一種提高重組人干擾素α2b天然構(gòu)象含率的制備工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高重組人干擾素α2b天然構(gòu)象含率的方法，操作如下：將重組人干擾素α2b表達(dá)菌體裂解后的菌體裂解液依次用pH不低于7.0的第一透析液和pH低于4的第二透析液進(jìn)行透析，透析后分離純化得到天然構(gòu)象含率高的重組人干擾素α2b。通過采用兩步透析法對(duì)干擾素α2b進(jìn)行復(fù)性，其中，第二步采用低pH透析的方案，其最初目的在于將進(jìn)一步降低鹽酸胍濃度并更換緩沖體系，同時(shí)與去除酸不穩(wěn)定的雜蛋白。但是通過實(shí)驗(yàn)意外發(fā)現(xiàn)，這種兩步復(fù)性法在未降低復(fù)性率的同時(shí)，可以極大地提高天然構(gòu)象干擾素的得率，促使SMM及聚集體或中間態(tài)向天然構(gòu)象轉(zhuǎn)化，降低SMM及聚集體含量。
【專利說明】一種提高重組人干擾素Cl 2b天然構(gòu)象含率的制備工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及一種提高重組人干擾素a 2b天然構(gòu)象含率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]干擾素(Interferon,IFN)由英國(guó)科學(xué)家 Isaacs 和 LinderMann 于 1957 年發(fā)現(xiàn)，是一類具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)。根據(jù)其氨基酸結(jié)構(gòu)、抗原性和細(xì)胞來源，可將其分為三類:a干擾素、β干擾素以及Y干擾素。其中α干擾素是應(yīng)用較為廣泛的一類干擾素，臨床上主要用于治療乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性疾??；也用于一些腫瘤化療藥物的聯(lián)合用藥。
[0003]α干擾素至少有20種以上的不同亞型，其家族成員具有相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn):氨基酸數(shù)目為165或166，氨基酸成分相似，不同亞型間氨基酸序列同源性為70%，第1、29、98/99和138/139位上的半胱氨酸非常保守，形成兩個(gè)二硫鍵(C1-C98、C29-C138，或C1-C99、C29-C139), 二硫鍵對(duì)干擾素α的正確折疊、維持干擾素的立體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性十分重要。
[0004]干擾素中兩對(duì)二硫鍵的形成是正確折疊的關(guān)鍵。兩對(duì)二硫鍵的形成需要不同的氧化還原條件，其中C29-C139容易形成，而C1-C99則需要更強(qiáng)的氧化條件。因此，常規(guī)方法復(fù)性的α干擾素在氧化型電泳中存在快遷移單體(FMM)和慢遷移單體(SMM)，一般認(rèn)為:SMM是由于其一對(duì)二硫鍵(Cl一C99)沒有配對(duì)所造成的。SMM可以視作復(fù)性過程的一種中間體，在一定條件下可以向Nature(天然構(gòu)象,N)構(gòu)象轉(zhuǎn)化,這種轉(zhuǎn)化需要較高的氧化條件；同時(shí)也容易形成鏈間二硫鍵而聚集形成寡聚物(Oligomer)。
[0005]
N^―— SMM 5*=^ Oligomer
[0006]N構(gòu)象是指與人體自身分泌干擾素具有同樣構(gòu)象的一種存在，同SMM及Oligomer比較，其具有比活高、免疫原性低；人體依從性好等特征。
[0007]采用高濃度鹽酸胍溶解，隨后逐步降低鹽酸胍濃度是蛋白質(zhì)復(fù)性的最常用方法之一，降低鹽酸胍濃度可以采用稀釋或透析兩種方法。而稀釋液或透析液往往都采用偏堿性的緩沖體系。較為常規(guī)/簡(jiǎn)單的復(fù)性液(稀釋液或透析液)基礎(chǔ)組分為pH為8左右的磷酸緩沖液或Tris-鹽酸緩沖液。為了有效地促進(jìn)SMM向N構(gòu)象轉(zhuǎn)化，人們會(huì)在上述基礎(chǔ)復(fù)性液中加入氧化還原對(duì)，以期提高復(fù)性效率，常用的氧化還原對(duì)有還原型和氧化型的谷胱甘肽(GSH / GSSG)，其使用濃度為I~3mMGSH，GSH與GSSG比例為I~10:1。但是，由于較高的氧化環(huán)境及堿性條件，甲硫氨酸的硫醚基團(tuán)可能被氧化成亞砜或砜，如文獻(xiàn)(劉云東，“復(fù)合干擾素包涵體折疊復(fù)性、分離純化及穩(wěn)定性研究”)認(rèn)為甲硫氨酸氧化會(huì)在“反相上出現(xiàn)保留時(shí)間時(shí)間較天然結(jié)構(gòu)小的雜峰”，如圖4所示，在含有GSH / GSSG的復(fù)性液的實(shí)施例中，該雜峰含量明顯增加。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種提高重組人干擾素a 2b天然構(gòu)象含率的方法，其可有效提高重組人干擾素a 2b中天然構(gòu)象含率。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下方案進(jìn)行實(shí)施:
[0010]一種提高重組人干擾素a 2b天然構(gòu)象含率的方法，操作如下:
[0011]將重組人干擾素α 2b表達(dá)菌體裂解后的菌體裂解液依次用pH不低于7.0的第一透析液和PH低于4的第二透析液進(jìn)行透析，透析后分離純化得到天然構(gòu)象含率高的重組人干擾素ct 2b。
[0012]通過采用兩步透析法對(duì)干擾素α 2b進(jìn)行復(fù)性，其中，第二步采用低pH透析的方案，其最初目的在于將進(jìn)一步降低鹽酸胍濃度并更換緩沖體系，同時(shí)與去除酸不穩(wěn)定的雜蛋白。但是通過實(shí)驗(yàn)意外發(fā)現(xiàn)，這種兩步復(fù)性法在未降低復(fù)性率(即復(fù)性液中α干擾素的總含量)的同時(shí)，可以極大地提高天然構(gòu)象干擾素的得率，促使SMM及聚集體或中間態(tài)向天然構(gòu)象轉(zhuǎn)化，降低SMM及聚集體含量。
[0013]進(jìn)一步的方案為:
[0014]第一透析液的pH為7.0~8.0，第二透析液的pH為2.0~3.6。
[0015]第一透析液為TriS-鹽酸、巴比妥鈉-鹽酸、硼酸-硼砂、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉中一種或幾種配制的堿性緩沖液。第一透析液為飲用水或純凈水。第二透析液為醋酸-醋酸鈉、甘氨酸-鹽酸、鄰苯二甲酸-鹽酸、磷酸氫二鈉-檸檬酸、檸檬酸-檸檬酸鈉中一種或幾種配制的酸性緩沖液，另外第二透析液也可為醋酸的水溶液、鹽酸的水溶液。用第一、二透析液透析時(shí)所用透析袋的透過`分子量為8000D。
[0016]上述只是列舉了幾種可以作為第一、二透析液的溶液體系，當(dāng)然本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)上述列舉的溶液體系以及其所起的作用，結(jié)合本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)手段和公知常識(shí)而進(jìn)行相應(yīng)的改變，用其他溶液體系進(jìn)行替換，也即是說，本發(fā)明中的第一、二透析液不限于上述限定的溶液體系。
[0017]在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的基礎(chǔ)上，通過后續(xù)的大量實(shí)驗(yàn)和研究發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)復(fù)性結(jié)果也有一定的影響，特別是在第二透析液中進(jìn)行透析時(shí)。對(duì)溫度的研究結(jié)果表明，當(dāng)用第二透析液透析的溫度為4~15°C的條件下，天然構(gòu)象含量無明顯改善；在28~33°C的條件下，天然構(gòu)象可以達(dá)到80% ；當(dāng)溫度升至37°C時(shí)，雖然SDS-PAGE與RP-HPLC結(jié)果無明顯變化，但蛋白總回收率降低至原來的一半。
[0018]因此，本發(fā)明中進(jìn)一步的方案為:
[0019]第一透析液透析的溫度為4~10°C、時(shí)間為12~24h條件下完成的。第二透析液透析的溫度為20~37°C、時(shí)間為12~24h完成。
[0020]更為具體的方案為，菌體與鹽酸胍按照1:2~5 (w/v)的質(zhì)量體積比混合進(jìn)行裂解。重組人干擾素α 2b表達(dá)菌體為表達(dá)重組人干擾素a 2b大腸桿菌。分離純化包括第二透析液透析后對(duì)重組人干擾素a 2b菌體裂解液進(jìn)行離心,過濾回收上清液,然后將上清液經(jīng)單抗親和層析吸附及洗脫，收集得到天然構(gòu)象含率高的重組人干擾素a 2b。
[0021]通過上述的實(shí)施，可將正確復(fù)性率(Nature構(gòu)象的比重)從40%提升至80%。其中RP-HPLC主峰含量從15%提升至60%，大大提高天然構(gòu)象含量，減小了純化壓力。另外，在復(fù)性過程中，采用菌體裂解液直接透析的方法，省去了包涵體洗滌及離心收集沉淀及溶解這一步驟，大大縮短了重組人干擾素a 2b純化提取的工藝流程。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為干擾素a 2b對(duì)照品的RP-HPLC圖譜；
[0023]圖2為實(shí)施例1所獲產(chǎn)品的RP-HPLC圖譜；
[0024]圖3為實(shí)施例2所獲產(chǎn)品的RP-HPLC圖譜；
[0025]圖4為實(shí)施例3所獲產(chǎn)品的RP-HPLC圖譜；
[0026]圖5為實(shí)施例1~3中所獲干擾素a 2b的氧化和還原型電泳圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下結(jié)合【具體實(shí)施方式】來對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0028]目前，大多采用的是蛋白回收率及活性回收率來考察復(fù)性效率，這種研究存在的局限在于:由于相關(guān)蛋白與天然構(gòu)象差異較小，其比活性差異更微乎其微，且比活測(cè)定采用細(xì)胞抑制法也存在較大誤差，因此采用上述考察方法，所得到的復(fù)性率的概念大多指的是復(fù)性液中可溶性干擾素的含量，所指是復(fù)性收率這一概念。無法真實(shí)準(zhǔn)確反映天然構(gòu)象含量的實(shí)際情況；而由于復(fù)性液中雜質(zhì)/雜蛋白的干擾，亦無法直接通過RP-HPLC或SDS-PAGE來考察。
[0029]為了充分驗(yàn)證復(fù)性結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，本發(fā)明中采用單抗親合層析這一技術(shù)對(duì)復(fù)性結(jié)果予以評(píng)價(jià):單抗層析介質(zhì)采用抗原抗體結(jié)合原理，專一性捕獲干擾素及其相關(guān)蛋白(包括各種異構(gòu)體及聚集體)而不與雜蛋白結(jié)合，將復(fù)性液直接與單抗銜接，通過洗脫峰蛋白含量測(cè)定來考察回收率:以避免其他降解途徑的干擾；對(duì)洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE與RP-HPLC檢測(cè)，來考察天然構(gòu)象的含量。
[0030]SDS-PAGE可以較為有效的鑒別α干擾素SMM、FMM以及寡聚物(Oligomer)，寡聚物由于分子量大，位于凝膠上方；SMM由于一條二硫鍵未配對(duì),導(dǎo)致其表觀分子量偏大,其遷移率略低于FMM，緊鄰于FMM的上方；FMM位于凝膠的最下方，其二硫鍵完全配對(duì)，即為上文所述的天然構(gòu)象。
[0031]天然構(gòu)象指的是二硫鍵正確配對(duì)的干擾素，但是其成分也是不均質(zhì)的，主要原因是其存在N末端修飾、以及化學(xué)降解所造成的同分異構(gòu)體，這些成分不能在SDS-PAGE上得到分離，但是確可以在RP-HPLC得到鑒別。如圖3、圖5所示。
[0032]有鑒于此，本發(fā)明中采用SDS-PAGE與RP-HPLC相結(jié)合的方法，一則可以降低單一檢測(cè)方法的誤差；二則通過RP-HPLC的同步考察，可以驗(yàn)證該復(fù)性方案未給α干擾素帶來新的修飾(蛋白酶酶切或化學(xué)降解)。
[0033]以下采取具體操作方法對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明，為了充分說明本方法具有的顯著優(yōu)勢(shì)，其中實(shí)施例1復(fù)性液為pH為8.3的Tris-鹽酸，ImMEDTA ;實(shí)施例2第一步復(fù)性液為Tris-鹽酸，pH8.3，ImMEDTA, 3mMGSSG / ImMGSH，第二步復(fù)性液同實(shí)施例1 一致，目的在于去除氧化還原對(duì)；實(shí)施例3~7是對(duì)本發(fā)明的具體闡述。
[0034]實(shí)施例1
[0035]重組人干擾素a 2b菌體按1:3 (重量/體積)的比例加入6M鹽酸胍/0.1M硼酸，4°C攪拌裂解4h;[0036]上述裂解液經(jīng)50mMTris-鹽酸，pH為8.3，ImMEDTA進(jìn)行透析。裂解液與透析液比例為1:40,期間更換透析液4次,透析時(shí)間48h,溫度2~8°C。所獲蛋白溶液經(jīng)8000rpm/15min離心取上清。
[0037]親和層析吸附及洗脫:將上述上清調(diào)pH至7.4，離心后上單抗親合層析柱，PBS洗滌后，1%醋酸洗脫，收集洗脫液。計(jì)算蛋白量，并利用RP-HPLC、SDS-PAGE檢測(cè)N構(gòu)型含量，結(jié)果如圖2及表1所示。
[0038]實(shí)施例2
[0039]重組人干擾素a 2b菌體按1:3 (重量/體積)比例加入6M鹽酸胍/0.1M硼酸，4°C攪拌裂解4h。
[0040]上述裂解液依次用第一、二透析液進(jìn)行透析，溫度2~8°C。裂解液與透析液比例為1:40，期間更換第一、二透析液各2次，透析總時(shí)間48h。其中，第一透析液為50mMTris-鹽酸，pH8.3, 1mMEDTA, 3mMGSSG / ImMGSH，第二透析液為 20mMTris-鹽酸，ρΗ8.3，ImMEDTA。所獲蛋白溶液經(jīng)8000rpm/15min離心取上清。
[0041]親和層析吸附及洗脫:將上述上清調(diào)pH至7.4，離心后上單抗親合層析柱，PBS洗滌后，1%醋酸洗脫，收集洗脫液。計(jì)算蛋白量，并利用RP-HPLC、SDS-PAGE檢測(cè)N構(gòu)型含量，結(jié)果如附圖3及表1所示。
[0042]實(shí)施例3
[0043]重組人干擾素a 2b菌體按1:3 (重量/體積)比例加入6M鹽酸胍/0.1M硼酸，4°C攪拌裂解4h。上述裂解液經(jīng)依次用第一、二透析液進(jìn)行透析。第一透析液透析時(shí)溫度為4°C，第二透析液透析時(shí)溫度為28°C。裂解液與透析液比例為1:40，期間更換第一、二透析液各2次，對(duì)第一透析液透析時(shí)間為24h，對(duì)第二透析液透析時(shí)間為24h。其中第一透析液為
0.lMPBS，pH7.4，第二透析液為40mM醋酸鈉/醋酸，pH3.6。所獲蛋白溶液經(jīng)8000rpm/15min離心取上清。
[0044]親和層析吸附及洗脫:將上述上清調(diào)pH至7.4，離心后上單抗親合層析柱，PBS洗滌后，1%醋酸洗脫，收集洗脫液。計(jì)算蛋白量，并利用RP-HPLC、SDS-PAGE檢測(cè)N構(gòu)型含量，結(jié)果如附圖3及表1所示。
[0045]實(shí)施例4:
[0046]重組人干擾素a 2b第二透析液菌體按1:2(重量/體積)比例加入6Μ鹽酸胍/0.1M硼酸，4°C攪拌裂解4h。上述裂解液依次用第一、二透析液進(jìn)行透析。第一透析液透析時(shí)溫度為8°C，第二透析液透析時(shí)溫度為30°C。裂解液與透析液比例為1:40，期間更換第一、二透析液各2次，對(duì)第一透析液透析時(shí)間12h，對(duì)第二透析液透析時(shí)間24h。其中第一透析液為pH7.2的飲用水，第二透析液為IOmM鹽酸pH2.0。所獲蛋白溶液經(jīng)8000rpm/15min離心取上清。
[0047]親和層析吸附及洗脫:將上述上清調(diào)pH至7.4，離心后上單抗親合層析柱，PBS洗滌后，1%醋酸洗脫，收集洗脫液。計(jì)算蛋白量，并利用RP-HPLC、SDS-PAGE檢測(cè)N構(gòu)型含量，結(jié)果如表1所示。
[0048]實(shí)施例5
[0049]重組人干擾素a 2b菌體按1:3 (重量/體積)比例加入6M鹽酸胍/0.1M硼酸，4°C攪拌裂解4h。上述裂解液依次用第一、二透析液進(jìn)行透析。第一透析液透析時(shí)溫度為10°C，第二透析液透析時(shí)溫度為33°C。裂解液與透析液比例為1:40，期間更換第一、二透析液各2次，對(duì)第一透析液透析時(shí)間12h，對(duì)第二透析液透析時(shí)間24h。
[0050]其中第一透析液為0.lMPBSpH7.0，第二透析液為20mM磷酸氫二鈉-檸檬酸pH2.4。所獲蛋白溶液經(jīng)8000rpm/15min離心取上清。
[0051]親和層析吸附及洗脫:將上述上清調(diào)pH至7.4，離心后上單抗親合層析柱，PBS洗滌后，1%醋酸洗脫，收集洗脫液。計(jì)算蛋白量，并利用RP-HPLC、SDS-PAGE檢測(cè)N構(gòu)型含量，結(jié)果如表1所示。
[0052]實(shí)施例6
[0053]重組人干擾素a 2b第二透析液菌體按1:5(重量/體積)比例加入6Μ鹽酸胍/0.1M硼酸，4°C攪拌裂解4h。
[0054]上述裂解液依次用第一、二透析液進(jìn)行透析。第一透析液透析時(shí)溫度為4°C，第二透析液透析時(shí)溫度為33°C。裂解液與透析液比例為1:40，期間更換第一、二透析液各2次，對(duì)第一透析液透析時(shí)間24h,對(duì)第二透析液透析時(shí)間24h。其中第一透析液為50mMTris-鹽酸，pH8.0,第二透析液為40mM檸檬酸/檸檬酸鈉，pH4.0。所獲蛋白溶液經(jīng)8000rpm/15min離心取上清。
[0055]親和層析吸附及洗脫:將上述上清調(diào)pH至7.4，離心后上單抗親合層析柱，PBS洗滌后，1%醋酸洗脫，收集洗脫液。計(jì)算蛋白量，并利用RP-HPLC、SDS-PAGE檢測(cè)N構(gòu)型含量，結(jié)果如表1所示。
[0056]實(shí)施例7
[0057]重組人干擾素a 2b第二透析液菌體按1:3(重量/體積)比例加入6Μ鹽酸胍/0.1M硼酸，4°C攪拌裂解4h。
[0058]上述裂解液依次用第一、二透析液進(jìn)行透析。第一透析液透析時(shí)溫度為4°C，第二透析液透析時(shí)溫度為37°C。裂解液與透析液比例為1:40，期間更換第一、二透析液各2次，對(duì)第一透析液透析時(shí)間24h，對(duì)第二透析液透析時(shí)間24h。其中第一透析液為
0.1MPBSPH7.4，第二透析液為40mM醋酸鈉/醋酸，pH3.6。所獲蛋白溶液經(jīng)8000rpm/15min離心取上清，結(jié)果如表1所示。
[0059]親和層析吸附及洗脫:將上述上清調(diào)pH至7.4，離心后上單抗親合層析柱，PBS洗滌后，1%醋酸洗脫，收集洗脫液。計(jì)算蛋白量，并利用RP-HPLC、SDS-PAGE檢測(cè)N構(gòu)型含量，結(jié)果如表1所示。
[0060]表1為實(shí)施例1~7中的檢測(cè)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種提高重組人干擾素a 2b天然構(gòu)象含率的方法，操作如下: 將重組人干擾素a 2b表達(dá)菌體裂解后的菌體裂解液依次用pH不低于7.0的第一透析液和PH低于4的第二透析液進(jìn)行透析，透析后分離純化得到天然構(gòu)象含率高的重組人干擾素 a 2b。
2.如權(quán)利要求1所述的提高重組人干擾素a2b天然構(gòu)象含率的方法，其特征在于:第一透析液的pH為7.0~8.0，第二透析液的pH為2.0~3.6。
3.如權(quán)利要求1或2所述的提高重組人干擾素a2b天然構(gòu)象含率的方法，其特征在于:第一透析液為Tris-鹽酸、巴比妥鈉-鹽酸、硼酸-硼砂、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉中一種或幾種中一種或幾種配制的堿性緩沖液，或者第一透析液為飲用水或純凈水。
4.如權(quán)利要求1或2所述的提高重組人干擾素a2b天然構(gòu)象含率的方法，其特征在于:第二透析液為醋酸-醋酸鈉、甘氨酸-鹽酸、鄰苯二甲酸-鹽酸、磷酸氫二鈉-檸檬酸、檸檬酸-檸檬酸鈉中一種或幾種配制的酸性緩沖液。
5.如權(quán)利要求1或2所述的提高重組人干擾素a2b天然構(gòu)象含率的方法，其特征在于:第一透析液透析的溫度為4~10°C、時(shí)間為12~24h。
6.如權(quán)利要求1或2所述的提高重組人干擾素a2b天然構(gòu)象含率的方法，其特征在于:第二透析液透析的溫度為20~37°C、時(shí)間為12~24h。
7.如權(quán)利要求1或2所述的提高重組人干擾素a2b天然構(gòu)象含率的方法，其特征在于:菌體裂解是利用鹽酸胍/硼酸進(jìn)行裂解，菌體與鹽酸胍/硼酸按照1:2~5 (w/v)的質(zhì)量體積比混合裂解。
8.如權(quán)利要求1或2所述的提高重組人干擾素a2b天然構(gòu)象含率的方法，其特征在于:分離純化包括第二透析液透析后對(duì)菌體裂解液進(jìn)行離心，過濾回收上清液，然后將上清液經(jīng)單抗親和層析吸附及洗脫，收集得到天然構(gòu)象含率高的重組人干擾素a 2b。
9.如權(quán)利要求1或2所述的提高重組人干擾素a2b天然構(gòu)象含率的方法，其特征在于:重組人干擾素a 2b表達(dá)菌體為表達(dá)重組人干擾素a 2b的大腸桿菌。
10.如權(quán)利要求1或2所述的提高重組人干擾素a2b天然構(gòu)象含率的方法，其特征在于:用第一、二透析液透 析時(shí)所用透析袋的透過分子量為8000D。
【文檔編號(hào)】C07K1/22GK103804486SQ201410027089
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月20日
【發(fā)明者】宋禮華, 王榮海, 許培, 董世建, 周樂春, 李增禮, 沈毅 申請(qǐng)人:安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司