專利名稱：含有重組人α-2b干擾素的重組乳酸菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種含有重組人a-2b干擾素的重組乳酸 菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
a-2b干擾素屬于I型干擾素，是機(jī)體白細(xì)胞分泌的一種有廣譜抗病毒、抗腫瘤 及免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。自1987年Isaacs和Lindermann發(fā)現(xiàn)干擾素以來(lái)，人類 就一直試圖將其應(yīng)用于臨床。而直到20世紀(jì)70年代后期，隨著基因工程技術(shù)的出 現(xiàn)及發(fā)展，用這種方法生產(chǎn)的干擾素才進(jìn)入了工業(yè)化生產(chǎn)，并且大量投放市場(chǎng)。 目前，經(jīng)大腸桿菌和中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞表達(dá)的重組人a-2b干擾素在臨床上得到 廣泛應(yīng)用，主要用于治療由病毒引起的白血病、乙型、丙型肝炎等。重組干擾 素蛋白需要連續(xù)注射高劑量藥才能達(dá)到治療效果，且在血液中易被降解易產(chǎn)生 副作用，還可能產(chǎn)生中和抗體。因此有必要研究開(kāi)發(fā)新型的給藥方式，以提高 干擾素在體內(nèi)的作用，延長(zhǎng)在體內(nèi)的半衰期和降低免疫原性。
乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)千百年來(lái)廣泛應(yīng)用于食品加工工業(yè)，
是公認(rèn)的安全(GRAS)的食品級(jí)微生物。乳酸菌的主要作用包括改善食品風(fēng)味、
防止食品腐敗、增加養(yǎng)分、平衡消化道菌群、降低膽固醇、控制內(nèi)毒素等。而 分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步為探索其新的應(yīng)用潛力提供了基礎(chǔ)如利用基因工
程乳酸菌在生物反應(yīng)器內(nèi)發(fā)酵食品或直接在人和動(dòng)物消化道內(nèi)生產(chǎn)蛋白等，其 中最有前景的應(yīng)用即是乳酸菌作為活載體將治療性蛋白或抗原傳遞至黏膜表 面，繼而同時(shí)誘導(dǎo)黏膜免疫和系統(tǒng)免疫。
Wells等發(fā)現(xiàn)用表達(dá)破傷風(fēng)毒素片段C(tetanus toxin， TTFC)的重組乳酸 乳球菌給小鼠口服免疫后，能使小鼠免受致死劑量的TTFC攻擊(Wells JM， Wilson PW (1993) Lactococcus lactis: high-level expression of tetanus toxin fragment C and protection against lethal challenge. Mol Microbiol. 1993 8(6) :1155-62)。表達(dá)細(xì)胞因子的乳酸乳球菌也可以有效刺激黏膜免疫應(yīng) 答。表達(dá)有IL-12的重組乳酸乳球菌與表達(dá)HPV16(人乳頭狀瘤病毒)E7抗原的 重組乳酸乳球菌共同免疫小鼠后，檢測(cè)到Thl細(xì)胞因子、IL-2、 IFN-y的分泌水平均增加，能有效保護(hù)小鼠免受HPV-16誘導(dǎo)的腫瘤的攻擊 (Bermudez-Humaran LG， Cortes-Perez NG， Lefevre F (2005) A novel mucosal vaccine based on live Lactococci expressing E7 antigen and IL—12 induces systemic and mucosal immune responses and protects mice against human papillomavirus type 16-induced tumors. J" Immunol, 175， 7297-302)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組人a -2b干擾素的重組乳酸菌及其應(yīng)用。 本發(fā)明的重組人a-2b干擾素的編碼基因，是如下1)或2)或3)的核苷酸序
列
1) 序列表中序列l(wèi)所示的核苷酸序列；
2) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中序列l(wèi)的核苷酸序列雜交且編碼重組人a -2b干 擾素的核苷酸序列；
3) 與序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性且編碼重組人 a-2b干擾素的核苷酸序列。
所述的高嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖 液，pH7.2， 7%SDS)中，65。C預(yù)雜交30min;棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0.25mol/L 磷酸鈉緩沖液，pH7.2， 7%SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，65。C雜交12hr;棄雜 交液，加入洗膜液I (20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2， 5%SDS) ， 65。C洗膜2次，每 次30min;加入洗膜液II(20隨ol/L磷酸鈉緩沖液，pH7. 2， 1%SDS) ， 65。C洗膜30min。
含有上述重組人a -2b干擾素的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也在 本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
本發(fā)明的另一 目的在于提供一種重組乳酸菌，是將含有所述的重組人a -2b干 擾素的編碼基因的DNA分子導(dǎo)入乳酸菌中，獲得該重組乳酸菌。
為了便于重組乳酸菌分泌蛋白，所述重組人a-2b干擾素的編碼基因的5'端連 有編碼信號(hào)肽的DNA分子。
所述信號(hào)肽的氨基酸序列為序列表的序列2。
本發(fā)明的又一 目的在于提供所述的重組乳酸菌在制備重組人a -213干擾素中的 應(yīng)用。
本發(fā)明的又一目的在于提供所述的重組乳酸菌在制備抗病毒、抗腫瘤藥物中的 應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種抗病毒、抗腫瘤的藥物，其活性成分為上述的重組乳酸菌。 將含有重組人a-2b干擾素的編碼基因的乳酸菌作為載體，表達(dá)內(nèi)源或外源蛋 白，可以不經(jīng)表達(dá)后加工而直接服用或給藥，在功能食品、醫(yī)療保健等方面具有非 常誘人的前景。已有的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了乳酸乳球菌可有效提高黏膜免疫系統(tǒng)提呈抗 原及誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的能力，具有成為新型口服疫苗誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答的 潛力。


圖1為重組人a-2b干擾素原核表達(dá)載體pNZ-ifnm的構(gòu)建示意圖2為重組人a-2b干擾素在乳酸菌中誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的western-blot檢測(cè)結(jié)
果；
圖3為重組人a-2b干擾素在乳酸菌中誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的具體定位的
western-blot結(jié)果；
圖4為工程菌NZ(pNZ-ifnm)表達(dá)人干擾素的定量檢測(cè)結(jié)果； 圖5為工程菌NZ(pNZ-ifnm)表達(dá)人干擾素的活性測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。 下述實(shí)施例中，所述百分含量如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。 實(shí)施例1含有重組人a-2b干擾素的重組乳酸菌的制備及表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè) 一、含有重組人a-2b干擾素的重組乳酸菌的制備
1. 重組人a-2b干擾素基因的合成
根據(jù)乳酸菌偏愛(ài)密碼子表，在不改變天然人干擾素a-2b的氨基酸序列的情況 下，將其基因序列替換為含乳酸菌偏愛(ài)密碼子的序列，見(jiàn)序列表的序列1。合成的重 組人a-2b干擾素基因命名為i/)M7。
2. 構(gòu)建重組表達(dá)載體 重組表達(dá)載體的構(gòu)建流程見(jiàn)圖1。
(1) 將基因ifnm通過(guò)5"scl和tT/mI位點(diǎn)連接到pUC57質(zhì)粒上(Fermentas)， 所得到的含有上述重組人a-2b干擾素基因的重組載體命名為pUC57-ifnm，并經(jīng)測(cè) 序驗(yàn)證其正確性。
(2) 將跨膜信號(hào)肽Usp45的編碼序列連接到上述重組載體pUC57-ifnm中 根據(jù)乳酸菌信號(hào)肽Usp45的編碼序列(Genbank號(hào)M60178)設(shè)計(jì)引物，并在引物序列的兩端分別添加上限制性內(nèi)切酶^coRI和5"scl的識(shí)別位點(diǎn)，引物序列如下
引物1 (上游引物)5' - CGCGGATCCATGAAAAAAAAGATTATCTCAG-3'(帶下劃線堿 基為限制性內(nèi)切酶^boRI的識(shí)別位點(diǎn))
引物2(下游引物)5' - CGCTGAGCTCAGCGTAAACACCTGACAAC -3'(帶下劃線堿 基為限制性內(nèi)切酶^cl的識(shí)別位點(diǎn))
以乳酸乳球菌MG1363(Gasson MJ (1983) Plasmid complements of Streptococcus lactisNCD0 712 and other lactis streptococci after protoplast-induced curing. J Bacteriol 154:1-9)(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所) 的基因組DNA為模板，以引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C 15sec， 56 °C 15sec， 72°C 25sec，共30個(gè)循環(huán)。
反應(yīng)結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶fcoRI和5^cI進(jìn)行雙酶切，回收 100bp的酶切產(chǎn)物，純化后與同樣雙酶切的載體pUC57-ifnm 16。C連接16小時(shí)，將連 接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含100ug/mL氨芐青霉素的LB 抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶^coRI 和&cl進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)雙酶切得到100bp片段的質(zhì)粒為陽(yáng)性克隆。再對(duì)陽(yáng)性克隆 質(zhì)粒用PCR的方法做進(jìn)一步鑒定，所用引物為引物1和引物2，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序， 測(cè)序結(jié)果表明乳酸菌信號(hào)肽Usp45的編碼序列已插入pUC57-ifmn中且序列正確，信 號(hào)肽Usp45的編碼序列是Genbank號(hào)M60178的5，末端第101位到181位，編碼序列 表序列2的氨基酸。將此含乳酸菌信號(hào)肽Usp45編碼序列及重組人a -25干擾素編碼 序列的重組載體命名為pUC45-ifnm。 (3)乳酸菌表達(dá)載體的構(gòu)建
以pUC45-ifnm為模板，設(shè)計(jì)使用P3, P4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增包含有Usp45 信號(hào)肽及重組人a-2b干擾素編碼基因的融合片段。
P3: 5' -CATGCCATGGTGAAAAAAAAGATTATCTCAG-3'(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切 酶Afca[的識(shí)別位點(diǎn))
P4: 5' -CGCTGGTACCTTATTCTTTAGAACGTAAAG-3'(帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切 酶f/wl的識(shí)別位點(diǎn))
擴(kuò)增條件為94°C 30sec， 56°C 30sec， 72°C 90sec，共30個(gè)循環(huán)。
反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶7fca[和^OTl進(jìn)行雙酶切，再將 600bp的酶切產(chǎn)物純化后與同樣雙酶切并經(jīng)純化的載體pNZ8048( Kuipers, 0. P.，P. G. G. A. d. Ruyter， M. Kleerebezem & W. M. d. Vos (1998) Quorum sensing—controlled gene expression in lactic acid bacteria. /j57ofec力/ cL/, 64:15-21)(中科院微生物研究所)在16。C下連接16小時(shí)，將連接產(chǎn)物用氯化鈣法 轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061 (ATCC47035)感受態(tài)細(xì)胞，用含10ug/mL氯霉素的LB抗性平 板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶lot和^^1 進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)雙酶切能得到600bp片段的質(zhì)粒為陽(yáng)性克隆。再對(duì)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒 用PCR的方法做進(jìn)一步鑒定，所用引物為P3和P4，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié) 果表明乳酸菌信號(hào)肽Usp45及重組人a-2b干擾素的編碼序列已插入pNZ8048中且 序列正確，得到干擾素的誘導(dǎo)型分泌載體，命名為pNZ-ifmn。 3.重組乳酸菌的制備
將干擾素乳酸菌誘導(dǎo)型分泌表達(dá)載體pNZ-ifnra轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌厶 NZ9000( Kuipers， 0. P. ， P. G. G. A. d. Ruyter， M. Kleerebezem & W. M. d. Vos (1998) Quorum sensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria. /A'"ec力加,64:15-21)(中科院微生物研究所)，用含5 u g/mL氯霉素的GM17 抗性平板(胰蛋白胨0.5%，大豆蛋白胨0.5%，牛肉浸膏0.5%，酵母提取物0.25 %，葡萄糖0.5%，維生素C0.05X， 0-甘油磷酸鈉1.9%，硫酸鎂lmmol/L)篩 選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒，用引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增得到600bp目的片段的轉(zhuǎn)化子為干擾素誘導(dǎo)型表達(dá)工程菌，命名為 NZ(pNZ-ifnm)。
二、 基因的表達(dá)
將pNZ8048載體轉(zhuǎn)化乳酸菌，作為對(duì)照，命名為NZ (pNZ8048)。將NZ (pNZ-ifnm) 和NZ (pNZ8048)分別接種于含有5 w g/mL氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基的試管中，30 。C靜置培養(yǎng)12小時(shí)，再按2X接種量接種于新鮮的GM17液體培養(yǎng)基中，3(TC靜置 培養(yǎng)3小時(shí)至0De。。值為0. 5-0.6，然后加入終濃度為lng/mL的乳酸鏈球菌素(Nisin) 進(jìn)行誘導(dǎo)，在3(TC下靜置誘導(dǎo)3小時(shí)。對(duì)照同樣處理。
三、 表達(dá)產(chǎn)物的western-blot鑒定
取誘導(dǎo)型表達(dá)產(chǎn)物1. 35ml于4°C以4300g離心5分鐘，分別收集得到上清液1 及細(xì)胞沉淀l。
在上清液1加入100%三氯乙酸(TCA)150ul混勻，使TCA終濃度為10。/。，冰浴 10分鐘后，于4'C以11， 500g離心10min,得到的沉淀2，以lml冰冷的丙酮洗滌2次后晾干，并重懸于50ul 50mMNaOH中，所得液體為上清2。
將細(xì)胞沉淀1重懸于1/10體積的PBS中，超聲破碎。待菌液清亮后，于4t:以 13200g離心IO分鐘，棄掉含有未破碎細(xì)胞及細(xì)胞碎片的沉淀3，取上清，即為上 清3存放于-2(TC或4"C。
對(duì)重組人干擾素進(jìn)行更詳細(xì)的定位時(shí)，需將細(xì)胞壁與膜組分的進(jìn)行進(jìn)一步分 離，具體方法為將細(xì)胞沉淀1以TES(10mM Tris-HC1， pH8. 0， lmM EDTA， 25%蔗 糖)洗滌一次，并以1/10(體積百分比)的TES-LMR(TES中加入溶菌酶10mg/ml，Rnase 0. lmg/ml)重懸，37。C溫育30分鐘后，于4°C以2500g離心10分鐘，獲得上清4 和沉淀4，將上清4以10% TCA沉淀，重懸于50ul 50mMNaOH中，即為胞壁釋放的 蛋白；沉淀4為原生質(zhì)體，以TES洗滌后，重懸于500ul PBS (NaCl 137 mM, KC1 2. 7 raM， Na2HP04 10 mM， KH2P04 2 mM， pH 7. 4)中，隨后凍融5次，于4。C以21000g離 心45分鐘，獲得上清5和沉淀5。上清5中含有胞質(zhì)組分，以TCA沉淀后重懸于 50ulTE(10mMTris-Hcl， pH8. 0， lmMEDTA)中;沉淀5為膜組分，以50ul含有1%SDS 的TE溶解。
對(duì)細(xì)胞的不同組分進(jìn)行Western-blot鑒定，具體方法如下
1) SDS-PAGE
采用Tris-甘氨酸電泳系統(tǒng)對(duì)收集的各細(xì)胞組分進(jìn)行SDS-PAGE (分離膠濃度為 12%)，方法為取待測(cè)樣品液15uL，加入6求樣品緩沖液3wL (含100mmol/L Tris-HC1， pH6. 8， 200mmol/L DTT， 4%SDS， 0. 2%溴酚藍(lán)，20%甘油)，水浴煮 沸5min，上樣后用25mA穩(wěn)流電泳，待溴酚蘭進(jìn)入分離膠后，改用35 mA電泳至玻 璃板底部。
2) 免疫雜交
SDS-PAGE電泳結(jié)束后，不對(duì)膠染色，進(jìn)行Western-blot分析，具體方法為 將膠用蒸餾水沖洗并在電轉(zhuǎn)移液(25mM Tris， 192mM甘氨酸，pH8. 3， 20%甲醇) 中浸潤(rùn)15分鐘。裁好的PVDF膜先用甲醇潤(rùn)濕20秒后用蒸餾水洗2分鐘，然后以 電轉(zhuǎn)移液浸潤(rùn)5分鐘。安裝好電轉(zhuǎn)裝置后，在冰浴中以100mA電流轉(zhuǎn)移1.5h;轉(zhuǎn)有 蛋白的PVDF膜用蒸餾水漂洗后，以封閉液(含有0. 05% Tween20和5%脫脂奶粉的 pH7.4的PBS)于4。C封閉過(guò)夜。然后與一抗溶液(用封閉液以1:1000稀釋的小鼠抗 人a -2b干擾素(mouse monoclonal antibody to interferon alpha 2b， Abcam， ab9386) 37。C保溫lh，用PBST(含有0. 05% Tween的pH7. 4的PBS)洗膜三次，每次10min;與二抗溶液(用封閉液以1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG)37'C保溫lh， 再以PBST洗膜三次，每次lOmin。以商業(yè)化的ECL試劑盒顯色。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)， 將試劑盒中的A液與B液等體積混合，按照O. 125ml/cm2在膜上加上顯色液，去掉 多余的顯色液后，于暗室壓片曝光。重組人干擾素在乳酸菌中誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的 Western-blot檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。表明重組乳酸菌經(jīng)發(fā)酵后，菌體中產(chǎn)生能夠與 干擾素的抗體特異性相互作用的蛋白，但是表達(dá)產(chǎn)物沒(méi)有切除信號(hào)肽。圖2中泳道 1為工程菌NZ (pNZ-ifnm)的發(fā)酵上清液(上清2)，泳道2為工程菌NZ (pNZ-ifnm)的 細(xì)胞(上清3)，泳道3為同樣誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化pNZ8048的乳酸乳球菌L hc^s NZ9000 作為陰性對(duì)照。蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(170kDa、 130kDa、 95kDa、 72kDa、 55kDa、 43kDa、 34kDa、 26kDa、 17kDa、 llkDa)標(biāo)注在右邊。
為對(duì)重組乳酸菌中表達(dá)的干擾素進(jìn)行更詳細(xì)的定位，對(duì)細(xì)胞的各組分進(jìn)行了分 離。圖3為干擾素在乳酸菌中表達(dá)的定位圖，表明重組乳酸菌表達(dá)的Usp45-IFN蛋 白大部分位于膜上，沒(méi)有分泌到胞外。
圖3中泳道1為誘導(dǎo)的NZ(pNZ8048)樣品作為陰性對(duì)照，泳道2為誘導(dǎo)的 NZ (pNZ-ifnm)細(xì)胞內(nèi)組分(上清5)，泳道3為誘導(dǎo)的重組乳酸菌膜組分(沉淀5)， 泳道4為誘導(dǎo)的重組乳酸菌細(xì)胞壁組分(上清4)。蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(170kDa、 130kDa、 95kDa、 72kDa、 55kDa、 43kDa、 34kDa、 26kDa、 17kDa、 llkDa)。
實(shí)施例2含有重組人a-2b干擾素重組菌表達(dá)產(chǎn)物的含量測(cè)定 用商業(yè)化的重組人a-2b干擾素含量測(cè)定試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先 將試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品以200ul蒸餾水溶解，加入200ul樣品稀釋液稀釋至終濃度為 2000pg/ml。然后依次做倍比稀釋，使?jié)舛确謩e為2000， 1000， 500， 250， 125， 62.5， 31.25pg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品加入到板條孔中，每孔100ul，并做復(fù)孔，留下兩孔做空白 對(duì)照。在其余孔中分別加入100ul實(shí)施例1中的上清2和上清3， 37。C孵育1小時(shí)。 用20倍稀釋的洗滌液洗滌4-6次，在吸水紙上拍干。然后加入酶標(biāo)記的抗體100ul， 37"C孵育1小時(shí)。洗滌4-6次后，每孔加100ul顯色液，于37。C避光顯色15-30 分鐘，然后加上50ul終止液，于酶標(biāo)儀490nm處讀數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的含量數(shù)算出 樣品中干擾素的含量。圖4為重組乳酸菌表達(dá)干擾素的含量圖。圖4中，S代表上 清2， C代表上清3。經(jīng)過(guò)3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，菌體分泌到培養(yǎng)基即上清2中的干擾素 含量為41. 7pg/ml，菌體細(xì)胞即上清3中的干擾素含量為11. 6pg/ml。實(shí)施例3含有重組人a-2b干擾素重組菌表達(dá)產(chǎn)物的活性測(cè)定 生物學(xué)活性參照2005年《中華人民共和國(guó)藥典》三部附錄XC細(xì)胞病變抑制法 進(jìn)行，依據(jù)人羊膜細(xì)胞(WISH)-水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV) 系統(tǒng)，采用CPE (細(xì)胞病變效應(yīng))抑制為基礎(chǔ)的抑制微量測(cè)定法，以每毫升干擾素檢 品的最高稀釋度仍能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞(50%)免受病毒攻擊的稀釋度的倒數(shù)為干擾素單 位。
具體方法為
取WISH細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)至全部貼壁生長(zhǎng)后，去除培養(yǎng)液，分成兩組，一 組將人a干擾素標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所)稀釋成1000U/ml，每孔加 入100W，做4倍系列稀釋，供8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做2個(gè)復(fù)孔。另一組每孔 分別加入4倍系列稀釋的實(shí)施例1中的上清1和上清3，用100TCID50劑量 的水泡性口炎病毒(VSV)進(jìn)行攻毒，對(duì)照孔加無(wú)病毒的培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照 (只加經(jīng)系列稀釋的重組人a干擾素，不加病毒)、陽(yáng)性對(duì)照(不加干擾素，只加 病毒)、空白對(duì)照(不加干擾素，不加病毒)，在倒置顯微鏡下觀察標(biāo)準(zhǔn)品1U/ral 的孔出現(xiàn)50%病變的時(shí)候判斷結(jié)果。以結(jié)晶紫染色后在波長(zhǎng)570nm處測(cè)定吸光度， 采用四參數(shù)回歸計(jì)算法進(jìn)行處理，并按下式計(jì)算干擾素生物學(xué)活性。 供試品生物學(xué)活性(IU / ml) =Pr X [ (Ds X Es) / (Dr X Er)] 式中Pr為干擾素標(biāo)準(zhǔn)品生物學(xué)活性，1U/ml; Ds為供試品預(yù)稀釋倍數(shù)； Dr為干擾素標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)； Es為供試品相當(dāng)于干擾素標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋倍數(shù)； Er為干擾素標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋倍數(shù)。 干擾素生物學(xué)活性測(cè)定結(jié)果如圖5所示，上清1即重組菌分泌到培養(yǎng)基中的干 擾素活性為105U/ml，而上清3即滯留在細(xì)胞內(nèi)的干擾素活性為73. 2U/ml。 圖5中，S代表上清l， C代表上清3。序列表
<110>中國(guó)科學(xué)院微生物所
〈120〉含有重組人a-2b干擾素的重組乳酸菌及其應(yīng)用 <130〉 1 〈160〉 2
<210〉 1
<211> 498
<212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220> 〈230〉
〈400〉 1
tgtgatttaccacaaacacattctttaggttctcgtcgtacattaatgtt60
atgcgtcgtatttctttattttcttgtttaaaagatcgtc3tgattttggttttccacaa120
gaagaatttgtcaa^a3gcaga犯c犯1:tccagttttacatgsaMgatt180
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gaagttgttcgtgcaga^ttatgcgttctttttctttatct^ca^tttaca^gaatct■
ttacgttcta498
〈210〉 2
〈211〉 27
<212〉 PRT <213>人工序列〈220〉
〈230〉 〈400> 2
Met Lys Lys Lys lie lie Ser Ala lie Leu Met Ser Thr Val lie Leu 1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Phe Ser Ala Val Tyr Ala 20 2權(quán)利要求
1、一種重組人α-2b干擾素的編碼基因，是如下1)或2)或3)的核苷酸序列1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中序列1的核苷酸序列雜交且編碼重組人α2b干擾素的核苷酸序列；3)與序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且編碼重組人α-2b干擾素的核苷酸序列。
2、 含有權(quán)利要求l所述基因的重組表達(dá)載體。
3、 含有權(quán)利要求l所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
4、 一種重組乳酸菌，是將含有權(quán)利要求l所述的重組人a-2b干擾素的編碼基因的 DNA分子導(dǎo)入乳酸菌中，獲得的重組乳酸菌。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述重組乳酸菌，其特征在于，所述重組人a-2b干擾素的編碼 基因的5'端連有編碼信號(hào)肽的麗A分子。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述重組乳酸菌，其特征在于，所述信號(hào)肽的氨基酸序列為序 列表的序列2。
7、 權(quán)利要求4-6任一所述的重組乳酸菌在制備重組人a-2b干擾素中的應(yīng)用。
8、 權(quán)利要求4-6任一所述的重組乳酸菌在制備抗病毒、抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
9、 一種抗病毒、抗腫瘤的藥物，其活性成分為權(quán)利要求4-6任一所述的重組乳酸菌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人α-2b干擾素的編碼基因，是如下1)或2)或3)的核苷酸序列1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中序列1的核苷酸序列雜交且編碼重組人α-2b干擾素的核苷酸序列；3)與序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且編碼重組人α-2b干擾素的核苷酸序列。本發(fā)明提供一種重組乳酸菌，是將上述的重組人α-2b干擾素的編碼基因的DNA分子導(dǎo)入乳酸菌中，獲得該重組乳酸菌。本發(fā)明還提供所述的重組乳酸菌在制備重組人α-2b干擾素中以及制備抗病毒、抗腫瘤藥物中的應(yīng)用本發(fā)明還提供一種抗病毒、抗腫瘤的藥物，其活性成分為上述的重組乳酸菌。
文檔編號(hào)A61K35/66GK101538572SQ20091008307
公開(kāi)日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者張秋香, 還連棟, 瑾 鐘 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所