉化，篩選重組質粒pUC-L-R。
[0045]2)穿梭質粒 pLR (WboA)-SacB 的構建
[0046]設計引物(序列5和序列6)如下:
[0047]F:5，-CGCAGTCGACGCATCCAGATACATTCAAC-3，(含 Sal I 位點)；
[0048]R: 5，-CAAACCCGGGTGACCTGATAACACGTCTA-3’ (含 SmaI 位點)，
[0049]以pUC-L-R質粒為模板，擴增出包含上、下游同源臂(LR)的大小為1800bp的序列。將該PCR產物用Sal I和Sma I酶切后，克隆進同酶處理的pUC_SacB質粒(本實驗室構建保存)中，獲得重組質粒PLR (WboA) -SacB。
[0050](3)制備布魯氏菌2308的電轉化感受態(tài)細菌
[0051]將單個CFU的2308菌接種于10ml TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數期的中期，放冰水中冷卻。12000r/min離心1min,棄去培養(yǎng)基,再分別用10ml、50ml、10m、5m、2ml滅菌水各離心洗滌一次。最后將獲得的菌體重懸于的甘油水溶液中，此即為待用的感受態(tài)細菌。
[0052](4)電轉化和2308-Λ WboA重組菌的篩選[0053]I)電轉化將3 μ g pLR-SacB質粒加入到50 μ 12308感受態(tài)細菌中?；靹蚝筠D移到電極杯中。電擊電壓:2.5KV ;電擊時間:5暈秒。電擊完成后，加入1ml SOC培養(yǎng)基,置37°C搖振培養(yǎng)4h后，將全部菌落涂布到含50 μ g/ml氨芐青霉素的TSA平板上，37°C培養(yǎng)72h。
[0054]2)用于鑒定第二次同源重組成功的PCR引物
[0055]設計如下引物(序列7和序列8):
[0056]F389:5’ -AATGAGCTATTCCCGC-3’ (位于 WboA 閱讀框上游-44 到-28 位。)
[0057]R389:5’ -TAGCCGATAAACACGC-3’ (位于 WboA 閱讀框下游 1243 到 1258 反向互補位。)
[0058]陽性重組菌的預期大小為389bp，非重組菌的PCR產物大小為1302bp。
[0059]3)篩選挑取平板上單個菌落(第 一次重組菌)，接種到不含氨芐的TSB培養(yǎng)液中，37°C搖振培養(yǎng)6-8h，將菌液用生理鹽水進行1:10、1:100和1:1000稀釋，每稀釋度各取菌液100 μ I涂布含5%蔗糖的TSA平板，37°C培養(yǎng)72h。挑取蔗糖平板上生長的菌落，用鑒定引物進行菌落PCR，篩選陽性重組菌。對PCR篩選獲得的陽性菌，進一步用凝集試驗驗證其粗糙型特性。提取重組菌的基因組DNA，以F389和R389為引物進行PCR，并將PCR產物進行克隆和序列測定，結果證實WboA基因l-897bp之間的序列已經缺失，獲得的重組菌命名為2308-ΛWboA。
[0060](5)穿梭質粒pLR(vjbR)-SacB質粒的構建
[0061]設計用于擴增VjbR基因上、下游同源臂的引物(序列9、序列10、序列11和序列12)如下:
[0062]F(L-vjb):5，-ACCCGAATTCCGACGACAAGAAAG-3’ (含 EcoR I 位點);
[0063]R(L-vjb):5’ -GGGGTCTAGATGGAAATATCCTTGGTG-3’(含 Xba I 位點);
[0064]F(R-vjb):5，-ACACTCTAGACTGATGGCGAAATCG(含 Xba I 位點);
[0065]R(R-vjb):5’ -CACAGCATGCAGGAGGTGAAGGATGAA-3’(含 Sph I 酶切位點)。
[0066]以2308基因組DNA為模板，擴增出包含上、下游同源臂(LR)的大小分別978bp、1169bp。將上、下游PCR產物經相應的限制性內切酶處理后，克隆進同酶處理的pUC-SacB質粒(本實驗室構建保存)中，獲得重組質粒pLR (vjb) -SacB0
[0067](6) 2308-Λ WboA感受態(tài)細菌的制備、電轉化及2308-Λ WboA-Λ vjbR的篩選
[0068]I)參照步驟(3)制備2308- Δ WboA感受態(tài)細菌；
[0069]2)參照步驟⑷-①進行電轉化；
[0070]3)重組菌篩選參照步驟⑷-3)，鑒定引物(序列13和序列14)設計如下:
[0071]F Λ vjbR: 5’ -GACCTGTTATTGTGTGC-3’
[0072]R Λ vjbR:5 ’ -GCTTTTCTTTTCGCCTG-3 ’
[0073]重組菌預期PCR條帶大小為399bp.[0074]2.布魯氏菌2308-Λ WboA-Λ vjbR菌株的特性檢查
[0075](I)形態(tài)和生化特性檢查革蘭氏染色為陰性。菌體為球桿菌，單個散在，無鞭毛，不形成芽孢和莢膜，大小約0.6~2.5 μ m。生化試驗為硫化氫試驗陽性。
[0076](2)培養(yǎng)特性檢查重組布魯氏菌2308-Λ WboA-Λ vjbR株，在ρΗ6.4~6.8的胰大豆瓊脂(TAB)或其他適宜培養(yǎng)基(如馬丁湯、胰際肉湯、肉肝湯等)上生長良好；靜止培養(yǎng)易出現沉淀，振搖后液體渾濁、不透明。[0077](3)粗糙型特性檢查熱凝集試驗、吖啶黃凝集試驗、菌落結晶紫染色試驗結果符合粗糙型布魯氏菌的特點，即熱凝集試驗陽性，吖啶黃凝集試驗陽性，能被結晶紫染色。
[0078](4)血清學特性檢查將牛種布魯氏菌2308株和重組布魯氏菌2308-Λ WboA-Λ vjbR株菌培養(yǎng)物制成抗原注射小鼠2次，間隔I個月，第二次接種I個月后采血分離血清。牛種布魯氏菌2308株的抗血清與布魯氏菌Μ5株、Μ28株、Α387株和Α19株等光滑型布魯氏菌凝集反應為陽性；與布魯氏菌2308-Λ WboA-Λ vjbR株和Mill株等粗糙型布魯氏菌凝集反應為陰性；而布魯氏菌2308- Δ WboA- Δ vjbR株抗血清與S2株、M5株、M28株、A387株和A19株等光滑型布魯氏菌凝集反應為陰性，與粗糙型布魯氏菌Mlll株凝集反應為陽性(表1)。表明2308-Λ WboA-Λ vjbR菌株免疫小鼠后，其血清不含有對光滑型布魯氏菌的凝集類抗體。
[0079]表1布魯氏菌r2308_ Δ WboA- Δ vjbR株血清學檢查結果
[0080]
【權利要求】
1.基因缺失粗糙型布魯氏菌，其特征在于采用非抗性篩選技術，缺失牛種布魯氏菌2308菌株wboA基因I~897bp之間的序列，使原始菌株由光滑型轉變?yōu)榱舜植谛停煌瑫r缺失了 VjbR基因，使重組菌的安全性進一步提高。用該菌(2308-Λ WboA-Λ vjbR)制備的疫苗免疫動物后，其血清可用常規(guī)的凝集試驗與自然感染相區(qū)分，牛種布魯氏菌(Brucellaabortus) 2308-Λ WboA-Λ vjbR菌株已于2014年05月20日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物保藏委員會普通微生物保藏中心，保藏號為:CGMCCN0.8884。
2.一種基因缺失粗糙型布魯氏菌活疫苗，其特征在于該疫苗該疫苗含有活的布魯氏菌CGMCC N0.8884株和獸用生物制品常用的凍干保護劑。
3.一種基因缺失粗糙型布魯氏菌活疫苗的生產方法，其特征在于用胰大豆肉湯作為重組菌疫苗制造用培養(yǎng)基，培養(yǎng)基滅菌后按培養(yǎng)基量的按1%~2%接入布魯氏菌CGMCCN0.8884株種子菌液，37°C，按常規(guī)方法發(fā)酵培養(yǎng)28~38h，加入凍干保護劑，充分混勻、分裝疫苗瓶中后經冷凍真空干燥，即成為2308-Λ WboA-Λ vjbR株基因缺失粗糙型布魯氏菌活疫苗。
4.一種基因缺失粗糙型布魯氏菌活疫苗的鑒別診斷，其特征在于使用如序列7、8和序列13、14所述序列的2 對引物，通過PCR方法可對其進行特異性鑒別。
【文檔編號】C12R1/01GK104031874SQ201410240832
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月3日 優(yōu)先權日:2014年6月3日
【發(fā)明者】王芳, 丁家波, 馮宇, 王楠, 朱良全, 蔣卉, 寧宜寶, 王忠田, 張廣川, 毛開榮, 康孟佼, 范學政, 印春生, 李寧, 戴志紅 申請人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所